一种几丁质脱乙酰基酶突变体、重组表达载体、重组工程菌及其筛选方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种几丁质脱乙酰基酶突变体、重组表达载体、重组工程菌及其筛选方法。


背景技术：

2.虾蟹作为主要水产品，在加工业中，通常只取虾蟹的肉，剩下则作为加工副产品。研究表明虾蟹加工副产物主要包括几丁质、蛋白质和无机盐，其中几丁质含量约为20％。几丁质作为一种由n-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的多糖，由于溶解性很差，导致其应用价值有限。研究发现几丁质脱去乙酰基团转化为壳聚糖后，溶解性得到有效改善，可以很好的溶于稀酸，从而在农业、食品等领域具有良好的应用价值。
3.目前几丁质脱乙酰基的主流加工方式是化学浓碱法，在高浓度碱条件下，几丁质容易脱去乙酰基团。化学法虽然高效，但是具有很多缺点如：破坏几丁质的结构、脱乙酰过程很难精准控制、反应排放物对环境污染严重等，因此寻找绿色高效的加工方法具有重要意义。国内外科学家发现几丁质脱乙酰基酶能够定向水解几丁质的乙酰基团形成壳聚糖。相比于化学法，几丁质脱乙酰基酶作用过程具有绿色环保、反应条件温和、反应过程及产物结构可控等。在前期的研究中我们发现bacillus atrophaeus几丁质脱乙酰基酶cdaba具有良好的活性，能够高效催化几丁质转变为壳聚糖。但是几丁质脱乙酰基酶cdaba热稳定性较差，限制其产业化应用。因此提升几丁质脱乙酰基酶cdaba的热稳定性能够提升其稳定性以及催化性能，为其产业化应用奠定基础。


技术实现要素：

4.本发明以bacillus atrophaeus几丁质脱乙酰基酶cdaba为研究对象，通过二硫键设计、理性定点突变以及组合突变获得热稳定性提升的突变体cdabam为其下一步的产业化应用奠定基础。
5.本发明采用的具体方案如下：
6.一种几丁质脱乙酰基酶突变体cdabam，突变体cdabam的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.gprlepikesaslseqmqkeknknsakkqdeqktspeigkvvyltfddgchpaaseeimnllhkynckgtffmlkpnivqnpdcvkkmvesghsvgshgvthkvfeiykspdsfatemndtldfikeytkvnthlirapygskpyitgpfrevvkrnqfnlwdwtvdsedwkythgefikntiqqvlnlvgkeplvvlmhekpmtaaylgellkyfresgyeckaiddsikpvqfrfn(seq id no.1)；
8.优选地，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.ggtccaaggcttgaaccaataaaagaaagtgcctccctttctgagcagatgcaaaaagaaaagaataaaaattcagcaaagaaacaggatgaacaaaaaacatcacctgaaattggaaaggtggtctatttaacatttgatgat
ggatgtcatcctgctgcttcagaggagattatgaatttactccataaatacaattgtaaaggaacattttttatgttaaaacctaatatcgtgcaaaatccagattgtgttaagaaaatggtagaaagcggtcactctgttgggtctcacggcgtgacgcataaggtgttcgaaatctataaatcccctgatagctttgcgacagaaatgaacgatacgcttgactttatcaaagaatataccaaagtcaacacacatttgataagagcaccttacgggtctaagccgtacattactggcccatttagagaagttgttaagcgtaaccaatttaatctctgggattggacagttgattcagaagactggaagtacactcatggagaatttataaaaaatacaattcagcaagtactcaatcttgtagggaaagaaccacttgttgtgttaatgcacgaaaaaccgatgactgcggcatatttaggagaattattaaaatatttccgagaaagcggctacgaatgtaaagcaattgatgattcaataaagccggtacaattcagattcaac(seq id no.2)；
10.本发明还提供了一种重组表达载体ppiczαa-cdabam，包含编码所述几丁质脱乙酰基酶突变体cdabam的多聚核苷酸序列。
11.本发明还提供了一种重组工程菌，包含所述的重组表达载体ppiczαa-cdabam。
12.优选地，所述重组工程菌以毕赤酵母工程菌作为宿主。
13.优选地，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母x33。
14.本发明还提供了一种所述重组工程菌的筛选方法，包括如下步骤：
15.s1、将表达载体ppiczαa-cdabam线性化后转入毕赤酵母，电转后的转化子涂布于高浓度ypdz平板上；
16.s2、采用24孔板法挑选96个重组转化子进行初步筛选；
17.s3、将初步筛选获得高酶活转化子进行摇瓶培养复筛；
18.s4、将摇瓶培养筛选出来的转化子进行高密度发酵验证。
19.优选地，步骤s1所述高浓度ypdz平板中博莱霉素的浓度大于500mg/l。
