高产乙醇产酸克雷伯氏菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及高产乙醇产酸克雷伯氏菌株及其应用。


背景技术：

2.产酸克雷伯氏菌属于肠杆菌科克雷伯菌属，是一类荚膜包裹的革兰氏阴性杆菌，通常存在于人的肠道和呼吸道中，是引起多种类型感染的条件致病菌，是医院的重要病原菌，可引起多种临床疾病，包括泌尿道感染、膀胱炎、肺炎、肝脓肿、内源性眼内炎、手术切口感染、以及危及生命的感染，如感染性心内膜炎和败血症。
3.肠道微生物种类繁多、功能各异，肠道微生态的紊乱与多种慢性疾病的发生发展相关。研究发现肠道中高产乙醇肺炎克雷伯菌丰度的增加与非酒精性脂肪肝的发生有一定关系。人体肠道微生物会代谢碳水化合物产生内源性乙醇，正常情况下，乙醇在肝脏乙醇脱氢酶、过氧化氢酶、微粒体乙醇氧化系统等的作用下，迅速通过门静脉排出体外。当肠道菌群失调时，肠道产生的内源性乙醇超过肝脏的代谢能力，造成乙醇的过量累积，会导致血液乙醇浓度的升高，甚至引发自动酿酒综合征。
4.自动酿酒综合征，又叫肠道发酵综合症，是病人在没有摄入酒精的情况下，表现出醉酒状态的一类综合症。1948年，第一例自动酿酒综合征被报道，发生于一名5岁的男孩。到目前为止，约有20例自动酿酒综合征被报道，引发自动酿酒综合征的病原微生物主要是肠道中的真菌，如白色念珠菌和酿酒酵母等。目前，针对自酿酒综合征的患者，临床上采用采集其消化道内的样品(肠液或者粪便)进行体外的培养及鉴定，然后筛选抗菌药物对患者进行治疗，患者的症状可以得到缓解。如何提供一种生物自动酿酒综合症菌株模型，用于生物自动酿酒综合症药物的研究或制备诊断病因产品是本领域面临的问题。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本技术提供了产酸克雷伯氏菌。
6.所述产酸克雷伯氏菌为产酸克雷伯氏菌株(klebsiella oxytoca)，其菌株编号为yj-kox18-z，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.23188。
7.为了解决上述技术问题，本技术还提供了筛查和/诊断自动酿酒综合征的试剂盒。
8.所述试剂盒含有上述的产酸克雷伯氏菌。
9.上述试剂盒中，所述试剂盒含有用于培养上述产酸克雷伯氏菌的组合物，所述组合物为固体组合物或液体组合物，所述固体组合物由胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠组成，所述糖为葡萄糖或果糖，所述固体组合物中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比为胰蛋白胨5-15质量份，糖20-200质量份，酵母提取物3-10质量份，氯化钠5-15质量份；所述液体组合物是由水和所述固体组合物配制而成的培养基，所述液体组合物中，水和所述固体组合物的配比满足胰蛋白胨的含量为5-15g/l。
10.上述的试剂盒中，所述固体组合物中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比
为胰蛋白胨10质量份，糖20-200质量份，酵母提取物3-10质量份，氯化钠5-15质量份。
11.上述的试剂盒中，所述固体组合物中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比为胰蛋白胨10质量份，糖20-200质量份，酵母提取物3-7质量份，氯化钠8-12质量份。
12.上述的试剂盒中，所述固体组合物为所述固体组合物中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比为胰蛋白胨10质量份，糖80或100质量份，酵母提取物5质量份，氯化钠10质量份。
13.上文中，所述糖可为葡萄糖或果糖。
14.上文中，所述葡萄糖可为80质量份。
15.上文中，所述果糖可为100质量份。
16.为了解决上述技术问题，本技术还提供了下述应用。
17.上述产酸克雷伯氏菌在下述任一中的应用：
18.a1)在生产乙醇中的应用；
19.a2)在制备生产乙醇产品中的应用；
20.a3)在建立自动酿酒综合征模型生物中的应用；
21.a4)在制备建立自动酿酒综合征模型生物产品中的应用；
22.a5)在筛选治疗自动酿酒综合征药物中的应用；
23.a6)在制备筛选治疗自动酿酒综合征药物产品中的应用。
24.为了解决上述技术问题，本技术还提供了制备乙醇的方法。
25.所述方法包括使用上述的组合物培养上述的产酸克雷伯氏菌，获得乙醇。
26.为了解决上述技术问题，本技术还提供了一种自酿酒综合症征模型生物的构建方法。
27.所述方法包括给目的生物喂食上述的产酸克雷伯氏菌至目的生物出现自动酿酒综合征，获得自动酿酒综合征模型生物。
28.上述的方法中，所述目的生物可为下述任一种：
29.b1)哺乳纲动物；
30.b2)啮齿目或灵长目动物；
31.b3)鼠科或人科动物。
32.为了解决上述技术问题，本技术还提供了一种治疗自动酿酒综合征药物的筛选方法。
33.所述方法包括利用上述制备的自动酿酒综合征模型生物筛选治疗自动酿酒综合征药物。
34.有益效果
35.本发明发现了一种能够在人肠道产生酒精的菌株，其可使人患上自动酿酒综合征。经鉴定该菌株为克雷伯菌株(klebsiella oxytoca)，将其命名为yj-kox18-z。于2021年08月24日将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏中心登记入册编号为cgmcc no.23188。
