一种非鼠类哺乳动物IL-1α抗体的体内药效检测方法与流程

一种非鼠类哺乳动物il-1
α
抗体的体内药效检测方法
技术领域
1.本技术属于药物开发领域，具体而言，涉及一种检测针对非鼠类哺乳动物il-1α的抗体的体内药效的方法。


背景技术：

2.啮齿类动物如小鼠、大鼠是最常用于抗体药物体内药效研究的动物种属，其前提是抗体药物对人和啮齿类靶点蛋白具有交叉反应，即抗体既可与人靶点蛋白结合，又可与啮齿类靶点蛋白结合。
3.目前还没有靶向人il-1α的抗体药物上市，由于人il-1α和啮齿类il-1α的同源性较低，与小鼠、大鼠il-1α的氨基酸序列一致性分别只有56％、59％，在抗体发现研究中难以筛选获得具有人鼠交叉反应的候选抗体，目前唯一进入临床研究阶段的il-1α抗体药物bermekimab即不具有人鼠交叉反应，其在临床研究中用于治疗特应性皮炎、化脓性汗腺炎、类风湿关节炎等炎症性疾病，同时也用于治疗肿瘤。
4.由于生物体体内代谢的复杂性，体外活性结果并不能准确地反映出药物在生物体内的药效，因此，需要对药物的体内药效进行检测。对于因靶点人鼠同源性低而缺乏人鼠交叉的抗体药物如il-1α抗体，目前常采用以下两种途径进行体内药效的评价：一种是表达针对鼠源il-1α的替代抗体，在啮齿类中进行体内药效研究，但该方法只能间接反映阻断该靶点带来的效应，用于评价的是替代抗体，而不能对产品本身进行评价，也不能对多个候选分子进行比较，并且开发替代抗体会花费额外的时间和成本。另一种方式是使用表达人il-1α的转基因小鼠来开展体内药效研究，但目前尚无商品化的il-1α转基因小鼠提供，并且即便该转基因小鼠构建成功，能否成功诱导人类疾病相关反应也存在不确定性，因此目前该方法尚不具备可及性。
5.综上所述，靶向人il-1α的抗体药物由于缺乏人鼠交叉反应，目前还缺乏有效、实用的体内药效评价手段，已成为该靶点药物开发的主要瓶颈之一，常用的炎症性疾病啮齿类模型如特应性皮炎、银屑病、类风湿关节炎等的啮齿类模型均不适用，因此开发一种体内药效检测方法，对于该靶点药物的开发具有重要意义。


技术实现要素：

6.为了能够反映出抗人il-1α抗体药物的体内药效，本技术的发明人通过研究开发了一种体内药效检测方法，无需诱导动物患病即可实现对人il-1α抗体的体内药效的快速、灵敏的检测，这使得整个实验过程可在2天内完成，从而有助于高效地筛选得到具有期望的体内药效的il-1α抗体药物。
7.在一个方面，本技术涉及一种非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效检测方法，包括：
8.(1)向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α；
9.(2)向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予待测的il-1α抗体和pbs溶液；
10.(3)对给予所述待测的il-1α抗体的鼠科动物和给予所述pbs溶液的鼠科动物进行采血，分离得到二者的血清；
11.(4)检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量并进行比较。
12.在另一方面，本技术涉及一种用于实施上述方法的检测系统，包括：il-1α给予单元，il-1α抗体给予单元，采血和血清分离单元，以及il-6、il-8和ccl20的含量检测单元。
13.在另一方面，本技术涉及一种用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的试剂盒，包括：来自非鼠类哺乳动物的il-1α，以及il-6、il-8和ccl20的含量检测试剂。
14.在另一方面，本技术涉及一种筛选具有体内有效性的非鼠类哺乳动物il-1α抗体的方法，包括：
15.(i)向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α；
16.(ii)向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予待测的il-1α抗体和pbs溶液；
17.(iii)对给予所述待测的il-1α抗体的鼠科动物和给予所述pbs溶液的鼠科动物进行采血，分离得到二者的血清；
18.(iv)检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量并进行比较，筛选出相对于来自给予所述pbs溶液的鼠科动物的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量，在给予后能够降低il-6、il-8和ccl20的含量的il-1α抗体。
19.在另一方面，本技术涉及炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合中的用途。或者，本技术涉及炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合在制备用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合的试剂中的用途。
20.在又一方面，本技术涉及用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的鼠科动物模型的构建方法，包括向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α。
21.在又一方面，本技术涉及通过上述的构建方法得到的鼠科动物模型在筛选具有体内有效性的非鼠类哺乳动物il-1α抗体中的用途。
22.在又一方面，本技术涉及一种用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的鼠科动物模型，其中，所述鼠科动物模型通过向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α得到。
附图说明
23.图1示出了对小鼠注射人il-1α后2h的各细胞因子释放水平的检测结果，其中，上子图示出了按照雄性小鼠(m)和雌性小鼠(f)分开统计的各组小鼠(包括空白对照组和不同剂量的人il-1α给予组)的各细胞因子释放水平的检测结果；下子图分别示出了各组小鼠注射人il-1α后2h的il-6(mil-6)、il-8(mil-8)和ccl20(mccl20)的释放水平变化情况，其中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
24.图2示出了对小鼠注射人il-1α后24h的各细胞因子释放水平的检测结果，其中，各组小鼠(包括空白对照组和不同剂量的人il-1α给予组)的检测结果按照雄性小鼠(m)和雌性小鼠(f)分开统计。
25.图3为il-1α抗体的还原和非还原sds-page电泳图谱。
26.图4示出了il-1α抗体的sec-hplc图谱，可以看出，il-1α抗体的纯度达到99.8％。
27.图5示出了il-1α抗体对人il-1α诱导小鼠的il-6释放的阻断效应，其中，****表示p＜0.0001。
28.图6示出了il-1α抗体对人il-1α诱导小鼠的il-8释放的阻断效应，其中，*表示p＜0.05。
29.图7示出了il-1α抗体对人il-1α诱导小鼠的ccl20释放的阻断效应，其中，*表示p＜0.05。
具体实施方式
30.除非另外定义，否则本文使用的各技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如singleton等，dictionary of microbiology and molecular biology 2nded.，j.wiley&sons(new york，ny 1994)；sambrook等，molecular cloning，a laboratory manual，cold springs harbor press(cold springs harbor，ny 1989)；davis等，basic methods in molecularbiology，elsevier science publishing inc.，new york,usa(2012)；abbas等，cellular and molecularimmunology，elsevier science health science div(2009)；何维等，医学免疫学(第2版)，人民卫生出版社，2010年。
