一种基于磁性DQTP共固定化酶和吸附脱芳制备高F值乳清肽的方法与流程

一种基于磁性dqtp共固定化酶和吸附脱芳制备高f值乳清肽的方法
技术领域
1.本发明涉及一种高f值乳清肽的制备方法，具体是一种基于磁性dqtp共固定化酶和吸附脱芳制备高f值乳清肽的方法，属于特医食品领域。


背景技术：

2.高f值寡肽是指支链氨基酸(bcaa，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)与芳香族氨基酸(aaa，包括酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)物质的量比值f大于20，且由2～9个氨基酸组成的蛋白质前体物或水解物。上世纪70年代，德国医学博士fisher等人发现肝病病人血液中的f值在1.0左右或更低，远低于正常人的3.0。而高f值寡肽因其独特的氨基酸组成而具有多种生理活性，如保肝护肝、抗疲劳、解醉酒、治疗苯丙酮尿症等。
3.目前，高f值寡肽主要通过蛋白酶解和芳香族氨基酸的脱除两大步骤制备。蛋白酶水解条件温和，酶解位点可控，特异性强，但商业酶制剂为游离酶，状态多为可溶性粉末或液体，在实际应用中难以回收利用，且游离酶受环境影响较大，因此常受制于复杂环境下的大规模工业生产，同时也导致酶水解成为实际生产中成本较高的环节之一。因此，固定化酶因其稳定性高、可多次重复利用、可保持理想的酶活力而受到研究者的关注。合适的固定化酶可有效降低生产成本，节约资源。芳香族氨基酸的脱除常采用吸附法，该领域传统的吸附剂有活性炭、大孔吸附树脂等，然而它们的非特异性吸附较强，易造成营养成分的浪费。此外，蛋白深度水解后的寡肽产物易产生苦味，较高的游离氨基酸占比也易导致人体摄入后腹泻，因此有必要控制蛋白的水解度。发明专利申请号cn 108642113 a，发明名称为“一种高效且稳定制备高f值玉米寡肽的方法”，该方法通过两步酶解法水解玉米粗肽，采用的脱芳吸附剂为活性炭，非特异性吸附较强，易造成体系中营养成分的浪费。发明申请号为cn 108893515 a，发明名称为“高f值寡肽及其制备方法”，该方法以α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶a两步水解酵母抽提液，结合活性炭吸附得到了f值为30～40的高f值酵母寡肽，该方法使用游离双酶，难以回收利用，成本较高。
4.现有制备高f值肽的方法主要有以下不足：一、使用的酶是商业化游离酶，价格昂贵，游离酶难以从反应体系中分离，经济效益不高；二、部分固定化方法载体稳定性不足，使用中可能导致金属元素溶出等问题；三、吸附剂特异性不足，易导致除芳香族氨基酸外的有益成分被从体系中脱除，造成浪费。
5.提高酶的利用效率、充分游离和特异性脱除芳香族氨基酸是生产高f值肽过程中的关键问题，也是目前酶工程和食物蛋白质控制酶解技术中的研究难点。本发明要解决的技术问题是提供一种低成本、高效率、工艺简单的方法，以制备高f值乳清肽，解决特殊人群营养问题。


技术实现要素：

6.技术方案：
7.本发明的第一个目的是，提供一种基于磁性dqtp共固定化酶和吸附脱芳制备高f值乳清肽的方法，所述方法使用磁性dqtp作为共固定化内肽酶和外肽酶的载体以及芳香族氨基酸的吸附剂，制备高f值乳清肽，具体包括以下步骤：
8.s1、以磁性dqtp作为载体共固定化内肽酶和外肽酶，得到磁性dqtp共固定化酶；
9.s2、乳清蛋白溶液使用所述磁性dqtp共固定化酶进行酶水解，获取酶解液；
10.s3、以磁性dqtp作为吸附剂，吸附脱除所述酶解液中游离的芳香族氨基酸和含有芳香族氨基酸的寡肽，得高f值乳清肽。
11.本发明使用磁性dqtp作为载体共固定化内肽酶和外肽酶，对经加热、剪切均质预处理的乳清蛋白溶液进行酶解，获得酶解液；以未固定酶的磁性dqtp作为吸附剂，吸附脱除酶解液中游离的芳香族氨基酸，经磁分离可得到高f值乳清肽溶液；可选地进一步反渗透浓缩、冷冻干燥后得到高f值乳清肽粉。
12.可选的，在一种实施方式中，步骤s1中，所述内肽酶包括α-糜蛋白酶，所述外肽酶包括羧肽酶a，其中，所述内肽酶与磁性dqtp的质量比为1:2～1:50，所述外肽酶与磁性dqtp质量比为1:8～1:30。
13.可选的，在一种实施方式中，步骤s1中，所述磁性dqtp共固定化酶的制备方法包括：磁性dqtp用交联剂在室温下活化1～3h，加入内肽酶和外肽酶，在4～25℃的旋转摇床上孵育4～12h，得到固定有内肽酶和外肽酶的磁性dqtp共固定化酶。
14.进一步可选的，在一种实施方式中，所述交联剂为1％～7％的戊二醛溶液。