20.本发明的目的通过下述技术方案实现：(1)分析几丁质脱乙酰基酶cdaba三维构象，找到蛋白柔性区域，通过构建和筛选获得有效二硫键突变体；(2)分析几丁质脱乙酰基酶cdaba三维构象，理性设计定点突变体，获得有效单点突变体；(3)将有效二硫键突变体和单点突变体进行叠加组合，获得最佳突变体cdabam；(4)突变体cdabam在毕赤酵母高效制备；(5)突变体cdabam特性表征。
21.与现有技术相比，本发明具有如下优势：
22.本发明以几丁质脱乙酰基酶cdaba为出发模板，通过二硫键设计、单点突变、组合突变等过程获得最佳突变体cdabam。采用本发明方法制得的突变体cdabam在70℃热处理30分钟和60分钟后，剩余酶活分别为87.4％和52.8％，是出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba的5.8倍和10.4倍，同时突变体cdabam在毕赤酵母x33的高效表达，为其下一步产业化应用奠定了坚实基础。
附图说明
23.图1为几丁质脱乙酰基酶cdaba三维构象(a)及构象评估拉式图(b)；
24.图2为有效二硫键突变体最适反应温度(a)和热稳定性图(b)；
25.图3为有效单点突变体最适反应温度(a)和热稳定性图(b)；
26.图4为重组工程菌c28高密度发酵曲线(a)和不同时间发酵液蛋白电泳(b)；
27.图5为突变体cdabam最适反应温度和(a)和热稳定性图(b)。
具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明实施例中涉及到的试验材料及试剂如下：
29.1.菌株与载体：
30.大肠杆菌菌株top10、毕赤酵母x33均从商业途径购买获得。表达载体ppiczαa-cdaba由前期实验构建，构建过程大致如下：
31.(1)将前期获得的萎缩芽孢杆菌(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cicc21608)接入lb液体培养基中，于37℃，200rpm下培养1天；(2)取培养好的菌液1ml，在95℃下热处理10分钟后作为pcr扩增模板；(3)以热处理后的菌液为模板，通过引物cdaba-fw和引物cdaba-rev进行pcr扩增，pcr扩增体系如表1所示，pcr扩增程序如下：95℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环，通过pcr扩增获得基因cdaba；(4)分别用限制性内切酶ecori和noti酶切基因cdaba和表达载体ppiczαa，将酶切好的cdaba和表达载体ppiczαa参照dna产物纯化试剂盒(#dp204，天根生化科技(北京)有限公司)进行纯化回收，纯化回收过程如下：将目标产物进行切胶放入2ml离心管；加入溶胶液，在60℃条件下反应10分钟；将第二步的溶胶液体加入收集管，10000rpm离心1分钟；用75％乙醇洗两次后晾干；加入50μl水，离心3分钟，即可；(5)将酶切好的基因cdaba和表达载体ppiczαa进行连接反应，连接反应体系如表2所示，在4℃连接反应16小时后，转入大肠杆菌top10，均匀涂布于lbz固体平板后，37℃静置培养4天；(6)通过菌液pcr对阳性转化子进行筛选，筛选过程如下：用高压灭菌的牙签挑取单个菌落至含有500μl的lbz培养基中37℃，200rpm培养4小时；吸取2μl菌液作为pcr的模板，pcr反应体系如表3所示；菌液pcr所用引物为5’aox-fw和3’aox-rev，pcr扩增条件为95℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，33个循环，电泳后，观察结果，对阳性的结果相对应的平板上的菌落进行测序；(7)根据测序结果最终获得表达载体ppiczαa-cdaba。
32.表1菌液pcr反应体系
[0033][0034][0035]
表2连接反应体系
[0036]
试剂体积(μl)
基因cdaba7表达载体ppiczαa1.5t4连接酶0.5反应缓冲液1
[0037]
表3菌液pcr反应体系
[0038]
试剂体积(μl)taq酶mix25引物5’aox-fw0.5引物3’aox-rev0.5菌液2灭菌水22
[0039]
其中，载体ppiczαa的基因序列信息可参见网址：https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/v19520？icid＝search-product，表达载体ppiczαa-cdaba的基因序列信息如下所示。其中，双直线下划线的为启动子5’aox1序列信息，虚线下划线的为α信号肽序列信息，划波浪线部分为cdaba的基因的序列信息，直线下划线的为zeocin抗性基因序列信息。
[0040]
[0041]
[0042]
[0043][0044]
2.实验材料
[0045]
对硝基乙酰苯胺(s30072-5g)购自上海源叶生物科技有限公司；q5高保真taq酶mix购自neb公司；质粒提取试剂盒(#dp103-03)，胶纯化试剂盒(#dp209-02)购自天根生化科技(北京)有限公司；taq酶mix(max pcr master mix)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；zeocin(博莱霉素)购自美国invitrogen公司。
[0046]
3.培养基
[0047]
大肠杆菌培养基为lb培养基：1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)nacl，ph7.0。lbz为lb培养基加25μg/ml zeocin(博莱霉素，美国invitrogen公司)。
