一种近红外比率荧光探针及其应用

1.本发明属于探针检测技术领域，更具体地说，涉及一种近红外比率荧光探针及其应用。


背景技术：

2.肼由于在工业、工程、制药和农业化学等领域的广泛应用而引起了极大的健康问题。多项研究证明肼在人体生理学上可引起致癌和诱变作用，对肾、肝、肺和中枢神经系统造成一系列严重损害。因此，它已被美国环境保护署(epa)归类为b2类危险物质，其在饮用水中的阈限值为10ppb。除了人为来源外，一些酵母和固氮细菌可以作为副产品合成n2h4。此外，n2h4可以从某些药物如异烟肼和帕司烟肼的代谢中原位产生，从而导致人体肝毒性和严重的健康问题。因此，已经建立了多种方法和技术来检测环境和生物体中的n2h4，包括滴定分析法、色谱法、电化学分析法、比色法或荧光光谱法等。
3.其中，荧光光谱法具有成本低、响应快、灵敏度高、可实时原位检测、对样品无创等优越优势。水合肼具有α效应显著增加了“n”原子的亲核性。现有已知的反应型水合肼的荧光探针均依赖一个或两个亲电位点，分别通过单加成和双加成传感机制与水合肼发生反应(类型i和类型ii)，实现检测。其中i型探针与水合肼中的一个氮原子的发生单位点加成，而ii探针与水合肼中的两个氮原子发生双位点加成，后者可以极大地提高对n2h4的选择性和灵敏度，且通常伴随着比率型荧光变化。然而，据我们所知，由于需要两步亲核加成反应，ii型探针通常有较长的响应时间。


技术实现要素：

4.1.要解决的问题
5.针对现有技术中选择性和响应时间难以同时满足的问题，本发明提供一种同时具有优异的选择性和低的响应时间的近红外比率荧光探针及其应用。
6.2.技术方案
7.为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
8.本发明第一方面提供一种化合物，具有下式结构：
[0009][0010]
作为本发明第一方面的任意一种技术方案的优选，所述化合物cdm-1在ph＝7.4的
含有20％dmso的pbs缓冲溶液中具有390
±
5nm的紫外-可见吸收峰；；和/或
[0011]
所述化合物cdm-1在ph＝7.4的含有20％ dmso的pbs缓冲溶液中，在激发波长为423nm时，具有545
±
20nm的荧光发射峰。
[0012]
作为本发明第一方面的任意一种技术方案的优选，所述化合物cdm-1在ph＝7.4的含有20％dmso的pbs缓冲溶液中与肼反应后具有496
±
5nm的紫外-可见吸收峰；和/或
[0013]
所述化合物在ph＝7.4的含有20％ dmso的pbs缓冲溶液中与肼反应后，在激发波长为423nm时，具有666
±
20nm的荧光发射峰。
[0014]
本发明第二方面提供一种近红外比率荧光探针或试纸，包括化合物cdm-1；
[0015][0016]
所述近红外比率荧光探针是指，当荧光探针与被检测物接触时，荧光光谱中最大发射峰发生位移，在两个不同波长测定的荧光强度表现出比率变化，例如，本发明中的比率变化测定的是666nm与545nm两个波长下的荧光强度；且当与被检测物接触时，探针具有最大发射波长位于近红外区的荧光发射峰，所述近红外区是指波长范围在650～1700nm。
[0017]
所述试纸是指将所述化合物以物理或化学方式负载在纸基体上，以实现检测的便利性。
[0018]
本发明第三方面提供一种第一方面或第二方面中任意一项所述的化合物或近红外比率荧光探针或试纸在检测肼中的应用。
[0019]
作为本发明第三方面的任意一种技术方案的优选，采用荧光光谱法，所述化合物cdm-1对肼的检测限为0.3ppb。
[0020]
作为本发明第三方面的任意一种技术方案的优选，所述cdm-1与肼的接触时间小于等于20min。
[0021]
作为本发明第三方面的任意一种技术方案的优选，所述应用包括：使化合物cdm-1或含有化合物cdm-1的介质或载体与肼或含有肼的介质或载体接触，经过一定时间后，测定在特定激发波长下的荧光发射峰或在日光或紫外灯下比色。根据荧光发射峰位置、日光或紫外灯下比色结果判断肼的存在与否。
[0022]
本发明第四方面提供一种肼的定性检测方法，包括：
[0023]
s1采用化合物cdm-1或含有化合物cdm-1的介质或载体，与肼或含有肼的介质或载体接触形成混合物；所述的混合物包括不限于气态/液态与气态/液态混合形成的混合物，还包括气态/液态与固体介质接触形成的混合介质；