15.优选的，所述的两种蛋白酶分别为可特异性识别芳香族氨基酸所形成肽键的内肽酶和外肽酶，内肽酶包括但不限于α-糜蛋白酶，外肽酶包括但不限于羧肽酶a，共固定化酶的条件为，将磁性dqtp用1％～7％戊二醛在室温下活化1～3h，α-糜蛋白酶与磁性dqtp质量比为1:2～1:10，羧肽酶a与磁性dqtp质量比为1:10～1:20，在4℃～25℃的旋转摇床上孵育4～12h；更优选的戊二醛浓度为5％，活化时间1.5h，α-糜蛋白酶与磁性dqtp质量比为1:5，羧肽酶a与磁性dqtp质量比为1:20，摇床孵育温度为4℃，时间为12h。
16.可选的，在一种实施方式中，步骤s1、s3中，所述磁性dqtp的制备方法包括：将fe3o4磁性材料、2,6-二氨基蒽醌和1,3,5-三醛基间苯三酚超声分散在溶剂中，加入催化剂，混匀后转移至高压反应釜中，在90～120℃下反应24～72h，得到固体颗粒，用磁铁分离后洗涤，在40～80℃真空干燥12～24h，得到以磁性材料为核、以dqtp为壳的磁性dqtp。
17.进一步可选的，在一种实施方式中，所述fe3o4磁性材料、2,6-二氨基蒽醌和1,3,5-三醛基间苯三酚的摩尔比为(35～55):(12～16):10，优选的摩尔比为86:28:19。
18.进一步可选的，在一种实施方式中，所述溶剂为1,4-二氧六环或n,n-二甲基乙酰胺，优选的溶剂为1,4-二氧六环。
19.进一步可选的，在一种实施方式中，所述催化剂为3～8mol/l的乙酸溶液，更优选的催化剂为6mol/l的乙酸。
20.进一步可选的，在一种实施方式中，所述催化剂与溶剂体积比为1:15～1:30，优选的催化剂与溶剂体积比为1:20。
21.进一步可选的，在一种实施方式中，所述反应容器为含聚四氟乙烯内衬的反应釜，反应温度为90～120℃，时间24～72h；更优选的反应温度为120℃，时间48h。
22.进一步可选的，在一种实施方式中，所述洗涤过程具体包括用1,4-二氧六环、去离
子水、乙醇和甲醇(或丙酮、四氢呋喃)各洗至少3次，之后在索氏提取器中用四氢呋喃或丙酮提取洗涤24～48h。
23.优选的，反应完成的磁性dqtp需经过1,4-二氧六环、乙醇、水、丙酮、四氢呋喃或甲醇分别洗涤至少3次，直至磁分离后上清液澄清无色透明为止，随后在索氏提取器中用丙酮提取洗涤24h，干燥条件为40～80℃下干燥24～48h，更优选的干燥条件为60℃，48h。
24.可选的，在一种实施方式中，步骤s2中，所述的磁性dqtp共固定化酶的用量为500～3000u/g蛋白质等同物。
25.可选的，在一种实施方式中，步骤s2中，酶水解条件为ph 7.5～8.5，温度35～50℃，时间2～7h。
26.可选的，在一种实施方式中，步骤s2中，所述乳清蛋白液的浓度为3～36g/l，优选的浓度为24～32g/l。
27.可选的，在一种实施方式中，步骤s2中，所述乳清蛋白溶液在进行酶水解前进行预处理，所述预处理包括热处理，所述热处理条件为：60～100℃，10～15min，优选的热处理条件为：沸水浴，10～15min。
28.可选的，在一种实施方式中，所述预处理还包括超声处理，所述超声处理的条件为频率20～50khz，功率50～100w，时间20～50min；更优选的超声率为40khz，功率70w，时间40min。
29.可选的，在一种实施方式中，所述预处理还包括剪切均质处理，所述剪切均质处理的条件为5000～30000r/min，1～5min，进一步优选为2～3min；更优选的剪切均质处理的条件为11000r/min，1～3min，进一步优选为2～3min。
30.可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，所述磁性dqtp的添加量为所述酶解液的20～40wt.％，进一步优选为添加量为上清液质量的40wt.％。此处酶解液指的是去除磁性dqtp共固定化酶并进行分离后的上清液。
31.可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，吸附条件为：ph 4.0～7.0，进一步优选的吸附条件为：ph 5.0～6.0，更进一步优选的吸附条件为：ph 5.0。
32.可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，吸附条件为：温度25～35℃，时间12～24h；进一步优选的吸附条件为：温度为25℃，时间24h。
33.可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，经磁性dqtp吸附后，得高f值乳清肽液，再经浓缩、干燥得到高f值乳清肽粉；优选的，所述干燥包括冷冻干燥或喷雾干燥。