31.在本文中，除非另有说明，术语“包含、包括和含有(comprise、comprises和comprising)”或其等同物(contain、contains、containing、include、includes、including)为开放式表述，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
32.在本文中，除非另有说明，本文所使用的表示成分的量、测量值或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比相连时，术语“约”可以表示例如
±
1％、优选
±
0.5％、更优选
±
0.1％。
33.除非上下文另有明确指示，单数术语涵盖复数的指示对象，反之亦然。类似地，除非上下文另有明确指示，词语“或”意在包括“和”。
34.在本文中，除非另有说明，术语“任选的”或“任选地”表示其所修饰的对象或事件存在或不存在、或者发生或不发生，例如“il-1α给予单元和il-1α抗体给予单元包括任选的鼠科动物固定器”意味着所述单元可包含或不包含鼠科动物固定器。
35.在本文中，序列之间的一致性或同一性百分比(同源性程度)可以通过例如使用万维网(例如www.ncbi.nlm.nih.gov)上通常用于此目的的免费可用的计算机程序(例如具有默认设置的blastp或blastn)对两个序列进行比较来确定。
36.炎症是生物体对组织损伤和外来物质侵害等产生的防御反应，炎症性疾病是由于局部或全身性异常的炎症反应导致的一类疾病。作为il-1家族成员，il-1α在人类中由il-1a基因编码，通过与il-1r1亚基配对产生myd88依赖性信号，从而在调节免疫应答方面发挥作用，有望成为治疗炎性疾病的靶点。
37.目前针对il-1α这一靶点虽然开发了一些抗体，但是仍无相应药物上市，关于实现il-1α抗体的体内药效的快速、灵敏检测，目前尚无报道。由于il-1α的人鼠种间同源性较低，因此，已开发的非鼠源il-1α抗体(例如人il-1α抗体)难以利用常规的鼠类模型检测体内药效。然而，体内药效结果对于抗体的成药性有很重要的影响，由于稳定的转基因鼠类模
型的开发也存在技术难度，需要构建用于非鼠源il-1α抗体的体内药效检测的新方案。
38.体内药效检测
39.本技术的发明人通过实验发现，当向小鼠给予非鼠类哺乳动物il-1α(例如人il-1α)后，能够引起il-6、il-8、ccl20的释放水平显著升高，当待测的il-1α抗体能够与小鼠体内的该抗原实现有效结合时，使小鼠血清中的il-6、il-8、ccl20的水平相对于阴性对照小鼠中的相应水平降低，这反映出待测的il-1α抗体可以在体内实现期望的药效。由此，本技术的发明人发现可以通过上述操作快速、灵敏地检测il-1α抗体的体内药效(例如体内抗炎药效)。
40.在一个实施方式中，本技术涉及一种非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效检测方法，包括：
41.(1)向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α；
42.(2)向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予待测的il-1α抗体和pbs溶液；
43.(3)对给予所述待测的il-1α抗体的鼠科动物和给予所述pbs溶液的鼠科动物进行采血，分离得到二者的血清；
44.(4)检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量并进行比较。
45.在一些实施方式中，所述非鼠类哺乳动物包括灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选灵长目动物，例如猿类(例如长臂猿、黑猿、大猿等)、猴类(例如猕猴，如恒河猴、食蟹猴)、猩猩科(例如黑猩猩、大猩猩等)和人，更优选人。
46.在一些实施方式中，所述体内药效为体内抗炎药效。
47.在一些实施方式中，所述鼠科动物包括小鼠属、大鼠属和家鼠属动物，例如小鼠、大鼠、褐家鼠(rattusnorvegicus)、小家鼠(mus musculus)等。在一些实施方式中，按照0.1-5000μg/kg、优选0.5-200μg/kg、更优选1-100μg/kg(例如1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg或处于上述任意两个值构成的范围内)的剂量向鼠科动物给予il-1α。向鼠科动物给予il-1α的方式不受特别的限制，例如通过灌胃、腹腔注射等方式向鼠科动物给予il-1α。
48.在本文中，可以在向鼠科动物给予il-1α后立即或者间隔一段时间(例如间隔0.01-10h、0.05-5h、5min、10min、20min、30min、1h、1.25h、1.5h、2h、3h或前述任意两个值构成的范围)再给予待测的il-1α抗体或pbs溶液。
49.在本文中，向鼠科动物给予il-1α和待测的il-1α抗体的顺序不受特别的限制，可以任意调整。例如，可以向鼠科动物给予il-1α后再给予待测的il-1α抗体；或者可以先向鼠科动物给予待测的il-1α抗体，然后再给予il-1α；或者，可以向鼠科动物给予部分量的il-1α后，给予待测的il-1α抗体，然后再给予剩余量的il-1α，但不限于此。
50.在一些实施方式中，向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予等体积或者不同体积的待测的il-1α抗体和pbs溶液。在一个优选实施方式中，向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予等体积的待测的il-1α抗体和pbs溶液。
51.在一些实施方式中，pbs溶液与待测的il-1α抗体的给予体积可为1-50ml/kg、优选5-40ml/kg、5-30ml/kg、5-20ml/kg、5-15ml/kg、5-10ml/kg，例如2ml/kg、5ml/kg、8ml/kg、10ml/kg、12ml/kg、15ml/kg、20ml/kg、30ml/kg、40ml/kg或由上述任意两个值构成的范围。
52.在一些实施方式中，待测的il-1α抗体的给予剂量为0.1-50mg/kg，优选0.5-30mg/
kg、0.8-20mg/kg、1.0-15mg/kg、1.0-10mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg或由上述任意两个值构成的范围。在本文中，各样品(包括il-1α、il-1α抗体和pbs溶液)的给予剂量和体积均为相对于待给予的鼠科动物的体重(以kg计)的量。
53.在一些实施方式中，通过注射(例如静脉注射、皮下注射、腹腔注射等)向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予待测的il-1α抗体和pbs溶液(用作阴性对照)。
54.在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于70％(例如72％以上、75％以上、78％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％)的不同物种。优选地，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于85％(例如86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％)的不同物种。
55.在一些更优选的实施方式中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自近缘物种或相同物种，例如所述待测的il-1α抗体与所述il-1α分别来自相同或不同的灵长目动物、分别来自相同或不同的猿类、分别来自不同的猿类和猴类、分别来自相同或不同的猴类、分别来自人和猴类、分别来自人和猿类、分别来自人和猩猩科动物、分别来自相同或不同的猩猩科动物、分别来自相同或不同的人、分别来自人和猕猴、分别来自人和黑猩猩、或者分别来自人和长臂猿等，或者上述的任意组合或者顺序调换后的方案。
56.在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列和恒定区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。
