一种重组III型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法及应用与流程

一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物生物医用材料领域，特别涉及一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶的制备方法及应用。


背景技术：

2.理想的软组织填充材料需要具有以下三个特点：1)高度的生物相容性；2)易于注射；3)产生可接受的持久效果。从这3个标准来看，注射用交联透明质酸钠凝胶，作为目前最为流行的软组织填充剂最符合上述三个标准，并在安全性和有效性上，获得了一致认可。随着科技发展和同类产品迭代更新，重组胶原蛋白材料在软组织填充领域也有着了更广泛的应用前景。
3.重组人源化胶原蛋白是指由dna重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。重组iii型人源化胶原蛋白以人iii型胶原蛋白为原型，保持原有的氨基酸及gxy三肽的比例，含有498个氨基酸以改善亲水性和消除免疫原性为目的的498个氨基酸，该蛋白设计由构建的毕赤酵母基因工程菌通过高密度发酵得到。巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统是一种外源蛋白表达系统，既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统不具有的对外源蛋白的修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点。在过去的20年中已有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达，其中许多产品已被广泛应用于临床的诊断治疗和科研工作中。
4.bdde(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)作为一种双环氧化物，其交联能力是由位于分子两端的环氧化物基团的反应性赋予的，在碱性条件下，可与透明质酸钠的羟基发生交联反应生成含醚键的交联产物，比酯键或酰胺键更稳定。此外，bdde还可与胺、羟基、巯基反应，并分别产生仲胺，醚或硫醚键，在合适的条件下，也可以与重组iii型胶原蛋白进行交联反应，这也为重组iii型胶原蛋白填充剂的开发奠定了基础。例如专利cn202210232270.x采用bdde作为交联剂对重组胶原进行交联后，将凝胶切块，酸洗，缓冲盐溶液清洗，均质后加入蓝铜肽，搅拌至混合均匀得到交联重组胶原蛋白凝胶。其凝胶中含有的胶原蛋白降解后生成的氨基酸可被机体吸收作为营养成分，同时加入的蓝铜肽可促进自体胶原蛋白的再生和紧致，二者协同作用，在满足即时填充的同时亦可促进自体胶原蛋白再生，有效改变皱纹等皮肤问题。
5.但重组iii型胶原蛋白的分子量相对透明质酸钠偏低，一般在10万道尔顿以下，会对其制备产生一些不良影响，总体来说分为以下三点：1、分子量偏低，洗脱过程溶胀速度慢，终产品含量一般均大于40mg/ml，成本较高；2、分子量偏低，交联反应后形成的凝胶，在粘弹性模量数据上较透明质酸处于劣势；3、洗脱过程溶胀速度慢，透析效率显著偏低，使得交联剂的去除效率降低，增加了交联剂残留、以及临床不良反应的风险。此外，重组iii型胶原蛋白还可能会引起红肿、疼痛、肉芽肿、瘙痒等不良反应。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于改进现有技术中的缺陷，改进单一组分的注射用修饰透明质酸钠凝胶或注射用交联重组iii型胶原蛋白凝胶，提供一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，既可以起到即时修复、矫正轮廓以达到满意的效果的同时，随着交联重组iii型胶原蛋白降解所产生的氨基酸、肽类成分能为组织再生提供合适的微环境，有效提高组织再生速度的目的，且具备快速，有效，稳定制备该产品的新技术。
7.本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
8.本发明一方面提供了一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，具有如下步骤:
9.1)将重组iii型胶原蛋白，加纯水溶解，调节ph值为弱碱性，加入交联剂，交联剂与重组iii型胶原蛋白的质量比为1:1.5～1:8，优选1:4，混合均匀；
10.2)向步骤1)溶液中透明质酸钠，用量为重组iii型胶原蛋白质量的10-60％，优选30％，混匀溶解，得到重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠溶液；
11.3)将所述重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠溶液置于30～50℃保温进行交联反应，得到固体状的弹性凝胶，并切成0.1～0.8cm尺寸的块状；
12.4)向块状弹性凝胶中加入洗脱液，搅拌洗脱，之后滤去洗脱液，重复若干次，直至弹性凝胶溶胀至重组iii型胶原蛋白原料质量的18～70倍，优选40-64倍；
13.5)将步骤4)所得溶胀后的弹性凝胶均质成直径为200～600μm的颗粒，即为重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶；
14.6)灌装
15.将步骤5)制备得到的交联重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠凝胶，灌装至1ml预灌封注射器内；
16.7)灭菌
17.将步骤6)灌装后的交联重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠凝胶，采用纯蒸汽湿热灭菌。灭菌是为了使灌装后的交联重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠凝胶达到无菌状态。