34.可选的，在一种实施方式中，所述浓缩是利用反渗透膜进行浓缩，浓缩液固形物含量为10～15％。
35.可选的，在一种实施方式中，磁性dqtp对芳香族氨基酸的脱除率可达70％。
36.本发明的第二个目的是，提供一种高f值乳清肽，根据以上所述的方法制备得到。
37.可选的，在一种实施方式中，所述乳清肽的f值大于22。
38.可选的，在一种实施方式中，所述乳清肽的f值为22～30，如22、23、24、25、26、27、28、29、30等。在一种示例中，所述乳清肽的f值达26.07。
39.可选的，在一种实施方式中，所述乳清肽的支链氨基酸保留率达80％以上，在一种示例中，所述乳清肽的支链氨基酸保留率达82.02％。
40.可选的，在一种实施方式中，所述乳清肽包含80％以上的分子量大于300的多肽，
优选的，所述乳清肽包含80％～90％分子量大于1000的多肽。
41.可选的，在一种实施方式中，所述乳清肽包含80％～85％的分子量为1000～2000的多肽。
42.可选的，在一种实施方式中，所制备的固定化酶在回收使用4次后，aaa游离率可保持在80％以上。
43.本发明的第三个目的是，提供所述的高f值乳清肽的用途，用于制备配方食品或药品，所述配方食品包括特殊医学用途配方食品。
44.本发明的第四个目的是，提供一种磁性共固定化酶，所述磁性共固定化酶包括磁性dqtp和被固定的蛋白酶，所述磁性dqtp为核-壳结构的磁性纳米粒子，所述核包括但不限于fe3o4、fe2o3在内的磁性材料，所述壳为有机聚合物dqtp，所述被固定的蛋白酶包括内肽酶和/或外肽酶，所述内肽酶包括α-糜蛋白酶，所述外肽酶包括羧肽酶a。
45.可选的，在一种实施方式中，所述壳为以2,6-二氨基蒽醌和1,3,5-三醛基间苯三酚为单体合成的有机聚合物dqtp。
46.可选的，在一种实施方式中，所述磁性共固定化酶的酶活回收率大于85％，在一种示例中，所述磁性共固定化酶的酶活回收率达89.30％。
47.本发明的第四个目的是，提供一种磁性共固定化酶的用途，具体为所述磁性共固定化酶用于水解乳清蛋白。
48.可选的，在一种实施方式中，所述磁性共固定化酶水解后的乳清蛋白，其中芳香族氨基酸游离率达90％以上，在一种示例中，所述磁性共固定化酶水解后的乳清蛋白的芳香族氨基酸游离率达92.41％。
49.可选的，在一种实施方式中，所述磁性共固定化酶可重复使用。
50.本发明中固定化酶和吸附芳香族氨基酸的原理以dqtp为例解释如下：dqtp的结构如图2中所示，其氨基供体2,6-二氨基蒽醌相对1,3,5-三醛基间苯三酚过量，因此能提供游离的氨基，以戊二醛为交联剂将酶和dqtp的氨基共价交联，从而实现酶在载体表面的固定。此外，dqtp具有大量苯环结构，能与芳香类物质产生较强的π-π共轭作用，其多孔结构和相比芳香族氨基酸更大的孔径也能允许更多的芳香族氨基酸被吸附。
51.有益效果：
52.(1)本发明以磁性dqtp作为固定化酶和吸附芳香族氨基酸的材料，采用共固定化内肽酶和外肽酶的方式对乳清蛋白进行定向水解，共固定化酶水解简化了制备高f值肽的传统两步酶解过程，较单一固定化酶减少了底物传质和反应时间、扩散产生的中间损失。同时，固定化酶解决了游离酶难以回收利用的问题，有效降低了生产成本，提高了生产效率。
53.(2)采用本发明的方法芳香族氨基酸去除率可达70％以上(占蛋白当量)，得到f值为22～30的高f值乳清肽。制备的高f值乳清肽主要成分为多肽，不同于常规高f值寡肽，避免了寡肽含量过高造成的苦味重、摄入体内后肠道渗透压大的问题。
54.(3)本发明使用的磁性dqtp稳定性好，可适用于水相中固定化酶酶解和吸附；与现有针对芳香族氨基酸的吸附剂如活性炭、大孔树脂相比，具有吸附特异性强，产物得率高等优势，在生产高f值肽等特殊医学用途配方食品、吸附脱除或富集芳香族化合物方面具有广阔的应用前景。
附图说明
55.图1为基于磁性dqtp制备高f值乳清肽的流程图。
56.图2为制备磁性共固定化酶的流程图。
57.图3为制备磁性共固定化酶各阶段产物的红外光谱图。
58.图4为戊二醛浓度对酶固载量和相对酶活力的影响。
59.图5为ph对芳香族氨基酸去除率的影响。
具体实施方式
60.根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
61.本技术以下实施例公开了一种基于磁性dqtp共固定化酶和吸附脱芳制备高f值乳清肽的方法，以下实施例以磁性dqtp作为酶的载体和芳香族氨基酸的吸附剂为例，对本发明方法进行充分详细的说明。
62.本发明的一种具体实施方式，如图1所示，主要包括以下步骤：