57.在一些实施方式中，在给予待测的il-1α抗体或pbs溶液后1-24h对所述鼠科动物进行采血，优选在给予待测的il-1α抗体或pbs溶液后2-3h、例如2h对所述鼠科动物进行采血，以实现快速检测的目的。对采集的血液在常规条件下进行离心分离(例如在4℃、4000g
下离心10min)，从而得到血清。
58.在一些实施方式中，通过elisa反应并测定450nm及630nm波长下的吸光度来检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量。当获取自给予待测的il-1α抗体的鼠科动物的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量低于获取自阴性对照鼠科动物(给予pbs溶液的鼠科动物)的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量时，可说明所述待测的il-1α抗体表现出良好的体内药效。
59.在一个实施方式中，本技术涉及一种用于实施上述方法的检测系统，包括：il-1α给予单元，il-1α抗体给予单元，采血和血清分离单元，以及il-6、il-8和ccl20的含量检测单元。
60.在一些实施方式中，所述il-1α给予单元和il-1α抗体给予单元包括注射器和任选的鼠科动物固定器。在本文中，在使用鼠科动物固定器的情况下，所述il-1α给予单元和il-1α抗体给予单元可共用同一鼠科动物固定器或分别包括各自的鼠科动物固定器。
61.在一些实施方式中，所述采血和血清分离单元包括采血针、采血管和离心机。在本文中，考虑到血液的稳定性与保存时间呈反比，为了避免血液样本存放可能带来的不利影响，在采血后尽快进行血清和血浆的分离。
62.在一些实施方式中，所述il-6、il-8和ccl20的含量检测单元包括检测试剂盒和酶标仪。
63.在一个实施方式中，本技术涉及一种用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的试剂盒，包括：来自非鼠类哺乳动物的il-1α，以及il-6、il-8和ccl20的含量检测试剂。利用上述试剂盒中的来自非鼠类哺乳动物的il-1α对鼠科动物进行处理后，将待测的非鼠类哺乳动物il-1α抗体给予鼠科动物，然后利用试剂盒中的il-6、il-8和ccl20的含量检测试剂来检测鼠科动物血清中的il-6、il-8和ccl20的含量变化情况，从而可确定待检测的非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效。
64.在一些实施方式中，所述非鼠类哺乳动物包括灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选灵长目动物，例如猿类(例如长臂猿、黑猿、大猿等)、猴类(例如猕猴，如恒河猴、食蟹猴)、猩猩科(例如黑猩猩、大猩猩等)和人，更优选人。
65.在一些实施方式中，所述体内药效为体内抗炎药效。
66.在一些实施方式中，所述il-1α的部分或全部氨基酸序列与所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于70％的不同物种。优选地，所述il-1α的全部氨基酸序列与所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于85％的不同物种。
67.在一些更优选的实施方式中，所述il-1α的部分或全部氨基酸序列与所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列来自近缘物种或相同物种，例如所述il-1α与所述待测的il-1α抗体分别来自相同或不同的灵长目动物、分别来自相同或不同的猿类、分别来自不同的猿类和猴类、分别来自相同或不同的猴类、分别来自人和猴类、分别来自人和猿类、分别来自人和猩猩科动物、分别来自相同或不同的猩猩科动物、分别来自相同或不同的人、分别来自人和猕猴、分别来自人和黑猩猩、或者分别来自人和长臂猿等，或者上述的任意组合或者顺序调换后的方案。
68.在一些实施方式中，所述il-1α的全部氨基酸序列与所述待测的il-1α抗体的全部
氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列和恒定区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。
69.在一些实施方式中，il-6、il-8和ccl20的含量检测试剂包括：第一抗体(包被抗体/固相抗体)、第二抗体和显色底物等。在一些实施方式中，所述第一抗体为抗鼠科动物第一抗体，例如抗小鼠il-6第一抗体、抗小鼠il-8第一抗体和抗小鼠ccl20第一抗体。在一些实施方式中，所述第二抗体为生物素化的抗体，并且所述含量检测试剂还包含辣根过氧化酶标记的链霉亲和素(hrp-streptavidin)。在一些实施方式中，所述显色底物为tmb。在一些实施方式中，所述含量检测试剂还包括：il-6、il-8和ccl20各自的标准品、稀释缓冲液、洗涤缓冲液、终止液等。
70.在一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于所述检测的说明书。
71.抗体筛选和动物模型的构建
72.在一个实施方式中，本技术涉及一种筛选具有体内有效性的非鼠类哺乳动物il-1α抗体的方法，包括：
73.(i)向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α；
74.(ii)向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予待测的il-1α抗体和pbs溶液；
75.(iii)对给予所述待测的il-1α抗体的鼠科动物和给予所述pbs溶液的鼠科动物进行采血，分离得到二者的血清；
76.(iv)检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量并进行比较，筛选出相对于来自给予所述pbs溶液的鼠科动物的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量，在给予后能够降低il-6、il-8和ccl20的含量的il-1α抗体。
77.在一些实施方式中，所述非鼠类哺乳动物包括灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选灵长目动物，例如猿类(例如长臂猿、黑猿、大猿等)、猴类(例如猕猴，如恒河猴、食蟹猴)、猩猩科(例如黑猩猩、大猩猩等)和人，更优选人。
78.在一些实施方式中，所述体内药效为体内抗炎药效。
79.在一些实施方式中，所述鼠科动物包括小鼠属、大鼠属和家鼠属动物，例如小鼠、大鼠、褐家鼠(rattusnorvegicus)、小家鼠(mus musculus)等。在一些实施方式中，按照0.1-5000μg/kg、优选0.5-200μg/kg、更优选1-100μg/kg(例如1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg或处于上
述任意两个值构成的范围内)的剂量向鼠科动物给予il-1α。向鼠科动物给予il-1α的方式不受特别的限制，例如通过灌胃、腹腔注射等方式向鼠科动物给予il-1α。
80.在本文中，可以在向鼠科动物给予il-1α后立即或者间隔一段时间(例如间隔0.01-10h、0.05-5h、5min、10min、20min、30min、1h、1.25h、1.5h、2h、3h或前述任意两个值构成的范围)再给予待测的il-1α抗体或pbs溶液。
81.在一些实施方式中，向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予等体积或者不同体积的待测的il-1α抗体和pbs溶液。在一个优选实施方式中，向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予等体积的待测的il-1α抗体和pbs溶液。
82.在一些实施方式中，pbs溶液与待测的il-1α抗体的给予体积可为1-50ml/kg、优选5-40ml/kg、5-30ml/kg、5-20ml/kg、5-15ml/kg、5-10ml/kg，例如2ml/kg、5ml/kg、8ml/kg、10ml/kg、12ml/kg、15ml/kg、20ml/kg、30ml/kg、40ml/kg或由上述任意两个值构成的范围。
