一种酰胺类化合物及其制备方法和用途

1.本发明涉及一种酰胺类化合物，尤其是涉及从海洋放线菌中提取的酰胺类化合物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)是一种主要的人类病原体，也是历史上出现的具有兽医公共卫生重要性的人畜共患病原体。mrsa通常引起严重的传染病，包括食物中毒，化脓性心内膜炎，化脓性肺炎，中耳炎，骨髓炎和皮肤、软组织的化脓性感染。但是在人类和动物中频繁使用抗生素导致了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)对大多数商业抗生素具有抗药性。所以新抗生素发现研发的需求也日益提高。
3.在结构上，酰胺可看作是羧酸分子中羧基的羟基被氨基或烃氨基取代而成的化合物；也可看作是氨或氨分子中氮原子上的氢被酰基取代而成的化合物。酰胺主要用作工业溶剂，医药工业上用于生产维生素、激素等。在有机反应中，二甲基甲酰胺不但广泛用作反应的溶剂，也是有机合成的重要中间体。本发明人在对海洋放线菌steptomyces diastaticus在大米培养基发酵下的乙酸乙酯提取物的化学调查中，发现了酰胺类新天然产物，目前尚未见该化合物的化学结构及抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)具有抑制作用的酰胺类化合物及其制备方法和用途。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
6.1、一种酰胺类化合物，该化合物的结构式如(i)所示；
[0007][0008]
2、一种酰胺类化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0009]
(1)发酵生产
[0010]
将保藏号为cctcc no：m2020953的海洋放线菌(steptomyces sp.4-7)在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28℃培养箱中倒置培养7天后，挑取单菌落接种于高氏1号液
体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积比10％的接种量接种到大米固体培养基中，于温度28℃培养30天，获得发酵物；
[0011]
(2)浸膏提取
[0012]
在步骤(1)得到的发酵物中加入等量的乙酸乙酯，反复萃取3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后获得粗浸膏；
[0013]
(3)化合物的分离制备
[0014]
将步骤(2)得到的粗浸膏首先用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为7:3的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分；将收集的洗脱流分进行反相中压柱层析线性梯度洗脱，采用体积百分比为25-100％的甲醇-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到14个组分；将得到的第8个组分采用乙腈与水按体积比65:35的比例混合的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化获得化合物，其结构如(i)所示，
[0015][0016]
进一步，步骤(1)中所述的高氏1号固体培养基配制方法如下：将可溶性淀粉20g，kno
3 1g，k2hpo
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g和琼脂20g，1000ml蒸馏水，调ph＝7.4-7.6；所述的高氏1号液体培养基配制方法如下：将可溶性淀粉20g，kno
3 1g，k2hpo
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 0.5g和feso4·
7h2o 0.01g，1000ml蒸馏水，调ph＝7.4-7.6；所述的大米固体培养基的配制方法如下：将80g大米、120ml水、3.6g海盐配制而成。
[0017]
进一步，步骤(3)中所述的反相中压柱层析线性梯度洗脱中乙腈体积百分比从25～100％，洗脱时间150min。
[0018]
进一步，步骤(3)中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0ml/min。
[0019]
3、上述酰胺类化合物在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)抑制剂方面的用途。
[0020]
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种酰胺类化合物及其制备方法和用途，通过微生物发酵培养来获取发酵物，然后通过将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取，得粗浸膏，然后将该粗浸膏经中压正相硅胶柱层析，中压反相柱层析，及反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该化合物具有显著的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)活性，可用于抑制由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)引起的相关疾病的药物开发方面的用途。
[0021]
上述海洋放线菌(steptomyces sp.4-7)，该菌为nbu2966菌株，保藏编号为cctccno：m2020953，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
[0022]
图1为本发明化合物的核磁共振氢谱；
[0023]
图2为本发明化合物的核磁共振碳谱；
[0024]
图3为本发明化合物的核磁共振dept-135谱；
[0025]
图4为本发明化合物的核磁共振cosy谱；
[0026]
图5为本发明化合物的核磁共振hsqc谱；
[0027]
图6为本发明化合物的核磁共振hmbc谱。
具体实施方式
[0028]
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0029]
实施例1
[0030]
一种酰胺类化合物的结构式如(i)所示：
[0031][0032]
实施例2
[0033]
如实施例1结构式(i)所示的酰胺类化合物制备方法，具体包括如下步骤：
[0034]
(1)发酵生产
[0035]
将保藏号为cctcc no：m2020953的海洋放线菌(steptomyces sp.4-7)在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28℃培养箱中倒置培养7天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积比10％的接种量接种到大米固体培养基中，于温度28℃培养30天，获得发酵物；其中高氏1号固体培养基配制方法如下：将可溶性淀粉20g，kno
3 1g，k2hpo
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g和琼脂20g，1000ml蒸馏水，调ph＝7.4-7.6；高氏1号液体培养基配制方法如下：将可溶性淀粉20g，kno
3 1g，k2hpo
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 0.5g和feso4·
7h2o0.01g，1000ml蒸馏水，调ph＝7.4-7.6；大米固体培养基的配制方法如下：将80g大米、120ml水、3.6g海盐配制而成；
[0036]
(2)浸膏提取
[0037]
在步骤(1)得到的发酵物中加入与发酵物等量的乙酸乙酯，反复浸泡3次，随后对
乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，获得粗浸膏；
[0038]
(3)化合物的分离制备
[0039]
将步骤(2)得到的粗浸膏首先用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为7:3的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分；将收集的洗脱流分进行反相中压柱层析线性梯度洗脱，采用体积百分比为25-100％的甲醇-水为洗脱剂，洗脱时间150min，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到14个组分；将得到的第8个组分采用乙腈与水按体积比65:35的比例混合的溶液为流动相,经半制备反相高效液相色谱分离纯化，获得化合物，其结构如(i)所示。
[0040][0041]
实施例3
[0042]
本发明化合物ⅰ为浅绿油状粉末，正离子模式下的高分辨质谱(hr-esi-ms)给出其准分子离子峰m/z 182.1548[m+h]
+
(calcd for c
11h20
no,182.1545)，结合图11hnmr和图2
13
c nmr确定其分子式为c
11h19
no，表明含有3个不饱和度。如图2和图3所示，
13
c nmr给出1个羰基碳δ
c 168.5(c-1)；4个非端烯碳δ
c 117.0(c-2)，δ
c 143.4(c-3)，δ
c 126,5(c-4)，δ
c 145.7(c-5)；2个亚甲基δ
c 28.5(c-6),43.2(c-7)；3个等价甲基δ
c 29.4(c-9、c-10、c-11)。如图5所示，δ
h 5.44的nh2质子缺乏hsqc相关性；如图6所示，hmbc数据显示nh2(δ
h 5.44)与c-1相关；h-9(δ
h 0.89)与c-8、c-7相关，表明分子中存在叔丁基结构片段，同时h-5(δ
h 6.01)与c-6、c-7相关，h
2-6(δ
h 2.16)与c-5、c-4、c-7相关，h-7(δ
h 1.3)与c-5、c-9相关。如图4所示，在cosy谱中显示h-2(δh5.52)、h-3(δ
h 6.44)、h-4(δ
h 7.40)和h-5(δ
h 6.01)耦合相关。通过cosy和hmbc连接起来即可确定结构。最后，该化合物的结构被鉴定为(2z,4e)-8,8-dimethylnona-2,4-dienamide((2z，4e)-8,8-二甲基九氢-2，4-二酰胺)，经scifinder查询该化合物为新化合物。
[0043]
表1.化合物ⅰ的nmr数据(cdcl
3-d6)
[0044][0045]
注1：s—单重峰、d—二重峰、t—三重峰、m—多重峰。
[0046]
注2：1h在600mhz nmr获得；
13
c在150mhz nmr获得。
[0047]
实施例4
[0048]
实施例1所述酰胺类化合物活性及应用
[0049]
(1)实验样品
[0050]
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物ⅰ纯品，精密称取适量样品，用dmso配制成所需浓度的溶液供测试抗菌活性。该实验使用的指示菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0051]
(2)实验方法
[0052]
96孔板法抗菌测试：挑取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)单菌落接种到肉汤mh液体培养基中，每孔加入4μl12.8mg/ml的样品和96μlmh培养基溶液。通过梯度稀释，最终浓度分别为128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。以dmso为阴性对照，同时以相同浓度的万古霉素作阳性对照。在28℃下培养2d后观察耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)生长情况，整个实验重复3次。
[0053]
(3)实验结果
[0054]
96孔板法抗菌测试中，化合物ⅰ对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)mic被确定为64μg/ml。
[0055]
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