36.本发明尝试了不同糖源培养基，所述培养基由胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠组成，所述糖为葡萄糖或果糖，所述培养基中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比为胰蛋白胨5-15质量份，糖20-200质量份，酵母提取物3-10质量份，氯化钠5-15质量份；所
述液体组合物是由水和所述固体组合物配制而成的培养基，所述液体组合物中，水和所述固体组合物的配比满足胰蛋白胨的含量为5-15g/l。发现碳源为20-100g/l的葡萄糖或果糖时，尤其是有氧条件下，生产酒精的能力较强，尤其是20、40、60、80或100g/l时较强，特别在100g/l果糖或80g/l葡萄糖时产乙醇能力达到峰值。上述培养基还包括胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l。
37.利用上述20g/l葡萄糖培养基、40g/l葡萄糖培养基、60g/l葡萄糖培养基、80g/l葡萄糖培养基、100g/l葡萄糖培养基、20g/l果糖培养基、40g/l果糖培养基、60g/l果糖培养基、80g/l果糖培养基和100g/l葡萄糖培养基中进行体外培养，发现这些真菌在这10种培养基中均不能生长，更不具有产乙醇能力。上述培养基可以用于鉴定由yj-kox18-z引起的自动酿酒综合症。
38.进一步，也可利用yj-kox18-z构建自动酿酒综合症征模型生物，进而利用yj-kox18-z构建自动酿酒综合症征模型生物筛选治疗自动酿酒综合征药物。
39.保藏说明
40.菌种名称：产酸克雷伯氏菌
41.拉丁名：klebsiella oxytoca
42.菌株编号：yj-kox18-z
43.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
44.保藏机构简称：cgmcc
45.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
46.保藏日期：2021年08月24日
47.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.23188
附图说明
48.图1所示为yj-kox18-z在不同浓度葡萄糖和培养条件下的产乙醇能力图；
49.图2所示为yj-kox18-z在不同浓度果糖和培养条件下的产乙醇能力图；
50.图3所示为yj-kox18-z的生长速率图。
具体实施方式
51.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
52.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
53.下述实施例采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用one-way anova检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有极显著性差异，p＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
54.2020年11月，发明人对一名62岁的自动酿酒综合征男性患者进行了研究，该患者该患者自2012年起反复出现不明原因醉酒现象，其血液酒精浓度最高可到400mg/dl。该患
者肠道微生态菌群显著失调，肠道中肠杆菌科细菌过度富集，尤其在其发病阶段，克雷伯菌属细菌丰度显著升高。通过体外发酵培养实验，证实了单糖和多糖是其发病的饮食诱因。同时，左氧氟沙星被筛选出作为敏感药物，可以有效抑制产乙醇细菌的增殖，最终通过口服抗生素治疗配合口服益生菌调整肠道菌群，同时结合低糖饮食，该患者症状得到治愈，并且其肠道菌群结构趋于正常。发明人通过微生物体外培养技术，获得一株具有高产乙醇能力的产酸克雷伯氏菌，该菌株不仅生长速率较快，而且在葡萄糖、果糖的诱导下具有很高的产乙醇能力，用于筛选治疗自动酿酒综合征的药物具有很高的价值。
55.根据最新的分类规则，产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)属于克雷伯菌属，属于人和动物肠道中的正常菌群。
56.生物材料说明：本发明产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)的名称为yj-kox18-z，该菌株已于2021年8月24日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.23188。又称其为yj-kox18-z。
57.实施例一：产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)yj-kox18-z的分离、鉴定及保藏
58.一、产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)yj-kox18-z的分离
59.lb-琼脂培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l，琼脂10g/l，溶剂为ddh2o。
60.lb-单糖培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l，葡萄糖10wt％(100g/l)，溶剂为ddh2o。
61.采集自动酿酒综合征患者的新鲜粪便样品，使用lb-琼脂培养基进行培养，37℃，13小时。挑取单克隆转接至lb-单糖培养基，37℃，摇床转速180rpm，13小时。结束后测定培养液中的乙醇浓度，挑选出产乙醇浓度最高的菌株，命名为yj-kox18-z。
