一种载核酸的茶多酚自聚纳米粒及其制备方法与应用

1.本发明涉及纳米生物医药领域，具体涉及一种载核酸的茶多酚自聚纳米粒及其制备方法与应用。


背景技术：

2.基因治疗已被公认为是治疗难治性疾病的一种有前途的策略，它采用遗传材料操纵基因表达以达到治疗目的。目前，各种类型的治疗性核酸，如反义寡核苷酸、小干扰核糖核酸、信使rna、质粒dna、和crispr复合物，已被开发为基因疗法，它们通过纠正染色体的遗传缺陷，供应缺乏的成分，或抑制有害蛋白质的产生而发挥作用。由于这些核酸只在需要它们的特定细胞区间有活性，所以基因治疗的一个共同任务是开发有效的基因载体来传递外源核酸，在体内应用时应仔细考虑几个挑战。首先，核酸，尤其是核糖核酸，在体内循环时容易发生生物降解。第二，它们是高度带负电的聚合物，不能透过细胞膜的脂质双分子层。因此，一个成功的递送系统应该具有生物相容性，并且必须保护核酸不被过早降解，有效地穿过细胞膜，并传递到亚细胞的作用部位。
3.目前，基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类型。病毒载体具有高稳定性和出色的转染效率的优点，但其固有的局限性，如免疫原性、毒性和高成本，严重阻碍了其在生物医学上的广泛应用。另外，非病毒载体近年来引起了人们的极大关注，其中阳离子脂质和聚合物的研究最为广泛。这些载体可以通过静电吸引来包装核酸，保护核酸不被核酸酶降解，并能高效地转染到细胞中。然而，这些带正电的载体在循环过程中会吸附大量的血清蛋白以加速体内清除，而且其固有的毒性会引起强烈的副作用。为了避免这些限制，人们还通过将核酸共轭到纳米颗粒中来开发非正电荷载体，但这需要复杂的合成过程，而且转染效率受纳米颗粒的大小、形状和表面环境的影响很大。因此，开发简单、生物安全、高效而又经济的核酸载体仍然是基因治疗中非常需要的。
4.表没食子儿茶素没食子酸酯(以下简称egcg)，是绿茶中主要的水溶性成份，也称为茶多酚，具有抗炎、抗氧化等多重药理活性。egcg是一个两亲性化合物，既是水溶性又有脂溶的特性，因在其结构中含有多个苯环从而影响egcg水溶性。然而，egcg的稳定性较差，一些外界因素会致使其失活，包括高温、高氧、碱性环境以及金属离子的络合作用，为了提高其稳定性，保持其药理活性，一般通过egcg改性来解决了这一难题。专利cn112933241a公开了一种egcg-coptnps-apt纳米粒子，该纳米粒采用金属阳离子co和pt对egcg络合形成纳米粒子，然后在纳米粒子表面吸附修饰核酸适配体形成，该纳米粒子通过金属阳离子络合后表面带正电荷，且其组成含有多种阳离子，这都可能带来较强的人体毒性而影响其推广应用。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提出了一种载核酸的茶多酚自聚纳米粒及其制备方法与应用，将核酸药物与egcg混合后采用金属锰离子催化氧化自聚，egcg在氧化自聚过程
中有效包载核酸药物，且不会引入金属离子，离子表面带负电荷，制备方法与组成成分简单可控，适合推广应用于核酸的体内外递送及基因治疗相关疾病治疗药物的制备。
6.为了实现上述目的，本发明首先提供了一种载核酸的茶多酚自聚纳米粒，其特征在于，包括茶多酚纳米粒和核酸药物，所述茶多酚纳米粒由表没食子儿茶素没食子酸酯在弱碱性环境中通过二价金属锰离子的催化氧化自聚而成，所述茶多酚纳米粒在氧化自聚过程中以聚合的方式包载所述核酸药物，所述茶多酚纳米粒的核酸包载率高于80％。
7.其中，所述核酸药物为生物大分子的基因片段或细胞遗传物质；所述茶多酚自聚纳米粒由天然植物提取物表没食子儿茶素没食子酸酯氧化聚合形成。
8.作为优选，所述核酸药物为反义寡核苷酸(aso)、小干扰rna(sirna)、信使rna(mrna)和质粒(pdna)中的一种。
9.作为优选，所述载核酸的茶多酚自聚纳米粒为不规则椭球形，粒径为180～220nm。
10.基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种载核酸的茶多酚自聚纳米粒的制备方法，，包括以下步骤：
11.s1、将表没食子儿茶素没食子酸酯溶液和核酸药物溶液共同加入到弱碱性缓冲盐溶液中，剧烈搅拌反应；
12.s2、将二价金属锰离子溶液加入到步骤s1反应体系中，继续进行搅拌反应，离心收集沉淀得到载核酸的茶多酚自聚纳米粒。
13.作为优选，所述没食子儿茶素没食子酸酯溶液浓度范围为1～5mm。
14.作为优选，所述缓冲盐溶液为hepes缓冲液、tris缓冲液和磷酸盐缓冲液中的一种，所述缓冲液浓度为5～20mm，ph范围为7.4-8.5。
