一种诱导阴地蕨孢子萌发、有效培养原叶体的培养基及方法与流程

1.本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种诱导阴地蕨孢子萌发、有效培养原叶体的培养基及方法。


背景技术：

2.阴地蕨(botrychiumternatum(thunb)sw.)属于阴地蕨科阴地蕨属植物，别名小春花、一朵云、花蕨、独立金鸡，主要分布于陕西、江苏、安徽、浙江、江西等地。阴地蕨是一种用途广泛的民间中草药，在传统中医中，阴地蕨归肝经、肺经，性味甘平、味淡，具有清热解毒、平肝息风、止咳、止血、明目去翳的作用，主治小儿高热惊搐、肺热咳嗽、百日咳、癫狂、痢疾、疔疮痈毒、毒蛇咬伤、目赤火热、目生翳障等。尤其在我国贵州等地，民间多用阴地蕨治疗肺热咳嗽，毒蛇咬伤，出血等疾病，受到了人们的关注。
3.阴地蕨作为我国传统中药。阴地蕨属植物化学成分复杂，主要含皂苷、酚类、糖、多糖类、有机酸、鞣质、蛋白质、香豆素、内酯、强心苷类、黄酮类、挥发油、甾体类和三萜类等成分，不含生物碱和油脂。阴地蕨属植物具有多种生物活性，具有很高的药用价值。
4.阴地蕨目前资源主要依靠野生，但是野生资源经过多年的人工挖掘，趋于灭绝，加上自然环境的变异，自然状态下，阴地蕨孢子萌发率非常低，野生抚育以及驯化栽培非常困难，至今少有成功。因此，要保存阴地蕨野生资源，实现规模化栽培以及合理开发其药用价值，组织培养技术必不可缺，但是阴地蕨的人工繁育以及组织培养等方面研究暂未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种诱导阴地蕨孢子萌发、有效培养原叶体的培养基及方法，能够快速诱导阴地蕨孢子萌发并培养得到原叶体，为阴地蕨的组织培养及快繁技术体系建立奠定基础。
6.本发明提供了一种促进阴地蕨孢子萌发并诱导分化原叶体的培养基，以1/2ms培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～3.0mg/l的kt、0.5～1.5mg/l的naa、2.0～5.0mg/l的ga3、1.5～3.0g/l的活性炭和25～30g/l的蔗糖，ph5.8～6.0。
7.优选的，所述1/2ms培养基为大量元素、钙盐和铁盐减半的ms培养基。
8.优选的，所述培养基为液体培养基，还包括支撑材料。
9.优选的，所述支撑材料为脱脂棉。
10.本发明还提供了一种诱导阴地蕨孢子萌发病有效培养原叶体的方法，包括以下步骤：(1)将干燥的阴地蕨孢子与赤霉素溶液混合后，于15～20℃第一静置培养24～48h，然后于4～6℃第二静置培养12～24h，得预处理孢子；
11.(2)将所述预处理孢子消毒后，将消毒的孢子置于上述培养基上进行诱导培养；
12.所述诱导培养包括依次进行10～15d的暗培养，更换新鲜的所述培养基后进行光暗交替培养。
13.优选的，步骤(1)所述赤霉素溶液的浓度为20～50mg/l；
14.优选的，步骤(1)在所述第一静置培养期间，共给予光照8～12h。
15.优选的，步骤(1)在所述第二静置培养期间，共暗培养6～8h。
16.优选的，步骤(2)所述消毒包括将所述预处理孢子置于0.1％的升汞溶液中消毒8～12min，无菌水清洗5～8次。
17.优选的，步骤(2)所述光暗交替培养包括每天光照12～15h，光照强度为1500～2000lx，所述诱导培养的温度为25～28℃。
18.有益效果：本发明提供了一种促进阴地蕨孢子萌发并诱导分化原叶体的培养基，可同时满足孢子萌发和促进原叶体分化所需要的营养成分。本发明还提供了基于所述培养基构建的诱导培养方法，以孢子作为外植体，取材方便，投入少，有利于资源的保护；将所述孢子经过预处理、诱导萌发等过程，约40～50天即可培养出原叶体，有利于阴地蕨组培快繁以及再生体系的建立。
具体实施方式
19.本发明提供了一种诱导阴地蕨孢子萌发、有效培养原叶体的培养基，以1/2ms培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～3.0mg/l的kt、0.5～1.5mg/l的naa、2.0～5.0mg/l的ga3、1.5～3.0g/l的活性炭和25～30g/l的蔗糖，ph5.8～6.0。
20.本发明所述1/2ms培养基优选为大量元素、钙盐和铁盐减半的ms培养基。
21.本发明所述培养基中含有kt，所述kt的浓度优选为1.5～2.5mg/l，更优选为2.0mg/l。在本发明所述培养基中，所述kt为6-糠基氨基嘌呤，可促进细胞分化、分裂、生长，解除顶端优势，促进种子发芽、打破侧芽的休眠，诱导花芽分化等。
22.本发明所述培养基中含有naa，所述naa的浓度优选为0.75～1.25mg/l，更优选为1.0mg/l。在本发明所述培养基中，所述naa为萘乙酸，耐高温高压，不易分解，能诱导愈伤组织分化，促进芽的形成以及促进未分化组织的分化。
23.本发明所述培养基中含有ga3，所述ga3的浓度优选为3.0～4.0mg/l，更优选为3.5mg/l。在本发明所述培养基中，所述ga3为赤霉素，可刺激细胞分裂和延伸从而促进根茎快速延伸；对需要层积处理或者光照诱导发芽的一些植物，赤霉素可解除休眠，诱导有丝分裂和开始；提高种子萌发率。