63.(1)将fe3o4磁性材料和2,6-二氨基蒽醌、1,3,5-三醛基间苯三酚两种单体按一定比例经超声混匀、高温催化条件下合成，后经磁分离、洗涤、干燥得到固体磁性dqtp；
64.(2)以一部分磁性dqtp作为载体共固定化内肽酶和外肽酶两种蛋白酶，如图2所示，得到共固定化酶，另一部分不固定酶；以磁性dqtp作为载体共固定化酶的方法采用本领域常规的酶固定化方法，本发明不做限制；
65.(3)将浓缩乳清蛋白粉溶解、热处理、剪切处理、超声分散处理，得到乳清蛋白预处理液；
66.(4)将步骤(3)中的乳清蛋白预处理液用步骤(2)中的共固定化酶水解，得到乳清蛋白酶解液；
67.(5)将步骤(4)中的乳清蛋白酶解液磁分离后用步骤(2)中未固定酶的磁性dqtp进行吸附，吸附剂经磁分离后得到高f值乳清肽溶液；
68.(6)将步骤(5)中得到的高f值乳清肽溶液进一步浓缩、冷冻干燥或喷雾干燥得到高f值乳清肽粉。
69.氨基酸含量测定：采用氨基酸分析高效液相色谱仪进行测定；
70.色谱条件如下：色谱柱：agilent hypersil ods柱(5μm，4.0mm
×
250mm)；梯度洗脱程序：0min，8％b；17min，50％b；24min，0％b；流动相a(ph＝7.2)：27.6mmol/l醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃(体积比＝500:0.11:2.5)；流动相b(ph＝7.2)：80.9mmol/l醋酸钠-甲醇-乙腈(体积比＝1:2:2)；流动相流速1.0ml/min；柱温：40℃；紫外检测波长：338nm，脯氨酸于262nm处检测，氨基酸含量以外标法定量。
71.蛋白质含量测定：参照gb5009.5-2016通过凯氏定氮法测得蛋白含量。
72.实施例1：核-壳结构磁性dqtp的合成
73.1.称取100mg(0.432mmol)fe3o4磁性材料、34mg(0.142mmol)2,6-二氨基蒽醌和20mg(0.096mmol)1,3,5-三醛基间苯三酚于15ml 1,4-二氧六环中，超声40min使原料充分混匀；
74.2.随后加入750μl 6mol/l的乙酸，快速转移至反应釜中，于120℃下反应48h；
75.3.将所得产物用1,4-二氧六环、乙醇、水、丙酮、甲醇或四氢呋喃各洗涤3次，至上清液澄清无色透明；
76.4.在索氏提取器中用丙酮提取洗涤24h；
77.5.转入60℃烘箱中干燥24h，所得红棕色粉末为磁性dqtp。
78.实施例2：酶的固定化
79.1.称取20mg实施例1制备得到的磁性dqtp于离心管中，用ph 7.4的pbs缓冲液洗三次，磁分离后弃掉上清液；
80.2.分别加入2ml 5％的戊二醛水溶液，混合均匀后在150r/min下震荡1.5h，经磁分离后再用ph 7.4的pbs缓冲液洗3次充分洗掉残留的戊二醛水溶液；
81.3.随后加入2ml浓度为2mg/ml的α-糜蛋白酶和2ml浓度为0.5mg/ml的羧肽酶a溶液，在4℃150r/min下震荡12h，磁分离后弃上清液，并用ph 7.4的pbs缓冲液洗3次除去未被固定的酶，底部沉淀即为固定化酶；
82.4.在室温下真空干燥24h制成干燥粉末或加入ph 7.4的pbs缓冲液于4℃或-18℃下低温保存备用。
83.固定化酶及游离酶酶活测定
84.使用n-苯甲酰-l-酪氨酸乙酯(btee)法测定游离酶和固定化酶的酶活力，用50％甲醇和ph 7.8 10mmol/l的tris-hcl缓冲液配制0.5mm btee底物溶液，将2.9ml btee底物溶液加入比色皿中，随后加入0.1ml游离酶溶液或等量(游离酶或固定化酶中酶的质量相等)的固定化酶。在2～5min内测定256nm处的吸光度。按下式计算酶比活力：
[0085][0086]
式中，e为酶的比活力(u/mg)；δa为时间t内吸光度的变化值；n为酶溶液添加到底物溶液后的稀释倍数；v为体系总体积(ml)；0.964为n-苯甲酰-l-酪氨酸乙酯在256nm处的摩尔消光系数；m为酶的质量(mg)；t为反应时间(min)。
[0087]
测得游离酶和固定化酶的酶比活力如表1所示，可知酶被固定化后酶比活力有所下降，可能是由于共价结合和酶在载体表面的空间位阻影响了酶的活力，但固定化酶仍保持了较高的酶活回收率(89.30％)，可以进行相应的实际应用。
[0088]
酶活回收率指酶被固定化后的比活力占固定化前比活力的比率，其计算公式如下：
[0089][0090]
表1为固定化酶和游离酶的酶活力表
[0091] 酶比活力(u/mg)酶活回收率(％)游离酶267.95/固定化酶239.2889.30
[0092]
实施例3：
[0093]
戊二醛浓度对固定化效率和酶固载量的影响
[0094]