15.作为优选，所述二价金属锰离子溶液的浓度为0.5～2mm，所述表没食子儿茶素没食子酸酯与二价金属锰离子摩尔比为1:5～5:1。
16.作为优选，所述步骤s1中搅拌反应的温度为37℃，搅拌反应时间为30～60min。
17.作为优选，所述步骤s2中搅拌反应的温度为37℃，搅拌反应时间为2～3h。
18.基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种载核酸的茶多酚自聚纳米粒在制备核酸型药物中的应用。
19.本发明中的载核酸的茶多酚自聚纳米粒的制备的主要原理如图1所示，核酸药物与egcg氧化自聚前进行了充分的预混，核酸药物在egcg氧化自聚过程中以聚合的方式被包裹在egcg纳米粒中，形成载核酸的茶多酚自聚纳米粒。其中egcg氧化自聚的反应过程如下所示：
[0020][0021]
锰离子在弱碱性环境中催化egcg迅速氧化，邻苯二酚和邻苯三酚单元转化为相应的高活性半醌和醌，通过一系列醌与半醌的亲核加成反应，或者过半醌自由基的偶联反应，egcg分子实现氧化偶联聚合的连锁反应，形成一系列低聚物；随着反应推进，低聚物产生增多，逐渐聚集，并遵循最小表面能原理，通过非共价相互作用自组装形成多酚自聚纳米球。
[0022]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0023]
1、本发明提供的载核酸的茶多酚自聚纳米粒，是由egcg在弱碱性环境下由二价锰离子催化氧化自聚过程中包载和核酸药物形成，其中锰离子仅催化egcg氧化自聚，不会与egcg络合进入纳米粒子结构中，结构简单稳定，没有明显的毒副作用，生物安全性高；
[0024]
2、该在核酸自聚纳米粒对于核酸药物具有较高的包载率，通过氧化自聚形成的纳米粒子粒径在180～220nm，表面带负电荷，因此其在体内转运构成中不易吸附蛋白冠，避免在体内循环过程中被快速清除，有良好的核酸药物保护能力；
[0025]
3、该纳米粒子中的egcg不仅是可以作为核酸药物的有效载体，egcg本身在氧化自聚过程中可以保持较高的生物活性，具有光谱清除活性氧与活性氮的优异活性，egcg与包载的核酸药物在抵达病灶后可以协同抗氧化抗炎作用，可以有效的降低细胞内的氧化应激和炎症水平，可以有效的改善体内致病因素造成的高炎症状态和减低氧化应激水平；
[0026]
4、该载核酸的茶多酚自聚纳米粒同时还具有较好的肝脏靶向性，其通过核酸药物与egcg的共同作用，有效减轻动物肝脏淤血水肿程度，降低动物的肝脏细胞损伤，传递的核酸有效抑制了凋亡蛋白的表达，降低了肝细胞凋亡，肝功能损伤也能得到显著缓解，在肝脏炎症相关疾病的治疗方面功效显著。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]
图1为本发明实施例1中na@tpns的合成路线及体内外递送原理图；
[0029]
图2为本发明实施例1中na@tpns的表征图，其中图2a为na@tpns制备流程模拟图，图2b为荧光淬灭光谱图，图2c为tpns包载sirna的琼脂糖凝胶电泳半定量图，图2d为粒径分布图，图2e为pdi和ζ电位图，图2f为na@tpns的透射电镜图和元素扫描图，图2g为na@tpns的
非变性page凝胶电泳图；
[0030]
图3为本发明实施例1中na@tpns的表征图，其中图3a为tpns包载aso、sirna、mrna和pdna的琼脂糖凝胶电泳半定量图，图3b为粒径分布图，图3c为检测核酸包载方式的琼脂糖凝胶电泳半定量图；
[0031]
图4为本发明实施例2中na@tpns与阳离子脂质体dotap和聚合物pei基因递送载体的载体性能比较，其中图4a为na@tpns与na@pei和na@dotap包载不同质量核酸的粒径图，图4b为na@tpns与na@pei和na@dotap包载不同质量核酸的ζ电位图，图4c为考察na@tpns与na@pei和na@dotap蛋白质吸附量的考马斯亮蓝染色图，图4d为蛋白质吸附量的bca定量图，图4e为na@tpns与na@pei和na@dotap包载不同质量核酸的琼脂糖凝胶电泳半定量图，图4f为na@tpns与na@pei和na@dotap的细胞毒性检测图；
[0032]
图5为本发明实施例3中na@tpns的体外细胞核酸递送图，其中图5a为na@tpns递送不同核酸的荧光图像，图5b、5c、5d和5e为na@tpns递送不同核酸的流式细胞术定量图，图5f和5g为na@tpns递送核酸后在细胞内执行功能的western-blot和qrt-pcr检测图；