[0048]
酵母培养基为ypd培养基：1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖。酵母筛选培养基为ypdz(ypd+300mg/l zeocin)。
[0049]
酵母培养基bmgy：1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、1.34％(w/v)ynb、0.00004％(w/v)biotin、1％甘油(v/v))，注：ynb(上海源叶生物科技有限公司)为酵母氮源基础(yeast nitrogen base)；biotin为生物素(上海源叶生物科技有限公司)。
[0050]
酵母诱导培养基bmmy：1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、1.34％(w/v)ynb、
0.00004％(w/v)biotin、1％甲醇(v/v))，注：ynb(上海源叶生物科技有限公司)为酵母氮源基础(yeast nitrogen base)；biotin为生物素(上海源叶生物科技有限公司)。
[0051]
酵母高密度发酵bsm培养基：85％h3po
4 26.7ml/l，caso4·
2h2o 0.93g/l，k2so
4 18.2g/l，mgso4·
2h2o 14.9g/l，koh 4.13g/l，甘油40g/l，pmt1微量元素溶液4.0ml/l。
[0052]
pmt1微量元素溶液：cuso4·
5h2o 6.0g/l，ki 0.088g/l，mnso4·
h2o 3.0g/l，na2moo4·
2h2o 0.2g/l，h3bo
3 0.02g/l，cocl2·
6h2o 0.5g/l，zncl
2 20.0g/l，feso4·
7h2o 65.0g/l，biotin 0.2g/l。
[0053]
4.几丁质脱乙酰基酶活性测定所用试剂
[0054]
对硝基乙酰苯胺：200mg/l的对硝基乙酰苯胺水溶液；0.05mol/l的ph7.0磷酸缓冲液。
[0055]
实施例1几丁质脱乙酰基酶cdaba三维建模及生物信息学分析
[0056]
本发明拟通过不同蛋白质理性设计方法提升重组几丁质脱乙酰基酶cdaba热稳定性。蛋白质理性设计必须基于酶蛋白的三维结构进行，因此首先需要模拟构建几丁质脱乙酰基酶cdaba三维构象。以蜡样芽胞杆菌几丁质脱乙酰基酶三维结构为模板(pdb数据库登录号：5nc9.1.a)，通过建模软件modeller10.4(https://salilab.org/modeller/)获得几丁质脱乙酰基酶cdaba三维构象(图1a)。通过在线软件saves v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)对获得的三维构象进行评估。由图1b可知，拉式图结果表明，90.6％的氨基酸位于最优区域，9.4％的氨基酸位于其他允许区域，表明获得模型构象正确，可以用于下一步理性设计分析。
[0057]
通过分子动力学模拟软件gromacs 2019.06(https://www.gromacs.org/)对几丁质脱乙酰基酶cdaba进行分析，模拟过程中，蛋白质使用amber_ff14sb力场，小分子配体使用gaff力场，gaff力场中使用resp电势，其中resp电势的拟合是使用multiwfn 3.6软件配合gaussian 16.0软件完成的。将蛋白质/配体模型置于立方体盒子中，蛋白质距离盒子的最小距离为1.2nm。以tip3p水填充盒子。使用最速下降法对体系能量最小化，进行50ns的分子动力学模拟，模拟步长为2fs，每10ps贮存1次数据。通过分析模拟结果发现，几丁质脱乙酰基酶cdaba存在多个蛋白柔性区域，如第46位苯丙氨酸至第54位丙氨酸区域、第65位酪氨酸至第73位甲硫氨酸区域、第97位丝氨酸至113位丝氨酸区域、第129位苏氨酸至146位异亮氨酸区域、第158位谷氨酰胺至170位天门冬氨酸区域和第219位丝氨酸至235位苯丙氨酸区域。几丁质脱乙酰基酶cdaba的蛋白柔性区域在高温条件下容易发生结构变化，从而引起变性失活。因此提升几丁质脱乙酰基酶cdaba柔性区域的刚性，能够有效提升其热稳定性。
[0058]
实施例2二硫键理性设计提升几丁质脱乙酰基酶cdaba热稳定性
[0059]
在蛋白柔性区域理性设计二硫键能够有效提升重组蛋白的热稳定性，根据实施例1模拟分析结果，定向的在几丁质脱乙酰基酶cdaba三维构象的柔性区域设计二硫键提升其刚性，从而提升其热稳定性。分别通过在线二硫键设计软件bridged-disulfide bond prediction(http://biodev.cea.fr/bridged/results.aspx？jobid＝769)和disulfide by design(http://cptweb.cpt.wayne.edu/dbd2/index.php)进行二硫键设计分析，最终结合这两个软件设计结果，选择12对二硫键进行实验。这12对二硫键分别为p50c-i84c、a54c-a206c、a67c-m223c、k68c-a225c、t70c-s94c、f72c-h98c、f72c-r137c、s97c-t121c、t101c-k103c、k103c-e106c、y108c-y145c和f216c-y221c。
[0060]
