一种测定免疫动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞频率的方法与流程

一种测定免疫动物体内抗原特异性抗体分泌b细胞频率的方法
技术领域
1.本发明涉及免疫学技术领域，具体地说是涉及一种利用elispot测定动物体内抗原特异性抗体分泌b细胞频率的方法。


背景技术：

2.抗体效价也称为抗体滴度，是特异性抗体生物活性的重要标志，反应了特异性抗体与抗原的结合能力。抗体效价是疾病诊断、特异性免疫球蛋白制备和疫苗评价等领域的重要指标，对其检测在临床上意义重大。从细胞化学角度说，抗体效价指的是抗体在保持其最佳特异性染色，并且具备最小背景染色条件下的最高稀释倍数，也就是抗体识别特定抗原决定部位所需要的最低浓度。
3.抗体效价通常通过酶联免疫吸附测定（elisa）法来检测，其实验原理为将血清样品先稀释一定倍数后，在酶标板中逐孔倍比稀释加样，采用常规elisa方法检测，读取od值。od值高于空白对照2倍的孔判断为阳性，颜色最淡的一孔阳性孔的稀释倍数即为该血清样品中目的抗体效价比。目前常用的几种elisa 方法有：间接法，双抗体夹心法和竞争法等。计算待检抗体与空白对照吸光度比（positive/negative，p/n），当p/n大于2时为阳性，p/n小于2为阴性，取稀释倍数最大的阳性结果为测得的抗体效价。抗体效价通常用
ꢀ“
1：x
”ꢀ
的形式表示（x表示抗体可以被检测出来的最大稀释倍数），例如抗体效价为1:32000，就表示抗体被稀释到32000倍仍可以检测出来，再稀释就无法检测。x的数值越大，抗体效价越大，表示抗体与抗原结合能力越强。
[0004] 监测免疫后产生的 b 细胞反应的传统方法是通过 elisa 测量血清中的特异性抗体滴度。然而，血清中的抗体水平不提供有关 抗体分泌细胞 (asc)数量、记忆 b 细胞反应和免疫反应状态（例如对抗原无反应）的信息。处于静止状态时，记忆 b 细胞的存在无法通过 elisa 确定。免疫动物通常会诱导由循环抗原特异性记忆 b 细胞介导的长期保护作用，这些细胞不会离体自发产生抗体。具有较长寿命的记忆 b 细胞在重新暴露于特定抗原后的快速反应中起着核心作用。静止记忆 b 细胞在体内不会产生大量抗体，需要抗原刺激才能分化为 asc。激活这些记忆 b 细胞需要在高细胞密度（》10
6 个细胞/孔/ml）和适当的刺激下进行2-5 天的体外预孵育实现。酶联免疫斑点测定（enzyme linked immunospot assay，简称elispot）是一种高灵敏的广泛使用的监测免疫反应的方法，用于在体外适当刺激后对细胞因子或抗体分泌细胞进行定量（cox et al 2006年）。 一般，如果释放出一种特征性的蛋白质，并且有识别蛋白质的特异性高亲和力抗体可用，则可以通过 elispot 检测每个细胞。b 细胞 elispot 检测是鉴定和确定asc 数量以及定量外周血循环中记忆 b 细胞频率的首选方法。b 细胞 elispot 测定的一个主要优点是它能够激活离体抗原特异性记忆 b 细胞，然后对其进行测量。
[0005]
elispot 测定与elisa 相当，并且基于相同的免疫化学原理。 主要区别在于 elispot 是免疫测定和生物测定的结合，因为活细胞直接在 elispot 板的孔中培养。首
先，将对目的蛋白具有特异性的抗体包被在固相（96 孔板）上。 随后将免疫细胞（例如 pbmc 或活化的 b 细胞）添加到96孔板中，并在存在或不存在细胞刺激因子（il-2和r848）或抗体分泌的刺激物的情况下孵育。 释放的蛋白质被包被抗体捕获在直接围绕生产细胞的区域。 在清洗孔以去除免疫细胞后，包被抗体捕获的任何细胞因子或抗体都保留在孔中。 然后通过第二特异性检测抗体、偶联物和沉淀底物的组合使捕获的蛋白质可视化。单个细胞在孔底部形成一个彩色“足迹”（点），代表其分泌活动。点形成细胞的频率可以从孔中的点数和细胞输入中量化。术语“斑点形成细胞”用作 elispot 测定中细胞因子或抗体分泌细胞数量的定量测量。elispot可以在单细胞水平对抗体分泌细胞及细胞因子分泌细胞进行检测，比elisa和有限稀释法等具有更髙的灵敏性（一般高100-400倍），能从10万-30万细胞中检岀1个分泌该蛋白的细胞。该方法能够对抗原刺激后的活细胞进行功能性检测，具有较髙的特异性、直观可信度髙、易操作。