62.二、yj-kox18-z菌株的全基因组测序
63.lb培养基配方：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l，溶剂为ddh2o。
64.将yj-kox18-z菌株接种于lb培养基，37℃培养13小时，摇床转速180rpm。收集yj-kox18-z菌体，提取全基因组dna，并随机打断，电泳回收所需长度的dna片断，并加上接头进行cluster制备，进行hiseq4000测序，对测序结果进行soapdenovo组装，基于组装结果进行基因信息分析，确定为产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)，其16s rdna序列见序列表中序列1，具体如下：。
65.acttaaattgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagcttgtaggtgaggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtgaggttaataacctcattcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagt
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66.形态检测结果如下：
67.产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)yj-kox18-z是革兰氏阴性菌，杆状，有荚膜，有菌毛，无芽孢和鞭毛；其具有o抗原和k抗原，大小为(0.5-0.8)μm
×
(1-2)μm，兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：37℃；生长酸碱度范围：ph 4-10，最适ph值为6.8。
68.三、产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)yj-kox18-z保藏
69.产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)yj-kox18-z菌株于2021年8月24日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.23188。
70.实施例二：适合yj-kox18-z生长的培养基配方
71.培养基的配方为：胰蛋白胨(tryptone)5-15g/l，葡萄糖或果糖20-200g/l，酵母提取物(yeast extract)3-10g/l，氯化钠(nacl)5-15g/l，溶剂为水；
72.优选：胰蛋白胨(tryptone)8-12g/l，葡萄糖或果糖2-10wt％，酵母提取物(yeast extract)3-7g/l，氯化钠(nacl)8-12g/l，溶剂为水；
73.最优选：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，葡萄糖10wt％，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l，溶剂为水，即实施例一中的lb-单糖培养基，或胰蛋白胨(tryptone)10g/l，果糖8wt％或葡萄糖10wt％，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l，溶剂为水。
74.2wt％葡萄培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l，葡萄糖2wt％(20g/l)，溶剂为ddh2o。
75.制备方法如下：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将20g葡萄糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
76.4wt％葡萄糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将40g葡萄糖置于容器中，加
入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
77.6wt％葡萄糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将60g葡萄糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
78.8wt％葡萄糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将80g葡萄糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
79.10wt％葡萄糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将100g葡萄糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
80.2wt％果糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将20g果糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
81.4wt％果糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将40g果糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