根据cdaba基因序列分别设计二硫键扩增引物(引物序列信息如表4所示)。不同二硫键突变体所对应的表达载体构建过程如下(以突变体p50c-i84c所对应的表达载体ppiczαa-cdaba1为例，其他以此类推)：(1)以ppiczαa-cdaba为模板，先用上下游引物p50c-fw和p50c-rev进行pcr扩增，pcr扩增体系如表1所示，pcr扩增程序如下：95℃3分钟，95℃30秒，52℃30秒，72℃60秒，33个循环，琼脂糖电泳检测pcr扩增结果；(2)在扩增成功的pcr产物中加入2μl限制性内切酶dpni，在37℃酶切反应2小时，去除模板载体ppiczαa-cdaba，从而降低转化子的假阳性率；(3)将酶切完的pcr产物纯化回收，纯化回收过程与酶切好的cdaba和表达载体ppiczαa的纯化回收过程相同，将纯化后的酶切产物转入大肠杆菌top10中；(4)大肠杆菌转化子的筛选采用菌液pcr法，首先将重组转化子分别以单菌落的形式挑入lb培养基，200rpm，37℃培养4小时后，取2μl菌液作为模板，用引物5’aox-fw和3’aox-rev进行pcr扩增，pcr扩增反应体系如表3所示，pcr扩增条件为95℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环，将验证正确的产物进行测序，根据测序结果确定突变位点p50c，从而获得突变表达载体ppiczαa-cdaba-p50c；(4)以表达载体ppiczαa-cdaba-p50c为模板，按照构建突变体p50c所对应表达载体相同的方法，只是将扩增引物换成i84c-fw和i84c-rev，从而获得二硫键突变体表达载体ppiczαa-p50c-i84c(简称为ppiczαa-cdaba1)。
[0061]
通过实验最终获得12对二硫键突变体所对应的表达载体，分别是ppiczαa-cdaba1(对应突变体p50c-i84c)，ppiczαa-cdaba2(对应突变体a54c-a206c)，ppiczαa-cdaba3(对应突变体a67c-m223c)，ppiczαa-cdaba4(对应突变体k68c-a225c)，ppiczαa-cdaba5(对应突变体t70c-s94c)，ppiczαa-cdaba6(对应突变体f72c-h98c)，ppiczαa-cdaba7(对应突变体f72c-r137c)，ppiczαa-cdaba 8(对应突变体s97c-t121c)和ppiczαa-cdaba9(对应突变体t101c-k103c)、ppiczαa-cdaba10(对应突变体k103c-e106c)、ppiczαa-cdaba11(对应突变体y108c-y145c)和ppiczαa-cdaba12(对应突变体f216c-y221c)。
[0062]
表4二硫键突变体引物序列表
[0063]
[0064][0065]
通过限制性内切酶saci将12对不同二硫键突变体所对应的表达载体线性化后，通过电转化法转入毕赤酵母x33，电转化过程如下：(1)将毕赤酵母x33感受态细胞置于冰上放置20分钟；(2)加入200ng线性化后的不同二硫键突变体所对应的表达载体，混匀冰上放置5分钟后进行电转化，电转化条件为1.5千伏，400欧姆；(3)电击2min后，立即加入0.6ml预冷的1m山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；(4)30℃，静止放置2小时后涂布于ypdz平板，培养2～3天后观察转化子的情况。
[0066]
二硫键突变体筛选实验分为初步筛选和复筛两部分。初步筛选实验采用24孔板法，具体实验步骤如下：(1)将ypdz平板上的重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有2ml bmgy培养基的24孔板，30℃，200rpm过夜培养24小时后，4000rpm离心去掉上清，加入2ml的bmmy培养基，30℃，200rpm培养24小时，测定重组转化子几丁质脱乙酰基酶活性。
[0067]
几丁质脱乙酰酶活性的测定方法如下：2ml离心管中加入50℃预保温的0.05mol/l ph7.0的磷酸缓冲液600μl，200mg/l的对硝基乙酰苯胺水溶液200μl，酶液200μl，于50℃水浴反应10分钟，沸水浴终止反应，离心10分钟，测定上清液在410nm下的吸光度。以添加200μl同样浓度沸水浴灭活10分钟的酶液为对照。酶活单位(u)定义：在上述反应条件下每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量为一个酶活力单位。
[0068]
根据酶活结果，进一步测定酶热稳定性，热稳定性测试方法如下：将几丁质脱乙酰酶发酵酶液用磷酸缓冲液(ph7.0)稀释10倍后，在60℃水浴保温30分钟后进行剩余酶活测定，以没有热处理的样品作为对照。
[0069]
12对不同二硫键突变体初步筛选结果如表5所示，由表5可知，理性设计的12对二硫键中，只有突变体p50c-i84c和a67c-m223c能够有效提升几丁质脱乙酰基酶cdaba热稳定性，60℃水浴保温30分钟后，二者剩余酶活分别是出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba的1.33倍和1.61倍。
[0070]
表5不同二硫键突变体重组菌发酵酶活及热稳定性
[0071]
[0072][0073]
将初步筛选过程中效果明显的突变体p50c-i84c、a67c-m223c以及出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba进行复筛，复筛实验过程大致如下：(1)将突变体p50c-i84c、a67c-m223c和几丁质脱乙酰基酶cdaba所对应的重组工程菌分别挑入含有50ml bmgy培养基的250ml摇瓶中，30℃，200rpm培养至od
