协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于肿瘤的免疫治疗技术领域，具体涉及一种协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗及其制备方法与应用。


背景技术：

2.胰腺癌是难治性肿瘤之一，据文献报道
1.，患者总体5年存活率仅为6％。外科手术是胰腺癌患者的首选治疗手段，但是，超过60％的胰腺癌患者确诊时已失去了最佳手术机会。目前针对胰腺癌的化疗方案有限，全身毒作用大、易发生化疗耐药，而局部微创介入成为近年来用于胰腺癌治疗的非常有前景的新策略
2.。
3.不可逆电穿孔(irreversible electroporation，ire)是近年来新兴的非热消融技术，因其不引起热损伤，避免了“热沉效应”，在实体瘤的治疗上具有很好的应用前景。近期研究提示
3.，胰腺癌、肝癌和肾癌患者接受纳米刀治疗后均有不同程度的临床获益。但是，纳米刀消融后胰腺癌仍有较高的复发和转移风险，病人生存获益相对有限
4.。研究表明
5.，这可能和胰腺特殊免疫微环境有关：肿瘤免疫细胞浸润不足、免疫细胞功能缺失、大量的免疫抑制物质，容易导致了肿瘤免疫逃逸和消融后肿瘤的快速复发。因此，如何激活纳米刀消融肿瘤后的免疫效应，是提高纳米刀治疗效果、延长患者生存期的关键。
4.目前单纯免疫治疗对胰腺癌效果欠佳，然而，纳米刀消融可在一定程度上逆转免疫抑制，使其成为目前唯一适用于胰腺癌的消融治疗方法。ire通过高频短脉冲可在细胞膜上形成不可逆的纳米级穿孔，不仅可直接杀伤肿瘤细胞，且细胞内隐蔽肿瘤抗原的大量释放可促使肿瘤细胞变成原位“肿瘤疫苗”，诱发潜在的抗肿瘤免疫反应，有助于杀伤消融后残余的肿瘤细胞并抑制肿瘤的局部复发与转移，为ire联合免疫疗法治疗恶性肿瘤奠定了基础。
5.在临床实践中，免疫检查点阻断(icb)是最常用的免疫治疗方法。然而，阻断pd-1/pd-l1或联合ctla-4阻断对胰腺癌无效，仅有极少数微卫星不稳定的胰腺癌病例可能由于这种联合免疫治疗获益。最近的研究表明
6.，pd-1/pd-l1抑制可以在临床前癌症模型中协同治疗ire消融治疗胰腺癌或者前列腺癌。这种协同效应主要是由于肿瘤相关抗原(taa)释放增加和免疫浸润增强。然而，临床证据表明
7.，接受联合治疗的胰腺癌患者仍然具有较高的肿瘤复发风险。
6.zhao等
8.将纳米刀消融与pd-1抗体联合用于小鼠原位胰腺癌模型，结果显示联合治疗后小鼠存活时间明显长于单独接受pd-1或纳米刀消融者。进一步联合应用细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)抗体、pd-1抗体与纳米刀消融，发现小鼠存活时间反而缩短，甚至低于单用纳米刀消融及单用pd-1抗体小鼠，主要原因可能在于ctla-4抗体毒性过高。
7.narayanan等
9.报道，纳米刀联合pd-1和toll样受体7(tlr7)可增加胰腺癌小鼠的生存时间和cd8
+
t淋巴细胞及树突状细胞浸润。因此，纳米刀消融联合免疫治疗理论上可改善胰腺癌治疗的效果，但目前仍然存在免疫治疗效率不佳的问题。
8.事实上，免疫治疗的效率高度依赖于免疫浸润和免疫激活水平。尽管免疫检查点
receptorligand,as a means of in vivo vaccination for metastatic pancreaticductal adenocarcinoma(panfire-iii).a phase-i study protocol.cancers 13(2021).
19.[6]lin,m.,et al.irreversible electroporation plus allogenic vγ9vδ2 tcells enhances antitumour effect for locally advanced pancreatic cancerpatients.signal transduction and targeted therapy 5,215(2020).
[0020]
[7]narayanan,j.,et al.irreversible electroporation combined withcheckpoint blockade and tlr7 stimulation induces antitumourimmunity in a murine pancreatic cancer model.cancer immunologyresearch 7,1714-1726(2019).