25℃下，分别称取20mg的磁性dqtp于5个离心管中，用ph 7.4的pbs缓冲液洗三次，磁分离后弃掉上清液，分别加入2ml 1％、3％、5％、7％、9％的戊二醛水溶液，混合均匀后在150r/min下震荡1.5h，经磁分离后再用ph 7.4的pbs缓冲液洗3次充分洗掉残留的戊二醛水溶液，随后分别加入2ml 2mg/ml的α-糜蛋白酶和羧肽酶a溶液，在4℃150r/min下震荡12h，磁分离后弃上清液，并用ph 7.4的pbs缓冲液洗3次除去未被固定的酶，底部沉淀即为固定化酶，可在室温下真空干燥24h制成干燥粉末或加入ph 7.4的pbs缓冲液于4℃下低温保存。
[0095]
采用考马斯亮蓝法和btee法分别测定酶固载量和蛋白酶活性，结果如图4所示，可得戊二醛水溶液浓度为5％时，酶固载量和相对酶活力均较高，因此，选用该浓度的戊二醛水溶液作为交联剂用于后续实验。
[0096]
酶固载量测定是由考马斯亮蓝法完成，基本原理是通过测定上清液在反应前后蛋白质浓度的差值得到固定在载体上的酶质量，再除以载体质量得到酶固载量。蛋白酶活性通过btee法测得，其基本原理是蛋白酶可将btee水解，其产物在256nm处有特征吸收峰，通过测定该处吸光度的值可计算得到酶活力。
[0097]
实施例4：
[0098]
ph对磁性dqtp吸附芳香族氨基酸的影响
[0099]
25℃下，分别取0.01g的磁性dqtp和1500mg/l，ph为3、5、7、9、11的芳香族氨基酸混合溶液4ml，混合均匀后在125r/min下搅拌，24h后磁分离，收集上清液。采用茚三酮法计算样品中游离芳香族氨基酸的含量。结果如图5所示，吸附体系在ph为4～7时具有较高的芳香族氨基酸脱除率，在ph为5～6时更佳，尤其是在ph＝5时具有最高的芳香族氨基酸脱除率，因此选择ph＝5用于后续实验。
[0100]
实施例5：
[0101]
共固定化酶结合磁性dqtp吸附制备高f值乳清肽，包括以下步骤：
[0102]
1.磁性dqtp及固定化酶的制备
[0103]
(1)磁性dqtp的制备
[0104]
同实施例1
[0105]
(2)固定化酶的制备
[0106]
同实施例2
[0107]
2.蛋白酶解
[0108]
(1)乳清蛋白粉的溶解、热处理和剪切均质处理
[0109]
将750g乳清蛋白粉溶于水至蛋白浓度为24g/l，使用夹层锅在80℃下加热搅拌10min进行蛋白质热变性处理，剪切均质处理的条件为10000r/min，3min，得到预处理液，蛋白质含量参照gb5009.5-2016通过凯氏定氮法测得蛋白含量78.37％，氨基酸分析仪测得芳香族氨基酸占蛋白总量为5.60％。
[0110]
(2)固定化酶水解
[0111]
使用制备得到的固定化酶进行酶解，酶活力为3000u/g蛋白质等同物；酶解条件为ph 7.5，温度为45℃，时间为6h。经甲醛滴定法测得乳清蛋白水解度为56.48％。
[0112]
(3)磁分离处理
[0113]
磁分离除去固定化酶，得到蛋白酶解液。
[0114]
3.芳香族氨基酸脱除
[0115]
向所述蛋白酶解液中添加40wt.％的磁性dqtp，ph 5.0环境下25℃震荡24h，经磁分离去除吸附剂后，收集上清液，获得高f值乳清肽，经全自动氨基酸分析仪测定得，固定化酶水解结合磁性dqtp吸附乳清蛋白的氨基酸分析结果如表2所示，该法对芳香族氨基酸的游离率达到92.86％，脱除率达到87.50％，支链氨基酸保留率达到82.02％，所得乳清肽的f值为26.07。
[0116]
其中，游离率由酶解液测定游离氨基酸得到，方法为将样品用10g/100ml三氯乙酸等体积稀释，静置1h以沉淀蛋白，随后用双层滤纸过滤，离心后取上清液测定。
[0117]
脱除率和保留率由测定吸附后溶液酸水解产物得到，方法为向1ml样品中加入1ml浓盐酸和6ml 6mol/l hcl，氮吹3min后在120℃烘箱中水解22h，将样品全部转移至容量瓶中，加4.8ml 10mol/l naoh中和，用蒸馏水定容25ml，双层滤纸过滤后离心，取上清液测定。
[0118]
表2固定化酶水解结合磁性dqtp吸附乳清蛋白的氨基酸分析结果
[0119][0120][0121]
注：
①
nd表示未检出；
[0122]
②
表格中氨基酸含量单位均为mg/ml；
[0123]
4.分子量分布测定
[0124]
对酶解后的酶解液及吸附后的乳清肽上清液均进行分子量分布的测定，方法如下：样品通过0.22μm水性微孔滤膜过滤后，用配备tsk gel g2000 swxl柱的高效液相色谱
进行分析。在波长220nm，30℃和0.5ml/min流速的条件下检测。流动相为乙腈、水和三氟乙酸混合物(体积比40:60:0.05)。