600
为6.0；(2)将培养好的菌液离心，去掉上清，转入含有100ml bmmy培养基的500ml摇瓶，菌液起始od
600
值为1.0，于30℃，200rpm培养，培养过程中每隔24时按0.5％(体积比，v/v)的比例加入甲醇进行诱导培养5天；(3)将培养好的发酵液离心收集上清液，并用10kda超滤管将收集的上清发酵液进行浓缩；(4)将浓缩好的发酵液参照ni-ida蛋白纯化试剂盒(上海生工)进行纯化，纯化过程如下：首先离心摇瓶培养发酵液，收集上清液；用10kda超滤管将收集的上清发酵液进行浓缩；将浓缩好的上清发酵液参照ni-ida蛋白纯化试剂盒(上海生工)进行纯化；(5)对纯化后重组几丁质脱乙酰基酶cdaba、突变体p50c-i84c和a67c-m223c进行最适反应温度和热稳定性测定。
[0074]
几丁质脱乙酰基酶cdaba、突变体p50c-i84c和a67c-m223c最适反应温度测定如下：在ph7.0条件下测定在30℃-80℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100％，计算其他温度下的相对酶活。
[0075]
几丁质脱乙酰基酶cdaba、突变体p50c-i84c和a67c-m223c最适反应温度实验结果如图2a所示。几丁质脱乙酰基酶cdaba、突变体p50c-i84c和a67c-m223c最适反应温度均为50℃，突变体p50c-i84c和a67c-m223c在高温条件下(50℃-80℃)相对酶活均高于几丁质脱乙酰基酶cdaba。
[0076]
几丁质脱乙酰基酶cdaba、突变体p50c-i84c和a67c-m223c热稳定性测定如下：在50℃-80℃不同温度下水浴热处理30分钟后测定剩余酶活，以没有做热处理样品的酶活为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。
[0077]
几丁质脱乙酰基酶cdaba、突变体p50c-i84c和a67c-m223c热稳定性如图2b所示。
当热处理温度大于50℃，突变体p50c-i84c和a67c-m223c水浴处理30分钟后，剩余酶活明显高于出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba。当热处理温度为70℃，突变体p50c-i84c和a67c-m223c的剩余酶活分别为38.1％和51.3％，分别是几丁质脱乙酰基酶cdaba剩余酶活的2.5和3.4倍。当热处理温度为80℃，几丁质脱乙酰基酶cdaba剩余酶活仅为5.1％，突变体p50c-i84c和a67c-m223c的剩余酶活则分别为13.3％和21.3％。
[0078]
实施例3点突变提升几丁质脱乙酰基酶cdaba热稳定性
[0079]
前期许多研究表明对蛋白进行氨基酸定点突变能够提升其热稳定性，此外不同氨基酸之间具有协同作用能够进一步提升蛋白稳定性。fireprot(https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotweb/)是由马萨克里大学生物系科研团队开发的一款在线突变分析软件，通过fireprot软件预测分析，能够获得目标突变体，从而提升目的蛋白热稳定性。通过fireprot软件对几丁质脱乙酰基酶cdaba进行突变预测分析，最终选定15个目标单点突变体。fireprot软件预测结果表明这15个单点突变体通过降低几丁质脱乙酰基酶cdaba三维构象自由能，从而提升其稳定性。这15个单点突变体及其对应的自由能分别为：k75w(-2.16kcal/mol)、v79i(-2.47kcal/mol)、s105f(-2.15kcal/mol)、d112n(-3.28kcal/mol)、n119k(-2.11kcal/mol)、d120i(-3.92kcal/mol)、d123y(-2.07kcal/mol)、e127y(-2.09kcal/mol)、t128y(-3.91kcal/mol)、k130g(-3.23kcal/mol)、n160y(-2.59kcal/mol)、e177g(-5.48kcal/mol)、n187l(-2.04kcal/mol)、k202w(-3.35kcal/mol)和t204m(-3.09kcal/mol)。
[0080]
根据cdaba基因序列分别设计单点突变体扩增引物(引物序列信息如表6所示)。不同单点突变体所对应的表达载体构建过程和实施例2中二硫键突变体构建方法相同，只是将扩增引物换成每个单点突变体所对应的引物。通过实验最终获得15个单点突变体所对应的表达载体，分别为ppiczαa-cdabas1(对应突变体k75w)、ppiczαa-cdabas2(对应突变体v79i)、ppiczαa-cdabas3(对应突变体s105f)、ppiczαa-cdabas4(对应突变体d112n)、ppiczαa-cdabas5(对应突变体n119k)、ppiczαa-cdabas6(对应突变体d120i)、ppiczαa-cdabas7(对应突变体d123y)、ppiczαa-cdabas8(对应突变体e127y)、ppiczαa-cdabas9(对应突变体t128y)、ppiczαa-cdabas10(对应突变体k130g)、ppiczαa-cdabas11(对应突变体n160y)、ppiczαa-cdabas12(对应突变体e177g)、ppiczαa-cdabas13(对应突变体n187l)、ppiczαa-cdabas14(对应突变体k202w)和ppiczαa-cdabas15(对应突变体t204m)。
