一种山苍子胚性愈伤组织诱导培养基及诱导方法

1.本发明属于植物组织培养技术领域，涉及诱导培养基以及基于该培养基的诱导方法，特别涉及山苍子胚性愈伤组织诱导培养基及基于山苍子胚性愈伤组织诱导培养基的山苍子胚性愈伤组织诱导方法。


背景技术：

2.山苍子是我国南方极具开发利用价值的木本香料树种，但其良种选育及产业规模化仍为亟待解决的问题。
3.目前，山苍子人工栽培规模较小，主要受制于优良种苗的高效繁育技术，其苗木繁育技术主要包括种子繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖、组织培养4种方式。
4.种子繁殖不仅发芽率低，经济成本高，且后代性状分离严重，难以保持亲本优良性状，不适宜开展大规模造林或产业化开发。
5.由于受到柠檬醛等代谢产物的影响，山苍子枝条伤口处极易氧化，且繁殖过程受限于自然因素，导致山苍子的扦插和嫁接繁殖育苗繁殖系数较低。
6.组织培养与上述三种繁殖技术相比，具有繁殖系数高、周期短、不受自然条件影响、遗传稳定等优点。现有的组织培养方法，例如cn111642391a公开的一种山苍子组织培养方法，以山苍子春稍带芽的茎段为外植体进行培养。
7.将外植体置于特定激素配比的培养基中，先诱导出胚性愈伤组织，再由胚性愈伤组织分化形成体细胞胚，最后形成完整植株。这一过程称为体细胞胚胎发生的间接途径。体细胞胚胎发生作为组织培养的方式之一，具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点，在苗木快繁、基因工程、种质资源保存等方面均具有广泛的应用前景。其中，优质的胚性愈伤组织是获得体细胞胚的前提，也是研究植物单细胞分化和基因全能性表达的理想材料。但现有技术还没有关于山苍子进行胚性愈伤组织培养的相关研究。


