华西牛亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合和应用及鉴定方法

华西牛亲缘关系鉴定的snp分子标记组合和应用及鉴定方法
技术领域
1.本发明属于基因分型技术领域，具体涉及华西牛亲缘关系鉴定的snp分子标记组合和应用及鉴定方法。


背景技术：

2.系谱的准确性对于牛育种至关重要。不正确的系谱将大大降低遗传评定的准确性，影响选配效果，并且会阻碍群体的遗传改良，从而对养殖业造成巨大的经济影响。但是在实际育种生产中，系谱记录常因多种因素造成记录错误，如配种记录、产犊记录，以及人为错误等。特别是在饲养粗放的散养式牧场中，很难确定犊牛的父亲甚至双亲，可能会导致系谱错误。全世界各国牛群平均系谱错误率可达11％
1.，不同国家由于饲养方式和生产管理情况不同，系谱错误率也存在一定差异，但系谱错误在实际生产管理中难以完全避免。郭刚等
2..研究表明，北京地区的荷斯坦母牛的系谱错误率平均为20.9％。如果按照世界平均11％的系谱错误率发生在实际生产中，会导致近交系数、公畜方差和跨国间的遗传相关等的估计值偏低。israel和weller等
3.的模拟研究表明，如果系谱错误率达10％，假设遗传力为0.25，在20年内以色列肉牛的群体遗传进展将会损失4.3％。在奶牛的遗传评估过程中，如果母牛的父亲记录错误率为11％，群体遗传进展将会降低11％～15％。weller等
4.提出，要保证每年牛群的遗传进展在1％以上，系谱错误率需控制在8％以下。因此，完整、准确的系谱对整个养牛业的生产与发展十分必要。
3.华西牛是中国农业科学院北京畜牧兽医研究所历经40余年潜心培育的肉牛新品种，2021年通过国家畜禽遗传资源委员会审定，并获得国家畜禽新品种证书，其具有生长速度快、饲料转化率高、净肉率高、产肉和繁殖性能好、抗逆性强等特性。与国际同类型肉牛品种相比，华西牛的日增重、屠宰率、净肉率处于国际先进水平。华西牛既适应我国的牧区、农区以及北方农牧交错带，也适应南方草山草坡地区。由于牧区的养殖方式多为粗放式饲养，在配种过程中，既有公牛本交，又有人工授精，加之在人工授精实施过程中人为操作失误，系谱错误率很高。因此，为了准确估计华西牛个体育种值，加快遗传进展，亲缘关系的确认非常重要。
4.目前常用的亲子鉴定的分子手段，主要包括dna指纹技术、微卫星及snp分子标记法。尽管在过去的几十年中，使用的分子标记已经从等位酶、微卫星(str)逐步更新为snp，但亲子分析的理论基础并未偏离遵循孟德尔遗传定律的要求。snp标记即单核苷酸多态性(single nucleotide p0lymorphism)标记，它是指在基因组水平由于单个碱基的变异引起的dna序列多态性，通常由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但前者的发生概率是后者的2倍。通常来讲，snp标记的最小等位基因频率在群体中不小于1％，但不排除存在小于1％的情况(如cdna)。
5.目前尚无利用snp标记进行华西牛进行亲缘关系鉴定的报道。缺少系谱记录对推广华西牛的质量追溯系统造成极大困难；另外，在牛的遗传研究方面系谱信息的应用十分重要。因此，完整、准确的系谱对整个华西牛养殖业的发展和推广十分必要，在实际记录无
法保障正确性的情况下，亲缘关系鉴定成为华西牛遗传育种改良方面的重要环节。
6.参考文献：
7.[1]banos g,wiggans g r,powell r l.impact of paternity errors in cow identification on genetic evaluations and international comparisons[j].journal of dairy science,2001,84(11):2523-2529.
[0008]
[2]郭刚,周磊,刘林,李东,张胜利,刘剑锋,丁向东,张毅,王雅春,张勤,张沅.利用snp标记进行北京地区中国荷斯坦牛亲子推断的研究[j].畜牧兽医学报,2012,43(01):44-49.
[0009]
[3]israel c,weller j i.effect of misidentification on genetic gain and estimation of breeding value in dairy cattle populations[j].journal of dairy science,2000,83(1):181-187.
[0010]
[4]weller j i,feldmesser e,golik m,et al.factors affecting incorrect paternity assignment in the israeli holstein population[j].journal of dairy science,2004,87(8):2627-2640.