18.在一些优选的实施方式中，所述步骤1)中，重组iii型胶原蛋白原料为发酵法制备，分子量为30～120kd，优选55kd；所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜(dvs)、聚乙二醇、京尼平、碳化二亚胺中的一种或任意两种以上的混合，优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚；所述弱碱性是指ph值为9.5～12.5，优选ph值为12.0。
19.在一些优选的实施方式中，所述步骤1)中，加纯水溶解后重组iii型胶原蛋白的浓度为50～300mg/ml，优选100mg/ml。
20.在一些优选的实施方式中，所述步骤2)中透明质酸钠的分子量为80～150万道尔顿；所述重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠溶液中透明质酸钠的浓度为20～100mg/ml，优选30mg/ml。
21.在一些优选的实施方式中，所述步骤3)中交联反应温度优选45℃，反应时间为8h～16h。在一些特殊情况下，交联反应温度可进一步放宽至35℃～65℃。
22.在一些优选的实施方式中，所述步骤4)中，所述洗脱液中，氯化钠的质量分数为0.6～0.9％，磷酸二氢钠质量分数为0.004％～0.01％，磷酸氢二钠质量分数为0.08％～0.15％；优选地，氯化钠质量分数为0.78％，磷酸二氢钠质量分数为0.0085％，磷酸氢二钠
质量分数为0.135％。
23.在一些优选的实施方式中，所述步骤3)中，弹性凝胶切块尺寸优选为边长0.5～0.8cm的立方体；所述步骤4)中搅拌洗脱的重复次数为2-6次，总时长为18～24h。所述步骤4)即为透析过程。
24.在一些优选的实施方式中，所述步骤5)中，所述均质的次数为2～4次；所述均质是指过筛网，所述筛网优选40目；步骤7)中，所述灭菌温度为115℃～125℃，灭菌时间为8～15min。
25.本发明另一方面还提供了一种上述任一方法制备的重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，其最小单一包装的规格为1ml。
26.本发明另一方面还提供了一种所述重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶在制备软组织填充物中的用途，所述软组织包括但不限于鼻唇沟，颞部，苹果肌。
27.本发明具有以下有益效果：
28.本发明将重组iii型胶原蛋白与透明质酸钠在合适的条件下进行双重交联，具有以下优势：
①
在整个反应体系中，重组iii型胶原蛋白与透明质酸钠既可以发生同类交联，也可能发生相互交联；
②
透明质酸钠成分还可以作为后续洗脱过程的“溶胀载体”，使得最终成品交联重组iii型胶原蛋白的含量能控制在一个较低的范围内，同时还能保持了合理的粘弹性模量。
③
整个体系中因为存在交联透明质酸钠作为“溶胀载体”，极大的增加了凝胶的吸水性能，使得洗脱过程中对于交联剂的去除效率有非常显著的提升，降低临床不良反应发生概率。本发明将以最终产品的粘弹性模量、溶胀度、推挤力、体外抗降解性能等为主要评价指标来判断最终产品的综合性能，本发明所制备的重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶相较于普通重组iii型胶原蛋白具有显著优势。
附图说明
29.图1不同工艺制备样品溶胀速率对比图。
具体实施方式：
30.下面结合实施例对本发明进一步说明，可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明。但不以任何方式限制本发明，凡依照本发明的内容所做的任何本领域的等同替换均属于本发明的保护范围之内。
31.说明
32.1：以下实施例所选透明质酸钠原料为发酵法生产(购自华熙生物)。
33.2：以下实施例所采用的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)
34.3：实施例不局限于发酵法制备的原料，也将以提取法制备的原料为例说明本发明的有效性和通用性。
35.4：以下实施例所选重组iii型人源胶原蛋白为发酵法生产的粉末状原料(供应商：江苏聚源，bss级，分子量为55kd)，为同一批次。
36.实施例1
37.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
38.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)5g，加纯水50ml溶解，采用氢氧化钠溶液(10％浓度)调节ph至12.0，再加入1.2ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，采用旋涡振荡器混合均匀。
39.称取分子量为80万的透明质酸钠(ha)原料1.0g与上述溶液混匀，溶胀直至肉眼无可见白色未溶解ha为止。开启恒温水浴锅调节水浴温度至45℃，将上述凝胶置于水浴中，保温8h进行交联反应。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.4x0.4cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续进行第3次洗脱6h，直至凝胶最终重量为250g为止，达到洗脱终点，停止洗脱，共计时20h，重组iii型人源胶原蛋白浓度为20mg/ml(质量百分比2％)。取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号a。
40.实施例2
41.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
