一种杂交瘤细胞株及其分泌均一识别泰乐菌素/替米考星单克隆抗体的制备及应用

1.本发明涉及免疫学领域，涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌均一识别泰乐菌素/替米考星单克隆抗体和应用。


背景技术：

2.泰乐菌素(tylosin，tyl)是从链霉菌的培养液中提取的一种大环内酯类抗生素，替米考星(tilmicosin，tm)是泰乐菌素的半合成衍生物，其抗菌谱与泰乐菌素相似，两者广泛用于治疗各种动物的细菌感染。此外，它们作为饲料添加剂还能促进动物生长，提高饲料利用率。然而，tyl和tm给药后，药物残留广泛分布于家畜的体液和组织中，长期食用这些受污染的食物可能会引起过敏反应，因此，我国规定牛奶中tyl和tm的最大残留限量(mrl)为50μg/kg，建立牛奶中同步检测tyl/tm的快速分析方法，有较好的应用价值。
3.侧流层析免疫分析法(lfa)是最为常用的快速分析方法。性能优越的抗体是免疫分析方法建立的核心，尤其是针对不同化合物的检测时，抗体的识别能力决定了免疫分析方法检测结果的准确性。文献报道表明，采用tyl或者tm的分子结构进行衍生制备的半抗原，获得的抗体针对tyl/tm的识别能力往往差异性很大，采用tyl-aoaa制备出抗体，针对tm的交叉反应率(cr)仅为27.57％；而采用半抗原des-aoaa，制备出tyl抗体，与tm的cr为51％。若基于上述抗体，建立同时检测tyl/tm的免疫分析方法，若以tyl为标准，抗体对tm的识别力较弱，会给检测带来假阴性结果；若以tm为标准，抗体对tyl的识别力较强，会给检测带来假阳性结果。因此制备均一识别tyl/tm的单克隆抗体，并建立牛奶中同时准确检测tyl/tm的lfa，十分重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种杂交瘤细胞株及其分泌均一识别tyl和tm单克隆抗体和应用。所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以同步识别tyl和tm，交叉反应率为92.44％，可用来建立准确检测tyl和tm的免疫学分析方法。
5.第一方面，本发明提供一种des-aoaa半抗原及完全抗原，其结构式如下所示：
[0006][0007]
第二方面，本发明提供一种杂交瘤细胞株des-aoaa-14d5，通过所述半抗原及完全抗原制备得到。完整保藏信息如下：
[0008]
保藏编号为：cgmcc no.45303；分类命名为：杂交瘤细胞株des-aoaa-14d5；保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2022年8月26日。
[0009]
进一步采用杂交瘤细胞株des-aoaa-14d5制备单克隆抗体。该抗体针对tyl/tm的ic
50
分别为1.59ng/ml和1.72ng/ml，以tyl为标准，cr为92.44％。
[0010]
第三方面，本发明进一步提供包含所述单克隆抗体的免疫层析试纸条。
[0011]
第四方面，本发明进一步提供所述单克隆抗体或所述免疫层析试纸条在牛奶中同步准确检测tyl和tm中的应用。
[0012]
本发明优点：提供了一种杂交瘤细胞株，其能分泌均一识别tyl和tm单克隆抗体，该单克隆抗体可以同步识别tyl和tm，交叉反应率为92.44％。可以用来建立准确检测tyl和tm的免疫学分析方法。该单克隆抗体制备的试纸条灵敏度和准确度较高(ic
50
分别为2.91和2.78ng/ml)，对于监控牛奶中的tyl/tm具有良好的实际应用性。
附图说明
[0013]
图1为本发明实施例2和例3提供的包被原和免疫原的紫外扫描图谱；
[0014]
图2为本发明实施例2提供的半抗原des-aoaa离子扫描质谱图；
[0015]
图3为本发明实施例5提供的单克隆抗体des-aoaa-14d5的elisa标准曲线；