[0081]
表6单点突变体引物序列
[0082][0083][0084]
单点突变体重组菌构建过程和实施例2中二硫键突变体重组工程菌构建过程一致。首先通过限制性内切酶saci将15个不同单点突变体所对应的表达载体线性化后，转入毕赤酵母x33，转化子涂布于ypdz平板，30℃培养4天后进行筛选实验。
[0085]
单点突变体重组工程菌筛选过程和实施列2中二硫键突变体重组工程菌筛选过程一致，包括初步筛选和复筛。
[0086]
初步筛选结果如表7所示，突变体s105f、t128y、n187l和t204m能够提升几丁质脱乙酰基酶cdaba热稳定性，60℃，热处理30分钟后，剩余酶活分别为43.5％、45.1％、44.2％和43.7％，相比出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba，热稳定性分别提升10.7％、14.8％、12.5％和11.2％。
[0087]
表7不同单点突变体重组菌发酵酶活及热稳定性
[0088][0089]
将有效单点突变体s105f、t128y、n187l和t204m进行复筛实验。复筛实验过程和实施例2中二硫键突变体复筛过程一致。通过培养、纯化实验分别获得纯化后的单点突变体s105f、t128y、n187l和t204m。分别对纯化后的单点突变体s105f、t128y、n187l和t204m进行最适反应温度和热稳定性测定，整个实验过程以几丁质脱乙酰基酶cdaba作为对照。
[0090]
单点突变体s105f、t128y、n187l、t204m和几丁质脱乙酰基酶cdaba最适反应温度实验结果如图3a所示。单点突变体s105f、t128y、n187l、t204m和几丁质脱乙酰基酶cdaba最适反应温度均为50℃，单点突变体s105f、t128y、n187l和t204m在50℃-80℃范围内，相对酶活均高于几丁质脱乙酰基酶cdaba。
[0091]
单点突变体s105f、t128y、n187l、t204m和几丁质脱乙酰基酶cdaba热稳定性结果如图3b所示。当热处理温度大于60℃，单点突变体s105f、t128y、n187l和t204m的热稳定性明显好于出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba。70℃水浴处理30分钟后，单点突变体s105f、t128y、n187l和t204m的剩余酶活分别为23.1％，28.6％，27.6％和22.8％，分别是几丁质脱乙酰基酶cdaba的1.54倍、1.91倍、1.84倍和1.52倍。
[0092]
实施例4有效突变体组合突变
[0093]
实施例2通过实验获得2对有效二硫键突变体p50c-i84c和a67c-m223c，实施例3通过实验获得4个有效单点突变体s105f、t128y、n187l和t204m。本部分将这些有效突变体进行组合突变，从而进一步提升热稳定性。
[0094]
首先将二硫键突变体p50c-i84c和a67c-m223c进行组合突变，实验过程和实施例2
一致，以突变体a67c-m223c对应的表达载体ppiczαa-cdaba3为模板，通过实验最终获得双二硫键突变体(p50c-i84c和a67c-m223c)所对应的表达载体ppiczαa-cdaba3-1。双二硫键突变体表达载体ppiczαa-cdaba3-1经限制性内切酶saci线性化后转入毕赤酵母x33。重组转化子的筛选、酶活测定以及热稳定性测定均和实施例2一致。最终双二硫键突变体p50c-i84c/a67c-m223c的最适反应温度为55℃，相比出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba提升5℃。此外双二硫键突变体p50c-i84c/a67c-m223c在60℃水浴处理30分钟后，剩余酶活为92.5％是出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba剩余酶活的2.35倍。
[0095]
以双二硫键为模板，分别叠加有效单点突变体s105f、t128y、n187l和t204m。通过实验分别获得表达载体ppiczαa-cdaba3-1-105(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-s105f)、ppiczαa-cdaba3-1-128(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-t128y)、ppiczαa-cdaba3-1-187(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-n187l)、ppiczαa-cdaba3-1-204(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-t204m)、ppiczαa-cdaba3-1-105-128(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-s105f-t128y)、ppiczαa-cdaba3-1-105-187(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-s105f-n187l)、ppiczαa-cdaba3-1-105-204(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-s105f-t204m)、ppiczαa-cdaba3-1-128-187(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-t128y-n187l)、ppiczαa-cdaba3-1-128-204(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-t128y-t204m)、ppiczαa-cdaba3-1-187
