一种与半纤维素合成调控紧密相关的SsuTDX基因及其应用的制作方法

一种与半纤维素合成调控紧密相关的ssutdx基因及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与半纤维素合成调控紧密相关的ssutdx基因及其应用。


背景技术：

2.木荷(schima superba)是山茶科(theaceae)木荷属(schima reinw.)常绿硬木类阔叶大乔木，第九次全国森林资源清查数据显示，按全国乔木树种重要值排序位居全国第9，是我国南方第一大珍贵优质阔叶造林树种，浙江省主推“十大碳汇树种”之首。其树干端直，木材坚重致密(气干密度0.697g/cm3)，结构均匀，机械加工综合性能较好，市场需求量巨大。研究发现，与其他硬木类阔叶用材树种相比，木荷半纤维素含量较低(低于树种平均2.5％)，木纤维解剖结构(木纤维长、宽、壁厚等)显著优于其他树种1.6-3.3倍(表1)，木纤维细胞壁具有较强的塑性，但在群体中变异较大(变异系数高达10％)。
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注：纤维分级标准：纤维长度：＜900μm，短：900-1600μm，中等：＞1600um，长(clawa，1937)：纤维宽度：＜16um，细：16-25μm，中等：26-30μm，粗：＞30μm，甚粗(pashin et al.1964)：壁厚：甚薄，胞腔比胞壁厚度大很多；薄，胞腔比胞壁厚度较大；厚,胞腔小于胞壁厚度；甚厚，胞腔几乎完全封闭。
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对于木荷木纤维生长发育的机理，较少有深入研究。在模式植物拟南芥和杨树中，与维管束/木纤维生长发育的相关基因主要涉及纤维素、半纤维素和木质素的合成及转录调控。在木荷中哪种物质及其调控过程是限制因子，目前尚不得知。木纤维解剖结构对木材物理性质影响显著，对于木材的用途产生重要影响，如造纸材需要木纤维长，壁薄韧性强的材料，建筑材需要木纤维宽，壁厚刚性强的材料等。利用木荷木纤维长度发育相关调控基因改良目标材料木纤维解剖结构形态的工作具有重要科学意义和应用价值。