[0024][0025]
s2检测步骤s1的混合物的紫外可见吸收光谱或荧光发射光谱，或在日光或紫外灯下比色。当紫外可见吸收光谱出现cdm特征吸收峰、或荧光发射光谱出现cdm荧光发射峰，或日光或紫外灯下显示与cdm相同的颜色或荧光时，即表示肼的存在；所述cdm结构式如下：
[0026][0027]
本发明第五方面提供一种肼的定量检测方法，包括：
[0028]
a1建立不同量肼与化合物cdm-1的荧光发射强度比值i
666 nm
/i
545 nm
的工作曲线，其中，荧光发射光谱的激发波长为423nm；
[0029][0030]
a2采用化合物cdm-1或含有化合物cdm-1的介质或载体，与肼或含有肼的介质或载体接触形成混合物；
[0031]
a3在激发波长为423nm条件下检测步骤a2的混合物的荧光发射光谱，得到荧光发射强度比值i
666 nm
/i
545 nm
；
[0032]
a4计算肼的量。
[0033]
3.有益效果
[0034]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0035]
(1)本发明的化合物cdm-1中，二氰基异佛尔酮荧光团用于近红外(nir)发射荧光，而吡啶甲酰酯单元作为反应位点与目标肼形成必要的氢键；化合物cdm-1首先通过吡啶基团上的n原子与n2h4的h原子之间的非共价氢键捕获n2h4，然后通过n2h4触发的分子内六元环反应促使酯键裂解释放带有oh基团的自由荧光团；精心设计的氢键产生了显著的焓效益，
1(10μm)；(b)cdm-1(10μm)与500μm inh；(c)cdm-1(10μm)与1mm inh。(d)图(a-c)中荧光强度相对比率(红色通道/绿色通道)的量化。误差条为sd(n＝3)。***p《0.001,**p《0.01.绿色通道:e
x
＝405nm,em＝480-540nm。红色通道:e
x
＝480nm,em＝620-680nm。比例尺:25μm。
具体实施方式
[0045]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0046]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0047]
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
[0048]
时间、浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
[0049]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0050]
一、化合物hdm-1、cdm-1～cdm-3的制备
[0051][0052]
hdm-1是按照文献方法(r.an,d.zhang,y.chen and y.-z.cui,sens.actuators,b 2016,222,48
–
54.)合成。
[0053]
cdm：将m-1(1.45g，7.8mmol)和3-氯-4-羟基苯甲醛(0.979g，6.25mmol)溶于80ml乙醇中。向混合物中加入一滴哌啶，并在惰性气体下回流12h。在真空下除去溶剂后，使用硅胶色谱法以二氯甲烷(dcm)作为洗脱剂纯化得到的粗产物，得到化合物cdm。
[0054]
化合物cdm-1：吡啶甲酸(0.325g,2.79mmol)溶解在10ml二氯甲烷中，加入cdm(0.3g,0.93mmol)、edc(0.268g,1.4mmol)和dmap(0.114g,0.93mmol)。。反应在室温n2气氛下搅拌3h，真空下除去溶剂，以石油醚/丙酮为洗脱剂的硅胶层析色谱法纯化得到的残余物，得到cdm-1。
[0055]
cdm-2和cdm-3分别从烟酸和异烟酸出发，采用相同的方法制备。
nmr(100mhz,cdcl3)δ169.0,162.8,152.8,151.0,147.3,135.9,135.5,134.0,130.9,129.2,127.6,126.8,124.6,124.1,123.3,113.2,112.5),79.9,43.0,39.2,32.1,28.0.esi-hrms(m/z):[m+h]
+
calc.for c
25h21
cln3o2:430.1322；found 430.1325.