[0006]
通常我们选择具有最佳效价的老鼠或兔子去做细胞融合产生单克隆抗体，但有时这些动物不会产生任何阳性克隆或仅产生很少的阳性克隆。 原因是这些动物的脾脏中只有少量分泌特异性抗体的 b 细胞，它们显示出超高的效价，但因为这些特异性b细胞数量太少，导致与骨髓瘤细胞成功融合的概率太低。传统的elisa法仅测定分泌抗体的总浓度（即效价），无法测定动物体内的分泌特异性抗体的b细胞数量或比例。因为肠系膜淋巴结、外周血和脾脏中含有大致相等百分比的 b 细胞。因此，可以通过对外周血中抗原特异性b细胞频率进行测定以得到脾脏中抗原特异性b细胞的频率，从而在杂交瘤抗体或重组抗体制备前选择最合适的动物。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是找到一种快速高效测定动物体内抗原特异性抗体分泌b细胞的频率的方法。
[0008]
为了实现本发明目的，本发明提供一种简单、方便、低成本的方法。该方法包括以下步骤：（1）采集免疫动物的外周血，经离心分离得到外周血单个核细胞（如记忆b淋巴细胞、t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞）；（2）记忆b细胞在细胞因子 il-2 和 r848 刺激下扩增2-5天；（3）活化 b 细胞释放的抗体被elispot板底聚偏二氟乙烯（pvdf）膜上预包被的二抗（elispot板1）捕获；（4）去除细胞后，被捕获的抗体与生物素标记的二抗结合（elispot板1）或者生物素标记的抗原结合（elispot板2），最后再与酶标记的链霉亲和素结合；（5）elispot板加入底物后，pvdf膜上出现的斑点表明b淋巴细胞产生了抗体，对斑点进行计数和分析；（6）计算elispot板2和elispot板1的斑点数的比值。比值高的动物被选中进行下一步的抗体制备。
[0009]
本发明中，步骤（1）所述“免疫动物”包括各种品系小鼠、大鼠和兔子。
[0010]
其中，步骤（3）所述“二抗”包括但不限于全长羊抗鼠igg，全长羊抗兔igg，fab形式的羊抗鼠igg，fab形式的羊抗兔igg等。
[0011]
其中，步骤（4）所述“酶”包括辣根过氧化酶（hrp）和碱性磷酸酶等（ap）等。
[0012]
其中，步骤（5）所述“底物”包括但不限于各种比色底物如tmb，pnpp，aec，荧光底物等。
附图说明
[0013]
图1是测定免疫动物体内抗原特异性抗体分泌b细胞频率的流程图。
实施方式
[0014]
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
[0015]
实施例1 小鼠外周血中抗体分泌细胞总数的测定
[0016]
小鼠加强免疫后 3-9 天及最后一次冲击免疫之前，用肝素或柠檬酸钠抗凝管（禁止用edta抗凝管）采集小鼠眼眶血，3000g离心10分钟，将血浆和血细胞分离，得到小鼠外周血单个核细胞。全血应保存在室温下（20-26
ꢀ°
c）不超过 8 小时，不要冷藏。在 il-2 和 r848 刺激下，按照2x10
6 个细胞/ml（用imdm细胞培养基+15%胎牛血清稀释）在37
ꢀ°
c、5% co2培养箱中孵育 2-5 天，激活外周血中的记忆 b 细胞。
[0017]