技术实现要素：

[0011]
本发明的目的在于提供华西牛亲缘关系鉴定的snp分子标记组合和应用及鉴定方法，所述snp标记组合可用于华西牛完整、准确的系谱鉴定，提高华西牛育种准确性。
[0012]
本发明提供了一种用于华西牛亲缘关系鉴定的snp分子标记组合，包括表1所示snp分子标记中的至少70个。
[0013]
优选的，各snp分子标记的位点以bos_taurus_umd_3.1为参考基因组。
[0014]
本发明还提供了用于鉴定上述snp分子标记组合的探针。
[0015]
本发明还提供了基于上述snp分子标记组合制备得到的基因芯片。
[0016]
优选的，所述基因芯片的类型包括液相芯片。
[0017]
本发明还提供了上述snp分子标记组合或上述探针或上述基因芯片在鉴定华西牛亲缘关系中的应用。
[0018]
本发明还提供了上述snp分子标记组合或上述探针或上述基因芯片在华西牛遗传改良育种中的应用。
[0019]
本发明还提供了一种鉴定华西牛亲缘关系的方法，包括以下步骤：以待测牛的基因组dna为模板，鉴定上述snp分子标记组合的基因型，根据待测牛个体的基因型计算亲子指数的lod值，根据lod值鉴定待测牛的亲缘关系。
[0020]
优选的，当lod值大于0时，候选亲本有可能是真实亲代，lod值最高的个体是最似亲本；当lod值小于0时，候选亲本不可能是真实亲本。
[0021]
有益效果：本发明提供了一种用于华西牛亲缘关系鉴定的snp分子标记组合，通过对1,252头华西牛测序结果数据分析，筛选出29条常染色体上的多个snp位点，且通过1,000个位点的至少70个即可完成华西牛亲缘关系的鉴定。本发明提供了1,000个分布于29条常染色体上的snp标记，同一染色体上相邻snp标记的平均距离为2m。该标记组合的最小等位基因频率(maf)、期望杂合度(hexp)、多态信息含量(pic)的平均值分别为0.4846、0.4983、0.3741；当母本基因型未知时，累计排除概率为0.9999999999999。本发明的snp标记组合可
用于华西牛完整、准确的系谱鉴定，可提高华西牛育种准确性，加快其遗传进展，具有良好的应用前景和经济效益。
附图说明
[0022]
图1为华西牛亲缘关系鉴定的具体操作实施步骤。
具体实施方式
[0023]
本发明提供了一种用于华西牛亲缘关系鉴定的snp分子标记组合，包括表1所示snp分子标记中的至少70个。
[0024]
本发明通过对1,252头华西牛测序结果数据分析，筛选出29条常染色体上的1,000个snp位点，可用于华西牛群亲缘关系鉴定的snp标记组合。本发明提供的1,000个snp标记组合分布于29条常染色体上，同一染色体上的相邻snp的平均距离为2m。本发明表1中的snp分子标记信息中，位点以bos_taurus_umd_3.1为参考基因组。本发明所述snp分子标记组合为1,000个snp位点，该标记组合的最小等位基因频率(maf)、期望杂合度(hexp)、多态信息含量(pic)的平均值分别为0.4846、0.4983、0.3741；这1000个snp标记组合的累计排除概率为0.9999999999999，亲子鉴定效力极高。
[0025]
表11000个snp分子标记信息
[0026]
[0027]
[0028]
[0029]
[0030]
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[0058]
[0059]
[0060]
[0061][0062]
[0063]
本发明还提供了用于鉴定上述snp分子标记组合的探针。
[0064]
本发明对所述探针的设计方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行设计即可，满足特异性识别并结合到对应snp位点即可。
[0065]
本发明还提供了基于上述snp分子标记组合制备得到的基因芯片。
[0066]
本发明所述基因芯片的类型优选包括液相芯片，利用所述液相芯片可直观测定对应snp分子标记位点的基因型，从而有利于亲缘关系的判定。
[0067]
本发明还提供了上述snp分子标记组合或上述探针或上述基因芯片在鉴定华西牛亲缘关系中的应用。
[0068]
本发明在鉴定华西牛亲缘关系时，首先以待测牛的基因组dna为模板，利用本领域的常规手段，如测序、基因芯片等手段判定上述snp分子标记位点的基因型，并基于似然法进行亲子鉴定。本发明优选根据待测牛个体的基因型计算亲子指数的lod值，通过建立似然函数，应用假设检验的方法找到最似父亲。过程及计算方法如下：
[0069]
根据kalinowski等(2007)提出的计算公式：kalinowski s t，taperm l，marshall t c.revising how the computerprogram cervus accommodates genotyping error increases success inpaternity assignment[j].molecular ecology，2007，16(5)：1099-1106.