[0066]
二、检测方法
[0067]
分别在dmso中制备浓度为1mm的hdm-1和cdm-1-cdm-3原液。将新制备的n2h4和各探针溶液加入pbs缓冲溶液(10mm,ph＝7.4，含20％ dmso)中，总体积为2.0ml。所有光谱测量在37℃下进行，探针最终浓度为10μm。n2h4和其他相关分子和离子的溶液在去离子水或dmso中制备。所有的紫外可见光谱和荧光光谱分别用日立uv-2910分光光度计和日立f-7000荧光光谱仪记录。
[0068]
三、检测限
[0069]
检测限计算公式。检测限lods是通过荧光强度滴定法测定。对该探针cdm-1的发射光谱进行了30次测量，得到了该空白测量的标准差(σ)。斜率(k)由n2h4定量分析的校正曲线推导而来。检出限的计算公式为lod＝3σ/k。
[0070]
四、共聚焦荧光成像实验
[0071]
采用leica tcs sp8超分辨率激光扫描共聚焦显微镜进行共聚焦荧光成像研究。每个样品分别使用405nm和480nm激光激发，分别在480-540nm和620nm-680nm之间收集发射。用于外源性n2h4成像的hepg2细胞与新鲜制备的含n2h4(0μm,50μm,200μm,and 400μm)的培养基在37℃的5％ co2/95％空气培养箱中孵育。pbs洗涤三次，每组加入探针cdm-1(10μm,0.5％ dmso作为共溶剂)，孵育45min后成像。
[0072]
用异烟肼孵育三组细胞，对内源性n2h4进行成像。i组细胞在显像前用新配制的含有cdm-1(10μm,0.5％ dmso作为共溶剂)的培养基在37℃的5％ co2/95％空气培养箱中孵育45min。ii组和iii组细胞分别用异烟肼(500μm,1mm)孵育6h，用pbs洗涤三次后加入cdm-1(10μm,0.5％ dmso为助溶剂)再孵育45min。
[0073]
五、定性光谱研究
[0074]
我们首先通过采用化合物hdm-1的吡啶甲酰酯基团笼合荧光团(图1a)来进行肼的检测。如图1b所示，加入n2h4在585nm处诱导了hdm-1大约7.6倍的荧光增强，对1.25mm n2h4的响应在60min内完成(图1c)。这种n2h4触发反应的初步设计表明，将含酚荧光团转化为选择性n2h4响应荧光探针是一种可行的方法。然而，由于hdm的pka为8.62，其在测试条件即ph＝7.4时表现为非去质子化的结构，具有较短的发射波长。因此，hdm-1在585nm处显示了一个荧光开启型响应和相对较短的发射，预示着其在精确检测n2h4及生物成像应用方面的潜在局限性。因此，我们下一步的目标是优化探针，以实现对n2h4的快速的nir发光的比率型荧光响应。
[0075]
如图2所示，cdm-1(10μm)本身在390nm处具有紫外-可见吸收，在545nm处表现出相对较弱的发射，这是由于酯基对苯酚基的保护抑制了ict过程(图2b)。引入n2h4后，吸收峰发生了较大的红移，在496nm附近有一个峰。值得注意的是，最大发射光谱从545nm到666nm出现了较大的红移，表现出比率变化(图2c)。采用n2h4处理后，n2h
4-cdm-1体系的吸收和发射几乎与化合物cdm的吸收和发射吻合，这与反应后cdm的释放有关。由于cdm具有较小的pka，在测试条件下以去质子化的结构存在表现出较长的发射波长。同时，溶液颜色在日光下由无色变为红色(图2b插图)，在uv灯(365nm)下由淡黄色变为鲜红色(图2c插图)，便于肉眼检
测n2h4。
[0076]
cdm-1结构中具有cl
…
c＝o n
→
π*相互作用(图2a)，表现出了更好的稳定性。重要的是，hdm-1和cdm-1的伪一级动力学测定的k
obs
分别为0.65m-1
·
s-1
和8.70m-1
·
s-1