ꢀ‑
204(对应突变体p50c-i84c/a67c-m223c-n187l-t204m)和ppiczαa-cdaba3-1-105-128-187-204(p50c-i84c/a67c-m223c-s105f-t128y-n187l-t204m)。
[0096]
分别将组合突变体表达载体线性化后转入毕赤酵母x33，重组转化子的筛选和酶活测定均和实施例2一致。
[0097]
不同组合突变体热稳定性测定参照实施例2热稳定性方法进行，只是将热处理温度提升至70℃。在70℃水浴处理30分钟后进行剩余酶活测定，整个实验过程以出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba为对照。
[0098]
不同组合突变体酶活和热稳定性结果如表8所示。由表8可知，将有效二硫键突变体和单点突变进行组合均能够进一步有效提升热稳定性。其中组合突变体p50c-i84c/a67c-m223c-s105f-t128y-n187l-t204m效果最好，其次分别为突变体p50c-i84c/a67c-m223c-t128y-n187l和p50c-i84c/a67c-m223c-s105f-n187l。组合突变体p50c-i84c/a67c-m223c-s105f-t128y-n187l-t204m在70℃水浴处理30分钟后剩余酶活为87.2％，是出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba的5.69倍。
[0099]
为了便于书写，将突变体p50c-i84c/a67c-m223c-s105f-t128y-n187l-t204m简写为cdabam，其对应的表达载体简称为ppiczαa-cdabam。
[0100]
表8组合突变体重组菌发酵酶活及温度特性
[0101]
[0102][0103]
实施例5重组突变体cdabam高效制备
[0104]
由于重组突变体cdabam的热稳定性得到有效提升，从而扩宽了其产业化应用的价值。为了进一步增强其产业化应用前景，必须降低cdabam生产成本。
[0105]
高酶活重组工程菌筛选和高密度发酵能够有效提升重组蛋白在毕赤酵母的表达量，本部分拟通过这两种技术实现重组突变体cdabam的高效制备。
[0106]
高酶活重组工程菌筛选实验过程如下：(1)将表达载体ppiczαa-cdabam线性化后转入毕赤酵母，转化方法(即电转化法)参照实施列2进行，将电转后的转化子涂布于高浓度ypdz平板(大于500mg/l zeocin)；(2)采用24孔板法挑选96个重组转化子进行初步筛选；(3)将初步筛选获得高酶活转化子进行摇瓶培养复筛；(4)将摇瓶培养筛选出来的转化子进行高密度发酵验证。
[0107]
通过24孔板初步筛选从96个转化子中获得3个高酶活重组工程菌，分别命名为c12、c28和c78，这三个重组工程菌的酶活分别为11.2u/ml，12.5u/ml和10.8u/ml。
[0108]
将初步筛选获得的3个高酶活重组工程菌c12、c28和c78进行摇瓶培养，实验过程如下：(1)将相应的重组工程菌种接入含有5ml bmgy培养基的50ml离心管中，于30℃，220rpm培养24小时；(2)将培养好的重组酵母工程菌种按1％(v/v)的接种量接入含有50ml bmmy培养基的250ml三角瓶中，摇瓶培养条件为30℃，220rpm；(3)每隔24小时加入1％(v/v)的甲醇进行诱导培养，取样进行酶活性的测定。
[0109]
摇瓶诱导培养120小时后，重组工程菌c12、c28和c78的发酵酶活分别为35.6u/ml、41.2u/ml和33.5u/ml。
[0110]
将摇瓶筛选获得的重组工程菌c28进行高密度发酵。重组工程菌的高密度发酵在7l发酵罐进行，具体过程大致如下：将单菌落重组酵母工程菌接入含有50ml ypd培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm振荡培养16小时。再将过夜培养的重组酵母工程菌按1％(v/
v)的接种量接入含有100ml ypd培养基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至od 600
大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌按10％(v/v)的接种量接入含有3l bsm培养基的7l发酵罐。重组酵母工程菌在7l发酵罐的培养条件为：温度为30℃、ph值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40l/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量(180g/l左右)，停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后(溶氧迅速上升)开始用甲醇诱导。发酵过程中每隔24小时测定酶活和总蛋白。
[0111]
重组工程菌c28发酵过程曲线如图4a所示，当诱导培养至168小时，发酵酶活达到最大(1562.6u/ml)，总蛋白浓度最大为5.16g/l。