[0070]
(1)母本基因型未知时，假设父亲成为真实父亲的可能性
[0071]
l(h1)＝p(ga){(1-ε)2t(go|ga)+ε(1-ε)2p(go)+ε2p(go)}
[0072]
l(h2)＝p(ga){(1-ε)2p(go)+ε(1-ε)2p(go)+ε2p(go)}
[0073]
(2)母本基因型已知时，假设父亲成为真实父亲的可能性
[0074]
l(h1)＝p(gm)p(ga){(1-ε)3t(go|gm，ga)+ε(1-ε)2[t(go|gm)+t(go|ga)+p(go)]+ε2(1-ε)3p(go)+ε3p(go)}
[0075]
l(h2)＝p(gm)p(ga){(1-ε)3t(go|gm)+ε(1-ε)2[t(go|gm)+p(go)]+ε2(1-ε)3p(go)+ε3p(go)}.
[0076]
(3)假设母本和假设父本成为子代双亲的可能性
[0077]
l(h1)＝p(gm)p(ga){(1-ε)3t(go|g
am
，ga)+ε(1-ε)2[t(go|g
am
)+t(go|ga)+p(go)]+ε2(1-ε)3p(go)+ε3p(go)}
[0078]
l(h2)＝p(g
am
)p(ga){(1-ε)3p(go)+ε(1-ε)2p(go)+ε2(1-ε)3p(go)+ε3p(go)}.
[0079]
(4)似然比的表达式为：l(h1)/l(h2)，则
[0080]
lod＝ln[l(h1)/l(h2)]
[0081]
以上公式中，h1：假设父亲为真实父亲，h2：假设父亲为无关个体。l(h1)、l(h2)为在假设条件h下的似然函数。go为子代基因型，ga为假设父本的基因型，gm为已知母本的基因型，g
am
为假设母本的基因型，t为标准孟德尔传递概率，p为基因型概率，ε为基因型判别错误率。
[0082]
根据以上计算公式，可以得到每个候选亲本在所有检测位点似然比的lod值，及可知道候选亲本为子代真实亲本的可能性大小，从而可对亲子对之间的亲缘关系作出判断。
[0083]
marshall等根据lod值的定义又指出，lod值等于0表示假设父亲与群体中随机雄性个体成为子代真实父亲的可能性相同；lod值小于0时表示假设父亲不可能为子代的真实父亲，这通常意味着假设父亲与子代之间存在一个或多个位点基因型不匹配；而lod大于0
时表示假设父亲极有可能是子代的真实父亲，当lod值足够大时，可确定子代与候选父亲之间的亲缘关系。
[0084]
当多个候选亲本所计算的lod值均大于0时，那么它们都有可能成为子代的真实父亲，实际真实父亲却只有一个。此时，可将候选亲本按照lod值的大小排队，拥有较大lod值的成为真实父亲的可能性就越大。然而，有时候会出现一些正的lod值近似相等，判别的难度较大。鉴于此种情况，marshall等(marshall t c，slate j，kruuk l e b，et al.statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations[j].molecular ecology，1998，7(5)：639-655.)定义了一个统计量δ用于亲子鉴定：
[0085]
δ＝lod
max-lod
sec
[0086]
δ是用于评价鉴定结果可信度的统计量。其中，lod
max
表示最似亲本的lod值，lod
sec
表示第二似亲本的lod值。δ值越大，最似亲本是真实亲本的置信度越高，用δ进行亲子鉴定，可保证鉴定的准确性。同时对最似亲本指派的置信度也将被显示：*表示亲子关系极显著，置信度超过95％；+表示亲子关系较显著，置信度超过80％；-表示亲子关系没有达到显著要求，置信度为0～80％。
[0087]
因此，本发明提供的鉴定华西牛亲缘关系的方法是根据待测牛个体的基因型计算亲子指数的lod值，根据lod值鉴定待测华西牛亲缘关系。当lod值大于0时，候选亲本有可能是真实亲代，lod值最高的个体是最似亲本；当lod值小于0时，候选亲本不可能是真实亲本。
[0088]
本发明还提供了上述snp分子标记组合或上述探针或上述基因芯片在华西牛遗传改良育种中的应用。
[0089]
利用本发明所述snp分子标记组合及对应产品可用于华西牛完整、准确的系谱鉴定，提高华西牛育种准确性，加快其遗传进展，具有良好的应用前景和经济效益。
[0090]
本发明还提供了一种鉴定华西牛亲缘关系的方法，包括以下步骤：以待测牛的基因组dna为模板，鉴定上述snp分子标记组合的基因型，根据待测牛个体的基因型计算亲子指数的lod值，根据lod值鉴定待测牛的亲缘关系。
[0091]
本发明具体的lod计算方法与上述相同，在此不再赘述。在本发明中，当lod值大于0时，候选亲本有可能是真实亲代，lod值最高的个体是最似亲本；当lod值小于0时，候选亲本不可能是真实亲本。