83.在一些实施方式中，待测的il-1α抗体的给予剂量为0.1-50mg/kg，优选0.5-30mg/kg、0.8-20mg/kg、1.0-15mg/kg、1.0-10mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg或由上述任意两个值构成的范围。在本文中，各样品(包括il-1α、il-1α抗体和pbs溶液)的给予剂量和体积均为相对于待给予的鼠科动物的体重(以kg计)的量。
84.在一些实施方式中，通过注射(例如静脉注射、皮下注射、腹腔注射等)向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予待测的il-1α抗体和pbs溶液(用作阴性对照)。
85.在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于70％的不同物种。优选地，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于85％的不同物种。
86.在一些更优选的实施方式中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自近缘物种或相同物种，例如所述待测的il-1α抗体与所述il-1α分别来自相同或不同的灵长目动物、分别来自相同或不同的猿类、分别来自不同的猿类和猴类、分别来自相同或不同的猴类、分别来自人和猴类、分别来自人和猿类、分别来自人和猩猩科动物、分别来自相同或不同的猩猩科动物、分别来自相同或不同的人、分别来自人和猕猴、分别来自人和黑猩猩、或者分别来自人和长臂猿等，或者上述的任意组合或者顺序调换后的方案。
87.在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列
与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列和恒定区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。
88.在一些实施方式中，在给予待测的il-1α抗体或pbs溶液后1-24h对所述鼠科动物进行采血，优选在给予待测的il-1α抗体或pbs溶液后2-3h、例如2h对所述鼠科动物进行采血，以实现快速检测的目的。对采集的血液在常规条件下进行离心分离(例如在4℃、4000g下离心10min)，从而得到血清。
89.在一些实施方式中，通过elisa反应并测定450nm及630nm波长下的吸光度来检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量。当获取自给予待测的il-1α抗体的鼠科动物的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量低于获取自阴性对照鼠科动物(给予pbs溶液的鼠科动物)的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量时，可说明所述待测的il-1α抗体表现出良好的体内药效。
90.在一个实施方式中，本技术涉及用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的鼠科动物模型的构建方法，包括向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α。
91.在一些实施方式中，所述非鼠类哺乳动物包括灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选灵长目动物，例如猿类(例如长臂猿、黑猿、大猿等)、猴类(例如猕猴，如恒河猴、食蟹猴)、猩猩科(例如黑猩猩、大猩猩等)和人，更优选人。
92.在一些实施方式中，所述体内药效为体内抗炎药效。
93.在一些实施方式中，所述鼠科动物包括小鼠属、大鼠属和家鼠属动物，例如小鼠、大鼠、褐家鼠(rattusnorvegicus)、小家鼠(mus musculus)等。
94.在一些实施方式中，按照0.1-5000μg/kg、优选0.5-200μg/kg、更优选1-100μg/kg(例如1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg或处于上述任意两个值构成的范围内)的剂量向鼠科动物给予il-1α。向鼠科动物给予il-1α的方式不受特别的限制，例如通过灌胃、腹腔注射等方式向鼠科动物给予il-1α。
95.在一个实施方式中，本技术涉及通过上述的构建方法得到的鼠科动物模型在筛选具有体内有效性的非鼠类哺乳动物il-1α抗体中的用途。
96.在一些实施方式中，所述非鼠类哺乳动物包括灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选灵长目动物，例如猿类(例如长臂猿、黑猿、大猿等)、猴类(例如猕猴，如恒河猴、食蟹猴)、猩猩科(例如黑猩猩、大猩猩等)和人，更优选人。
97.在一些实施方式中，所述鼠科动物包括小鼠属、大鼠属和家鼠属动物，例如小鼠、大鼠、褐家鼠(rattusnorvegicus)、小家鼠(mus musculus)等。
98.在一个实施方式中，本技术涉及一种用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的鼠科动物模型，其中，所述鼠科动物模型通过向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α得到。
99.在一些实施方式中，所述非鼠类哺乳动物包括灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选灵长目动物，例如猿类(例如长臂猿、黑猿、大猿等)、猴类(例如猕猴，如恒河猴、食蟹猴)、猩猩科(例如黑猩猩、大猩猩等)和人，更优选人。
100.在一些实施方式中，所述体内药效为体内抗炎药效。
101.在一些实施方式中，所述鼠科动物包括小鼠属、大鼠属和家鼠属动物，例如小鼠、大鼠、褐家鼠(rattusnorvegicus)、小家鼠(mus musculus)等。在一些实施方式中，按照0.1-5000μg/kg、优选0.5-200μg/kg、更优选1-100μg/kg(例如1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg或处于上述任意两个值构成的范围内)的剂量向鼠科动物给予il-1α。向鼠科动物给予il-1α的方式不受特别的限制，例如通过灌胃、腹腔注射等方式向鼠科动物给予il-1α。
102.在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于70％的不同物种。优选地，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于85％的不同物种。
103.在一些更优选的实施方式中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自近缘物种或相同物种，例如所述待测的il-1α抗体与所述il-1α分别来自相同或不同的灵长目动物、分别来自相同或不同的猿类、分别来自不同的猿类和猴类、分别来自相同或不同的猴类、分别来自人和猴类、分别来自人和猿类、分别来自人和猩猩科动物、分别来自相同或不同的猩猩科动物、分别来自相同或不同的人、分别来自人和猕猴、分别来自人和黑猩猩、或者分别来自人和长臂猿等，或者上述的任意组合或者顺序调换后的方案。
104.在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。或者，在一些实施方式中，所述待测的il-1α抗体的cdr(可以是重链的cdr1、cdr2和cdr3；或者，重链的cdr1、cdr2和cdr3以及轻链的cdr1、cdr2和cdr3)的氨基酸序列和恒定区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种，例如可以都来源于人。
105.炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合