[0112]
此外蛋白电泳分析结果(图4b)表明发酵上清液中主要为重组突变体cdabam，其大小约为30kda。
[0113]
实施例6重组突变体cdabam特性表征
[0114]
采用实施例2中二硫键突变体纯化方法，对重组突变体cdabam进行分离纯化(具体过程同浓缩好的发酵液，参照ni-ida蛋白纯化试剂盒)。通过实验获得纯化后的重组突变体cdabam。对重组突变体cdabam进行特性表征，包括比活、酶动力学参数和温度特性，整个实验过程中以出发模板几丁质脱乙酰基酶cdaba为对照。
[0115]
重组突变体cdabam和几丁质酶脱乙酰基酶cdaba酶比活以及酶动力学参数如表9所示。重组突变体cdabam和几丁质酶脱乙酰基酶cdaba酶比活分别为355u/mg和293u/mg，米氏常数km分别为2.3mg/ml和2.6mg/ml，最大反应速度v
max
分别为561.1μm/min/mg和506.8μm/min/mg。
[0116]
表9突变体cdabam和几丁质脱乙酰基酶cdaba酶动力学参数
[0117]
酶动力学参数cdabacdabam酶比活(u/mg)355293米氏常数km(mg/ml)2.32.6最大反应速度v
max
(μm/min/mg)561.1506.8
[0118]
重组突变体cdabam和几丁质酶脱乙酰基酶cdaba最适反应温度测定方法和实施列2二硫键突变体最适反应温度相同。实验结果如图5a所示。
[0119]
由图5a可知，出发模板几丁质酶脱乙酰基酶cdaba最适反应温度为50℃，重组突变体cdabam的最适反应温度为60℃，相比几丁质酶脱乙酰基酶cdaba提升10℃。
[0120]
重组突变体cdabam和几丁质酶脱乙酰基酶cdaba热稳定性测定方法大致如下：在60℃，70℃和80℃条件下水浴保温30分钟和60分钟后测定剩余酶活，以没有做热处理样品的酶活为100％，计算其它温度下的相对剩余酶活。实验结果如图5b所示。
[0121]
由图5b可知，重组突变体cdabam在60℃至80℃范围内热稳定性显著好于出发模板几丁质酶脱乙酰基酶cdaba。60℃热处理30分钟和60分钟后，重组突变体cdabam剩余酶活分别为97.2％和75.3％，相同条件下几丁质酶脱乙酰基酶cdaba剩余酶活分别为41.6％和18.9％。
[0122]
当温度提升至70℃，重组突变体cdabam热处理30分钟和60分钟后，剩余酶活分别为87.4％和52.8％，分别是几丁质酶脱乙酰基酶cdaba的5.8倍和10.4倍(图5b)。
[0123]
当温度转化至80℃，重组突变体cdabam热处理30分钟和60分钟后，剩余酶活分别为40.2％和21.3％，分别是几丁质酶脱乙酰基酶cdaba的10.2倍和18.5倍(图5b)。

技术特征：
1.一种几丁质脱乙酰基酶突变体cdabam，其特征在于，突变体cdabam的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述几丁质脱乙酰基酶突变体cdabam，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如seq id no.2所示。3.一种重组表达载体ppiczαa-cdabam，其特征在于，包含编码权利要求2所述几丁质脱乙酰基酶突变体cdabam的多聚核苷酸序列。4.一种重组工程菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组表达载体ppiczαa-cdabam。5.如权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌以毕赤酵母工程菌作为宿主。6.如权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母x33。7.一种如权利要求4所述重组工程菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、将表达载体ppiczαa-cdabam线性化后转入毕赤酵母，电转后的转化子涂布于ypdz平板上；s2、采用24孔板法挑选96个重组转化子进行初步筛选；s3、将初步筛选获得高酶活转化子进行摇瓶培养复筛；s4、将摇瓶培养筛选出来的转化子进行高密度发酵验证。8.如权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，步骤s1所述ypdz平板中博莱霉素的浓度大于500mg/l。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种几丁质脱乙酰基酶突变体、重组表达载体、重组工程菌及其筛选方法。本发明首先通过对出发模板几丁质脱乙酰基酶CdaBa进行二硫键设计，获得2对有效的二硫键突变体。通过对出发模板几丁质脱乙酰基酶CdaBa进行理性单点突变，获得4个有效单点突变体。最后将2对有效的二硫键突变体和4个有效的单点突变体进行组合突变，进一步筛选获得最佳突变体CdaBaM；这种突变体进一步应用于重组载体及重组菌株的制备过程。采用本发明方法制得的突变体CdaBaM在70℃热处理30分钟和60分钟，剩余酶活分别为87.4％和52.8％，是出发模板几丁质脱乙酰基酶CdaBa的5.8倍和10.4倍。5.8倍和10.4倍。5.8倍和10.4倍。


技术研发人员：王建荣 祝木金 陈微 王平 钟斌 陈孟林 高美芳 曹革
受保护的技术使用者：深圳润康生态环境股份有限公司
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/8/16