[0021]
[8]zhao,j.,wen,x.,tian,l.et al.irreversible electroporation reversesresistance to immune checkpoint blockade in pancreatic cancer.natcommun 10,899(2019).
[0022]
[9][1]narayanan j,ray p,hayashi t,et al.irreversibleelectroporation combined with checkpoint blockade and tlr7stimulation induces antitumor immunity in a murine pancreatic cancermodel.[j].cancer immunol res,2019(10).


技术实现要素：

[0023]
本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗及其制备方法与应用。本发明的技术目的在于，一方面解决现有的抗肿瘤药物虽然能够靶向t细胞，但存在t细胞的浸润少，需要进一步的激活手段，或是需要相应的肿瘤细胞突变才能发挥疗效的问题；另一方面提供一种能够实现扩增和激活cd8
+
t细胞浸润并启动后续抗肿瘤免疫的免疫放大水凝胶微球疫苗。
[0024]
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案来实现：
[0025]
本发明首先提供了一种协同肿瘤局部消融的免疫放大水凝胶微球疫苗，所述水凝胶微球疫苗具有内外层的核壳结构，其内层由包载有cd40l的多羧基聚合物于表面沉淀而形成的聚合物碳酸钙纳米粒子组成；其外层由负载有flt3l带负电的水凝胶微球共同组成。
[0026]
经过发明人的大量摸索和研究发现，通过纳米刀消融能够促进cdc1浸润，进一步选择flt3l能够扩增cdc1，cd40l能够活化cdc1。通过本发明方法制备的水凝胶微球负载flt3l和cd40l后，能够靶向激活cdc1细胞，触发后续级联免疫反应。很好解决了现有抗肿瘤药物存在t细胞浸润少，需要树突细胞激活以实现扩增和获能的问题，以及现有部分抗肿瘤药物需要相应肿瘤基因突变才能发挥疗效的问题。
[0027]
本发明提供的载体，通过构建内层在多羧基聚合物表面沉淀得到碳酸钙纳米粒子，然后采用水凝胶微球包裹碳酸钙纳米粒子，构建得到水凝胶微球疫苗。通过将本发明构建得到的载体按照本发明的方式负载flt3l和cd40l后，意外发现该载药体系能够实现扩增和激活cd8
+
t细胞浸润以及启动后续抗肿瘤免疫的效果。
[0028]
起初，本发明人以为是载体实现的相应缓释功能从而实现了上述效果。然而，当本发明人采用上述水凝胶微球载体来负载其它肿瘤药物的组合时，如选择了具有靶向t细胞的抗肿瘤药物(anti-pd-1和anti-ctla-4)，以及涉及基因突变的抗肿瘤药物，如奥拉帕利(brca基因突变)、拉罗替尼或恩曲替尼(ntrk融合基因)以及厄洛替尼(egfr突变)等，结果
发现：选择以上药物中的任何两种，或者选择任何一种与cd40l或flt3l的协同，在与本发明的载体结合时，都达不到扩增和激活cd8
+
t细胞浸润以及启动后续抗肿瘤免疫的效果。因此，本发明的载体与药物的结合，是共同实现了“免疫效应放大器”的功能，能够达到扩增和激活cd8
+
t细胞浸润，增强免疫反应的效果。
[0029]
本发明制备的水凝胶微球疫苗，通过flt3l细胞因子与水凝胶微球之间的静电相互作用调控，可实现早期flt3l通过扩散的方式快速释放，而包裹在第二道屏障caco3纳米颗粒中的cd40l在肿瘤酸性环境中通过caco3纳米颗粒的分解，可实现药物的后续缓慢释放。本发明提供的水凝胶微球疫苗中的flt3l和cd40l细胞因子在肿瘤局部的先后程序化缓慢释放的调控，可实现内源性cdc1s的招募和活化级联扩增，显著放大内源性cd8
+
t细胞在消融治疗后的抗肿瘤免疫作用。
[0030]
进一步的是，所述多羧基聚合物包括分子链中含有谷氨酸或/和甘氨酸的多肽，或是由该多肽形成的peg-聚多肽嵌段聚合物；优选的，所述多肽的分子量为3000-100000da，peg的分子量为500-2000da。
[0031]
进一步的是，所述聚合物包括hooc-plga-peg-plga-cooh、hooc-pla-peg-pla-cooh、hooc-pcl-peg-pcl-cooh、mpeg-plga-cooh、mpeg-pla-cooh或mpeg-pcl-cooh中的任一种；优选的，所述聚合物中plga、pla和pcl的分子量均为500-3000da。