106.在一个实施方式中，本技术涉及炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合中的用途。或者，本技术涉及炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合在制备用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合的试剂中的用途。或者，本技术涉及一种检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合的方法，包括测定炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合的含量变化。
107.在一些实施方式中，所述非鼠类哺乳动物包括灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选灵长目动物，例如猿类(例如长臂猿、黑猿、大猿等)、猴类(例如猕猴，如恒河猴、食蟹猴)、猩猩科(例如黑猩猩、大猩猩等)和人，更优选人。
108.在一些实施方式中，所述炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合用于在鼠科动物中检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合。在一些实施方式中，所述鼠科动物包括小鼠属、大鼠属和家鼠属动物，例如小鼠、大鼠、褐家鼠(rattus norvegicus)、小家鼠(mus musculus)等。
109.在本文中，当获取自给予待测的il-1α抗体的鼠科动物的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量均低于获取自阴性对照鼠科动物(给予pbs溶液的鼠科动物)的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量时，可说明所述待测的il-1α抗体表现出良好的与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合能力。
110.在本文中，上述各实施方式和优选的方案之间可以任意组合、删除或替换，通过上述变更得到的方案也均落在本技术的保护范围内。
111.下面通过实施例对本技术进行详细描述，但并不意味着存在对本技术而言任何不利的限制。本文已经详细地描述了本技术，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本技术精神和范围的情况下针对本技术具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
112.实施例
113.除非另有特别说明，下述各实施例中涉及的试剂、材料或仪器为可商购得到的常规的试剂、材料或仪器。
114.实施例1人il-1α抗体的表达纯化
115.对293f细胞进行传代培养，当细胞密度达到2～4
×
106个细胞/ml左右时，准备待转染的细胞，按照转染后细胞密度3
×
106个细胞/ml取相应数量细胞进行离心，弃去上清，用27ml opm-293cd 05培养基(购自上海奥浦迈生物科技股份有限公司)重悬细胞，置于二氧化碳培养箱待用。
116.用1.5ml opm-293cd 05培养基稀释pei 4000转染试剂(购自biohub公司)至浓度为60μg/ml，用1.5ml opm-293cd 05培养基稀释含有人抗il-1α抗体的轻链和重链的核苷酸序列的重组表达载体pcdna3.4至浓度为20μg/ml(抗il-1α抗体的重链和轻链的序列如下文所示)，然后将1.5ml稀释后的pei4000转染试剂加入到1.5ml稀释后的表达载体中轻柔混匀，室温下孵育20-25min，得到3ml pei-dna转染复合物。
117.重链序列：
118.qvqlvesgggvvqpgrslrlsctasgftfsmfgvhwvrqapgkglewvaavsydgsnkyyaesvkgrf
119.tisrdnsknilflqmdslrledtavyycargrpkvvipaplahwgqgtlvtfssastkgpsvfplapsskst
120.sggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkp
121.sntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfn
122.wyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpr
123.epqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:1)
124.轻链序列：
125.diqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqgisswlawyqqkpgkapklliyeasnletgvpsrfsgsgsgsdf
126.tltisslqpedfatyycqqtssfllsfgggtkvehkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfyprea
127.kvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:2)
128.将3ml pei-dna转染复合物逐滴加入上述准备好的27ml细胞中进行转染，然后置于二氧化碳培养摇床(购自infors公司)中培养，转染后1天添加5％opm-293profeed补料培养基(购自上海奥浦迈生物科技股份有限公司)，培养过程中维持培养物的葡萄糖浓度在3～6g/l。
129.当细胞活率低于60％时收获，收集的细胞培养液于5000g下离心10min，取上清液进行protein a亲和层析纯化，洗脱液为50mm醋酸醋酸钠缓冲液(ph 3.0)，将洗脱液用2m tris溶液回调ph至5～6之间。
130.对纯化得到的il-1α抗体进行还原和非还原sds-page电泳，结果如图3所示；并采用sec-hplc检测纯度，色谱柱为tskgel g3000swxl，流动相为磷酸盐缓冲液(含有68.5mmol/l nah2po4·
2h2o、31.5mmol/l na2hpo4·
12h2o和200mmol/l nacl)，进样量35μg，结果如图4所示，所得到的il-1α抗体纯度达到99.8％。
131.实施例2人il-1α诱导的小鼠细胞因子释放水平的测定
132.实验分组：使用8周龄balb/c小鼠，体重18-22g，雌雄各半，按表1所示的方案进行分组。在给予il-1α前后，小鼠自由饮水和摄食。
133.表1动物分组方案
134.组别数量给予的样品给予剂量空白对照组4只，雌雄各半无菌pbs/低剂量组4只，雌雄各半人il-1α1μg/kg中剂量组4只，雌雄各半人il-1α10μg/kg高剂量组4只，雌雄各半人il-1α100μg/kg
135.各组小鼠按表1所示给予相应的样品，低剂量组、中剂量组、高剂量组的小鼠分别腹腔注射1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg的人il-1α(重组人il-1f1/il-1α，购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，空白对照组腹腔注射等体积无菌pbs(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ph 7.3)，各样品给予体积均为10ml/kg。
136.每组分别在给予后2h和24h各处死2只小鼠(雌、雄小鼠各1只)并采血，血液样本于4℃下4000g转速离心10min，分离得到血清，-80℃保存。
137.分别采用相应的商品化elisa试剂盒(其中，小鼠il-1βelisa试剂盒、小鼠il-4elisa试剂盒、小鼠il-6elisa试剂盒、小鼠il-13elisa试剂盒、小鼠il-17a elisa试剂盒、小鼠tnf-αelisa试剂盒、小鼠ifn-γelisa试剂盒、小鼠ccl20 elisa试剂盒、小鼠il-23elisa试剂盒和小鼠il-12p70 elisa试剂盒均购自杭州联科生物技术股份有限公司；小