技术实现要素：

8.鉴于此，本发明目的之一在于提供一种山苍子胚性愈伤组织诱导培养基。
9.本发明目的之二在于提供一种山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法。
10.发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，在ms培养基中添加有0.5～1mg
·
l-1 6-ba、0.2～1.0mg
·
l-1 2,4-d、0.2～0.5mg
·
l-1
iaa，ph 5.85。
11.根据本发明山苍子胚性愈伤组织诱导培养基的一个实施方式，所述诱导培养基中还添加有20～30g/l蔗糖或20～40g/l葡萄糖。
12.根据本发明山苍子胚性愈伤组织诱导培养基的一个实施方式，所述诱导培养基中还添加有700mg/l酸水解酪蛋白。
13.根据本发明山苍子胚性愈伤组织诱导培养基的一个实施方式，所述诱导培养基中
还添加有7g/l琼脂。
14.本发明还提供了一种山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法，包括如下步骤：
15.s1、采集具胚且未成熟山苍子鲜嫩果实，立即处理或4～8℃保存待处理；
16.s2、外植体预处理
17.彻底清洗去除果实表面泥垢，无菌条件下剥去肉质外种皮，再用75％乙醇浸泡3～5min，摇晃灭菌后用无菌水冲洗数次；
18.s3、诱导培养
19.消毒后的山苍子果实用无菌滤纸吸干，剥去外果皮，沿胚中轴将种子切开；接种至权利要求1～4任一项所述诱导培养基中诱导培养，获取胚性愈伤组织；
20.s4、胚性愈伤增殖与分化诱导培养
21.选取新鲜、长势良好的胚性愈伤组织，置于增殖培养基进行增殖培养。
22.根据本发明山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法的一个实施方式，所述增殖培养基组分为：在ms培养基中添加有0.5mg
·
l-1 6-ba、0.1mg
·
l-1 2,4-d、0.25mg
·
l-1
iaa。
23.根据本发明山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法的一个实施方式，所述增殖培养基组分还包括30g/l蔗糖或40g/l葡萄糖、700mg/l酸水解酪蛋白和7g/l琼脂。
24.根据本发明山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法的一个实施方式，所述未成熟山苍子鲜嫩果实中的胚为幼胚。
25.根据本发明山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法的一个实施方式，所述幼胚为球形胚、心形胚、鱼雷胚或子叶形胚。
26.根据本发明山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法的一个实施方式，培养条件为黑暗培养，温度为24
±
2℃。
27.与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
28.a)本发明首次实现了山苍子胚性愈伤组织诱导，为山苍子资源利用和产业化开发开辟了新的途径。胚性愈伤组织诱导阶段是分化了的体细胞重新恢复全能性的关键阶段，它受外植体种类、外植体发育阶段、激素添加物的配比、培养方式与培养条件等多种内外因素的影响，并决定后期体胚发生能否成功，是体胚发生研究中非常重要的环节。
29.b)本发明采用的体胚发生技术作为植物组织培养中形态发生的最有效途径之一，与器官发生途径相比，其产生的体细胞胚具有明显的两极性，还具有繁殖量更大，增殖效率更高、遗传更稳定等优点。
30.c)本发明提供的胚性愈伤组织诱导方案，是体细胞胚胎发生间接方式中的首要环节，也是获得大量体细胞胚的前提。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
32.图1是山苍子果实、种子和种胚形态图。
33.图2是山苍子未成熟胚诱导的愈伤组织图，其中，a.白色紧实型；b.白色松散型；c.
胚性愈伤组织；d.体细胞胚；nec:非胚性愈伤组；ec:胚性愈伤组织；se:体细胞胚。
34.图3是山苍子胚性愈伤组织和体细胞胚的产生过程。其中，ec:胚性愈伤组织；se:体细胞胚。
具体实施方式
35.下面结合附图与一个具体实施例进行说明。
36.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
37.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中可以不对其进行进一步定义和解释。
38.实施例1
39.本实施例所描述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基是基于阶段性试验数据分析推导得出的理论最优培养基配方：在ms培养基中添加有0.5mg
·
l-1 6-ba、1.0mg
·
l-1 2,4-d、0.2mg
·
l-1
iaa、40g/l葡萄糖、700mg/l酸水解酪蛋白和7g/l琼脂，ph 5.85。
40.因山苍子种子发育阶段对山苍子胚性愈伤组织诱导效果具有显著影响，以及未成熟种子保存方式和保藏时间对山苍子胚性愈伤组织诱导效果也存在显著影响，故而诱导材料限制了发明人团队对该理论最优培养基配方的验证。
41.尽管如此，发明人已经通过试验证明了6-ba、2,4-d与iaa的激素组合能够实现山苍子胚性愈伤组织诱导，并且已经达到了可以在产业中应用的诱导效果。
42.根据发明人研究过程中获得的试验数据：发明人以ms为基本培养基，添加不同浓度(mg
·
l-1
)的2,4-d(0.2、0.5、1.0、2.0)、6-ba(0.5、1.0、1.5、2.0)、iaa(0.2、0.5)、naa(0.2、0.5)、kt(1.0、2.0)激素组合筛选实验，通过l9(34)正交实验设计和单因素完全随机实验设计，每处理设置重复4次，每次重复的培养皿中接种5个山苍子种胚进行试验，通过数据分析最终确认在ms培养基中添加0.5mg