[0032]
进一步的是，所述聚合物碳酸钙纳米粒子的粒径为200-1000nm。
[0033]
进一步的是，所述带负电的水凝胶微球是由微流控方法制备得到的具有双键修饰的天然聚合物水凝胶微球，其中天然聚合物包括海藻酸钠、透明质酸钠的一种或两种，天然聚合物的分子量为10000-400000da，修饰双键的单体为：丙烯酸酐、丁烯酸酐、n碳烯基酸酐(n＝3-15)或丙烯酰氯中的至少一种，双键的修饰率为10-100％。
[0034]
本发明的目的之二是提供如上所述的协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
[0035]
(1)将cd40l和多羧基聚合物溶解于缓冲溶液中，配制成多羧基聚合物浓度为0.05-25wt％、cd40l浓度为10-1000μg/ml的混合溶液，然后将配制好的混合溶液滴加到cacl2溶液中，搅拌反应，得到负载cd40l的聚合物碳酸钙纳米粒子，记为cd40l@聚合物@caco3；
[0036]
(2)将制备的cd40l@聚合物@caco3纳米粒子冷冻干燥；
[0037]
(3)配制flt3l的浓度为10-1000μg/ml，含双键的天然聚合物的浓度为1-5wt％，lap的浓度为0.01-1.5wt％的混合溶液；
[0038]
(4)将步骤(2)冻干后的纳米粒子加入到步骤(3)的混合溶液中，搅拌均匀，作为水相；将表面活性剂分散于石蜡油溶剂中，作为油相，将水相和油相采用微流控方法，制备得到所述协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗。
[0039]
进一步的是，步骤(1)中所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲溶液；优选的，所述搅拌反应的时间为30min；进一步优选的，步骤(1)中所述混合溶液和cacl2溶液的体积比为1:1。
[0040]
进一步的是，步骤(3)中所述含双键的天然聚合物为海藻酸钠或透明质酸钠；优选的，步骤(4)中所述表面活性剂包括span20、span60、span65、span80、吐温20、吐温60、吐温80中的至少一种，所述表面活性剂的浓度为5-15wt％；
[0041]
进一步的是，步骤(4)中将水相和油相分别通过微流控装置，控制油相的流速为
150-1000μl/min，控制水相的流速为5-100μl/min。
[0042]
本发明的目的之三是提供如上所述的水凝胶微球疫苗或是由如上所述方法制备得到的水凝胶微球疫苗的应用，其是将该水凝胶微球疫苗制备成治疗肿瘤的药物。
[0043]
具体的，本发明所指的肿瘤为胰腺癌，同时也为其它的肿瘤在免疫放大效应上提供了方向。
[0044]
本发明的有益效果如下：
[0045]
(1)本发明制备的水凝胶微球疫苗，通过flt3l细胞因子与水凝胶微球之间的静电相互作用调控，可实现早期flt3l通过扩散的方式快速释放，而包裹在第二道屏障caco3纳米颗粒中的cd40l在肿瘤酸性环境中通过caco3纳米颗粒的分解，可实现药物的后续缓慢释放。
[0046]
(2)本发明提供的水凝胶微球疫苗中的flt3l和cd40l细胞因子在肿瘤局部的先后程序化缓慢释放的调控，可实现内源性cdc1s的招募和活化级联扩增，显著放大内源性cd8
+
t细胞在消融治疗后的抗肿瘤免疫作用。
[0047]
(3)本发明的水凝胶微球疫苗安全有效地促进了胰腺癌由“冷”肿瘤向“热”肿瘤的转化，显著提高了原位胰腺癌小鼠的生存时间，并诱导了较强的全身抗肿瘤免疫，产生远隔效应抑制了远处转移的形成和生长。
附图说明
[0048]
图1为本发明实施例1制备的cd40l@聚合物@caco3纳米粒子的sem图片。
[0049]
图2为本发明实施例5制备的cd40l@聚合物@caco3纳米粒子的粒径分布图片。
[0050]
图3为本发明实施例1制备的cd40l@聚合物@caco3/flt3l/hama水凝胶微球疫苗中cd40l在ph 6.8和ph 7.4的释放曲线。
[0051]
图4为本发明实施例1制备的cd40l@聚合物@caco3/flt3l/hama水凝胶微球疫苗中cd40l和flt3l在ph 6.8时的释放曲线。
[0052]
图5为本发明实施例1制备的cd40l@聚合物@caco3/flt3l/hama水凝胶微球疫苗。
[0053]
图6为实验例中制备的各组水凝胶微球疫苗对免疫细胞浸润程度比较。
[0054]
图7为实验例中制备的各组水凝胶微球疫苗募集的cdc1s细胞数量比较。
具体实施方式
[0055]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0056]