技术实现要素：

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针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于涉及提供一种与半纤维素合成调控紧密相关的ssutdx基因及其应用的技术方案。
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本发明具体采用以下技术方案实现：
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本发明第一方面提供了一种与半纤维素合成调控紧密相关的ssutdx基因，该基因包含3个xth串联重复单元ssuxth15、ssuxth16和ssuxth17，3个xth串联重复单元的cds序列分别如seq id no.1～3所示。
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进一步，所述ssuxth15、ssuxth16和ssuxth17基因编码的蛋白如seq id no.4～6所示。
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本发明第二方面提供了上述ssutdx基因在调控植物木纤维生长发育中的应用。
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本发明第三方面提供了上述ssutdx基因在提高植物木纤维长度中的应用。
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本发明第四方面提供了一种提高植物木纤维长度的方法，其包括如下步骤：将权利要求1所述的ssutdx基因导入目标植物中，得到转基因植物；与目标植物野生型对照相比，转基因木纤维长度显著提高。
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本发明的实验证明，本发明在木荷中发现的ssutdx基因与半纤维素合成调控紧密相关，将该ssutdx基因在杨树中过表达，转基因杨树的木纤维长度长于野生型对照，验证了该ssutdx基因具有调控植物木纤维生长发育的功能，为定向培育木荷及其他植物长木纤维长度品种提供候选基因。
附图说明
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图1木荷s1-s3的纤维形态和化学成分分析。图中：a-d纤维长度、宽度、次生壁厚度和纤维长宽比。e纤维素、半纤维素和木质素含量。误差条表示标准偏差。不同的字母表示不同半同胞子代的显著差异(通过单因素方差分析，p《0.01)。
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图2ssutdx基因结构示意图。
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图3ssutdx基因的氨基酸序列与模式物种比对。
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图4ssutdx蛋白的酶活性。
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图5通过qrt-pcr验证rna-seq数据。图中：柱形图表示qrt-pcr结果，折线图表示转录组结果。
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图6ssutdx转基因杨树的木纤维长度分析。图中：a：2月龄；b：3月龄。
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图7ssutdx基因对杨树木纤维长度的影响。
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图8ssutdx基因对杨树茎解剖结构的影响。
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图9ssutdx基因对杨树茎细胞壁厚度的影响。
具体实施方式
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以下结合实施例来进一步说明本发明。
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实施例：
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(一)样品制备
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试验材料来自福建建瓯12年生木荷优树自由授粉家系测定林，筛选木纤维解剖形态在一个家系内个体间变异显著的3个材料。采集该3个半同胞子代(s1，s2和s3，图1)的皮层(次生木质部、次生韧皮部和形成层)，液氮速冻，-80℃保存，用于转录组测序及后续基因功能研究。
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(二)测序及转录组分析
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采用易思得easy plant rna kit(polysaccharides&polyphenolics-rich)提取总rna，使用ultra
tm rna library prep kit for(beckman coulter，beverly，usa)构建cdna文库，使用诺禾致源的illumina novaseq platform(illuminainc，usa)测序。测序获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads。为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对原始数据进行过滤。同时，对clean data的q20，q30和gc含量进行计算。后续所有分析均是基于clean data进行的高质量分析。
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木荷基因组已测序并组装完成，因此直接使用hisat2 v2.0.5将clean reads比对至基因组。并通过stringtie软件组装新的转录本。基因表达水平由fpkm确定，差异表达基因(differential expressed genes，degs)的鉴定标准参考|log2(foldchange)|》0和padj≤0.05。
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(三)差异基因筛选
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基因的表达水平材用fpkm进行比较。采用cuffdiff软件确定差异表达(fdr≤0.01)。对纤维素、半纤维素和木质素合成、调控相关的差异基因进行分析，获得一个与半纤维素合成调控紧密相关的ssutdx基因序列。该基因包含3个xth串联重复单元(ssuxth15、ssuxth16、ssuxth17)(图2)，三个基因cds序列长分别为876、912和888bp，其核苷酸序列如seq id no.1～3所示，编码蛋白分别包含氨基酸291、300和295aa，其氨基酸序列如seq id no.4～6所示。
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ssutdx基因主要在韧皮部和木质部表达，采用比色法和粘度法测得其具有xet酶和xeh酶活性，且在ph 6.5时，xet酶活性最高，水解活性约2h左右，对木葡聚糖具有专一性。其中木荷xth蛋白跨膜结构、信号肽及磷酸化位点预测见表2所示，ssutdx基因的氨基酸序列与模式物种比对如图3所示，ssutdx蛋白的酶活性如图4所示。
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表2木荷xth蛋白跨膜结构、信号肽及磷酸化位点预测预测
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(四)荧光定量分析
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为了验证ssutdx基因，测定s1-s3材料的相对表达量，使用木荷特异ssuact基因作为内参，使用applied biosystems q7(usa)仪器进行rt-qpcr。20μl的反应体系包含10μl 2
×
tb greenpremix ex taqii(tli rnaseh plus)(rr820a，takara，japan)、2μl稀释cdna、前后引物(表3)(10mm)各0.8μl、0.4μl rox reference dye(50
×
)和6μl水。反应程序如下：95℃孵育30s；95℃育5s，60℃孵育30s，循环40次；溶解曲线采集。根据3次生物学重复和3次技术重复的值计算平均ct值，使用2-δδct
法计算基因的相对表达量。如图5所示，ssutdx基因表达量与转录组测序结果一致，且在s2中表达量最高。
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(五)转基因验证
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将木荷ssutdx全长cdna克隆到含有35s启动子的植物表达载体pcamia1300-gfp上。具体步骤：设计特异引物，见表3，以木荷s2cdna为模板，获得ssutdx的cdna序列。通过pcr割胶回收，连接pmd20-t载体，热激法转化top10，通过gateway的方式连入pcamia1300，
构建过表达载体p35s：：ssutdx。采用冻融法将重组载体转入gv3101农杆菌感受态。农杆菌介导的叶盘法转化杨树。对转基因阳性株系进行表型性状观察、木纤维形态及半纤维素含量等测定。
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表3相关引物
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试验结果表明：
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ssutdx极显著促进杨树木纤维伸长发育，伸长比率可达15％左右。
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证据1：如图6所示，转基因杨树土培2月时，第15节间，ssuxth15-oe、ssuxth16-oe和ssuxth17-oe株系的木纤维长度极显著大于wt，分别增加13.34％、20.76％和21.14％。转基因杨树土培3月时，第15节间，ssuxth15-oe、ssuxth16-oe和ssuxth17-oe株系的木纤维长度极显著大于wt，分别增加8.46％、15.44％和12.70％；第20节间，ssuxth15-oe、ssuxth16-oe和ssuxth17-oe株系的木纤维长度极显著大于wt，分别增加9.23％、15.65％和17.99％。
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证据2：如图7所示，转基因杨树土培90d时，ssuxth15&16&17-oe株系第10、第15和第20节间的木纤维长度极显著大于wt，ssuxth15&16&17-oe株系第10节间的木质部厚度明显小于wt(图8)，ssuxth15&16&17-oe株系的细胞壁厚度明显小于wt(图9)。
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综上所述，本发明在木荷中发现的ssutdx基因与半纤维素合成调控紧密相关，将该ssutdx基因在杨树中过表达，转基因杨树的木纤维长度长于野生型对照，验证了该ssutdx基因具有调控植物木纤维生长发育的功能，为定向培育木荷及其他植物长木纤维长度品种提供候选基因。

技术特征：
1.一种与半纤维素合成调控紧密相关的ssutdx基因，其特征在于该基因包含3个xth串联重复单元ssuxth15、ssuxth16和ssuxth17，3个xth串联重复单元的cds序列分别如seq id no.1～3所示。2.如权利要求1所述的ssutdx基因，其特征在于所述ssuxth15、ssuxth16和ssuxth17基因编码的蛋白如seq id no.4～6所示。3.如权利要求1所述的ssutdx基因在调控植物木纤维生长发育中的应用。4.如权利要求1所述的ssutdx基因在提高植物木纤维长度中的应用。5.一种提高植物木纤维长度的方法，其特征在于包括如下步骤：将权利要求1所述的ssutdx基因导入目标植物中，得到转基因植物；与目标植物野生型相比，转基因木纤维长度显著提高。

技术总结
一种与半纤维素合成调控紧密相关的SsuTDX基因及其应用，属于生物技术领域。本发明一方面提供了与半纤维素合成调控紧密相关的SsuTDX基因，该基因包含3个XTH串联重复单元SsuXTH15、SsuXTH16和SsuXTH17，3个XTH串联重复单元的CDS序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，本发明另一方面提供了该SsuTDX基因的应用。本发明在木荷中发现的SsuTDX基因与半纤维素合成调控紧密相关，将该SsuTDX基因在杨树中过表达，转基因杨树的木纤维长度长于野生型对照，验证了该SsuTDX基因具有调控植物木纤维生长发育的功能，为定向培育木荷及其他植物长木纤维长度品种提供候选基因。维长度品种提供候选基因。维长度品种提供候选基因。


技术研发人员：张蕊 杨中义 周志春 王家燚 王云鹏 王淼
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院亚热带林业研究所
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/8/21