[0092]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的华西牛亲缘关系鉴定的snp分子标记组合和应用及鉴定方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0093]
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的化学试剂均为市售。
[0094]
实施例1
[0095]
华西牛亲缘关系鉴定相关的1,000个snp分子标记的筛选
[0096]
1、华西牛亲缘关系鉴定相关的snp标记的筛选
[0097]
利用illumina平台对来自内蒙古乌拉盖管理区的1,252头华西牛进行二代测序，共获得12,468,401个snp分子标记。采取以下质控标准对snp进行筛选：
①
位于常染色体上；
②
最小等位基因频率大于0.35；
③
每个snp标记的检出率(call rate)大于0.95；
④
同一条
染色体上相邻snp间距大于1mb；为避免所选snp标记间存在连锁不平衡，分染色体进行筛选。
⑤
哈迪-温伯格平衡检验(hw)p》1
×
106。经初步筛选获得17,023个多态snp位点。
[0098]
应用cervus3.0.7软件统计17,023个snp的各个遗传多态性参数，包括等位基因频率，期望杂合度，多态信息含量，哈迪-温伯格平衡，排除某疑似亲本的平均概率(pe)、位点组合的累计排除概率(cpe)以及无效等位基因频率等。
[0099]
根据各参数统计的结果，分染色体再次进行筛选。首先按照pe值高低对位点重新进行排序，其次根据pic高低并参考maf值，在保证同一条染色体相邻snp之间的距离大于2m的条件下保留各项参数值最高的位点。最后获得筛选的标记个数为1,000个。snp位点在各染色体上的数目分布见表2。
[0100]
表2各染色体上的snp数目及相邻snp之间的距离
[0101]
[0102][0103]
最终的snp分子标记组合为表1所示的1,000个snp位点，同一条染色体相邻位点间的平均距离为2m，该标记组合的maf、hexp、pic的平均值分别为0.4846、0.4983、0.3741；这1,000个snp标记组合的累计排除概率为0.9999999999999，亲子鉴定效力极高。
[0104]
2、snp标记华西牛亲缘关系鉴定体系的建立
[0105]
snp标记的数量越多，其亲缘关系鉴定的准确性越高。snp标记的数量不同，其检测成本也不同。由于在不同的实际生产中，操作难度和检测成本会产生较大差异，为了满足各种情况的需要，在最合理成本的情况下满足最高的亲子鉴定准确性。本实施例通过模拟研究和在华西牛群体中验证，最终确定了不同情况下能达到理想鉴定效力所需要的最低数量的snp组合。
[0106]
将1,000个snp标记随机分成含500、300、200、100、80、70、60、50、40、30和20的亚组合，从而确定不同情况下所需要的最少的snp标记数量。应用cervus3.0.7软件进行亲子鉴定的模拟实验，来确定最适合的snp组合。
[0107]
模拟参数设置如下：位点分型成功率为1，分析错误率设为0.01，置信度的临界值设为80％和95％，模拟子代为10,000头，候选亲本检出率设为100％。对模拟结果进行统计分析(表3)，发现cpe1由0.93051929(20snp)增大至1(200snp)，cpe2由0.98424600(20snp)增大至1(100snp-200snp)，cpe3由0.998644213(20snp)增大至1(60snp-200snp)，当位点增大到一定程度时，排除率保持不变最高为1。由表3可得，当snp标记数目达到70个时，cpe1和cpe2都超过了99.99％，cpe3更是达到了1，并且70个以上snp标记组合的亲子鉴定分配率(80％、95％置信水平)都可达100％，且在亲子置信度为95％的水平下，亲子推断的比例可达到100％。
[0108]
因此通过模拟研究可知，为保证达到理想的鉴定效力，在实际应用中需要至少70个位点组成标记组合。本研究最终筛选了1,000个snp标记作为华西牛群体亲缘关系鉴定的snp标记组合(表1)。
[0109]
表3不同梯度组合排除概率、分配率及推断率
[0110][0111]
注：cpe1为对一疑似亲本的累积排除概率，cpe2为当另一亲本基因型已知时，对疑似亲本的累积排除概率，cpe3为对疑似亲本对的累积排除概率。分配率为此置信水平下，亲本被指派的模拟子代的百分数，推断率为此置信水平下指派的亲本为真实亲本的概率。
[0112]
实施例2
[0113]
表1所示的1,000个snp分子标记在鉴定华西牛亲缘关系中的应用，如图1所示：