实施例1
[0057]
水凝胶微球疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0058]
(1)将1000μg cd40l和10mg hooc-plga
1700-peg
1500-plga
1700-cooh(上式中plga的分子量为1700da，peg的分子量为1500da)嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液(ph7,50mm)，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(ph 8.0，50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过
离心(12,000g，5分钟)收集负载cd40l的聚合物碳酸钙纳米粒子(记为cd40l@聚合物@caco3)，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用，该cd40l@聚合物@caco3纳米粒子的sem图见图1；
[0059]
(2)将1000μg的flt3l和1g的丙烯酸酐修饰的透明质酸(hama，透明质酸的分子量为100000da，双键的修饰率为60％)溶解于100ml的去离子水中，并将0.05g蓝光引发剂lap(亮氨酰氨基肽酶)加入到混合溶液中，将体系在磁力搅拌下均匀混合2h；
[0060]
(3)将步骤(1)中得到的冻干cd40l@聚合物@caco3纳米粒子加入到步骤(2)的混合溶液中，将两体系在4℃的条件下，磁力搅拌混合30min，将该体系作为微流控技术的水相；将5g的span20溶于100g的石蜡油溶剂中，在磁力搅拌下均匀混合30min，待溶液成均一相，将该体系作为微流控技术的油相；将水相和油相分别以15μl/min和300μl/min的流速通过微流控装置，缓慢滴加到-20℃的容器中，然后将收集有水凝胶微球的容器在15w的紫外灯下辐照10min，而后将微球转移至50ml的离心管，加入40ml的无水乙醚洗涤三次，收集离心管底部的微球，用去离子水再洗涤三次，冷冻干燥后，将水凝胶微球储存于-20℃备用，水凝胶微球疫苗记为cd40l@聚合物@caco3/flt3l/hama。
[0061]
实施例2
[0062]
水凝胶微球疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0063]
(1)将10μg cd40l和10mg mpeg
1500-plga
1700-cooh嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集cd40l@聚合物@caco3纳米颗粒，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用；
[0064]
(2)将100μg的flt3l和5g的丙烯酸酐修饰的透明质酸(hama，分子量为100000da，双键的修饰率为60％)溶解于100ml的去离子水中，并将0.1g蓝光引发剂lap加入到混合溶液中，将体系在磁力搅拌下均匀混合2h；
[0065]
(3)将步骤(1)得到的冻干cd40l@caco3纳米粒子加入到步骤(2)的混合溶液中，将两体系在4℃的条件下，磁力搅拌混合30min，将该体系作为微流控技术的水相；将10g的span40溶于100g的石蜡油溶剂中，在磁力搅拌下均匀混合30min，待溶液成均一相，将该体系作为微流控技术的油相；将水相和油相分别以30μl/min和500μl/min的流速通过微流控装置，缓慢滴加到-4℃的容器中，然后将收集有水凝胶微球的容器在60w的紫外灯下辐照30s，而后将微球转移至50ml的离心管，加入40ml的无水乙醚洗涤三次，收集离心管底部的微球，用去离子水再洗涤三次，冷冻干燥后，将水凝胶微球储存于-20℃备用。
[0066]
实施例3
[0067]
水凝胶微球疫苗的制备方法参照实施例1，不同之处在于步骤(1)如下：
[0068]
将100μg cd40l和10mg mpeg
1500-glu嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集cd40l@聚合物@caco3纳米颗粒，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用。
[0069]
实施例4
[0070]
水凝胶微球疫苗的制备方法参照实施例1，不同之处在于步骤(1)如下：
[0071]
将1000μg cd40l和10mg p(gly)-peg