[0016]
图4为本发明实施例6提供的不同k2co3添加量胶体金颜色对比图；
[0017]
图5为本发明实施例6提供的胶体金试纸条包被原不同划膜浓度检测线显色强度变化柱形图；
[0018]
图6为本发明实施例6提供的胶体金试纸条不同抗体添加量检测线显色强度变化柱形图；
[0019]
图7为本发明实施例6提供的胶体金试纸条不同探针添加量检测线显色强度变化柱形图；
[0020]
图8为本发明实施例6提供的胶体金试纸条对tyl/tm的标准曲线；
[0021]
图9为本发明实施例6提供的胶体金试纸条的特异性测试图。
具体实施方式
[0022]
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明，以下没有特别说明，百分比均为质量百分比。
[0023][0024]
实施例1：des的制备
[0025]
称取酒石酸泰乐菌素5g，溶解于ph 2.0硫酸溶液300ml中，85℃水浴3h。反应完毕后，冷却至20℃，并转入分液漏斗中，二氯甲烷100ml萃取3次，弃二氯甲烷层。水相用饱和碳酸钠溶液调ph至8.8，二氯甲烷100ml萃取3次，合并二氯甲烷层，加入无水硫酸钠10g，振摇后静置过夜。过滤后，40℃减压旋转蒸干。残留物加入5ml二氯甲烷，放入-20℃冰箱中，静置过夜，析出物即为des。
[0026][0027]
实施例2：半抗原des-aoaa的制备
[0028]
取des 72mg和o-羧甲氧基胺11mg溶于4ml甲醇中，室温搅拌2.5h，旋转蒸干即得半抗原des-aoaa。质谱鉴定结果见图2。合成产物的分子离子峰[m+h]+为m/z 846.4583。说明半抗原合成成功。
[0029]
其结构式如下所示：
[0030][0031]
实施例3：完全抗原的制备
[0032]
取des-aoaa85mg、n，n-二环己基碳二亚胺42mg和n，n-羟基丁二酰亚胺22mg溶于4ml n，n-二甲基甲酰胺中，室温下反应12h，1000rmp/min离心去除沉淀，即为活化的半抗原。
[0033]
取血蓝蛋白(klh)10mg，溶于10ml 0.1mmol磷酸钠缓冲液中。滴入上述活化的半抗原0.1ml。冰浴条件下，磁力搅拌12h。偶联物在磷酸盐缓冲液中透析3d，即得免疫原des-aoaa-klh，分装，置-20℃保存备用。
[0034]
在上述步骤中，将klh换成30mg牛血清白蛋白(bsa)，即得偶联物des-aoaa-bsa，作为包被原用。其结构式如下所示：
[0035][0036]
将半抗原，免疫原，包被原，klh和bsa分别使用紫外分光光度计扫描。如图1所示，半抗原在289nm处有最大吸收峰，klh和bsa分别在279.5nm和278.5nm处有最大吸收峰。而免疫原des-aoaa-klh和包被原des-aoaa-bsa的最大吸收峰分别为284nm和285nm处，紫外吸收峰有了一定的偏移，证明了免疫原和包被原成功合成。
[0037]
实施例4：单克隆抗体的制备
[0038]
4.1动物免疫
[0039]
以实施例3中制备的des-aoaa-klh为免疫原，免疫balb/c雌性小鼠。首次免疫用100μl生理盐水和100μl弗氏佐剂乳化，皮下注射到背部的多个部位。每3周用100μl生理盐水和100μl弗氏不完全佐剂乳化，加强免疫3次。第3次免疫后8d，采集小鼠尾部静脉血清，采用间接elisa和间接竞争elisa方法进行检测，包被原des-aoaa-bsa稀释倍数为20000，小鼠血清稀释7000倍测定，结果见表1，所有小鼠均获得较好的免疫，对tyl的识别力较好，其中9号小鼠可以同步识别tm，抑制率分别为57.9％和45.73％，选取9号小鼠融合。
[0040]
表1.des-aoaa-klh免疫原第4次免疫结果
[0041][0042]
4.2细胞融合与筛选
[0043]