鼠白介素8(il-8)elisa试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司)，按照制造商提供的说明书检测上述得到的各血清样本中的小鼠il-1β、il-4、il-6、il-8、il-13、il-17a、tnf-α、ifn-γ、ccl20、il-23和il-12的含量。以小鼠il-6的含量检测为例，其检测步骤如下：
138.(1)血清样本标准曲线的制备：用超纯水复溶小鼠il-6标准品至浓度为1000pg/ml。取130μl复溶后的标准品，加入130μl标准品稀释液，作为标准曲线的最高浓度(500pg/ml)。在每一个试管中加入130μl标准品稀释液，使用高浓度标准品进行1:1系列稀释，以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度，相关信息如表2所示。
139.表2标准品的稀释
140.稀释步骤起始浓度(pg/ml)取样体积(μl)标准品稀释液体积(μl)终浓度(pg/ml)1100013013050025001301302503250130130125412513013062.5562.513013031.25631.2513013015.63715.631301307.8180/1300
141.(2)检测抗体稀释：根据实验孔数量配制il-6检测抗体溶液量(用抗体稀释液1:100稀释)。例如，总共32个孔，50μl/孔，则配取18μl检测抗体，加入1782μl抗体稀释液，配制总量为1800μl。
142.(3)浸泡酶标板：根据样品数量拆卸所需酶标板条数，加入300μl 1
×
洗液静置浸泡30秒，弃去洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干。
143.(4)加标准品：标准品孔每孔加入100μl梯度稀释好的il-6标准品溶液，空白孔加入100μl标准品稀释液。
144.(5)加血清样本：将血清从-80℃取出，平衡至室温。样品孔每孔先加入92μl检测缓冲液，再分别加入8μl待检血清(稀释倍数12.5倍)。
145.(6)加检测抗体：所有实验孔均加入50μl稀释好的检测抗体。
146.(7)孵育：使用封板膜封板，300rpm振荡，室温(25℃
±
3℃)孵育1.5h。
147.(8)洗涤：弃去液体，每孔加入300μl洗液洗板，洗涤6次，每次洗板后在吸水纸上拍干。
148.(9)加酶标抗体孵育：根据实验孔数量计算所需酶标抗体用量。例如，总共32个孔，100μl/孔，则配取35μl酶标抗体，加入3465μl样品稀释液，配制总量为3500μl。每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100)。使用封板膜封板，300rpm振荡，室温孵育30min。
149.(10)洗涤：弃去液体，每孔加入300μl洗液洗板，洗涤6次，每次洗板后在吸水纸上拍干。
150.(11)显色：每孔加入100μl显色底物tmb，避光，室温孵育5-30min。
151.(12)终止：每孔加入100μl终止液，每孔颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色变化不均匀，轻轻叩击板框，充分混匀。
152.(13)检测读数：酶标仪(购自md公司)设置为吸光检测模式，读取450nm及630nm波长的吸光度值。采用四参数拟合或log-log数据处理模型，进行标准曲线拟合，酶标仪可自动回算待测血清样品中的il-6含量。
153.检测结果如表3以及图1-图2所示，采用单因素方差分析进行统计学分析。该实验的结果显示出，向小鼠给予人il-1α后，能够显著诱导il-6、il-8、ccl20的释放，10μg/kg剂量下的诱导作用最为显著。给药后2h三种细胞因子均已处于较高水平，给药后24h，ccl20的释放进一步增加，il-6、il-8的释放则回落至接近基线水平。基于这一实施例的研究数据，后续研究采用10μg/kg剂量的il-1α，以il-6、il-8、ccl20作为检测的细胞因子，以给药后2h作为检测时间点，从而确定待测的il-1α抗体与il-1α是否能够在体内表现出有效的结合。
154.表3小鼠给予人il-1α后不同时间点的细胞因子检测数据
[0155][0156]
nd：低于检测限，未检测到。
[0157]
本领域已知il-1β、il-4、il-6、il-8、il-13、il-17a、tnf-α、ifn-γ、ccl20、il-23、il-12均为与炎症性疾病相关性较高的细胞因子，然而，出乎意料的是，本技术的发明人首次发现，向小鼠体内给予异源的il-1α后仅引起il-6、il-8、ccl20的释放水平显著增加，因此，这些细胞炎症因子可作为判断体内的异源il-1α促炎活性是否被阻断的分子指标。
[0158]
实施例3 il-1α抗体阻断人il-1α诱导的细胞因子释放的体内实验
[0159]
实验分组：使用8周龄balb/c小鼠，体重18-22g，雌雄各半，按表4所示的方案进行分组。在给予il-1α前后，小鼠自由饮水和摄食。
[0160]
表4动物分组方案
[0161]
组别数量il-1α给予剂量il-1α抗体给予剂量空白对照组4只，雌雄各半//
阴性对照组4只，雌雄各半10μg/kg/低剂量静脉组4只，雌雄各半10μg/kg1 mg/kg中剂量静脉组4只，雌雄各半10μg/kg3 mg/kg高剂量静脉组4只，雌雄各半10μg/kg10 mg/kg高剂量皮下组4只，雌雄各半10μg/kg10 mg/kg
[0162]
注：“/”表示给予等体积的无菌pbs。
[0163]
各组小鼠按表4所示给予相应的样品，低剂量静脉组、中剂量静脉组、高剂量静脉组的小鼠首先腹腔注射10μg/kg的人il-1α，然后所述各组小鼠分别静脉注射1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg的il-1α抗体(实施例1制备)；高剂量皮下组的小鼠首先腹腔注射10μg/kg的人il-1α，然后向该组小鼠皮下注射10 mg/kg的il-1α抗体(实施例1制备)；阴性对照组的小鼠首先腹腔注射10μg/kg的人il-1α，然后向该组的小鼠静脉注射等体积无菌pbs(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ph 7.3)；空白对照组的小鼠首先腹腔注射无菌pbs，然后向该组的小鼠静脉注射等体积无菌pbs，给药体积均为10 ml/kg。
[0164]
每组分别在给予后2 h和6 h各处死2只小鼠(雌、雄小鼠各1只)并采血，血液样本于4℃下4000 g转速离心10 min，分离血清，-80℃保存。
[0165]
分别采用相应的商品化elisa试剂盒，按照制造商提供的说明书检测上述得到的各血清中的小鼠il-6、il-8和ccl20的含量，采用各试剂盒和示例性操作步骤如实施例2所示。
[0166]
检测结果如表5及图5-图7所示。该实验的结果显示，il-1α抗体能够显著阻断人il-1α诱导的小鼠细胞因子il-6、il-8和ccl20的释放，静脉注射与皮下注射均具有阻断效应，其中，静脉注射的阻断效应相对更强，这一结果与静脉注射的药物吸收速率高于皮下注射相一致。
[0167]
表5il-1α抗体对人il-1α诱导小鼠细胞因子释放的阻断效应检测数据
[0168][0169]
因此，可通过观察向鼠科动物注射来自非鼠类动物的il-1α以及il-1α抗体后的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量变化，准确、灵敏地确定il-1α抗体的体内效力。
[0170]
为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利、专利申请和其它出版物在此明确地并入本文。这些出版物仅因为它们的公开早于本技术的申请日而提供。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。而且，在任何国家，在本中对这些出版物的任何引用并不构成关于该出版物成为本领域的公知常识的一部分的认可。
[0171]
本领域技术人员将认识到，本技术的范围并不限于上文描述的各种具体实施方式和实施例，而是能够在不脱离本技术的精神的情况下，进行各种修改、替换、或重新组合，这
都落入了本技术的保护范围内。

技术特征：