1500-p(gly)嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集cd40l@caco3纳米颗粒，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用。
[0072]
实施例5
[0073]
(1)将1000μg cd40l和10mg p(gly-ala)-peg
1500-p(gly-ala)嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集cd40l@聚合物@caco3纳米颗粒，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用；制备的cd40l@聚合物@caco3纳米粒子的粒径分布图见图2；
[0074]
(2)将1000μg的flt3l和1g的丙烯酸酐修饰的透明质酸(hama，同上)溶解于100ml的去离子水中，并将0.05g蓝光引发剂lap加入到混合溶液中，将体系在磁力搅拌下均匀混合2h；
[0075]
(3)将步骤(1)得到的冻干cd40l@聚合物@caco3纳米粒子加入到步骤(2)的混合溶液中，将两体系在4℃的条件下，磁力搅拌混合30min，将该体系作为微流控技术的水相；将5g的span80溶于100g的石蜡油溶剂中，在磁力搅拌下均匀混合30min，待溶液成均一相，将该体系作为微流控技术的油相；将水相和油相分别以80μl/min和800μl/min的流速通过微流控装置，缓慢滴加到-4℃的容器中，然后将收集有水凝胶微球的容器在300w的紫外灯下辐照1min，而后将微球转移至50ml的离心管，加入40ml的无水乙醚洗涤三次，收集离心管底部的微球，用去离子水再洗涤三次，冷冻干燥后，将水凝胶微球储存于-20℃备用。
[0076]
实施例6
[0077]
水凝胶微球疫苗的制备方法如下：
[0078]
(1)将1000μg cd40l和10mg p(glu-ala-phe)-peg
1500-p(glu-ala-phe)嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集cd40l@聚合物@caco3纳米颗粒，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用。
[0079]
(2)将10μg的flt3l和0.5g的丙烯酸酐修饰的海藻酸钠(algma)溶解于100ml的去离子水中，并将0.025g蓝光引发剂lap加入到混合溶液中，将体系在磁力搅拌下均匀混合2h。
[0080]
(3)将步骤(1)中得到的冻干cd40l@caco3纳米粒子加入到(2)的混合溶液中，将两体系在4℃的条件下，磁力搅拌混合30min，将该体系作为微流控技术的水相。将6g的吐温80溶于100g的石蜡油溶剂中，在磁力搅拌下均匀混合30min，待溶液成均一相，将该体系作为微流控技术的油相。将水相和油相分别以15μl/min和300μl/min的流速通过微流控装置，缓慢滴加到-4℃的容器中，然后将收集有水凝胶微球的容器在30w的紫外灯下辐照10min，而后将微球转移至50ml的离心管，加入40ml的无水乙醚洗涤三次，收集离心管底部的微球，用去离子水再洗涤三次，冷冻干燥后，将水凝胶微球储存于-20℃备用。
[0081]
对比例1
[0082]
水凝胶微球的制备方法与实施例1的不同之处主要在于药物负载顺序的差别，具
体如下：
[0083]
(1)将1000μg flt3l和10mg hooc-plga
1700-peg
1500-plga
1700-cooh嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集负载flt3l的聚合物碳酸钙纳米粒子，记为flt3l@聚合物@caco3，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用；
[0084]
(2)将1000μg的cd40l和1g的丙烯酸酐修饰的透明质酸(hama，同上)溶解于100ml的去离子水中，并将0.05g蓝光引发剂lap加入到混合溶液中，将体系在磁力搅拌下均匀混合2h；
[0085]
(3)将步骤(1)得到的冻干flt3l@聚合物@caco3纳米粒子加入到步骤(2)的混合溶液中，将两体系在4℃的条件下，磁力搅拌混合30min，将该体系作为微流控技术的水相；将5g的span80溶于100g的石蜡油溶剂中，在磁力搅拌下均匀混合30min，待溶液成均一相，将该体系作为微流控技术的油相；将水相和油相分别以15μl/min和300μl/min的流速通过微流控装置，缓慢滴加到-4℃的容器中，然后将收集有水凝胶微球的容器在30w的紫外灯下辐照10min，而后将微球转移至50ml的离心管，加入40ml的无水乙醚洗涤三次，收集离心管底部的微球，用去离子水再洗涤三次，冷冻干燥后，将水凝胶微球储存于-20℃备用，记为flt3l@caco3/cd40l@hama。
