杜鹃兰叶醇提物及其用途的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及杜鹃兰叶醇提物及其用途。


背景技术：

2.杜鹃兰(cremastra appendiculata(d.don)makino)为兰科杜鹃属植物，喜阴、不耐暑热，多生于海拔2900米以下的湿地或沟边湿地上以及山坡林下阴湿处。其干燥假鳞茎称为山慈菇，为传统的药用部位，主要用于清热解毒，化痰散结。山慈菇中含有黄酮类、酚类等化学成分，药理活性多样。现代药理学研究表明其具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等作用，中医临床中复方制剂的形式应用于疾病的治疗。杜鹃兰叶通常只有一枚，《本草纲目》中记载：“山慈菇(根)主疔肿，攻毒破皮，解诸毒蛊毒，蛇虫狂犬伤。(叶)涂乳痈、便毒尤妙”。《证类本草》中也有记载，杜鹃兰叶可治疗乳房肿块等，将其叶捣成膏状，和蜜攒匀贴在创口上即可。
3.目前关于杜鹃兰假鳞茎的报道逐渐增多，然而关于杜鹃兰叶的化学成分和药理作用却鲜有报道。中药可谓浑身是宝，通过对杜鹃兰叶的药理作用研究可以扩大杜鹃兰的药用部位，减少资源的浪费，对于中药的综合开发利用具有重要的作用。
4.众所周知，炎症作为一种常见的症状，可发生于机体的多个系统，参与疾病的发生、发展。临床应用发现尽管糖皮质激素具有强大的抗炎作用。但是由于影响糖、脂肪、蛋白质和水盐代谢以及机体许多器官的功能长期应用不良反应甚多。中草药在治疗各种炎症、免疫性疾病上具有悠久历史和确切的临床疗效且中药毒副作用相对小、资源丰富，因此寻找和开发抗炎的药物是国内外新药研究的热点。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供杜鹃兰叶醇提物及其用途，以解决上述现有技术存在的问题，本发明制备的杜鹃兰叶醇提物具有抑制炎症的作用，扩大了杜鹃兰的药用部位，为开发抗炎新药物提供思路。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种杜鹃兰叶醇提物的制备方法，向杜鹃兰叶中加入乙醇溶液进行超声提取，将获得的提取液经富集、洗脱处理后，即得所述杜鹃兰叶醇提物。
8.进一步地，所述杜鹃兰叶和所述乙醇溶液的料液比为1g：47ml；所述乙醇溶液的浓度为74％。
9.进一步地，所述超声提取的条件包括：提取时间为29-60min，提取温度为30-90℃，超声功率为100w，超声频率为40khz，提取次数为2-3次。
10.进一步地，所述洗脱处理具体为分别使用超纯水、50％、80％和90％的甲醇进行梯度洗脱，合并50％和80％甲醇洗脱液。
11.进一步地，将获得的提取液经富集、洗脱处理后，还包括将处理后的洗脱液经减压浓缩后，于50-60℃烘干的步骤。
12.本发明还提供一种所述的制备方法获得的杜鹃兰叶醇提物。
13.本发明还提供一种所述的杜鹃兰叶醇提物在制备抗炎药物中的应用。
14.本发明公开了以下技术效果：
15.本发明首次选用杜鹃兰叶作为研究对象，对其中黄酮类成分进行提取、制备；本发明制备的杜鹃兰叶醇提物具有抑制炎症的作用，扩大了杜鹃兰的药用部位，为开发抗炎新药物提供思路。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为杜鹃兰叶醇提物(cal)对脾细胞存活率的影响；其中a：细胞流式图；b：细胞存活率统计图；
18.图2为杜鹃兰叶醇提物(cal)对pma刺激下炎症因子(tnf-α、ifn-γ)表达的影响；其中a：tnf-α；b：ifn-γ；
19.图3为杜鹃兰叶醇提物(cal)对lps刺激下炎症因子(tnf-α、ifn-γ)表达的影响；其中a：tnf-α；b：ifn-γ；
20.图4为杜鹃兰叶醇提物(cal)对pma、lps刺激下炎症因子tnf-α含量的影响；其中a：pma处理；b：lps处理。
具体实施方式
21.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
22.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
23.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
24.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
25.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