82.6wt％果糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将60g果糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
83.8wt％果糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将80g果糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
84.10wt％果糖培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠置于容器中，加入适量去离子水(ddh2o)溶解，然后用去离子水定容至500ml；将100g果糖置于容器中，加入适量去离子水溶解，然后用去离子水定容至500ml；两种溶液分别121℃灭菌15min，冷却后将两种溶液混合即得。
85.实施例三：yj-kox18-z的产乙醇能力分析
86.yj-kox18-z种子液的制备：
87.挑取yj-kox18-z单菌落接种到lb-单糖培养基中，温度37℃，转速180rpm，振荡培养13h，收集发酵液，该发酵液即为yj-kox18-z种子液。
88.1、葡萄糖浓度和培养条件的筛选：
89.分别用实施例二制备的不同浓度的葡萄糖培养基培养本发明的菌株yj-kox18-z，具体方法为：
90.去50ml锥形瓶10个，分别标记为1号锥形瓶、2号锥形瓶、3号锥形瓶、4号锥形瓶、5号锥形瓶、6号锥形瓶、7号锥形瓶、8号锥形瓶、9号锥形瓶和10号锥形瓶。
91.将上述制备的2wt％葡萄糖培养基、4wt％葡萄糖培养基、6wt％葡萄糖培养基、8wt％葡萄糖培养基、10wt％葡萄糖培养基10ml分别加入1-5号追锥形瓶中，以及分别加入6-10号追锥形瓶中，再将上述制备的yj-kox18-z种子液100μl分别加入1-10号追锥形瓶中，使1-10号追锥形瓶中的yj-kox18-z菌含量均为107.cfu/ml，然后将1-5号锥形瓶在培养温度37℃，摇床转速180rpm条件下，有氧培养12h，检测培养液上清中的乙醇浓度；将6-10号锥形瓶厌氧培养12h，检测培养液上清中的乙醇浓度。检测结果见表1和图1。
92.乙醇检测方法如下：吸取1-10号锥形瓶中培养液2ml至无菌ep管中，12000rpm离心5min，吸取上清至新的ep管中，用乙醇检测试剂盒(bio vision,k620-100)测定每个样本上清的乙醇浓度。
93.表1不同培养条件(葡萄糖)下，培养液上清中的乙醇浓度
[0094][0095][0096]
表1和图1结果表明：菌株yj-kox18-z在需氧条件下比厌氧条件具有更高的产乙醇能力；尤其当在葡萄糖浓度为8wt％(80g/l)，需氧培养12小时，该菌株的产乙醇能力达到峰值，为65mmol/l(如图1所示)。
[0097]
2、果糖浓度的筛选：
[0098]
分别用实施例二制备的不同浓度的果糖培养基培养本发明的菌株yj-kox18-z，具
体方法为：
[0099]
取50.ml锥形瓶10个，分别标记为11号锥形瓶、12号锥形瓶、13锥形瓶、14号锥形瓶、15号锥形瓶、16锥形瓶、17号追锥形瓶、18号锥形瓶、19号锥形瓶和20号锥形瓶。将上述制备的2wt％果糖培养基、4wt％果糖培养基、6wt％果糖培养基、8wt％果培养基、10wt％果糖培养基10ml分别加入11-15号锥形瓶中，以及分别加入16-20号锥形瓶中，再将上述制备的yj-kox18-z种子液100μl分别加入11-20号锥形瓶中，使11-20号锥形瓶中的yj-kox18-z菌含量为107cfu/ml，然后将11-15号锥形瓶在培养温度37℃，摇床转速180rpm条件下，有氧培养12h，检测培养液上清中的乙醇浓度；将16-20号锥形瓶厌氧培养12h，检测培养液上清中的乙醇浓度。检测结果见表2和图2。
[0100]
乙醇检测方法如下：吸取11-20号锥形瓶中培养液2ml至无菌ep管中，12000rpm离心5min，吸取上清至新的ep管中，用乙醇检测试剂盒(bio vision,k620-100)测定每个样本上清的乙醇浓度。
[0101]
表2不同培养条件(果糖)下，培养液上清中的乙醇浓度
[0102][0103][0104]
表2和图2的结果表明：菌株yj-kox18-z在需氧条件下比厌氧条件具有更高的产乙醇精能力；尤其当果糖浓度为10wt％(100g/l)，需氧培养12h，该菌株的产乙醇能力达到峰值，为65mmol/l(如图2所示)，说明实施例二中的葡萄糖也可用果糖替换，菌株yj-kox18-z在葡萄糖中比在果糖中具有更高的产乙醇能力。
[0105]
3、yj-kox18-z生长能力分析：
[0106]
将上述制备的yj-kox18-z种子液1ml加入装有100ml上述制备的2wt％葡萄糖培养
基的锥形瓶中，培养温度37℃，摇床转速180rpm，有氧培养时间为12h，培养过程中每隔一小时测定培养液的od600nm值，检测结果见图3。
[0107]
图3结果表明：菌株yj-kox18-z在前2个小时生长速度较慢，第2至8小时为对数生长期，随后生长速度变慢，逐渐进入平台期。最高od600值达到1.42左右。
[0108]
实施例四：yj-kox18-z在筛选治疗自动酿酒综合征药物中的应用
[0109]
发明人从自动酿酒综合征患者的粪便中分离得到一株高产乙醇产酸克雷伯氏菌，并确定其是该病的致病菌之一，说明针对自动酿酒综合征的诊断不能仅局限于是否存在真菌。
[0110]
采集自动酿酒综合征患者的粪便样品进行体外培养，培养基为实施例二的培养基，培养温度37℃，摇床转速180rpm，需氧培养13h。培养完毕后将得到的菌液进行菌种的鉴定以及产乙醇量的检测。