24.本发明所述培养基中含有活性炭，所述活性炭的浓度优选为1.75～2.5g/l，更优选为2.0g/l。在本发明所述培养基中，所述活性炭，可防止褐变和有害物质的积累，促进原叶体形成。
25.本发明所述培养基中含有蔗糖，所述蔗糖的浓度优选为26～30g/l，更优选为27.5g/l。在本发明所述培养基中，所述蔗糖的作用为，调节培养基的渗透压。
26.本发明所述培养基优选为液体培养基，在进行诱导培养时，还需要支撑材料，所述支撑材料优选为脱脂棉(脱脂棉吸水性强，能保持孢子萌发所需水分又不至于大量积水，造成孢子堆叠，而且能有效减少杂菌污染)。
27.本发明对所述液体培养基的配制方法并没有特殊限定，优选包括以大量元素、钙盐和铁盐减半的ms培养基为基础培养基，添加kt、naa、ga3、活性炭和蔗糖，加水定容并混合均匀；在培养瓶中装入脱脂棉，以盖严培养瓶底部为宜，再倒入上述混匀的培养基，没过脱脂棉即可，101kpa、121℃灭菌25min后备用。
28.本发明还提供了一种诱导阴地蕨孢子萌发并有效培养原叶体的方法，包括以下步骤：(1)将干燥的阴地蕨孢子与赤霉素溶液混合后，于15～20℃第一静置培养24～48h，然后于4～6℃第二静置培养12～24h，得预处理孢子；
29.(2)将所述预处理孢子消毒后，将消毒的孢子置于上述培养基上进行诱导培养；
30.所述诱导培养包括依次进行10～15d的暗培养，更换新鲜的所述培养基后进行光暗交替培养。
31.本发明将干燥的阴地蕨孢子与赤霉素溶液混合后，于15～20℃第一静置培养24～48h，然后于4～6℃第二静置培养12～24h，得预处理孢子。本发明以阴地蕨孢子作为繁殖材料，且所述阴地蕨孢子的采集时间优选包括每年11月至次年的2月，当阴地蕨叶片背面的孢子呈棕色时即可采集。本发明在采集所述阴地蕨孢子时，优选具有成熟孢子囊且孢子尚未脱落的叶片，从阴地蕨叶柄处剪断，用纸袋将整个叶片装好带回备用。本发明优选用清水轻轻冲洗带回叶面的灰尘及杂质，轻轻擦干后放入纸袋中自然风干，收集脱落的孢子于牛皮纸袋内。
32.本发明将所述干燥的阴地蕨孢子与赤霉素溶液混合，所述赤霉素溶液的浓度优选为20～50mg/l，更优选为25～45mg/l，最优选为35mg/l。本发明实施例中，所述混合优选在无菌培养皿中进行，在进行操作时皿内垫上一层无菌滤纸，倒入无菌的上述赤霉素溶液，以没过滤纸为宜，然后将干燥的阴地蕨孢子放入即可(直径为100mm的培养皿，孢子用量约为70～100粒)。
33.本发明在所述混合后，优选还包括两段静置培养，且两段静置培养优选均在培养箱中进行，首先于15～20℃培养箱中第一静置培养24～48h，再于4～6℃培养箱中第二静置培养12～24h，取出备用。本发明在进行所述第一静置培养时，优选先光照培养8～12h后在进行暗培养，更优选在光照培养12h后再进行暗培养，光强为1500lx～2000lx。本发明在进行所述第二静置培养时，优选先光照培养一段时间后再进行6～8h的暗培养，更优选的在先光照培6h后再进行暗培养，光强为1500lx～2000lx。
34.得预处理孢子后，本发明将所述预处理孢子消毒后，将消毒的孢子置于上述培养基上进行诱导培养。本发明所述消毒，优选包括将所述预处理孢子置于0.1％的升汞溶液中消毒8～12min，无菌水清洗5～8次。实施例由于预处理在培养皿中进行，所以进行所述消毒时，优选取出培养皿中的滤纸，并将滤纸放于装有无菌水的烧杯中，用镊子轻轻转动，使孢子转入烧杯中，直至滤纸上不沾有孢子，取出滤纸；用无菌纱布过滤孢子，然后用纱布包起孢子放入0.1％的升汞溶液中消毒8～12min，无菌水清洗5～8次；清洗结束后取出置于无菌纸上吸干表面水分备用。
35.本发明将上述消毒后的种子置于上述液体培养基中(每瓶接种量为20～30粒左右)，暗培养10～15d后，选择未污染的孢子转接到同样的新鲜培养基中，进行光暗交替培养，30d后可见少量孢子膨胀发白，40～50d后可见部分孢子变绿，继续培养15d后可见到原叶体。本发明所述暗培养的温度优选为25～28℃(阴地蕨为日照敏感的作物，其孢子在短日照下易分化，经暗培养后比在光下更容易分化原叶体)。本发明所述光暗交替培养的环境，优选包括：每天光照8～12h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25～28℃。
36.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种促进阴地蕨孢子萌发并诱导分化原叶体的培养基和诱导方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明
保护范围的限定。
37.实施例1
38.1)阴地蕨孢子采集时间：每年11月至次年的2月，当阴地蕨叶片背面的孢子呈棕色时即可采集；
39.2)孢子采集方法：选择具有成熟孢子囊且孢子尚未脱落的叶片，从阴地蕨叶柄处剪断，用纸袋将整个叶片装好带回备用；