26.实施例1杜鹃兰叶醇提物的制备
27.实验步骤
28.杜鹃兰叶药材洗净、烘干、粉碎，过4号筛，用74％乙醇超声提取(超声功率300w、工作频率40khz)，液料比47：1(ml：g)，超声时间29min，提取温度为60℃，提取两次，提取液抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味；将浓缩液与hp-20大孔树脂(重量比20：1)混合均匀后放置摇床中摇晃24h，摇晃结束后，分别使用超纯水、50％、80％和90％的甲醇进行梯度洗脱，根据薄层色谱法和高效液相色谱法显示结果，合并50％和80％甲醇洗脱液，洗脱液经减压浓缩后于60℃烘干，得杜鹃兰叶醇提物(cal)。
29.实验结果：经过大孔树脂富集、甲醇洗脱后，杜鹃兰叶醇提物总黄酮含量明显升高(如表1所示)。
30.表1洗脱前后的杜鹃兰叶醇提物总黄酮含量
[0031][0032]
实施例2杜鹃兰叶醇提物(cal)对脾细胞凋亡的影响。
[0033]
实验步骤：
[0034]
(1)细胞处理
[0035]
小鼠处死后分离脾脏，将其转移至装有5mlpbs的培养皿中，在提前放入的200目尼龙滤网上研磨，收集研磨液于15ml离心管中，900g离心3min，弃上清，pbs清洗一遍后加入2ml红细胞裂解液，重悬细胞，冰上作用5min，取出后稍振荡，随后用pbs终止裂解，上下颠倒混匀，900g离心3min,弃上清，再用pbs清洗两遍，加入10ml培养基制成脾细胞悬液进行细胞计数。细胞以6
×
104/孔接种于96孔板，1h后，给予cal处理24h(终浓度分别为25、50、100、200、400和800μg/ml)，设置空白组(blank)、阴性对照组(control)、阳性对照组(ros)给予h2o2诱导细胞死亡，每组细胞设3个平行孔，置于5％co2、37℃恒温培养箱中进行培养。其中，空白组后续不进行染色的，用于流式细胞群画门。
[0036]
(2)凋亡检测
[0037]
24h后将96孔板取出，900g离心3min，去除上清液，用预冷的pbs清洗3遍，处理孔中每孔加入100μl的7-aad，常温避光孵育30min，期间每隔3min震荡混匀。孵育结束后转移至流式管中上机检测。
[0038]
实验结果：杜鹃兰叶醇提物达到400μg/ml以上时，细胞凋亡率显著提高，对细胞有显著的毒性作用(如图1的a所示)；通过计算细胞存活率可以看出，杜鹃兰叶醇提物达到400μg/ml以上时，细胞存活率显著下降。因此，200μg/ml以内的浓度可作为后续实验的安全浓度(如图1的b所示)。
[0039]
实施例3杜鹃兰叶醇提物(cal)对pma刺激下炎症因子(tnf-α、ifn-γ)表达的影响
[0040]
实验步骤
[0041]
(1)细胞处理
[0042]
将脾细胞以107/孔接种于6孔板，设置阴性对照组(control)、阳性对照组(pma)、给药组，每组细胞设3个平行孔，放入5％co2、37℃恒温培养箱中进行培养，1h后阴性对照组和阳性对照组分别给予dmso处理，给药组分别加入不同浓度(50、100、200μg/ml)的cal处理，2h后阳性对照组、给药组分别加入终浓度为25ng/ml的pma处理，放入培养箱中继续培养，10h后收集细胞与1.5ml离心管中，900g离心3min，弃上清，用预冷的pbs清洗两遍。
[0043]
(2)rna提取
[0044]
每管加入500μl的ttizol反复吹打至细胞完全脱落后，每管加入400ul氯仿，振荡、混匀，常温静置2min，置12000rpm 4℃离心15min，取出ep管后可以看到明显的分层，尽可能多的吸取上层无色透明液体(约200ul)至新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇上下颠倒混匀，4℃静置10min后4℃离心，12000rpm，15min；弃去上清，加入1ml预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀，4℃离心，12000rpm，5min重复清洗一次，弃上清，瞬时离心数秒，移液枪小心去除多余上清液，打开ep管盖置常温晾干；待白色沉淀渐变成透明后加入10ul rna-free-water，振荡溶解混匀。然后使用nondrop 2000微量分光光度计测定rna浓度，计算加样体积，随后逆转录cdna，最后使用q-pcr检测cal对tnf-α和ifn-γ表达的影响。
[0045]