[0033]
图6为本发明实施例4中na@tpns的为本发明实施例1中na@tpns的抗炎抗氧化生物活性功能的检测图，其中图6a为na@tpns的抗氧化活性的荧光图像，图6b、6c、6d和6e为na@tpns的抗氧化活性的流式细胞术定量分析图，图6f为na@tpns的抗炎活性的qrt-pcr的检测结果，图6g为na@tpns的抗炎活性的western-blot的检测结果；
[0034]
图7为本发明实施例5中na@tpns的体内核酸递送及疾病治疗效果考察，其中图7a和7b为na@tpns体内递送器官靶向小动物荧光成像图及荧光定量图，图7c为动物实验流程图，图7d为不同干预组动物生存率，图7e和7f不同干预组动物肝脏质量图像及定量和特征性肝脏图像，图7g和7h为动物血生化肝功能检测图，图7i为不同干预组动物肝脏h&e染色图，图7j为不同干预组动物tunel染色和免疫荧光图像；
[0035]
图8为本发明实施例6中na@tpns在体内的抗氧化抗炎内外生物活性考察，其中图8a和8b为动物血液和肝组织氧化指标h2o2水平检测结果，图8c和8d为动物血液和肝组织氧化指标mda水平检测结果，图8e为动物肝组织氧化指标蛋白质羰基含量检测结果，图8f、g和h为动物血液和肝组织中炎症因子水平检测结果；
[0036]
图9为本发明实施例7中na@tpns在体外的生物安全性考察，其中图9a为细胞毒性实验结果，图9b为不同处理组活死细胞染色荧光图像；
[0037]
图10为本发明实施例7中na@tpns在体内的生物安全性考察，其中图10a为na@tpns的溶血试验，图10b为不同干预组动物心脏，肾脏和肺的h&e染色图像，图10c为不同干预组动物肾功能血生化检测结果。
具体实施方式
[0038]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0039]
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
[0040]
本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
[0041]
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
[0042]
实施例1
[0043]
制备载核酸的茶多酚自聚纳米粒na@tpns
[0044]
(1)在ph 8.0的hepes缓冲液中，加入egcg溶液预搅拌5min，随后缓慢滴加mncl2溶液，在37℃恒温的条件下剧烈搅拌1h(各组分的最终浓度分别为，hepes 10mm；egcg 2.5mm；mncl22 mm)。取最终反应液，16000rpm离心5min收集管底得到egcg纳米粒tpns。
[0045]
(2)na@tpns的制备是在预搅拌前将所需核酸药物(aso、sirna、mrna和pdna等)与egcg溶液同时投入到hepes缓冲液中，延长预搅拌时间至30min，反应时间延长至2h，其余制备流程保持不变。取最终反应液，16000rpm离心5min收集管底沉淀得到na@tpns。
[0046]
图1为na@tpns的合成路线以及体内外递送原理图。
[0047]
图2为na@tpns的表征图，其中图2a为na@tpns制备流程模拟图，图2b为sirna@tpns荧光淬灭光谱图，图2c为tpns包载sirna的琼脂糖凝胶电泳半定量图，图2d为sirna@tpns粒径分布图，图2e为sirna@tpns粒子的pdi和ζ电位图，图2f为sirna@tpns的透射电镜图和元素扫描图，图2g为sirna@tpns的非变性page凝胶电泳图。图2结果显示：tpns可以有效地包载sirna，具有较高的sirna包载量。na@tpns外观为不规则椭球形，粒径在200nm左右，元素扫描出现特征p元素，sirna@tpns成功包载核酸药物sirna，粒子表面呈负电性，具有良好的sirna保护能力。
[0048]
图3为na@tpns的表征图，其中图3a为tpns包载aso、sirna、mrna和pdna的琼脂糖凝胶电泳半定量图，图3b为粒径分布图，图3c为检测核酸包载方式的琼脂糖凝胶电泳半定量图。图3结果显示，tpns可以包载aso、tpns、mrna以及pdna在内的多种类型的核酸，tpns以聚合的方式包载核酸。
[0049]
实验例2
[0050]
考察实施例1中na@tpns与阳离子脂质体dotap和聚合物pei基因递送载体的载体性能：
[0051]