42.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)5g，加纯水50ml溶解，采用氢氧化钠溶液(10％浓度)调节ph至12.0，再加入1.2ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，采用旋涡振荡器混合均匀。
43.称取分子量为80万的透明质酸钠原料1.5g与上述溶液混匀，溶胀直至肉眼无可见白色未溶解ha为止。开启恒温水浴锅调节水浴温度至45℃，将上述凝胶置于水浴中，保温10h进行交联反应。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.4x0.4cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续进行第3次洗脱8h，直至凝胶最终重量为250g为止，达到洗脱终点，停止洗脱，共计时22h，重组iii型人源胶原蛋白终浓度20mg/ml(质量百分比2％)。取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号b。
44.实施例3
45.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
46.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)5g，加纯水50ml溶解，采用氢氧化钠溶液(10％浓度)调节ph至12.0，再加入1.2ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，采用旋涡振荡器混合均匀。
47.称取分子量为150万的透明质酸钠原料1.5g与上述溶液混匀，溶胀直至肉眼无可见白色未溶解ha为止。开启恒温水浴锅调节水浴温度至45℃，将上述凝胶置于水浴中，保温10h进行交联反应。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.4x0.4cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续进行第3次洗脱8h，直至凝胶最终重量为250g为止，达到洗脱终点，停止洗脱，共计时22h，重组iii型人源胶原蛋白终浓度为20mg/ml(质量百分比2％)。
取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号c。
48.实施例4
49.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
50.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)5g，加纯水50ml溶解，采用氢氧化钠溶液(10％浓度)调节ph至12.0，再加入1.2ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，采用旋涡振荡器混合均匀。
51.称取分子量为150万的透明质酸钠原料1.5g与上述溶液混匀，溶胀直至肉眼无可见白色未溶解ha为止。开启恒温水浴锅调节水浴温度至45℃，将上述凝胶置于水浴中，保温14h进行交联反应。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.4x0.4cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续进行第3次洗脱4h，再次更换3l洗脱液进行第4次洗脱，直至凝胶最终重量为250g为止，达到洗脱终点，停止洗脱，共计时24h，重组iii型人源胶原蛋白终浓度为20mg/ml(质量百分比2％)。取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号d。
52.实施例5
53.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
54.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)5g，加纯水50ml溶解，采用氢氧化钠溶液(10％浓度)调节ph至12.0，再加入1.2ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，采用旋涡振荡器混合均匀。
55.称取分子量为150万的透明质酸钠原料3.0g与上述溶液混匀，溶胀直至肉眼无可见白色未溶解ha为止。开启恒温水浴锅调节水浴温度至45℃，将上述凝胶置于水浴中，保温12h进行交联反应。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.4x0.4cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续进行第3次洗脱4h，再次更换3l洗脱液进行第4次洗脱，直至凝胶最终重量为320g为止，达到洗脱终点，停止洗脱，共计时23h，重组iii型人源胶原蛋白终浓度为15.7mg/ml(质量百分比1.57％)。取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号e。
56.实施例6
57.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
58.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)10g，加纯水50ml溶解，采用氢氧化钠溶液(10％浓度)调节ph至12.0，再加入2.0ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，采用旋涡振荡器混合均匀。