用 25 μl 70% 乙醇预润湿透明elispot 板（millipore，货号：msip n4510）或者白色fluorospot板（millipore，货号：msip n4w50）每个孔的 pvdf 膜 1 分钟，使pvdf膜亲水并确保包被抗体的最佳结合，从而提高灵敏度（增加斑点数）和更准确定量（更尖锐的斑点）。膜经过乙醇处理后，在整个检测过程中必须保持湿润。使用大量乙醇、浓度更高的乙醇和更长的暴露时间进行过度处理会导致残留液体滞留在膜和暗渠之间，这可能会导致测定性能不佳。
[0018]
用力抖出乙醇，然后立即用装有无菌 pbs（1.05mm kh2po4，2.97mm na2hpo4-7h2o、155mm nacl）的宽喷口洗瓶冲洗孔两次。随后将板倒空，并在吸水纸上轻拍。
[0019]
将 50 μl 2μg/ml 未标记的羊抗小鼠 igg（如果免疫动物是小鼠）或者羊抗兔igg（如果免疫动物是兔子）溶液加入 elispot 板的孔中。盖上板盖并在 4
ꢀ°
c 下孵育过夜至少16小时。同时，留3个孔只加 pbs，作为空白对照。
[0020]
去除包被抗体溶液，并用 200 μl 无菌pbs 冲洗每个孔 3 次。随后用力清空板子。向每个孔中加入 200 μl 封闭缓冲液（pbs+1% bsa）。盖上板盖并在室温下孵育至少 1 小时或 4
ꢀ°
c 下孵育过夜。
[0021]
用力摇匀elispot 板，从孔中去除封闭液，不要清洗孔。
[0022]
将预激活后的记忆b细胞按1x105/孔的密度（用imdm细胞培养基+15%胎牛血清稀释）缓慢转移至elispot板中，100 μl/孔。盖上板盖并在 37
ꢀ°
c、5% co2培养箱中孵育 20小时。使用具有宽开口的吸头来移液细胞，以避免对细胞产生可能诱导细胞凋亡从而抑制斑点形成的剪切应力。快速/突然添加细胞可能会导致斑点分布不均。
[0023]
用力甩出细胞，并用无菌pbs冲洗每个孔 2 次，200 μl/孔。
[0024]
用洗液（5.4 mm na2hpo4
·
2h2o，1.3 mm kh2po4，150 mm nacl，0.05% tween-20，ph7.4）洗板 5 次，250 μl /孔。
[0025]
向每孔中加入 100 μl 生物素标记的羊抗小鼠 igg或者生物素标记的羊抗兔igg
（如果免疫动物是兔子）。用封板膜封住板并在室温下避光孵育 2 小时（或在4℃下孵育过夜）。
[0026]
每孔加入 100 μl hrp 标记的链霉亲和素。用粘性盖玻片密封elispot板，并在室温下避光孵育 1 小时。清空elispot板，并用洗液洗涤 pvdf 膜的两侧 5 次。清空elispot 板，并用洗液清洗 pvdf 膜的两侧 5 次。
[0027]
向每个孔中加入 100 μl 新鲜制备的3-氨基-9-乙基咔唑（aec）溶液。盖上盖子，室温避光孵育 30 分钟。
[0028]
清空elispot 板，并用去离子水彻底冲洗 pvdf 膜的两侧以终止反应。pvdf 膜底板应在室温（20-26
ꢀ°
c）下避光干燥，不盖盖子，倒置，以防止斑点漂白。
[0029]
使用光学显微镜或荧光显微镜对斑点进行手工计数，或通过酶联免疫斑点分析仪（elispot reader）或荧光免疫斑点分析仪（fluorospot reader）对斑点进行自动计数。真正的斑点有一个致密中心和一个浅色外环，且强度均一，这是由b细胞分泌的抗体扩散造成的。真实斑点平均为 5000-10000 平方微米，尽管这因孵育时间、微量滴定板、抗体来源和浓度、酶活性、底物和使用的其他材料以及b细胞的功能状态而异。颜色深度或斑点大小取决于分泌抗体的量。只应计算强而明确的斑点，任何小的或微弱的斑点都可能是伪影，应被忽略。人为斑点可能由包被和检测过程中使用的抗体聚集、孵育后未完全从板上去除细胞、dna 沉淀或污垢引起。如果孔中存在大小不一，高度不规则的黑色灰尘颗粒，可向孔内吹入4-5 bar的压缩空气解决。
[0030]
实施例2小鼠外周血中抗原特异性抗体分泌细胞频率的测定