在融合前3d，9号小鼠腹腔注射300μg des-aoaa-klh，冲击免疫。采用peg将骨髓瘤细胞sp2/0和脾脏细胞进行融合，以tyl/tm为标准品，间接竞争elisa筛选阳性孔，通过有限稀释法进行亚克隆，最终建立一株能稳定分泌识别tyl/tm的杂交瘤细胞株，命名为des-aoaa-14d5。采用腹水诱生法制备抗体，用辛酸-硫酸铵法进行纯化，抗体亚型鉴定试剂盒鉴定该抗体亚型为igg2型。
[0044]
杂交瘤细胞株的完整保藏信息如下：
[0045]
保藏编号为：cgmcc no.45303；分类命名为：杂交瘤细胞株des-aoaa-14d5；保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2022年8月26日。
[0046]
实施例5：单克隆抗体性能测试
[0047]
5.1试剂配制
[0048]
碳酸盐缓冲液(cb，0.05mol/l，ph 9.6)：准确称取na2co
3 1.59g，nahco
3 2.93g，用超纯水溶解，并定容至1000ml。
[0049]
磷酸盐缓冲液(pbs，10mmol/l，ph 7.4)：准确称取nacl 8g，kcl 0.2g，na2hpo4·
12h2o 2.9g，kh2po
4 0.2g，用超纯水溶解，并定容至1000ml。
[0050]
洗涤液(0.5％ pbst)：量取pbs 1000ml，加入tween-20 0.5ml，涡旋混匀。
[0051]
封闭液：准确称取3.0g脱脂乳粉，加入pbs 100ml，充分搅拌均匀至完全溶解。
[0052]
底物显色液：底物显色液为四甲基联苯胺(tmb)溶液，取底物液a0.5ml，底物液b 0.5ml混匀，现配现用。
[0053]
终止液：将100ml浓硫酸缓慢滴加至800ml超纯水中，其间不断搅拌。
[0054]
5.2间接竞争elisa步骤
[0055]
将包被原des-aoaa-bsa用cb溶液稀释至0.25ng/l，每孔添加100μl，置于4℃冷藏过夜，用pbst溶液洗涤1次，甩干，每孔加入150μl封闭液，37℃封闭2h；甩干后每孔加入50μl pbs溶液或0.1，0.3，0.9，2.7，8.1，24.3ng/ml的tyl溶液，再加入50μl 0.05ng/l des-aoaa-14d5溶液，37℃反应30min；用pbst溶液洗涤1次，甩干，每孔加入100μl酶标二抗，37℃反应30min；用pbst溶液洗涤3次，甩干，每孔加入100μl底物混合液，37℃反应10min；每孔加入50μl终止液。用酶标仪测定od
450
值。根据酶标仪读出的数据，计算出标准曲线。以交叉反应率和ic
50
值综合考察抗体性能，结果见表2及图3，从结果可知：以des-aoaa-bsa作为包被原，des-aoaa-14d5抗体对tyl/tm的ic
50
值分别为1.59和1.72ng/ml，交叉反应率是92.44％，表明该抗体可以均一识别tyl/tm。
[0056]
表2.单克隆抗体性能测定
[0057][0058]
实施例6：胶体金侧流层析免疫分析方法的构建
[0059]
6.1溶液配置
[0060]
碳酸盐缓冲液(cb，0.05mol/l，ph 9.6)：准确称取na2co
3 1.59g，nahco
3 2.93g，用超纯水溶解，并定容至1000ml。
[0061]
磷酸盐缓冲液(pbs，10mmol/l，ph 7.4)：准确称取nacl 8g，kcl 0.2g，na2hpo4·
12h2o 2.9g，kh2po
4 0.2g，用超纯水溶解，并定容至1000ml。
[0062]
样品稀释液(0.5％ pbst)：称取pbs 1000ml，加入tween-20 0.5ml，涡旋混匀。
[0063]
样品垫处理液：称取牛血清蛋白2g，蔗糖10g，tween-20 200μl，proclin 30040μl，用pbs溶解并定容至200ml；
[0064]
二抗稀释液：称取牛血清白蛋白1g，proclin 300 20μl，用pbs溶解并定容至100ml。
[0065]