1.一种非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效检测方法，包括：(1)向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α；(2)向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予待测的il-1α抗体和pbs溶液；(3)对给予所述待测的il-1α抗体的鼠科动物和给予所述pbs溶液的鼠科动物进行采血，分离得到二者的血清；(4)检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量并进行比较。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非鼠类哺乳动物为灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选猿类、猴类、猩猩科或人。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述体内药效为体内抗炎药效。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述鼠科动物为小鼠属、大鼠属或家鼠属的动物。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，按照0.1-5000μg/kg、0.5-200μg/kg、或者1-100μg/kg的剂量向所述鼠科动物给予所述il-1α。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予等体积或者不同体积的所述待测的il-1α抗体和pbs溶液；优选地，向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予等体积的所述待测的il-1α抗体和pbs溶液。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述pbs溶液与所述待测的il-1α抗体的给予体积分别为1-50ml/kg、5-40ml/kg、5-30ml/kg、5-20ml/kg、5-15ml/kg、或者5-10ml/kg。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述待测的il-1α抗体的给予剂量为0.1-50mg/kg、0.5-30mg/kg、0.8-20mg/kg、1.0-15mg/kg、或者1.0-10mg/kg。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，通过注射向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予所述待测的il-1α抗体和pbs溶液。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于70％的不同物种；优选地，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于85％的不同物种。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自近缘物种或相同物种。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；或者
所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列和恒定区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，在给予所述待测的il-1α抗体或pbs溶液后1-24h、优选2-3h对所述鼠科动物进行采血。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，通过elisa反应并测定450nm及630nm波长下的吸光度来检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量。15.一种用于实施权利要求1-14中任一项所述的方法的检测系统，包括：il-1α给予单元，il-1α抗体给予单元，采血和血清分离单元，以及il-6、il-8和ccl20的含量检测单元。16.根据权利要求15所述的检测系统，其中，所述il-1α给予单元和il-1α抗体给予单元包括注射器和任选的鼠科动物固定器。17.根据权利要求15或16所述的检测系统，其中，所述采血和血清分离单元包括采血针、采血管和离心机。18.根据权利要求15-17中任一项所述的检测系统，其中，所述il-6、il-8和ccl20的含量检测单元包括检测试剂盒和酶标仪。19.一种用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的试剂盒，包括：来自非鼠类哺乳动物的il-1α，以及il-6、il-8和ccl20的含量检测试剂。20.如权利要求19所述的试剂盒，其中，所述非鼠类哺乳动物为灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选猿类、猴类、猩猩科或人。21.如权利要求19或20所述的试剂盒，其中，所述体内药效为体内抗炎药效。22.如权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其中，所述il-1α的部分或全部氨基酸序列与所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于70％的不同物种；优选地，所述il-1α的全部氨基酸序列与所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于85％的不同物种。23.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其中，所述il-1α的部分或全部氨基酸序列与所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列来自近缘物种或相同物种。24.如权利要求19-23中任一项所述的试剂盒，其中，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；或者所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列和恒定区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种。25.如权利要求19-24中任一项所述的试剂盒，其中，所述il-6、il-8和ccl20的含量检测试剂包括第一抗体、第二抗体和显色底物。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中，所述第一抗体为抗鼠科动物第一抗体；所述第二抗体为生物素化的抗体，并且所述含量检测试剂还包含辣根过氧化酶标记的链霉亲和素。27.如权利要求25或26所述的试剂盒，其中，所述显色底物为tmb。28.如权利要求25或26所述的试剂盒，其中，所述含量检测试剂还包括：il-6、il-8和ccl20各自的标准品、稀释缓冲液、洗涤缓冲液、终止液。29.一种筛选具有体内有效性的非鼠类哺乳动物il-1α抗体的方法，包括：(i)向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α；(ii)向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予待测的il-1α抗体和pbs溶液；(iii)对给予所述待测的il-1α抗体的鼠科动物和给予所述pbs溶液的鼠科动物进行采血，分离得到二者的血清；(iv)检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量并进行比较，筛选出相对于来自给予所述pbs溶液的鼠科动物的血清中的il-6、il-8和ccl20的含量，在给予后能够降低il-6、il-8和ccl20的含量的il-1α抗体。30.如权利要求29所述的方法，其中，所述非鼠类哺乳动物为灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选猿类、猴类、猩猩科或人。31.根据权利要求29或30所述的方法，其中，所述体内药效为体内抗炎药效。32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中，所述鼠科动物为小鼠属、大鼠属或家鼠属的动物。