技术特征：
0.5g，nacl 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g和琼脂20g，1000ml蒸馏水，调ph＝7.4-7.6；所述的高氏1号液体培养基配制方法如下：将可溶性淀粉20g，kno
3 1g，k2hpo
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 0.5g和feso4·
7h2o 0.01g，1000ml蒸馏水，调ph＝7.4-7.6；所述的大米固体培养基的配制方法如下：将80g大米、120ml水、3.6g海盐配制而成。4.根据权利要求2所述的一种酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的反相中压柱层析线性梯度洗脱中乙腈体积百分比从25～100％，洗脱时间150min。5.根据权利要求2所述的一种酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0ml/min。6.一种权利要求1所述的酰胺类化合物在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑制剂方面的用途。

技术总结
本发明公开了一种酰胺类化合物及其制备方法和用途，特点是该化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC NO：M2020953的放线菌通过发酵培养来获取酰胺类发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取得粗浸膏，在此基础上将该粗浸膏经正相硅胶柱层析，反相中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该酰胺类化合物具有在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑制剂方面的用途，优点是该酰胺类化合物具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用，可以用于开发预防和治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物。氧西林金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物。氧西林金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物。


技术研发人员：张作艳 丁立建 林珠 徐萍 周旋
受保护的技术使用者：宁波大学附属第一医院
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/8/14