[0086]
对比例2
[0087]
水凝胶微球的制备方法参照对比例1，不同之处在于步骤(1)如下：
[0088]
将100μg flt3l和10mg mpeg
1500-glu嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集flt3l@聚合物@caco3纳米颗粒，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用。
[0089]
对比例3
[0090]
水凝胶微球疫苗的制备方法参照实施例1，不同之处在于步骤(1)如下：
[0091]
将1000μg flt3l和10mg p(gly-ala)-peg
1500-p(gly-ala)嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集flt3l@聚合物@caco3纳米颗粒，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用。
[0092]
对比例4
[0093]
水凝胶微球的制备方法与实施例1有所不同，具体如下：
[0094]
(1)将1000μg toll样受体-7(tlr7)激动剂(1v270)和10mg hooc-plga
1700-peg
1500-plga
1700-cooh嵌段聚合物均匀分散于1ml的水溶液中，然后缓慢滴加1ml的100mm cacl2的tris-hcl缓冲溶液，混合体系进一步与10mm的naco3的hepes缓冲溶液(50mm)混合，混合后的溶液在4℃下搅拌12小时，最后，在4℃下通过离心(12,000g，5分钟)收集1v270@聚合物@caco3纳米粒子，并将其冷冻干燥后储存于-20℃备用；
[0095]
(2)将1000μg的anti-pd-1和1g的丙烯酸酐修饰的透明质酸(hama，同上)溶解于100ml的去离子水中，并将0.05g蓝光引发剂lap加入到混合溶液中，将体系在磁力搅拌下均
porator electroporator(btx，cat#ecm830，harvard bioscience)，ire参数设置如下：电强度1750v/cm；频率1hz；波长100us；脉冲数99。
[0107]
在ire消融后，使用nanoject iii(drummond,cat.#3-000-207)，随后在局部注射上述五组递药材料。随后，对肿瘤浸润淋巴细胞(tils)、tdlns和脾脏淋巴细胞进行提取，包埋，切片，采用苏木精-易红染色，最后在显微镜下观察那个组别细胞浸润的程度。并通过流式对不同组别肿瘤组织中的细胞进行分群，并统计cdc1s细胞的数量。
[0108]
考查不同组别的水凝胶微球与肿瘤药物的结合对小鼠胰腺癌的治疗效果，具体分组如下：
[0109]
第一组：ire+anti-pd-1@caco3/hama
[0110]
第二组：ire+flt3l@caco3/cd40l@hama
[0111]
第三组：ire+1v270@caco3/anti-pd-1@hama
[0112]
第四组：ire+cd40l@caco3/hama
[0113]
第五组：ire+cd40l@caco3/flt3l@hama
[0114]
上述各组水凝胶微球的制备方法均参照实施例1，不同之处仅在于负载的肿瘤药物的不同，如第一组是制备anti-pd-1@聚合物@caco3纳米粒子，然后与不含药物的hama进行交联。
[0115]
各组的水凝胶微球疫苗对小鼠肿瘤坏死和免疫细胞浸润的结果如图6，通过对不同组别的肿瘤组织进行流式分析，观察各组募集cdc1s细胞数量情况，结果如图7。
[0116]
从图6可以看出，与第二组相比，第五组接受肿瘤内程序化先后释放cd40l和flt3l的水凝胶微球疫苗，小鼠肿瘤坏死和免疫细胞浸润增加，而第一组和第三组的anti-pd1主要靶向t细胞，但是t细胞的浸润较少第四组cd40l只活化了cdc1细胞，前期的扩增较少，因此相对于第五组免疫细胞的浸润也比较少。
[0117]
从图7可以看出，与第一组到第四组相比，第五组募集的cdc1s细胞数量最多。
[0118]
上述结果表明，本发明提供的水凝胶微球疫苗能够达到扩增和激活cd8
+
t细胞浸润以及启动后续抗肿瘤免疫的效果，而其它的药物组合均无法实现上述效果。

技术特征：