40.3)孢子前处理：用清水轻轻冲洗叶面的灰尘及杂质，轻轻擦干后放入纸袋中自然风干，收集脱落的孢子于牛皮纸袋内；选择无菌培养皿，皿内垫上一层无菌滤纸，倒入浓度为30mg/l的无菌赤霉素溶液，以没过滤纸为宜，于25℃培养箱中放置36h(其中光照12h)，再于4℃培养箱中放置16h(暗培养6h)，取出备用；
41.4)孢子消毒处理：将滤纸放于装有无菌水的烧杯中，用镊子轻轻转动，使孢子转入烧杯中，直至滤纸上不沾有孢子，取出不含孢子的滤纸；用无菌纱布过滤孢子，然后用纱布包起孢子放入0.1％的升汞溶液中消毒10min，无菌水清洗5次；清洗结束后取出置于无菌纸上吸干表面水分备用；
42.5)培养基配置：以大量元素、钙盐、铁盐减半的ms培养基为基础培养基，添加1.5mg/l的kt、1.0mg/l的naa、3.0mg/l的ga3、2g/l的活性炭、以及25g/l的蔗糖，ph5.8～6.0，配为液体培养基，支撑材料为脱脂棉。即在培养瓶中装入脱脂棉，以盖严培养瓶底部为宜，再倒入培养基，没过脱脂棉即可。灭菌后备用。
43.6)诱导培养：将消毒后的孢子接种于无菌培养基中，25～28℃暗培养10～15d后，选择未污染的孢子转接到同样的培养基中，进行光照、黑暗交替培养，30d后可见少量孢子膨胀发白，40～50d后可见部分孢子变绿，继续培养15d后可见到原叶体。培养环境为：每天光照12h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25℃。
44.本实例中，孢子污染率为17.5％，萌发率为63.5％，原叶体诱导率为70％。
45.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种诱导阴地蕨孢子萌发、有效培养原叶体的培养基，其特征在于，所述培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～3.0mg/l的kt、0.5～1.5mg/l的naa、2.0～5.0mg/l的ga3、1.5～3.0g/l的活性炭和25～30g/l的蔗糖，ph5.8～6.0。2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述1/2ms培养基为大量元素、钙盐和铁盐减半的ms培养基。3.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述培养基为液体培养基，还包括支撑材料。4.根据权利要求4所述培养基，其特征在于，所述支撑材料为脱脂棉。5.一种诱导阴地蕨孢子萌发并有效培养原叶体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将干燥的阴地蕨孢子与赤霉素溶液混合后，于15～20℃第一静置培养24～48h，然后于4～6℃第二静置培养12～24h，得预处理孢子；(2)将所述预处理孢子消毒后，将消毒的孢子置于权利要求1～4任一项所述培养基上进行诱导培养；所述诱导培养包括依次进行10～15d的暗培养，更换新鲜的所述培养基后进行光暗交替培养。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(1)所述赤霉素溶液的浓度为20～50mg/l。7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(1)在所述第一静置培养期间，共给予光照8～12h。8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(1)在所述第二静置培养期间，共暗培养6～8h。9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(2)所述消毒包括将所述预处理孢子置于0.1％的升汞溶液中消毒8～12min，无菌水清洗5～8次。10.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(2)所述光暗交替培养包括每天光照12～15h，光照强度为1500～2000lx，所述诱导培养的温度为25～28℃。

技术总结
本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种诱导阴地蕨孢子萌发、有效培养原叶体的培养基及方法。本发明提供了一种促进阴地蕨孢子萌发并有效培养原叶体的培养基，可同时满足孢子萌发和促进原叶体分化所需要的营养成分。本发明还提供了基于所述培养基构建的诱导培养方法，以孢子作为外植体，取材方便，投入少，有利于资源的保护；将所述孢子经过预处理、诱导萌发等过程，约40～50天即可培养出原叶体，有利于阴地蕨组培快繁以及再生体系的建立。于阴地蕨组培快繁以及再生体系的建立。


技术研发人员：王彩云 侯俊 柳敏 王永 周茂嫦 成忠均 张翔宇 阮培均 李恒谦 黄晓旭 邹涛 徐庆祝 邹鹏 赵丽 查钦 陈杰
受保护的技术使用者：毕节市中药研究所
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/15