[0114]
为了验证所筛选的1,000个snp标记组合在实际群体中进行华西牛亲子推断的可行性与准确性，本实施例从基于illumina平台进行二代测序的内蒙古乌拉盖管理区的华西牛群体中选择了10对父子关系明确的组合做亲子鉴定的验证试验。将这10个子代牛(编号a1-a10)的候选父本设为曾经用于该试验群体配种的14头种公牛(编号p1-p14)。为保证试验结果的可靠性，进行三次重复试验，每次从1,000个snp标记中随机选择70个位点，组成鉴定组合。
[0115]
采用cervus3.0.7软件对其亲缘关系进行推断，结果见表4～13。具体拿a1个体的第一次试验结果为例，14个候选父本的lod值从高到低进行了排列。其中，p1的lod值最高，为15.27655587，δ值为15.27655587，置信度超过95％，因此p1是a1的最似亲本，而其他候选父本的lod值均为负值，所以p2-p14候选亲本不可能是a1的真实亲本。
[0116]
用本发明1,000个snp分子标记构成的组合找到的最可能父本，三次试验验证的结果均与系谱记录一致，且置信度达到95％，验证了本发明提供的snp组合在华西牛亲子鉴定中的准确性与可行性。
[0117]
表4亲子鉴定验证试验
[0118][0119][0120]
注：*表示亲子关系极显著，置信度超过95％；+表示亲子关系较显著，置信度为80％～95％；-表示亲子关系没有达到显著要求，置信度为0～80％；下同。
[0121]
表5亲子鉴定验证试验
[0122][0123][0124]
表6亲子鉴定验证试验
[0125][0126][0127]
表7亲子鉴定验证试验
[0128][0129][0130]
表8亲子鉴定验证试验
[0131][0132][0133]
表9亲子鉴定验证试验
[0134][0135][0136]
表10亲子鉴定验证试验
[0137][0138][0139]
表11亲子鉴定验证试验
[0140][0141][0142]
表12亲子鉴定验证试验
[0143][0144][0145]
表13亲子鉴定验证试验
[0146][0147][0148]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种用于华西牛亲缘关系鉴定的snp分子标记组合，其特征在于，包括以下snp分子标记中的至少70个：
2.根据权利要求1所述snp分子标记组合，其特征在于，各snp分子标记的位点以bos_taurus_umd_3.1为参考基因组。3.用于鉴定权利要求1或2所述snp分子标记组合的探针。
4.基于权利要求1或2所述snp分子标记组合制备得到的基因芯片。5.根据权利要求4所述基因芯片，其特征在于，所述基因芯片的类型包括液相芯片。6.权利要求1或2所述snp分子标记组合或权利要求3所述探针或权利要求4或5所述基因芯片在鉴定华西牛亲缘关系中的应用。7.权利要求1或2所述snp分子标记组合或权利要求3所述探针或权利要求4或5所述基因芯片在华西牛遗传改良育种中的应用。8.一种鉴定华西牛亲缘关系的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测牛的基因组dna为模板，鉴定权利要求1或2所述snp分子标记组合的基因型，根据待测牛个体的基因型计算亲子指数的lod值，根据lod值鉴定待测牛的亲缘关系。9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，当lod值大于0时，候选亲本有可能是真实亲代，lod值最高的个体是最似亲本；当lod值小于0时，候选亲本不可能是真实亲本。

技术总结
本发明公开了华西牛亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合和应用及鉴定方法，属于基因分型技术领域。本发明提供了一种用于华西牛亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合，利用1,000个位点中的至少70个即可完成华西牛亲缘关系的鉴定。本发明提供的1,000个位点分布于29条常染色体上的SNP标记，同一染色体上相邻SNP标记的平均距离为2M。该标记组合的MAF、HExp、PIC的平均值分别为0.4846、0.4983、0.3741；当母本基因型未知时，累计排除概率为0.9999999999999。本发明的SNP标记组合可用于华西牛完整、准确的系谱鉴定，提高华西牛育种准确性。提高华西牛育种准确性。提高华西牛育种准确性。


技术研发人员：高雪 朱波 李俊雅 王元清 高会江 陈燕 张路培 王泽昭
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/8/9