·
l-1 6-ba、1.0mg
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l-1 2,4-d、0.2mg
·
l-1
iaa的组合是最佳组合，见表1。
43.表1山苍子愈伤诱导l9(34)正交实验结果极差分析
[0044][0045]
不同激素配比均能产生愈伤组织，但愈伤组织诱导率差异显著。对l9(34)正交实验的愈伤诱导结果进行极差分析后，结果表明，因子主次顺序为iaa》2,4-d》6-ba，iaa浓度对愈伤组织诱导率具有更加显著影响，当iaa浓度为0.2mg
·
l-1
时，愈伤平均诱导率最高，达65.99％；2,4-d浓度为1.0mg
·
l-1
时，愈伤平均诱导率最高，达65.81％；6-ba浓度为0.5mg
·
l-1
时，愈伤平均诱导率最高，达64.11％。
[0046]
正交试验中，1.5mg
·
l-1 6-ba、1.0mg
·
l-1 2,4-d、0.2mg
·
l-1
iaa处理的愈伤诱导率为79.37％，基于数据分析，可以合理预期0.5mg
·
l-1 6-ba、1.0mg
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l-1 2,4-d、0.2mg
·
l-1
iaa激素组合的愈伤诱导效果更好。
[0047]
参见表2，不同碳源均能产生愈伤组织，且愈伤组织诱导率差异显著(p《0.05)，其中，从愈伤组织诱导率来看，葡萄糖＞蔗糖＞麦芽糖，当葡萄糖浓度为40g/l时，愈伤诱导率最高，可达100.00％。
[0048]
表2不同碳源对山苍子愈伤组织和胚性愈伤组织诱导的影响
[0049][0050]
实施例2
[0051]
本实施例所描述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，是在发明人研究试验过程中基于单因素试验设计筛选得出的阶段性成果，通过不同激素种类选择和浓度设置诱导试验发现，激素配比对山苍子胚性愈伤组织诱导成功与否具有非常重要的影响，参见表3。
[0052]
从表3可知，在同时添加kt和另一种激素(2,4-d、iaa、naa)的培养基中(处理1、2、3、4)，处理1、2愈伤诱导率为0.00％，处理3、4愈伤诱导率均在30％以下，且愈伤组织全为白色或灰白色紧实状，不具胚性。在同时添加2,4-d和另一种激素(iaa、naa、kt)的培养基中(处理3、4、5、6)，愈伤组织诱导率均在30％以下，处理3、4、5均为非胚性愈伤组织，而处理6可同时诱导产生胚性和非胚性愈伤组织，其中胚性愈伤组织诱导率为12.50％，呈淡黄色松散颗粒状，与外植体连接不紧密。非胚性愈伤组织呈白色松散状，与外植体连接紧密。在同时添加6-ba和另一种激素(2,4-d、iaa、naa)的培养基中(处理7、8、10)，愈伤组织诱导率明显提高，其中处理7、10可诱导出胚性愈伤组织，诱导率分别为5.00％和12.50％。在处理9中，同时添加三种激素(6-ba、2,4-d、iaa)，愈伤诱导率最高，可达79.63％，且胚性愈伤诱导率也最高，达17.50％。
[0053]
表3不同激素配比对山苍子愈伤组织和胚性愈伤组织的影响
[0054][0055]
因实验条件限制，特别是山苍子未成熟种子发育时间对材料采集的限制，发明人在后续实验中实际使用了本实施例中的培养基：在ms培养基中添加有1.0mg
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l-1 6-ba、0.2mg
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l-1
2,4-d、0.5mg
·
l-1
iaa、30g/l蔗糖、700mg/l酸水解酪蛋白和7g/l琼脂，ph 5.85。
[0056]
实施例3
[0057]
本实施例所描述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法，具体步骤如下。
[0058]
s1、采集未成熟山苍子鲜嫩果实。
[0059]
本实施例中，在江西农业大学科技园内，用高枝剪剪取高柠檬醛型的山苍子优良单株带果实的枝条，摘取的果实用密封袋装好后，置于医用冷藏柜中4-8℃保存，带回实验室立即处理。
[0060]
本实施例中，果实实际采集时间为7月10日。在该时间段内摘取的果实，子叶形胚已经开始出现分化，甚至有的果实已经趋于成熟，参见图1，处理1～6中的山苍子果实发育程度不同。以处理1～4为材料的诱导试验未获得胚性愈伤组织，处理5胚性愈伤诱导率为6.67％，处理6胚性愈伤诱导率为7.04％。根据申请人并列研究，发现山苍子心形胚时期是5
～6月份，从本发明试验结果可以合理推测，在5～6月份采摘球形胚、心形胚或鱼雷胚的山苍子果实，诱导率会明显高于本实施例所示出的试验结果数据。
[0061]
s2、外植体预处理
[0062]
选取无虫咬、发黑的果实，用洗洁精进行流水冲洗，并用带绒毛的毛刷轻轻搅拌，盖纱布流水冲洗一小时以保证表面泥垢充分除去。流水冲洗后置于洁净桌面上，佩戴无菌手套将肉质外果皮轻轻剥去。用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡5min，摇晃灭菌后用无菌水冲洗5次。
[0063]
外植体的消毒是进行胚性愈伤组织诱导的一个重要步骤。合适的消毒方式可以有效避免最初的微生物来源，从而保障胚性愈伤组织诱导率。选择75％酒精对内果皮消毒5min时，其污染率最低。
[0064]
表4不同消毒方式对山苍子污染率的影响
[0065][0066]
s3、诱导培养
[0067]
消毒后的山苍子果实用无菌滤纸吸干，剥去外果皮，沿胚中轴将种子切开；接种至实施例2所述诱导培养基中诱导培养，获取胚性愈伤组织。黑暗培养，温度为24℃。
[0068]