[0125]
表3乳清蛋白酶解液经磁性dqtp吸附后分子量分布表
[0126]
分子量分布酶解液/％吸附后/％mw》230010.654.77mw≈140045.3383.64mw≤30044.0010.13
[0127]
表3为乳清蛋白酶解液经磁性dqtp吸附后分子量分布表，由表3可知，固定化酶水解后产物中分子量小于300的组分占比较高，主要包含游离氨基酸和分子量小于300的寡肽，说明酶水解后大量氨基酸被成功游离。经磁性dqtp吸附后产物主要为分子量在1400左右(mw＝1000～2000)的多肽，表明吸附过程脱除了体系中大部分的游离氨基酸，主要保留了分子量在1400左右的多肽，这种肽的组成可产生较少的苦味，同时避免了游离氨基酸含量过高导致摄入体内后易诱发腹泻的问题。
[0128]
综上所述，共固定化酶结合磁性dqtp脱芳所得乳清肽f值可达26.07，满足f值大于20的需要，经双缩脲法测定产物得率为66.18％，支链氨基酸保留率为82.02％，较使用活性炭作为吸附剂的产物产率(14.26％)和支链氨基酸保留率(34.72％)均具有显著提升，表明磁性dqtp吸附芳香族氨基酸的特异性较高，用于生产高f值肽具有一定优势。
[0129]
实施例6：
[0130]
共固定化酶水解结合d101大孔树脂吸附制备低芳香族氨基酸乳清肽
[0131]
1.磁性dqtp及固定化酶的制备
[0132]
(1)磁性dqtp的制备
[0133]
同实施例1
[0134]
(2)固定化酶的制备
[0135]
同实施例2
[0136]
2.蛋白酶解
[0137]
(1)乳清蛋白粉的溶解、热处理和剪切均质处理
[0138]
将750g乳清蛋白粉溶于水至蛋白浓度为24g/l，使用夹层锅在80℃下加热搅拌10min进行蛋白质热变性处理，剪切均质处理的条件为10000r/min，3min，得到预处理液，蛋白质含量参照gb5009.5-2016通过凯氏定氮法测得蛋白含量76.24％，氨基酸分析仪测得芳香族氨基酸占蛋白总量为5.44％。
[0139]
(2)固定化酶水解
[0140]
使用制备得到的固定化酶进行酶解，酶活力为3000u/g蛋白质等同物；酶解条件为ph 7.5，温度为45℃，时间为6h。经甲醛滴定法测得乳清蛋白水解度为56.07％。
[0141]
(3)磁分离处理
[0142]
磁分离除去固定化酶，得到蛋白酶解液。
[0143]
3.d101大孔树脂的活化
[0144]
将未使用过的树脂用95％乙醇浸泡18h，用去离子水洗至无醇味后，浸泡于1mol/l的naoh溶液中4h，用去离子水反复冲洗至中性后，再用1mol/l hcl溶液酸洗4h，用去离子水冲至中性后存储待用。
[0145]
4.芳香族氨基酸脱除
[0146]
向所述蛋白酶解液中添加15g/l的d101大孔树脂，ph 5.0环境下25℃震荡24h，经离心去除吸附剂后，收集上清液，获得高f值乳清肽，经全自动氨基酸分析仪测定得，该法对芳香族氨基酸的游离率达到94.23％，脱除率达到53.85％，支链氨基酸保留率达到64.05％，所得乳清肽的f值为5.60，经双缩脲法测得产物得率为63.1％。
[0147]
表4固定化酶水解结合d101大孔树脂吸附乳清蛋白的氨基酸分析结果
[0148]
氨基酸乳清蛋白酸水解原液酶解液游离氨基酸吸附后酸水解氨基酸asp2.190.041.50glu3.380.022.36ser1.02nd0.54his0.490.120.19gly0.480.080.28thr1.220.100.80arg0.450.030.22ala0.910.030.66tyr0.410.370.19cys0.120.020.03val1.340.521.13met0.350.110.08phe0.630.610.29ile1.170.370.71leu1.691.060.85lys1.490.070.91pro1.77nd0.81aaa游离率/94.23％/aaa脱除率//53.85％bcaa保留率//64.05％bcaa(ile+leu+val)4.20/2.69aaa(tyr+phe)1.04/0.48f值(bcaa/aaa)4.04/5.60
[0149]
注：
①
nd表示未检出；
[0150]
②
表格中氨基酸含量单位均为mg/ml；
[0151]
表4为固定化酶水解结合d101大孔树脂吸附乳清蛋白的氨基酸分析结果，由表4可知，同实施例5，经固定化酶水解的乳清蛋白水解度较大，芳香族氨基酸游离程度较高，然而本实施例由于d101大孔树脂的特异性吸附能力较差，芳香族氨基酸的脱除率较低，导致最终产物的f值较低。
[0152]
实施例7：
[0153]