[0031]
重复实施例1中 [0016]
ꢀ‑ꢀ
[0024] 步骤。
[0032]
向每个孔中加入 100 μl 0.01-1 μg/ml 生物素化抗原。用封板膜封住elispot 板，室温下孵育 2 小时（或4℃下孵育过夜）。
[0033]
每孔加入 100 μl hrp 标记的链霉亲和素。用粘性盖玻片密封elispot板，并在室温下避光孵育 1 小时。清空elispot板，并用洗液洗涤 pvdf 膜的两侧 5 次。
[0034]
向每个孔中加入 100 μl 新鲜制备的 3-氨基-9-乙基咔唑（aec）溶液。盖上盖子，室温避光孵育 30 分钟。
[0035]
清空elispot板，并用去离子水彻底冲洗 pvdf 膜的两侧以终止反应。在室温下避光风干板子。
[0036]
使用光学显微镜或荧光显微镜对斑点进行手工或自动计数。注意：将板子存放在避光干燥的地方，以防止斑点漂白。将实施例2中的斑点数除以实施例1中的斑点数，即得到该免疫动物体内抗原特异性抗体分泌b细胞的频率。然后选择频率较高的免疫动物进行杂交瘤抗体或者重组抗体制备。
[0037]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种利用酶联免疫斑点测定来判断免疫动物体内抗原特异性抗体分泌b细胞频率的方法，其特征在于包含以下步骤：（1）采集免疫动物的外周血，经离心分离得到外周血单个核细胞，如记忆b淋巴细胞；（2）循环记忆b淋巴细胞在细胞因子 il-2 和 r848 刺激下扩增2-5天；（3）活化 b 细胞释放的抗体被elispot板底聚偏二氟乙烯膜上预包被的二抗捕获；（4）去除细胞后，被捕获的抗体与生物素标记的二抗结合（elispot板1）或者生物素标记的抗原结合（elispot板2），最后再与酶标记的链霉亲和素结合；（5）elispot板加入底物后，pvdf膜上出现的斑点表明b淋巴细胞产生了抗体，对斑点进行计数和分析；（6）计算elispot板2和elispot板1的斑点数的比值。比值高的动物被选中进行下一步的抗体制备。2.一种采用如权利要求1所述的方法制备得到的多克隆抗体。3.一种采用如权利要求1所述的方法制备得到的杂交瘤单克隆抗体。4.一种采用如权利要求1所述的方法制备得到的重组单克隆抗体。5.一种如权利要求2所述的多克隆抗体在体外诊断试剂盒中的应用。6.一种如权利要求3-4所述的单克隆抗体在体外诊断试剂盒和单克隆抗体药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种利用酶联免疫斑点测定来判断免疫动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞频率的方法。该方法包括以下步骤：采集免疫动物的外周血，经离心分离得到记忆B淋巴细胞；记忆B细胞在细胞因子IL-2和R848刺激下扩增2-5天；活化B细胞释放的抗体被ELISPOT板底聚偏二氟乙烯膜上预包被的二抗捕获；去除细胞后，被捕获的抗体与生物素标记的二抗结合（ELISPOT板1）或者生物素标记的抗原结合（ELISPOT板2），最后再与酶标记链霉亲和素结合；ELISPOT板加入底物后，PVDF膜上出现的斑点表明B淋巴细胞产生了抗体，对斑点进行计数和分析；计算ELISPOT板2和ELISPOT板1的斑点数的比值，比值越高，则动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞的频率越大，进行下一步抗体制备的成功概率也越高。进行下一步抗体制备的成功概率也越高。进行下一步抗体制备的成功概率也越高。


技术研发人员：罗昀昀 安妮塔
受保护的技术使用者：北京美德泰康生物科技有限公司 罗昀昀
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/16