质量百分比1％氯金酸的配制：称取0.6g氯金酸加入60ml超纯水中，混匀，4℃冰箱保存备用。
[0066]
质量百分比1％柠檬酸三钠的配制：取0.684g二水合柠檬酸三钠溶于60ml超纯水中，封口备用。
[0067]
k2co3溶液(0.1mol/l)：准确称取k2co
3 1.38g，用超纯水定容至100ml。
[0068]
金标抗体重悬液：准确称取牛血清白蛋白1g，proclin 300 20μl，葡聚糖40000 1g，peg 20000 0.05g，用pbs溶解并定容至100ml。
[0069]
6.2胶体金的制备
[0070]
取100ml锥形瓶，加入100ml超纯水，搅拌加热至沸腾后，迅速加入1ml质量百分比1％氯金酸溶液。待氯金酸水溶液沸腾后，迅速加入1ml质量百分比1％柠檬酸三钠溶液，溶液在2min内由金黄色变为紫红色，8min后形成酒红色溶液。冷却至室温，定容至100ml，置于4℃保存。
[0071]
6.3胶体金标记抗体制备
[0072]
取一系列1.5ml ep管用超纯水润洗，取1ml胶体金于每管内，分别加入0，0.5，1，1.5，2，2.5μl 0.1m k2co3溶液调节ph值，混匀；加入6μg des-aoaa-14d5，混匀静置25min；加入30μl 10％的bsa溶液，混匀静置20min；8500rpm离心10min，弃去上清液，用金标抗体重悬液将沉淀重悬至0.2ml，混匀后放在4℃备用。
[0073]
当k2co3添加量过少时，胶体金溶液的ph值低于抗体的等电点，带正电荷的抗体会与带负电荷的胶体金形成大颗粒，胶体金的稳定状态被破坏，造成胶体金颗粒聚沉，颜色发生改变。当k2co3添加量过大时，胶体金溶液ph值偏大，不利于实验的进行。如图4所示，可以明显看出，k2co3溶液添加量为2和2.5μl时，两者溶液颜色均呈红色，由于k2co3添加量过大不利于实验的进行，因此选择2μl 0.1m k2co3添加量为最佳ph条件。
[0074]
6.4试纸条的构建
[0075]
试纸条由样品垫，nc膜，吸水纸和pvc底板组成。将样品垫切割成5cm宽，经样品垫
处理液充分浸泡后放入鼓风干燥箱中，37℃烘干12h。用cb将包被原稀释至0.35mg/ml，划线形成检测线(t线)。用二抗稀释液将羊抗鼠igg稀释至0.5mg/ml，划线形成质控线(c线)。置于鼓风干燥箱37℃干燥过夜。将样品垫、nc膜、吸水纸依次粘贴于pvc底板上，切成3.2mm宽的试纸条，密封保存。
[0076]
6.5试纸条划膜浓度优化
[0077]
准确移取7μl金标抗体于微孔中，每孔添加200μl含有浓度为0，2，8ng/ml tyl的脱脂牛奶，分别插入des-aoaa-bsa包被原划取浓度为0.7，0.35，0.175mg/ml的试纸条，反应8min；使用金标免疫层析分析仪读取相应的数值，根据显色和竞争结果判断最佳划膜浓度。
[0078]
结果见图5，当划膜浓度为0.175mg/ml时，t线读值在602，检测线的显色较浅，不利于肉眼判读；当划膜浓度为0.7mg/ml时，t线读值在894，显色效果较好，但是tyl为2ng/ml和8ng/ml的抑制率分别为41.72％、62.75％，竞争效果较差，灵敏度较低；当划膜浓度为0.35mg/ml时，t线读值在784，tyl为2ng/ml和8ng/ml的抑制率为别为44.64％、74.11％。因此，选用0.35mg/ml为最佳划膜浓度，进行下一步优化。
[0079]
6.6抗体添加量的优化
[0080]
分别加入6，10，14μg的des-aoaa-14d5与200μl含有浓度为0，2，8ng/ml tyl的脱脂牛奶，插入试纸条，反应8min。
[0081]
结果见图6，当抗体添加量为6μg时，t线读值为612，检测线显色较浅，不利于肉眼的判读。当抗体添加量为14μg时，t线读值为912，显色效果较好，但是tyl为2ng/ml和8ng/ml的抑制率为别为38.15％、81.46％，灵敏度较低；当抗体添加量为10μg时，t线读值为784，显色效果较好，tyl为2ng/ml和8ng/ml的抑制率为别为44.64％、88.39％。因此，选用10μg抗体添加量进行后续实验。