33.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中，按照0.1-5000μg/kg、0.5-200μg/kg、或者1-100μg/kg的剂量向所述鼠科动物给予所述il-1α。34.根据权利要求29-33中任一项所述的方法，其中，向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予等体积或者不同体积的所述待测的il-1α抗体和pbs溶液；优选地，向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予等体积的所述待测的il-1α抗体和pbs溶液。35.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中，所述pbs溶液与所述待测的il-1α抗体的给予体积分别为1-50ml/kg、5-40ml/kg、5-30ml/kg、5-20ml/kg、5-15ml/kg、或者5-10ml/kg。36.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中，所述待测的il-1α抗体的给予剂量为0.1-50mg/kg、0.5-30mg/kg、0.8-20mg/kg、1.0-15mg/kg、或者1.0-10mg/kg。37.根据权利要求29-36中任一项所述的方法，其中，通过注射向给予il-1α的不同的鼠科动物分别给予所述待测的il-1α抗体和pbs溶液。38.根据权利要求29-37中任一项所述的方法，其中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于70％的不同物种；优选地，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于85％的不同物种。39.根据权利要求29-38中任一项所述的方法，其中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自近缘物种或相同物种。40.根据权利要求29-39中任一项所述的方法，其中，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；
所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；或者所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列和恒定区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种。41.根据权利要求29-40中任一项所述的方法，其中，在给予所述待测的il-1α抗体或pbs溶液后1-24h、优选2-3h对所述鼠科动物进行采血。42.根据权利要求29-41中任一项所述的方法，其中，通过elisa反应并测定450nm及630nm波长下的吸光度来检测所述血清中的il-6、il-8和ccl20的含量。43.一种用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的鼠科动物模型的构建方法，包括向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α。44.如权利要求43所述的方法，其中，所述非鼠类哺乳动物为灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选猿类、猴类、猩猩科或人。45.根据权利要求43或44所述的方法，其中，所述体内药效为体内抗炎药效。46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中，所述鼠科动物为小鼠属、大鼠属或家鼠属的动物。47.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中，按照0.1-5000μg/kg、0.5-200μg/kg、或者1-100μg/kg的剂量向所述鼠科动物给予il-1α。48.通过权利要求43-47中任一项所述的构建方法得到的鼠科动物模型在筛选具有体内有效性的非鼠类哺乳动物il-1α抗体中的用途。49.根据权利要求48所述的用途，其中，所述非鼠类哺乳动物为灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选猿类、猴类、猩猩科或人。50.根据权利要求48或49所述的用途，其中，所述鼠科动物为小鼠属、大鼠属或家鼠属的动物。51.一种用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体的体内药效的鼠科动物模型，其中，所述鼠科动物模型通过向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的il-1α得到。52.根据权利要求51所述的鼠科动物模型，其中，所述非鼠类哺乳动物为灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选猿类、猴类、猩猩科或人。53.根据权利要求51或52所述的鼠科动物模型，其中，所述体内药效为体内抗炎药效。54.根据权利要求51-53中任一项所述的鼠科动物模型，其中，所述鼠科动物为小鼠属、大鼠属或家鼠属的动物。55.根据权利要求51-54中任一项所述的鼠科动物模型，其中，按照0.1-5000μg/kg、0.5-200μg/kg、或者1-100μg/kg的剂量向所述鼠科动物给予il-1α。56.根据权利要求51-55中任一项所述的鼠科动物模型，其中，待测的所述il-1α抗体的
部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于70％的不同物种；优选地，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来自相同物种，或者来自il-α种间同源性大于85％的不同物种。57.根据权利要求51-56中任一项所述的鼠科动物模型，其中，所述待测的il-1α抗体的部分或全部氨基酸序列与所述il-1α的部分或全部氨基酸序列来自近缘物种或相同物种。58.根据权利要求51-57中任一项所述的鼠科动物模型，其中，所述待测的il-1α抗体的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的可变区的全部氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列和恒定区的部分氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种；或者所述待测的il-1α抗体的cdr的氨基酸序列和恒定区的全部氨基酸序列与所述il-1α的全部氨基酸序列来源于相同物种。59.炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合用于检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合中的用途。60.如权利要求59中所述的用途，其中，所述非鼠类哺乳动物为灵长目动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、犬科动物、或猫科动物；优选猿类、猴类、猩猩科或人。61.如权利要求59或60中所述的用途，其中，所述炎症细胞因子il-6、il-8和ccl20的组合用于在鼠科动物中检测非鼠类哺乳动物il-1α抗体与来自非鼠类哺乳动物的il-1α的体内结合。62.如权利要求59-61中任一项所述的用途，其中，所述鼠科动物为小鼠属、大鼠属或家鼠属的动物。

技术总结
本申请公开了一种非鼠类哺乳动物IL-1α抗体的体内药效检测方法，包括向鼠科动物给予来自非鼠类哺乳动物的IL-1α和待测的IL-1α抗体，通过检测来自所述鼠科动物的血清中的IL-6、IL-8和CCL20的含量来确定IL-1α抗体的体内药效。采用该方法实现了对IL-1α抗体的体内药效的快速、灵敏检测。灵敏检测。


技术研发人员：李竹石 朱燕 邓涛 赵真虎 龙杨洋 陈洪 王颖
受保护的技术使用者：成都优洛生物科技有限公司
技术研发日：2022.09.26
技术公布日：2023/8/9