(1)制备2mg/ml聚乙烯亚胺(pei)的无酶水溶液，将适量的pei与sirna在1ml hepes缓冲液(ph 7.4 10mm)中在室温下搅拌30分钟，然后在16000rpm下离心15分钟，得到na@pei纳米颗粒。
[0052]
(2)将阳离子脂质体dotap溶解在氯仿中，然后在真空旋转蒸发器中蒸发，得到一个半透明的薄膜。然后通过超声处理使该薄膜水化，得到浓度为2毫克/毫升的dotap脂质体。与fam-sirna在室温下孵育30分钟后，在16000rpm下离心15分钟，得到na@dotap纳米颗粒。
[0053]
图4为na@tpns与阳离子脂质体dotap和聚合物pei基因递送载体的载体性能比较图，其中图4a为na@tpns与na@pei和na@dotap包载不同质量核酸的粒径图，图4b为na@tpns与na@pei和na@dotap包载不同质量核酸的ζ电位图，图4c为考察na@tpns与na@pei和na@dotap蛋白质吸附量的考马斯亮蓝染色图，图4d为蛋白质吸附量的bca定量图，图4e为na@tpns与na@pei和na@dotap包载不同质量核酸的琼脂糖凝胶电泳半定量图，图4f为na@tpns与na@pei和na@dotap的细胞毒性检测图。图4结果显示，与na@pei和na@dotap相比，核酸包载量略低，只有na@tpns的ζ电位为负，粒径较小，粒子吸附的蛋白冠较少，具有更高的生物
安全性，而阳离子脂质体或者聚乙烯亚胺作为载体制得的核酸载体粒子电位均为正，容易吸附血清蛋白从而造成粒子的解离。
[0054]
实施例3
[0055]
考察实施例1中na@tpns的体外核酸递送：
[0056]
(1)raw 264.7细胞以104个/每孔铺于12板，置于培养箱培养。按实施例1中制备na@tpns。待24h细胞完全贴壁，弃掉上清液，使用搭载不同核酸的nps处理细胞，各核酸转染浓度分别为fam-sirna(0.5μm)，fam-aso(0.5μm)，mrna(2μg/ml)，pdna(2μg/ml)。fam-sirna/fam-aso@tpns nps处理组孵育时间为12h，mrna/pdna@tpns nps处理组孵育时间为24h。孵育结束后，弃去上清液，1
×
pbs清洗2次，细胞使用4％多聚甲醛固定10min，pbs清洗2次，使用1
×
dapi核染料染色5min，pbs继续清洗2次。随后在荧光显微镜下观察细胞摄取情况并拍摄荧光图片。使用western-blot实验和qrt-pcr实验验证na@tpns递送的核酸在细胞内发挥功能。
[0057]
(2)细胞摄取定量分析raw 264.7细胞以104个/每孔铺于24孔板，设置blank组、对应的游离核酸组以及载体递送组。按上述步骤(1)处理细胞。nps孵育的核酸浓度和时间分别为fam-sirna(0.5μm，2/4/8h)，fam-aso(0.5μm，2/4/8h)，mrna(2μg/ml，24/36/48h)，pdna(2μg/ml，24/36/48h)。孵育结束，pbs清洗3次后使用巴氏管将细胞吹下，离心后重悬至300μl pbs中。使用流式细胞仪上机检测fitc-a荧光强度。
[0058]
图5为na@tpns的体外核酸递送考察，其中图5a为na@tpns递送不同核酸的荧光图像，图5b、5c、5d和5e为na@tpns递送不同核酸的流式细胞术定量图，图5f和5g为na@tpns递送核酸后在细胞内执行功能的western-blot和qrt-pcr检测图。图5结果显示，na@tpns可以有效地将核酸递送进细胞，且经tpns递送的核酸可执行有效的生物学功能。
[0059]
实施例4
[0060]
考察na@tpns的抗氧化抗炎的内在生物活性：
[0061]
(1)考察na@tpns的抗氧化活性，raw 264.7细胞以104个/每孔铺于12孔板，置于培养箱培养，设置blank组，lps组，lps+tpns组，lps+sirna@tpns组。期间制备tpns，sirna@tpns。待12h细胞完全贴壁，弃掉上清液，使用含lps完全培养基(10μg/ml)处理细胞。24h后弃掉上清并使用pbs清洗两次。接着使用不同分组的nps处理细胞24h，孵育结束后，弃去上清液，1
×
pbs清洗2次。使用不同的ros探针工作液孵育细胞。2,7-二氯荧光黄双乙酸(dcfh-da)用于检测h2o2，10μm，30min；羟苯基荧光素(hpf)用于检测羟自由基过氧亚硝酸根离子(
·
oh/onoo-)，20μm，45min；二氢乙锭(dhe)用于检测超氧阴离子(
·o2-)，5μm，30min；no荧光探针(daf-fm-da)用于检测一氧化氮自由基(nitric oxide species，