实验结果：杜鹃兰叶醇提物(cal)对于pma诱导产生的tnf-α和ifn-γ的基因水平均有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性(如图2的a-b所示)。
[0046]
实施例4杜鹃兰叶醇提物(cal)对lps刺激下炎症因子(tnf-α、ifn-γ)表达的影响
[0047]
实验步骤
[0048]
将脾细胞以107/孔接种于6孔板，设置阴性对照组(control)、阳性对照组(pma)、给药组，每组细胞设3个平行孔，放入5％co2、37℃恒温培养箱中进行培养，1h后阴性对照组和阳性对照组分别给予dmso处理，给药组分别加入不同浓度(50、100、200μg/ml)的cal处理，2h后pma组、给药组分别加入终浓度为50ng/ml的lps处理，放入培养箱中继续培养，10h后收集细胞与1.5ml离心管中，900g离心3min，弃上清，用预冷的pbs清洗两遍。rna提取同上，逆转录为转录cdna，最后使用q-pcr检测杜鹃兰叶醇提物(cal)对炎症因子tnf-α、ifn-γ表达的影响。
[0049]
实验结果：杜鹃兰叶醇提物(cal)对于lps诱导产生的tnf-α和ifn-γ的基因水平均有抑制作用，且呈剂量依赖性(如图3中a-b所示)。
[0050]
实施例5杜鹃兰叶醇提物(cal)不同浓度对pma、lps诱导脾细胞产生炎症因子tnf-α的影响
[0051]
实验步骤
[0052]
将脾细胞以106/孔接种于96孔板，设置阴性对照组(control)、阳性对照组(pma、lps)、给药组，每组细胞设3个平行孔，放入5％co2、37℃恒温培养箱中进行培养，1h后对照组和刺激组(pma组、lps组)分别给予dmso处理，给药组分别加入不同浓度(50、100、200μg/ml)的cal处理，2h后阳性对照组(pma、lps)和相应给药组分别给予lps(50ng/ml)和pma(25ng/ml)刺激，24h后900g离心3min，收集上清液，使用欣博盛elisa试剂盒检测tnf-α.的含量。
[0053]
实验结果：杜鹃兰叶醇提物(cal)浓度为200μg/ml时能够显著抑制pma、lps诱导下
tnf-α的产生(如图4中a-b所示)。
[0054]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种杜鹃兰叶醇提物的制备方法，其特征在于，向杜鹃兰叶中加入乙醇溶液进行超声提取，将获得的提取液经富集、洗脱处理后，即得所述杜鹃兰叶醇提物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述杜鹃兰叶和所述乙醇溶液的料液比为1g：47ml；所述乙醇溶液的浓度为74％。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声提取的条件包括：提取时间为29-60min，提取温度为30-90℃，超声功率为100w，超声频率为40khz，提取次数为2-3次。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱处理具体为分别使用超纯水、50％、80％和90％的甲醇进行梯度洗脱，合并50％和80％甲醇洗脱液。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将获得的提取液经富集、洗脱处理后，还包括将处理后的洗脱液经减压浓缩后，于50-60℃烘干的步骤。6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法获得的杜鹃兰叶醇提物。7.一种如权利要求6所述的杜鹃兰叶醇提物在制备抗炎药物中的应用。

技术总结
本发明公开了杜鹃兰叶醇提物及其用途，属于医药技术领域，本发明公开了杜鹃兰叶醇提物的制备方法，向杜鹃兰叶中加入乙醇溶液进行超声提取，将获得的提取液经富集、洗脱处理后，即得所述杜鹃兰叶醇提物；本发明还公开了所述的杜鹃兰叶醇提物在制备抗炎药物中的应用。本发明首次选用杜鹃兰叶作为研究对象，对其中黄酮类成分进行提取、制备；本发明制备的杜鹃兰叶醇提物具有抑制炎症的作用，扩大了杜鹃兰的药用部位，为开发抗炎新药物提供思路。为开发抗炎新药物提供思路。为开发抗炎新药物提供思路。


技术研发人员：郝新才 李平飞 赵永恒 陈静 韩明清 宋梦楠 程银水 叶志航 夏月
受保护的技术使用者：湖北金水源农业开发有限公司
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/8/16