，揭示了在cdm-1中进行了氯取代后，反应速度提高了13.4倍。cdm-1中的氯取代有助于更快地响应n2h4，并认为氯的吸电子能力促进了n2h4对酯键的亲核攻击。
[0077]
六、定量研究
[0078]
探针cdm-1传感特性的附加评估：
[0079]
对n2h4的比率变化及检测限：我们仔细研究了cdm-1对不同量的n2h4的光学响应。随着n2h4(0
–
500μm，图3a)的增加，cdm-1表现出显著的比率荧光变化(响应时间15min)，其中荧光强度比(i
666 nm
/i
545 nm
，其中，荧光发射光谱的激发波长为423nm，下同)与n2h4在0
–
300μm范围内线性增加(r2＝0.99，图3b)。计算出n2h4的检测限(lod)为10.6nm(0.3ppb)(3σ/k)，远低于世界卫生组织规定的饮用水中n2h4的最大容许浓度(10ppb)，表示cdm-1可作为n2h4定量检测的灵敏荧光传感器。
[0080]
时间依赖性的变化和ph效应：通过发射比(i
666 nm
/i
545 nm
)随响应时间的增加来监测动力学变化，这与从cdm-1到cdm的转换增加相关(图3c)。500μm n2h4处理后，反应几乎在10min内达到饱和。ph效应研究表明，cdm-1在ph为2.00-9.00范围内较为稳定，在ph值为11.00时发生轻微分解；在ph为6.00-11.00的范围内，cdm-1很容易与n2h4发生反应，说明cdm-1适用于生物系统中n2h4的检测。
[0081]
选择性和抗干扰研究：cdm-1对n2h4的选择性和抗干扰能力优于其他相关胺和离子(nh3·
h2o、nh2oh、tea、异烟肼、苯肼、硫脲、gsh、缬氨酸、甘氨酸、二异丙胺、苯胺、葡萄糖、n、n-二异丙基乙胺、nacl、kf、koac、kcl、na2so4、na2co3、mg(clo4)2、zn(clo4)2、cacl2)。只有当n2h4存在时，才能显著观察到选择性比率发射变化(图3d)。其他被测试的样品既没有对cdm-1的发射显示出任何响应，也没有改变n2h4传感的任何变化。对n2h4的高选择性可以归因于我们设计的氢键-锚定传感策略与分子内六元环酯键断裂协同作用以及n2h4的α-杂原子效应，这将大大增强其亲核性，并提高了与其他取代胺或氨相比的特异性。
[0082]
上述结果表明，n2h4诱导的颜色和荧光颜色变化使比色法监测n2h4成为可能，即使是用肉眼检测。
[0083]
七、传感机制研究
[0084]
采用薄层色谱法、esi-ms和1hnmr光谱研究cdm-1与n2h4的传感反应。在thf/h2o(1:1)条件下进行cdm-1与n2h4的反应，以了解其传感机理。薄层色谱分析结果表明，cdm-1的斑点变小了，同时生成了cdm和2-吡啶甲酰肼的新斑点。此外，通过esi-ms谱图监测反应混合物，从中发现323.1380处的[m-h]-峰和138.0660处的[m+h]
+
峰，分别为生成的cdm和2-吡啶甲酰肼。
[0085]
如图4所示，为了收集更多cdm-1与n2h4反应的结构信息，分别在0.5ml dmso-d6溶液中不存在和存在2eq(10μmol,2μl)n2h4时对cdm-1(5μmol)进行了1h nmr光谱实验。质子ha、hb、hc和hd处的化学位移对阐明传感反应最有帮助，因此是下面讨论的重点。cdm-1在吡啶环上显示了四个不同的质子峰，分别为8.85,8.28,8.12和8.06ppm(图4a)。随着n2h4的加入，上述峰消失，在8.60、7.98、7.98和7.86ppm左右的上场逐渐出现新的峰(图4b)，这与报道的2-吡啶甲酰肼上的氢化学位移一致。同时，在9.85ppm和4.56ppm出现了两个新的单峰，
1对n2h4具有良好的选择性和反应性。该探针显示了对n2h4的比率荧光和比色近红外荧光响应，lod低至0.3ppb。此外，本发明还将cdm-1加载到试纸上并成功地用于检测n2h4蒸汽。值得注意的是，cdm-1已成功地用于监测活细胞中典型药物inh代谢产物的外源性和内源性n2h4，表明其在进一步生物学研究中的潜在价值。