59.称取分子量为150万的透明质酸钠原料1.0g与上述溶液混匀，溶胀直至肉眼无可见白色未溶解ha为止。开启恒温水浴锅调节水浴温度至40℃，将上述凝胶置于水浴中，保温8h进行交联反应。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.2x0.2cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续进行第3次洗脱4h，再次更换3l洗脱液进行第4次洗脱，直至凝胶最终重量为400g为止，达到洗脱终点，停止洗脱，共计时24h，重组iii型人源胶原蛋白终浓度为25mg/ml(质量百分比2.5％)。取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号f。
60.实施例7(对照组1)
61.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
62.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)5g，加纯水50ml溶解，采用氢氧化钠溶液(10％浓度)调节ph至12.0，再加入1.2ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，采用旋涡振荡器混合均匀。
63.开启恒温水浴锅调节水浴温度至45℃，将上述凝胶置于水浴中，保温10h进行交联反应。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.2x0.2cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续洗脱10h，凝胶最终重量为110g，停止洗脱，共计时24h，重组iii型人源胶原蛋白终浓度为45.4mg/ml(质量百分比4.54％)。取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号g。
64.实施例8(对照组2)
65.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
66.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)5g，加纯水50ml溶解，采用氢氧化钠溶液(10％浓度)调节ph至12.0，再加入1.2ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，采用旋涡振荡器混合均匀。开启恒温水浴锅调节水浴温度至45℃，将上述凝胶置于水浴中，保温16h进行交联反应。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.2x0.2cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续洗脱10h，凝胶最终重量为96g，停止洗脱，共计时24h，重组iii型人源胶原蛋白终浓度为52mg/ml(质量百分比5.2％)。取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号h。
67.实施例9(对照组3)
68.配制洗脱液20l，配方如下：氯化钠0.78％，磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)0.0085％，磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)0.135％，备用。
69.称取重组iii型人源胶原蛋白原料(bss级)5g，加纯水50ml溶解，采用旋涡振荡器使重组iii型人源胶原蛋白溶液保持旋涡搅拌状态，将0.35ml的碳化二亚胺溶液(20％浓度)缓慢滴加至溶液内，目测约45s内，溶液由液体状变为固体凝胶，交联反应完成。将交联完成的凝胶取出，为淡黄色固体弹性凝胶，切块成0.2x0.2cm尺寸的立方体块状，加入3l的洗脱液，低速搅拌溶胀2h后，更换3l洗脱液，继续进行第2次洗脱12h，再次更换3l洗脱液，继续洗脱10h，凝胶最终重量为68g，停止洗脱，共计时24h，重组iii型人源胶原蛋白终浓度为73mg/ml(质量百分比7.3％)。取透析完的凝胶，采用40目筛网连续均质3次，制得颗粒直径为200～600μm凝胶。取凝胶100g，灌装于1.0ml的预灌封注射器中，采用121℃，10min的条件湿热灭菌，最终得重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，样品编号i。
70.将以上实施例所得成品送检，考察指标为推挤力(27g一次性无菌注射针头)，bdde残留，弹性模量(g’)，粘性模量(g”)，外观性状等指标，具体结果见表1、表2和图1.。图1是各个样品工艺过程溶胀速率的对比图。
71.表1工艺过程主要参数汇总
[0072][0073][0074]
表2主要检验指标汇总
[0075]
[0076]
由上表可得出结论，在整个交联反应体系中，过程是否有透明质酸钠参与，对后续洗脱工艺乃至最终重组iii型胶原含量指标有着非常显著的影响，透明质酸钠在整个过程中虽然参与进行了交联反应，但因其本身分子量较大，吸水性能非常优良，在洗脱过程中极大的提高了溶胀速率，并对交联剂的洗脱效果产生了直接而显著的影响。例如实施例9的胶含量为73mg/ml，说明其相较于实施例1-6溶胀困难，透析效率低，同时成本会很高；此外实施例9的推挤力是41，说明注射困难，不方便临床使用。同时也能看出，交联过程中交联剂的比例，交联反应温度，交联反应时间等参数，均对最终成品的指标有很大影响。单纯的重组iii型胶原交联后的产物粘弹性模量数据偏低，直接影响临床使用效果，临床应用必然会受到限制，而重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联工艺制备的凝胶，该项指标有极大提升，在软组织塑形填充方面具备显著的优势。
[0077]