·
no)，10μm，30min。孵育结束后用pbs清洗2次，在荧光显微镜下观察各组细胞荧光并成像。同时使用流式细胞仪检测不同组荧光强度进行定量分析。
[0062]
(2)使用western-blot和qrt-pcr实验检测tpns是否可以在体外有效抑制炎症因子相关基因的转录。一抗比例分别为β-actin(1:5000)、tnf-α(1:500)、il-1β(1:1000)、il-6(1:500)。
[0063]
图6为na@tpns的抗氧化抗炎的内在生物活性考察，其中图6a为na@tpns的抗氧化活性的荧光图像，图6b、6c、6d和6e为na@tpns的抗氧化活性的流式细胞术定量分析图，图6f为na@tpns的抗炎活性的qrt-pcr的检测结果，图6g为na@tpns的抗炎活性的western-blot
的检测结果。图6结果显示，na@tpns具有显著的抗氧化抗炎的内在生物活性，可以有效的降低细胞内的氧化应激和炎症水平。
[0064]
实施例5
[0065]
考察na@tpns的体内核酸递送及疾病治疗效果：
[0066]
(1)nps体内分布考察：8周龄balb/c小鼠分为3组，pbs组、游离cy5.5-sirna组以及cy5.5-sirna@tpns组。尾静脉给药，浓度以核酸量计算为1mg/kg(tpns量为12.5mg/kg)，注射量为50μl/只。给药24h后，取小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)置于小动物成像仪中，拍摄荧光图像。
[0067]
(2)动物模型构建及生存率考察：8周龄balb/c小鼠分为4组，blank组、刀豆蛋白a(cona)组、con a+tpns组以及con a+sicaspase-3@tpns组，分别标记为g1～g4组。按照实施例1中制备纳米粒，核酸投料浓度为4μm。小鼠造模前给药，给药浓度为tpns 12mg/kg，sicaspase-3 1mg/kg。给药36h后，con a以20mg/kg尾静脉注射造模，期间正常饮食，观察并记录各组小鼠48h内的死亡情况。
[0068]
(3)运用tunel染色考察na@tpns体内核酸递送情况：
①
脱蜡，将石蜡切片放入烤箱中，65℃，2h软化蜡质。接着将切片放入不同浓度梯度的二甲苯中脱蜡15min。使用无水乙醇洗脱二甲苯，5min，重复一次。
②
水化，使用95％，85％及75％乙醇水化5min，放入蒸馏水中备用。
③
通透，蛋白酶k修复：滴加100μl蛋白酶k工作液，37℃反应15～20min；接着使用0.1％triton x-100pbs孵育5min，室温。pbs浸洗3次，5min。
④
封闭，3％h2o
2-甲醇溶液封闭10min，室温。pbs浸洗3次，5min。
⑤
荧光反应，每个样品滴加50μl tunel混合反应液，湿盒中37℃避光反应60min；pbs浸洗3次，5min。每个样品滴加50μl dapi，染色3min。在组织切片的中央滴加适量抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片。
[0069]
(4)运用免疫荧光考察na@tpns体内核酸递送情况：
①
脱蜡，将石蜡切片放入烤箱中，65℃，10min软化蜡质。结束后，将切片依次浸入不同浓度梯度的二甲苯中脱蜡，各5min。再依次浸入无水乙醇、90％酒精、80％酒精和70％酒精缸中，各浸泡5min。结束后，使用自来水浸洗三次(请勿直接冲洗切片)，去掉酒精。
②
高压修复抗原，微波盒中装满edta修复液，中高火加热1min至沸腾。同时将高压锅中的自来水加热至沸腾。将切片置于沸腾状态的修复液内，在高压锅中高压加热8分钟。结束后取出，冷却至室温，放入pbs缓冲液于摇床上浸洗3次。接着，将切片甩干后用组化笔在组织周围画圈，滴加bsa，封闭30min。
③
免疫反应，封闭结束后，将切片甩干(注意保持组织湿润)，在组织上滴加一抗，应完全覆盖组织。置于湿盒中，4℃冰箱孵育过夜。12h后，将切片放入37℃恒温箱中复温。pbs浸洗3次(5min/次)后甩干，滴加二抗，37℃烤箱孵育50min。孵育结束，弃去二抗，pbs浸洗3次。加dapi染液，避光室温孵育10min。玻片置于pbs中在脱色摇床上洗涤3次。加自发荧光淬灭剂b液5min，流水冲洗10min。
④
封片，抗荧光淬灭封片剂封片。图像采集。
[0070]
(5)运用h&e染色考察na@tpns体内疾病治疗效果：
①