[0093]
以上内容是对本发明及其实施方式进行了示意性的描述，该描述没有限制性，实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的实施方式并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的实施方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种化合物，具有下式结构：2.如权利要求1所述的化合物，所述化合物cdm-1在ph＝7.4的含有20％dmso的pbs缓冲溶液中具有390
±
5nm的紫外-可见吸收峰；和/或所述化合物cdm-1在ph＝7.4的含有20％dmso的pbs缓冲溶液中，在激发波长为423nm时，具有545
±
20nm的荧光发射峰。3.如权利要求1所述的化合物，所述化合物cdm-1在ph＝7.4的含有20％dmso的pbs缓冲溶液中与肼反应后具有496
±
5nm的紫外-可见吸收峰；和/或所述化合物在ph＝7.4的含有20％dmso的pbs缓冲溶液中与肼反应后，在激发波长为423nm时，具有666
±
20nm的荧光发射峰。4.一种近红外比率荧光探针或试纸，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物。5.如权利要求1～4中任意一项所述的化合物或近红外比率荧光探针或试纸在检测肼中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用荧光光谱法，所述化合物cdm-1对肼的检测限为0.3ppb。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述cdm-1与肼的接触时间小于等于20min。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：使化合物cdm-1或含有化合物cdm-1的介质或载体与肼或含有肼的介质或载体接触，经过一定时间后，测定在特定激发波长下的荧光发射峰或在日光或紫外灯下比色。9.一种肼的定性检测方法，其特征在于，包括：s1采用化合物cdm-1或含有化合物cdm-1的介质或载体，与肼或含有肼的介质或载体接触形成混合物；
s2检测步骤s1的混合物的紫外可见吸收光谱或荧光发射光谱，或在日光或紫外灯下比色。10.一种肼的定量检测方法，其特征在于，包括：a1建立不同量肼与化合物cdm-1的荧光发射强度比值i
666nm
/i
545nm
的工作曲线；a2采用化合物cdm-1或含有化合物cdm-1的介质或载体，与肼或含有肼的介质或载体接触形成混合物；a3检测步骤a2的混合物的荧光发射光谱，得到荧光发射强度比值i
666nm
/i
545nm
；a4计算肼的量。

技术总结
本发明公开了一种近红外比率荧光探针及其应用，属于探针检测技术领域。本发明利用氢键锚定的传感策略，研制了一种对N2H4具有比率荧光和比色响应的近红外(NIR)荧光探针CDM-1。在本发明中，首次利用探针的吡啶单元与肼的H原子形成氢键靶向分析物，产生分子内六元环亲核进攻以释放荧光团，从而保证了高选择性和灵敏度，检测限为0.3ppb。该探针已成功加载到试纸条上，以检测N2H4蒸汽。此外，本发明还证明了CDM-1在监测活细胞中典型药物INH代谢物的外源性和内源性N2H4方面的潜在生物学价值。方面的潜在生物学价值。方面的潜在生物学价值。


技术研发人员：江杰 宋琪 张永强
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/16