综合各个指标评估，实施例4工艺为优选项，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

技术特征：
1.一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，其特征在于，具有如下步骤:1)将重组iii型胶原蛋白，加纯水溶解，调节ph值为弱碱性，加入交联剂，交联剂与重组iii型胶原蛋白的质量比为1:1.5～1:8，优选1:4，混合均匀；2)向步骤1)溶液中透明质酸钠，用量为重组iii型胶原蛋白质量的10-60％，优选30％，混匀溶解，得到重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠溶液；3)将所述重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠溶液置于30～50℃保温进行交联反应，得到固体状的弹性凝胶，并切成0.1～0.8cm尺寸的块状；4)向块状弹性凝胶中加入洗脱液，搅拌洗脱，之后滤去洗脱液，重复若干次，直至弹性凝胶溶胀至重组iii型胶原蛋白原料质量的18～70倍，优选40-64倍；5)将步骤4)所得溶胀后的弹性凝胶均质成直径为200～600μm的颗粒，即为重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶；6)灌装将步骤5)制备得到的交联重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠凝胶，灌装至1ml预灌封注射器内；7)灭菌将步骤6)灌装后的交联重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠凝胶，采用纯蒸汽湿热灭菌。2.如权利要求1所述的一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，重组iii型胶原蛋白原料为发酵法制备，分子量为30～120kd，优选55kd；所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜、聚乙二醇、京尼平、碳化二亚胺中的一种或任意两种以上的混合，优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚；所述弱碱性是指ph值为9.5～12.5，优选ph值为12.0。3.如权利要求1所述的一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，加纯水溶解后重组iii型胶原蛋白的浓度为50～300mg/ml，优选100mg/ml。4.如权利要求1所述的一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤2)中透明质酸钠的分子量为80～150万道尔顿；所述重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠溶液中透明质酸钠的浓度为20～100mg/ml，优选30mg/ml。5.如权利要求1所述的一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤3)中交联反应温度优选45℃，反应时间为8h～16h。6.如权利要求1所述的一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述洗脱液中，氯化钠的质量分数为0.6～0.9％，磷酸二氢钠质量分数为0.004％～0.01％，磷酸氢二钠质量分数为0.08％～0.15％；优选地，氯化钠质量分数为0.78％，磷酸二氢钠质量分数为0.0085％，磷酸氢二钠质量分数为0.135％。7.如权利要求1所述的一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，弹性凝胶切块尺寸优选为边长0.5～0.8cm的立方体；所述步骤4)中搅拌洗脱的重复次数为2-6次，总时长为18～24h。8.如权利要求1所述的一种重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，所述均质的次数为2～4次；所述均质是指过筛网，所述筛网优
选40目；步骤7)中，所述灭菌温度为115℃～125℃，灭菌时间为8～15min。9.一种根据权利要求1-9任一方法制备的重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶，其特征在于，最小单一包装的规格为1ml。10.一种根据权利要求9所述的重组iii型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶在制备软组织填充物中的用途，所述软组织包括但不限于鼻唇沟，颞部，苹果肌。

技术总结
本发明公开的一种重组III型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶的制备方法及应用。具体方法为：重组III型胶原蛋白原料溶解-透明质酸钠原料溶解-1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联-洗脱-溶胀-均质-灌装-湿热灭菌。本发明通过设计反应条件，在一定条件下，将重组III型胶原蛋白、透明质酸钠同时与BDDE产生交联反应，再通过洗脱-溶胀-均质-灌装灭菌工序，获得无菌的重组III型胶原蛋白-透明质酸钠双重交联凝胶。由于最终成品同时包含了交联的透明质酸钠和交联的重组III型胶原蛋白，在流变学、抗降解性能、临床效果比单一的组分具备更大的优势。临床效果比单一的组分具备更大的优势。临床效果比单一的组分具备更大的优势。


技术研发人员：李建勇 陈亮 陈晓超
受保护的技术使用者：浙江诺维芙生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/8/21