参见图2，图中，nec为非胚性愈伤组；se为体细胞胚；ec为胚性愈伤组织。以山苍子种胚为外植体可以诱导得到2类愈伤组织，将愈伤置于体式显微镜下观察后发现，第一类愈伤组织多呈白色紧实(a图)或白色松散状(b图)，不易与外植体分离，且经过继代后极易褐化死亡，无法分化出体细胞胚，为非胚性愈伤组织。而第二类愈伤组织淡黄色颗粒状，质地疏松，与母体连接不紧密，易剥离(c图)。从诱导培养基中取出并进行增殖培养后，发现可以大量增殖，并成功分化出透明或白色的体细胞胚(d图)，因而判断该类愈伤组织具有胚性，为胚性愈伤组织。此外，在同一诱导条件下，胚性和非胚性愈伤可共同存在，但胚性愈伤组织出现时间明显晚于非胚性愈伤组织。
[0069]
s4、胚性愈伤增殖与分化诱导培养
[0070]
选取新鲜、长势良好的胚性愈伤组织，置于增殖培养基进行增殖继代培养。所述增殖培养基组分为：在ms培养基中添加有0.5mg
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l-1 6-ba、0.1mg
·
l-1 2,4-d、0.25mg
·
l-1
iaa，30g/l蔗糖、700mg/l酸水解酪蛋白和7g/l琼脂。
[0071]
参见图3。在体式显微镜下对胚性愈伤组织分化过程进行持续观察，能够发现胚性愈伤组织得到明显增殖，最初的淡黄色、松散颗粒状胚性愈伤组织(a图)，在15d后逐步膨大，分化形成黄色的球形胚(b图)，球形胚会进一步分化成两瓣透明的体细胞胚(c图)，随着培养时间的增加，体细胞胚会逐渐变成白色子叶状(e图)，最后，在子叶状体细胞胚的基部，能够观察到不定芽的萌发(f图)。
[0072]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，在ms培养基中添加有0.5～1mg
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l-1
6-ba、0.2～1.0mg
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l-1 2,4-d、0.2～0.5mg
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l-1
iaa，ph为5.85～6。2.根据权利要求1所述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基中还添加有20～30g/l蔗糖或20～40g/l葡萄糖。3.根据权利要求1或2所述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基中还添加有700mg/l酸水解酪蛋白。4.根据权利要求3所述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基中还添加有7g/l琼脂。5.一种山苍子胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、采集具胚且未成熟山苍子鲜嫩果实，立即处理或4～8℃保存待处理；s2、外植体预处理彻底清洗去除果实表面泥垢，无菌条件下剥去肉质外种皮，再用75％乙醇浸泡3～5min，摇晃灭菌后用无菌水冲洗数次；s3、诱导培养消毒后的山苍子果实用无菌滤纸吸干，剥去外果皮，沿胚中轴将种子切开；接种至权利要求1～4任一项所述诱导培养基中诱导培养，获取胚性愈伤组织；s4、胚性愈伤增殖与分化诱导培养选取新鲜、长势良好的胚性愈伤组织，置于增殖培养基进行增殖培养。6.根据权利要求5所述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述增殖培养基组分为：在ms培养基中添加有0.5mg
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l-1 6-ba、0.1mg
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l-1 2,4-d、0.25mg
·
l-1
iaa。7.根据权利要求6所述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述增殖培养基组分还包括30g/l蔗糖或40g/l葡萄糖、700mg/l酸水解酪蛋白和7g/l琼脂。8.根据权利要求6所述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述未成熟山苍子鲜嫩果实中的胚为幼胚。9.根据权利要求8所述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述幼胚为球形胚、心形胚、鱼雷胚或子叶形胚。10.根据权利要求5所述的山苍子胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，培养条件为黑暗培养，温度为24
±
2℃。

技术总结
本发明公开一种山苍子胚性愈伤组织诱导培养基及诱导方法，在MS培养基中添加有6-BA、2,4-D、IAA，pH 5.85，采集具胚且未成熟的山苍子鲜嫩果实，彻底清洗去除果实表面泥垢，无菌条件下剥去肉质外种皮，再用75％乙醇浸泡3～5min，摇晃灭菌后用无菌水冲洗数次；消毒后的山苍子果实用无菌滤纸吸干，剥去外果皮，沿胚中轴将种子切开；接种至诱导培养基中诱导培养，获取胚性愈伤组织；选取新鲜、长势良好的胚性愈伤组织，置于增殖培养基进行增殖培养。本发明首次实现了山苍子胚性愈伤组织诱导，胚性愈伤诱导率达17.50％以上，为山苍子资源利用和产业化开发开辟了新的途径。和产业化开发开辟了新的途径。和产业化开发开辟了新的途径。


技术研发人员：汪加魏 毛卓佳 易敏 陈尚钘 梁擎宇 王宗德 范国荣 付丹 欧阳逾菲 饶磊
受保护的技术使用者：江西农业大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/16