[0082]
6.7金标抗体添加量的优化
[0083]
分别加入5，7，9μl的金标抗体与200μl含有浓度为0，2，8ng/ml tyl的脱脂牛奶，插入试纸条，反应8min。
[0084]
结果见图7，当金标抗体添加量为5μl时，t线读值为402，检测线显色较浅，不利于肉眼的判读。当金标抗体添加量为9μl时，t线读值为912，显色效果较好，但是tyl为2ng/ml和8ng/ml的抑制率为别为12.28％、57.34％，灵敏度较低；当金标抗体添加量为7μl时，t线读值为784，显色效果较好，tyl为2ng/ml和8ng/ml的抑制率为别为47.45％、88.39％。因此，选用7μl金标抗体添加量进行标准曲线的建立。
[0085]
6.8标准曲线的建立
[0086]
基于上述优化条件，添加7μl金标抗体，将tyl/tm用脱脂牛奶稀释至0，1，2，4，8，16ng/ml，每孔添加200μl，插入试纸条，反应8min。以tyl/tm标准品添加浓度的对数值为横坐标，以显色读数仪检测的比色数值作为纵坐标进行标准曲线的绘制，以cut-off值和ic
50
值进行判定，建立标准曲线。
[0087]
结果如图8所示，通过肉眼观察，可得到cut-off值均为16ng/ml；通过定量检测，得到tyl/tm的ic
50
值分别为2.91和2.78ng/ml，线性范围分别为1.27～6.61ng/ml和1.05～7.34ng/ml，交叉反应率为104.68％。
[0088]
6.9特异性检验
[0089]
采用20ng/ml tyl，20ng/ml tm及1mg/l的泰妙菌素、阿维菌素、链霉素、红霉素、螺
旋霉素的标准品，按建立的lfa进行检测，考察lfa的特异性。结果见图9，本发明建立的lfa与上述抗生素几乎没有交叉反应性(cr《0.01％)，可以准确同时检测tyl/tm。
[0090]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种去碳霉糖泰乐菌素-氧羧甲基羟胺(des-aoaa)半抗原，其特征在于，其分子结构式如下所示：2.一种去碳霉糖泰乐菌素-氧羧甲基羟胺完全抗原，其特征在于，其分子结构式如下所示：klh代表血蓝蛋白；bsa代表牛血清白蛋白。3.一种杂交瘤细胞株des-aoaa-14d5，其特征在于，由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为：cgmcc no.45303，分类命名为：杂交瘤细胞株。4.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求3所述杂交瘤细胞株des-aoaa-14d5产生。5.一种胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所用抗原为权利要求2所述完全抗原，所述抗体为权利要求4所述单克隆抗体。6.如权利要求4所述的单克隆抗体用于胶体金免疫层析试纸条同步检测牛奶中tyl和tm的应用。

技术总结
本发明属免疫学领域，公开了一种杂交瘤细胞株及其分泌均一识别泰乐菌素/替米考星单克隆抗体的制备及应用。所述单克隆抗体杂交瘤细胞株命名为DES-AOAA-14D5，保藏编号为CGMCC NO：45303。本发明利用去碳霉糖泰乐菌素与氧羧甲基羟胺合成制备半抗原，偶联载体蛋白制备完全抗原，免疫小鼠，经过细胞融合及筛选技术制备得到一种能分泌均一识别泰乐菌素/替米考星单克隆抗体的杂交瘤细胞株，IC


技术研发人员：张西亚 王尤一 宋莲军 毛烨炫 黄现青 补彤 党梦 王田林 李子哲 李庆越 王金魁
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/16