脱蜡，将切片放入烘箱中，65℃加热2h，软化蜡质。接着依次将切片放入不同浓度二甲苯中脱蜡10min。再将切片放入100％乙醇中洗去二甲苯，重复一次。再依次放入95％乙醇，85％乙醇及75％乙醇中，水化5min。最后置入蒸馏水中备用。
②
染色，苏木素染色10min；使用自来水浸洗2min；1％酸酒精分化2s；自来水浸洗切片10min，重复一次。蒸馏水过洗2s。伊红染色10min。
③
分化，根据染色深浅依次使用80％、85％、95％及无水乙醇脱水5min。
④
透明，依次使用二甲苯ⅰ，二甲苯
ⅱ
浸泡10min。
⑤
封片，在石蜡切片中央滴加中性树胶，盖玻片封片。
[0071]
(6)运用血生化检测考察na@tpns体内疾病治疗效果：谷丙转氨酶检测(alt)，样品孔中加入20μl基质液(提前37℃预温)，接着每孔加入5μl待测血样，于37℃恒温箱中反应30min，注意避免气泡。结束后每孔加入20μl 2,4—二硝基甲苯，于37℃恒温箱中反应20min。随后加入200μl 0.4mol/lnaoh2溶液，轻轻混匀，室温放置15min，测定510nm处od值，根据标准曲线求得相应的alt/gpt活力值；谷草转氨酶检测(ast)，根据试剂盒要求，样品孔加入20μl提前温育的基质液，再加入5μl待测血样混匀，避免气泡，37℃反应30min。接着加入20μl 2,4—二硝基苯肼，反复吹打混匀，37℃孵育20min。结束后，加入0.4mol/l naoh溶液，轻轻混匀，室温放置15min，测定510nm处od值，根据标准曲线求得相应的ast/got活力值，标准曲线为：y＝0.01907215+303.10147*x-2060.8957*(x
2.5
)+14023.06*(33)。24.4210卡门氏单位＝11.7709u
·
l-1。
[0072]
图7为na@tpns的体内核酸递送及疾病治疗效果考察，其中图7a和b为na@tpns体内递送器官靶向小动物荧光成像图及荧光定量图，图7c为动物实验流程图，图7d为不同干预组动物生存率，图7e和f不同干预组动物肝脏质量图像及定量和特征性肝脏图像，图7g和h为动物血生化肝功能检测图，图7i为不同干预组动物肝脏h&e染色图，图7j为不同干预组动物tunel染色和免疫荧光图像。图7结果显示，na@tpns具有肝脏靶向性，na@tpns治疗后可以有效提高动物生存率(提高了4倍)，减轻动物肝脏淤血水肿程度，降低动物的肝脏细胞损伤，传递的核酸有效的抑制了凋亡蛋白的表达，降低了肝细胞凋亡，肝功能损伤也得到了显著的缓解，表明na@tpns有效的在体内传递了治疗性核酸，在疾病治疗方面功效显著。
[0073]
实施例6
[0074]
考察na@tpns在体内的抗氧化抗炎内外生物活性：
[0075]
按照实施例5中构建g1～g4四组动物模型，空白组g1，pbs处理组(阴性对照组)；g2，con a处理组(疾病模型组、阳性对照组)；g3，con a+tpns治疗干预组；g4，con a+na@tpns治疗干预组，按以下方法分别检测各组样品对应在体内抗氧化抗炎内外生物活性：
[0076]
(1)体内抗氧化检测-h2o2检测。样品制备，组织样品按照5-10mg组织加入100-200μl裂解液进行匀浆。12000rpm 4℃离心5min，取上清液于4℃暂存。血液样品需要使用ph 6.0的50mm磷酸缓冲液将样品稀释50倍。标准品按说明将储备液稀释至1、2、5、10、20、50、100μmol/l。检测时每孔加入50μl待测样品或者标准品，接着再加入100μl h2o2检测试剂，轻轻震荡混匀，室温(25℃左右)下孵育30min。立即测定a560，根据标准曲线计算样品中的h2o2浓度。
[0077]
(2)体内抗氧化检测-脂质氧化检测(mda，丙二醛)。样品制备，组织样品加入1
×
pbs(肝组织重量约占匀浆液10％)，组织裂解后以10000rpm离心10min取上清用于后续测定。血液样品制备后可直接用于检测。设置空白对照组，标准品组及样品组。空白对照组加入0.1ml匀浆液，标准品组加入不同浓度(1、2、5、10、20、50、100μm)标准品0.1ml，样品组加入0.1ml血液样品或者组织样品。随后加入0.2ml mda检测工作液。混匀后，100℃加热15min。加热时ep管盖刺一小孔，防止爆开。结束后水浴冷却至室温，1000rpm离心10min。取200μl加入96孔板中在酶标仪中测定532nm处od值。根据标准曲线计算样品中的mda浓度。血液样品可直接通过标准曲线计算，组织样品需进一步通过组织重量换算。
[0078]
(3)体内抗氧化检测-蛋白质羰基含量检测样品制备，称取约100mg肝组织样品，加