[0111]
若培养得到的菌种为产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)且符合本发明菌株yj-kox18-z的性状特征，则判定该患者为该菌株所致的自动酿酒综合征，然后使用左氧氟沙星口服治疗7天。经诊断为菌株yj-kox18-z所致的自动酿酒综合征的患者，经左氧氟沙星治疗后康复，自动酿酒综合征的症状再无发作。
[0112]
对上述患有菌株yj-kox18-z所致的自动酿酒综合征的患者使用抗真菌药物氟康唑，没有治疗效果；用抗真菌药物氟康唑在体外作用菌株yj-kox18-z，也没有抑菌效果。同时将目前报道的引起自动酿酒综合征的真菌酿酒酵母菌，白色念珠菌，假丝酵母菌均接种在本发明实施例二的2wt％葡萄糖培养基、4wt％葡萄糖培养基、6wt％葡萄糖培养基、8wt％葡萄糖培养基、10wt％葡萄糖培养基、2wt％果糖培养基、4wt％果糖培养基、6wt％果糖培养基、8wt％果糖培养基和10wt％果糖培养基中进行体外培养，发现这些真菌在这10种培养基中均不能生长，更不具有产乙醇能力。以上共同说明自动酿酒综合征并不是由真菌引起的，而是本发明的菌株引起的。
[0113]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.产酸克雷伯氏菌，其特征在于，所述产酸克雷伯氏菌为产酸克雷伯氏菌株(klebsiella oxytoca)，其菌株编号为yj-kox18-z，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.23188。2.筛查和/诊断自动酿酒综合征的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1的产酸克雷伯氏菌。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有用于培养权利要求1的产酸克雷伯氏菌的组合物，所述组合物为固体组合物或液体组合物，所述固体组合物由胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠组成，所述糖为葡萄糖或果糖，所述固体组合物中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比为胰蛋白胨5-15质量份，糖20-200质量份，酵母提取物3-10质量份，氯化钠5-15质量份；所述液体组合物是由水和所述固体组合物配制而成的培养基，所述液体组合物中，水和所述固体组合物的配比满足胰蛋白胨的含量为5-15g/l。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述固体组合物中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比为胰蛋白胨10质量份，糖20-200质量份，酵母提取物3-10质量份，氯化钠5-15质量份。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述固体组合物中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比为胰蛋白胨10质量份，糖20-200质量份，酵母提取物3-7质量份，氯化钠8-12质量份。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述固体组合物为所述固体组合物中胰蛋白胨、糖、酵母提取物和氯化钠的质量比为胰蛋白胨10质量份，糖80或100质量份，酵母提取物5质量份，氯化钠10质量份。7.权利要求1所述产酸克雷伯氏菌在下述任一中的应用：a1)在生产乙醇中的应用；a2)在制备生产乙醇产品中的应用；a3)在建立自动酿酒综合征模型生物中的应用；a4)在制备建立自动酿酒综合征模型生物产品中的应用；a5)在筛选治疗自动酿酒综合征药物中的应用；a6)在制备筛选治疗自动酿酒综合征药物产品中的应用。8.制备乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求3-6中任一所述的组合物培养权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌，获得乙醇。9.一种自酿酒综合症征模型生物的构建方法，其特征在于，所述方法包括给目的生物喂食权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌至目的生物出现自动酿酒综合征，获得自动酿酒综合征模型生物。10.一种治疗自动酿酒综合征药物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求8制备的自动酿酒综合征模型生物筛选治疗自动酿酒综合征药物。

技术总结
本发明公开了高产乙醇产酸克雷伯氏菌株及其应用。本发明提供了一种能够在人肠道产生酒精使人患上自动酿酒综合征的克雷伯菌。并可将其应用于生产乙醇和/或制备生产乙醇产品，和/或，建立自动酿酒综合征模型生物和/或制备建立自动酿酒综合征模型生物产品，和/或，筛选治疗自动酿酒综合征药物和/或制备筛选治疗自动酿酒综合征药物产品。为自动酿酒综合征模型生物或药物药物的研究打下理论和研究基础。生物或药物药物的研究打下理论和研究基础。生物或药物药物的研究打下理论和研究基础。


技术研发人员：袁静 薛冠华 冯俊霞 闫超 崔晶花 冯燕玲 赵汉青 甘霖 范政
受保护的技术使用者：首都儿科研究所
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/8/16