1.一种协同肿瘤局部消融的免疫放大水凝胶微球疫苗，其特征在于，所述水凝胶微球疫苗具有内外层的核壳结构，其内层由包载有cd40l的多羧基聚合物于表面沉淀而形成的聚合物碳酸钙纳米粒子组成；其外层由负载有flt3l带负电的水凝胶微球共同组成。2.根据权利要求1所述的水凝胶微球疫苗，其特征在于，所述多羧基聚合物包括分子链中含有谷氨酸或/和甘氨酸的多肽，或是由该多肽形成的peg-聚多肽嵌段聚合物；优选的，所述多肽的分子量为3000-100000da，peg的分子量为500-2000da。3.根据权利要求2所述的水凝胶微球疫苗，其特征在于，所述聚合物包括hooc-plga-peg-plga-cooh、hooc-pla-peg-pla-cooh、hooc-pcl-peg-pcl-cooh、mpeg-plga-cooh、mpeg-pla-cooh或mpeg-pcl-cooh中的任一种；优选的，所述聚合物中plga、pla和pcl的分子量均为500-3000da。4.根据权利要求1或2所述的水凝胶微球疫苗，其特征在于，所述聚合物碳酸钙纳米粒子的粒径为200-1000nm。5.根据权利要求1或2所述的水凝胶微球疫苗，其特征在于，所述带负电的水凝胶微球是由微流控方法制备得到的具有双键修饰的天然聚合物水凝胶微球，其中天然聚合物包括海藻酸钠、透明质酸钠的一种或两种，天然聚合物的分子量为10000-400000da，修饰双键的单体为：丙烯酸酐、丁烯酸酐、n碳烯基酸酐(n＝3-15)或丙烯酰氯中的至少一种，双键的修饰率为10-100％。6.如权利要求1-5任一项所述的协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将cd40l和多羧基聚合物配制成混合溶液，然后将配制好的混合溶液滴加到cacl2的缓冲溶液中，再与naco3溶液混合，搅拌反应，得到负载cd40l的聚合物碳酸钙纳米粒子，记为cd40l@聚合物@caco3，冷冻干燥后备用；(2)配制flt3l浓度为10-1000μg/ml、含双键的天然聚合物浓度为1-5wt％、亮氨酰氨基肽酶浓度为0.01-1.5wt％的混合溶液；(3)将步骤(1)冻干的纳米粒子加入到步骤(2)的混合溶液中，搅拌均匀，作为水相；将表面活性剂分散于石蜡油溶剂中，作为油相，将水相和油相采用微流控方法，制备得到所述协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合溶液中多羧基聚合物浓度为0.05-25wt％，cd40l的浓度为10-1000μg/ml；优选的，所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲溶液；优选的，所述搅拌反应的时间为30min；优选的，所述混合溶液和cacl2溶液的体积比为1:1。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述含双键的天然聚合物为海藻酸钠或透明质酸钠；优选的，步骤(3)中所述表面活性剂包括span20、span60、span65、span80、吐温20、吐温60、吐温80中的至少一种，所述表面活性剂的浓度为5-15wt％。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将水相和油相分别通过微流控装置，控制油相的流速为150-1000μl/min，控制水相的流速为5-100μl/min。10.如权利要求1-5任一项所述的水凝胶微球疫苗或是由权利要求6-9任一项所述方法制备得到的水凝胶微球疫苗的应用，其特征在于，是将该水凝胶微球疫苗制备成治疗肿瘤
的药物；优选的，所述肿瘤包括胰腺癌。

技术总结
本发明提供了一种协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗及其制备方法与应用，该水凝胶微球疫苗的制备方法包括：(1)将CD40L和多羧基聚合物加入到CaCl2溶液中，然后与NaCO3溶液混合，搅拌反应，得到负载CD40L的聚合物碳酸钙纳米粒子；(2)配制FLT3L、含双键的天然聚合物、LAP的混合溶液；(3)将冻干后的纳米粒子加入到步骤(2)的混合溶液中，搅拌均匀，作为水相；将表面活性剂分散于石蜡油溶剂中，作为油相；将水相和油相采用微流控方法，制备得到所述协同消融的免疫放大水凝胶微球疫苗。本发明制备的水凝胶微球疫苗可实现内源性cDC1s的招募和活化级联扩增，显著放大内源性CD8


技术研发人员：王忠敏 刘霄宇 庄亚平 崔文国 黄蔚
受保护的技术使用者：上海市伤骨科研究所
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/8/16