入1ml样品提取液，匀浆后以5000rpm，4℃下离心10min取上清液于4℃暂存。按照说明书要求测量蛋白质羰基含量
[0079]
(4)体内抗炎检测-血液样品，设置空白孔(不加样品及酶标试剂)，标准品及样品孔。标准品孔各加不同浓度的标准品50μl，样品孔依次加入10μl待测血样及40μl样品稀释液,混匀，注意避免气泡。随后，每孔加入酶标试剂100μl，密封后于37℃孵育1h。结束后弃去孔中液体，甩干，孔中注满1
×
洗涤液，静置30s后弃去，重复洗涤5次后，在滤纸上排干。每孔依次加入显色剂a 50μl，显色剂b 50μl，震荡混匀，密封后在37℃孵育15min。每孔添加终止液50μl终止反应。测量每孔在450nm波长处od值，空白孔调零；体内抗炎检测-组织样品，样品制备，每组小鼠，分别切取50-100mg肝脏组织，置入2ml ep管，加入1ml pbs裂解液，12000rpm离心10min后取上清液200μl。检测方法同血液样品。
[0080]
图8为na@tpns在体内的抗氧化抗炎内外生物活性考察，其中图8a和b为动物血液和肝组织氧化指标h2o2水平检测结果，图8c和d为动物血液和肝组织氧化指标mda水平检测结果，图8e为动物肝组织氧化指标蛋白质羰基含量检测结果，图8f、g和h为动物血液和肝组织中炎症因子水平检测结果。图8结果显示，na@tpns在体内表现出良好的抗氧化抗炎活性，可以有效的改善体内致病因素造成的高炎症状态和减低氧化应激水平。
[0081]
实施例7
[0082]
考察na@tpns在体内外的生物安全性：
[0083]
按照实施例5中构建g1～g4四组动物模型，空白组g1，pbs处理组(阴性对照组)；g2，con a处理组(疾病模型组、阳性对照组)；g3，con a+tpns治疗干预组；g4，con a+na@tpns治疗干预组。
[0084]
(1)tpns、sirna@tpns样品制备，按实施例1中方法制备tpns，sirna@tpns。离心，浓缩10倍。暂存于4℃冰箱。raw 264.7细胞以104个/每孔铺于96孔板，置于培养箱培养12h。使用完全培养基将样品稀释至0、5、10、20、50、100、200、500nm(按核酸转染浓度计算)。弃去培养基，样品组每组设定6个复孔，每孔加入100μl已稀释的样品，37℃孵育24h。mtt储备液使用完全培养基稀释至工作浓度，每孔加入100μl孵育4h。完全弃去工作液，每孔加入150μl dmso溶液，于恒温震荡箱中震荡10min。酶标仪检测每孔在570nm处的od值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(实验组od值-调零组od均值)/(空白组od值-调零组od均值)
×
100％。
[0085]
(2)活死细胞试剂盒(calcein/pi细胞活性与细胞毒性检测试剂盒)用于检测nps的细胞毒性。每孔105个细胞铺于12孔板中，设置blank组，tpns处理组，sirna@tpns处理组，置入培养箱培养使其贴壁。12h后分别加以不同的处理，继续培养24h。弃去培养基，1
×
pbs清洗两次，吸净残留的pbs缓冲液。每孔加入500μl现配置的calcein am/pi 1
×
探针检测液完全覆盖所有细胞。37℃避光孵育45min。孵育结束后，去除并洗净多余检测液，在荧光显微镜下观察细胞荧光。
[0086]
(3)取8周龄balb/c小鼠眼眶血1ml。血液存于抗凝管中，1000rpm，5min离心，生理盐水多次清洗至上清液无明显颜色。弃掉上清后加入9倍体积的生理盐水配置成10％红细胞悬液，同理继续稀释配置2％红细胞悬液备用。设置blank组及不同浓度(以tpns浓度计算，10、20、40、80、160、320μg/ml)的nps(tpns，sirna@tpns)处理组，3h后观察各组细胞悬液状态(无溶血、部分溶血、全溶血、凝集)，并测定每组上清液在541(415或576)nm处吸光度进
行定量。
[0087]
(4)血生化检测-尿素氮检测(bun)设置空白管(dd h2o)，标准品管(10mm bun标准应用液)及样品管，每管加入4μl。接着加入50μl缓冲酶液，混匀，于37℃水浴10min。随后依次加入200μl酚显色剂和碱性次氯酸钠，充分混匀后37℃水浴10min，测定640nm处od值。计算公式为：bun(mmol/l)＝(a
测定-a
空白
)/(a
标准-a
空白
)
×c标准
。
[0088]