游离酶水解结合磁性dqtp吸附制备高f值乳清肽
[0154]
1.蛋白酶解
[0155]
(1)乳清蛋白粉的溶解、热处理和剪切均质处理
[0156]
将750g乳清蛋白粉溶于水至蛋白浓度为24g/l，使用夹层锅在80℃下加热搅拌10min进行蛋白质热变性处理，剪切均质处理的条件为10000r/min，3min，得到预处理液，蛋白质含量参照gb5009.5-2016通过凯氏定氮法测得蛋白含量76.69％，氨基酸分析仪测得芳香族氨基酸占蛋白总量为5.38％。
[0157]
(2)蛋白酶处理
[0158]
同时使用α-糜蛋白酶和羧肽酶a酶解乳清蛋白，α-糜蛋白酶添加量为3000u/g蛋白质等同物；羧肽酶a添加量为5u/ml蛋白质溶液，酶解条件为ph 7.5，温度为45℃，时间为6h。经甲醛滴定法测定，水解度达58.73％。
[0159]
2.磁性dqtp的制备
[0160]
同实施例1
[0161]
3.芳香族氨基酸脱除
[0162]
向所述蛋白酶解液中添加40wt.％的磁性dqtp，ph 5.0环境下25℃震荡24h，磁分离，收集上清液，获得高f值乳清肽。
[0163]
经全自动氨基酸分析仪测定得，游离酶水解结合磁性dqtp吸附乳清蛋白的氨基酸分析结果如表5所示，该法对芳香族氨基酸的游离率达到95.61％，脱除率达到86.84％，支链氨基酸保留率达到82.37％，所得乳清肽的f值为25.53。
[0164]
表5游离酶水解结合磁性dqtp吸附乳清蛋白的氨基酸分析结果
[0165]
[0166][0167]
注：
①
nd表示未检出；
[0168]
②
表格中氨基酸含量单位均为mg/ml；
[0169]
综上所述，游离内肽酶和外肽酶同时水解结合磁性dqtp脱芳后，所得乳清肽的f值为25.53，高于20，满足高f值的需要，通过对比可知共固定化酶在实现较高的酶活回收率的前提下，还可保留与游离酶接近的芳香族氨基酸游离率。同时也进一步证明了磁性dqtp对酶解液脱芳的有益效果，其对于游离酶和共固定化酶水解后的蛋白酶解液均具有较佳的脱芳效果。
[0170]
实施例8：
[0171]
回收固定化酶和磁性dqtp吸附制备高f值乳清肽
[0172]
1.磁性dqtp及固定化酶的制备
[0173]
(1)磁性dqtp的制备
[0174]
同实施例1
[0175]
(2)固定化酶的制备
[0176]
同实施例2
[0177]
2.蛋白酶解
[0178]
(1)乳清蛋白粉的溶解、热处理和剪切均质处理
[0179]
同实施例5
[0180]
(2)固定化酶第一次水解
[0181]
同实施例5
[0182]
3.芳香族氨基酸脱除
[0183]
同实施例5
[0184]
4.固定化酶的回收
[0185]
磁分离回收步骤2(2)中使用的固定化酶，使用pbs缓冲液洗3次，除去表面附着的酶解液，备用。
[0186]
5.固定化酶第二次水解
[0187]
使用步骤4中回收的固定化酶对步骤2(1)中相同处理的乳清蛋白溶液进行水解，酶解条件相同。酶解结束后，经磁分离去除固定化酶，得到蛋白酶解液，经甲醛滴定法测得乳清蛋白水解度为56.11％。
[0188]
6.磁性dqtp吸附剂的解吸
[0189]
将步骤3中使用的磁性dqtp经磁分离后回收，加入75％乙醇150r/min震荡12h，重复解吸1次，磁分离得到吸附剂后用去离子水洗3次，置于60℃烘箱真空干燥12h后用于第二次吸附。
[0190]
7.磁性dqtp第二次吸附脱芳
[0191]
向步骤5中所述蛋白酶解液中添加步骤6中解吸后的磁性dqtp，ph 5.0环境下25℃震荡24h，磁分离，收集上清液，获得高f值乳清肽。
[0192]
经全自动氨基酸分析仪测定得，回收固定化酶和磁性dqtp吸附乳清蛋白的氨基酸分析结果如表6所示，该法对芳香族氨基酸的游离率达到91.96％，脱除率达到83.93％，支链氨基酸保留率达到83.82％，所得乳清肽的f值为24.87。由此可知，固定化酶和磁性dqtp的重复使用性较好，可用于多次生产高f值乳清肽。
[0193]
表6回收固定化酶和磁性dqtp吸附乳清蛋白的氨基酸分析结果
[0194][0195][0196]
注：
①
nd表示未检出；
[0197]
②
表格中氨基酸含量单位均为mg/ml；
[0198]
采用同种方法对固定化酶进行数次回收，并测定其水解酶解液中的aaa游离率，结果如表7所示。
[0199]
表7固定化酶回收数次后的水解乳清蛋白后的酶解液游离氨基酸分析结果
[0200]
回收次数aaa游离率092.86％191.96％290.82％387.66％483.48％578.93％675.96％772.25％867.88％
[0201]