血生化检测-血肌酐检测(cre)设置空白孔(dd h2o)，标准品孔(442μmol/l)及样品孔。每孔加入6μl。接着加入180μl酶溶液a，37℃孵育5min，546nm处测定od值a；再加入60μl酶溶液b，37℃孵育5min，546nm处测定od值b。计算公式为：cre(μmol/l)＝(δa
测定-δa
空白
)/(δa
标准-δa
空白
)
×c标准
。
[0089]
图9为na@tpns在体外的生物安全性(细胞毒性)考察，其中图9a为细胞毒性实验结果，图9b为不同处理组活死细胞染色荧光图像。图9结果显示，在体外，na@tpns具有较低的细胞毒性，在一定范围内对细胞的生存率影响极低。
[0090]
图10为na@tpns在体内的生物安全性考察，其中图10a为na@tpns的溶血试验，图10b为不同干预组动物心脏，肾脏和肺的h&e染色图像，图10c为不同干预组动物肾功能血生化检测结果。图10的结果显示，在体内，na@tpns具有极低的细胞毒性，不引起血液溶血，对动物的肾脏功能没有损害，以及从病理学角度分析各脏器组织认为na@tpns不对重要脏器产生毒性反应，不增加脏器负荷。
[0091]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种载核酸的茶多酚自聚纳米粒，其特征在于，包括茶多酚纳米粒和核酸药物，所述茶多酚纳米粒由表没食子儿茶素没食子酸酯在弱碱性环境中通过二价金属锰离子的催化氧化自聚而成，所述茶多酚纳米粒在氧化自聚过程中以聚合的方式包载所述核酸药物，所述茶多酚纳米粒的核酸包载率高于80％。2.根据权利要求1所述载核酸的茶多酚自聚纳米粒，其特征在于，所述核酸药物为反义寡核苷酸、小干扰rna、信使rna和质粒中的一种。3.根据权利要求1所述载核酸的茶多酚自聚纳米粒，其特征在于，所述载核酸的茶多酚自聚纳米粒为不规则椭球形，粒径为180～220nm。4.一种如权利要求1～3任一项所述载核酸的茶多酚自聚纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将表没食子儿茶素没食子酸酯溶液和核酸药物溶液共同加入到弱碱性缓冲盐溶液中，剧烈搅拌反应；s2、将二价金属锰离子溶液加入到步骤s1反应体系中，继续进行搅拌反应，离心收集沉淀得到载核酸的茶多酚自聚纳米粒。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述没食子儿茶素没食子酸酯溶液浓度范围为1～5mm。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲盐溶液为hepes缓冲液、tris缓冲液和磷酸盐缓冲液中的一种，所述缓冲液浓度为5～20mm，ph范围为7.4-8.5。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述二价金属锰离子溶液的浓度为0.5～2mm，所述表没食子儿茶素没食子酸酯与二价金属锰离子摩尔比为1:5～5:1。8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中搅拌反应的温度为37℃，搅拌反应时间为30～60min。9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中搅拌反应的温度为37℃，搅拌反应时间为2～3h。10.一种如权利要求1～3任一项所述载核酸的茶多酚自聚纳米粒或者如权利要求4～9任一项制备方法制得的载核酸的茶多酚自聚纳米粒在制备核酸型药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种载核酸的茶多酚自聚纳米粒，包括茶多酚纳米粒和核酸药物，茶多酚纳米粒由表没食子儿茶素没食子酸酯在弱碱性环境中通过二价金属锰离子的催化氧化自聚而成，茶多酚纳米粒在氧化自聚过程中以聚合的方式包载核酸药物，茶多酚纳米粒的核酸包载率高于80％。其制备方法简单，将表没食子儿茶素没食子酸酯与核酸共同溶于弱碱性的缓冲液中，加入二价锰离子催化氧化自聚即可制得。该纳米粒表面带负电荷，其在体内转运构成中不易吸附蛋白冠，避免在体内循环过程中被快速清除，有良好的核酸药物保护能力，转染入胞后可成功释放核酸并发挥生物学功能可以有效的降低细胞内的氧化应激和炎症水平，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：周文虎 陈浩 郭丽娜
受保护的技术使用者：中南大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/16