由表7可知，所制备的固定化酶在回收使用4次后，aaa游离率仍可保持在80％以上，回收使用8次后，aaa游离率为67.88％。aaa游离率下降的原因可能是在酶解过程中的剧烈震荡造成酶的机械损伤或从载体上脱落。总的来看，固定化酶可保持较好的可重复使用性，具有良好的实际应用价值。
[0202]
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

技术特征：
1.一种基于磁性dqtp共固定化酶和吸附脱芳制备高f值乳清肽的方法，其特征在于，所述方法使用磁性dqtp作为共固定化内肽酶和外肽酶的载体以及芳香族氨基酸的吸附剂，制备高f值乳清肽，具体包括以下步骤：s1、以磁性dqtp作为载体共固定化内肽酶和外肽酶，得到磁性dqtp共固定化酶；s2、乳清蛋白溶液使用所述磁性dqtp共固定化酶进行酶水解，获取酶解液；s3、以磁性dqtp作为吸附剂，吸附脱除所述酶解液中游离的芳香族氨基酸和含有芳香族氨基酸的寡肽，得高f值乳清肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述内肽酶包括α-糜蛋白酶，所述外肽酶包括羧肽酶a，其中，所述内肽酶与磁性dqtp的质量比为1:2～1:50，所述外肽酶与磁性dqtp质量比为1:8～1:30。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述磁性dqtp共固定化酶的制备方法包括：磁性dqtp用交联剂在室温下活化1～3h，加入内肽酶和外肽酶，在4～25℃的旋转摇床上孵育4～12h，得到固定有内肽酶和外肽酶的磁性dqtp共固定化酶。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1、s3中，所述磁性dqtp的制备方法包括：将fe3o4磁性材料、2,6-二氨基蒽醌和1,3,5-三醛基间苯三酚超声分散在溶剂中，加入催化剂，混匀后转移至高压反应釜中，在90～120℃下反应24～72h，得到固体颗粒，用磁铁分离后洗涤，在40～80℃真空干燥12～24h，得到以磁性材料为核、以dqtp为壳的磁性dqtp。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述的磁性dqtp共固定化酶的用量为500～3000u/g蛋白质等同物，酶水解条件为ph 7.5～8.5，温度35～50℃，时间2～7h。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述乳清蛋白液的浓度为3～36g/l，优选的浓度为24～32g/l；所述乳清蛋白溶液在进行酶水解前进行预处理，所述预处理包括热处理，所述热处理条件为：60～90℃，10～15min。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，所述磁性dqtp的添加量为所述酶解液的20～40wt.％；吸附条件为：ph 4.0～7.0，温度25～35℃，时间12～24h。8.一种高f值乳清肽，根据权利要求1～8所述的方法制备得到，其特征在于，所述乳清肽f值大于22，支链氨基酸保留率达75％。9.根据权利要求8所述的高f值乳清肽的用途，用于制备配方食品或药品，所述配方食品包括特殊医学用途配方食品。10.一种磁性共固定化酶，其特征在于，所述磁性共固定化酶包括磁性dqtp和被固定的蛋白酶，所述磁性dqtp为核-壳结构的磁性纳米粒子，所述核包括但不限于fe3o4、fe2o3在内的磁性材料，所述壳为有机聚合物dqtp，所述被固定的蛋白酶包括内肽酶和/或外肽酶，所述内肽酶包括α-糜蛋白酶，所述外肽酶包括羧肽酶a。

技术总结
本发明公开了一种基于磁性DQTP共固定化酶和吸附脱芳制备高F值乳清肽的方法，乳清蛋白溶液经预处理后使用磁性DQTP共固定化酶进行酶水解，磁分离后获取酶解液；以磁性DQTP作为吸附剂，吸附脱除酶解液中游离的芳香族氨基酸和含有芳香族氨基酸的寡肽，经磁分离后得到高F值乳清肽溶液，再经浓缩、干燥后得高F值乳清肽粉。共固定化酶水解简化了传统两步酶解的生产过程，重复使用性好，可有效降低成本，提高效率。本发明所得芳香族氨基酸游离率达90％，支链氨基酸保留率可达80％，乳清肽F值超过22，具有应用于制备针对于氨基酸代谢疾病患者的特殊医学用途配方食品的潜力。特殊医学用途配方食品的潜力。特殊医学用途配方食品的潜力。


技术研发人员：张毅 徐力志 杨艺楠 王文龙 沈晓芳 严秀平
受保护的技术使用者：徐州锡沂康成食品检验检测研究院有限公司
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/16