光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物及制备方法

1.本发明属于药物技术领域，具体涉及光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物及制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是全球第二大死因，严重威胁着人类的生命健康，临床常用的治疗方法如化疗，由于化疗药物选择性差，在杀死肿瘤细胞的同时，也会对人体正常细胞造成损害，因此往往会导致严重的副作用，不能达到理想的治疗效果。
3.新型活性氧相关的肿瘤治疗策略，如光动力学治疗，利用光敏剂在光照条件下产生能量或电子转移，产生高浓度活性氧破坏肿瘤氧化还原平衡，诱导肿瘤细胞氧化应激从而死亡，具有无创、低毒、高选择性等优点，成为肿瘤治疗领域的前沿进展。然而，肿瘤细胞内过表达的谷胱甘肽具有强还原性，会严重降低活性氧的效能，这导致单独使用光动力学治疗的效果始终不理想。
4.大量研究表明，肿瘤细胞内谷胱甘肽水平的降低可以使肿瘤细胞更易受到氧化应激和化疗药物的影响。因此，开发光触发活性氧增强的光动力-化疗联合治疗肿瘤的纳米药物，既能保留光动力学治疗高选择性的优势，同时又能实现化疗药物在肿瘤部位的特异性释放，降低化疗毒副作用，通过消耗还原型谷胱甘肽，增强活性氧介导的肿瘤治疗，协同增强光动力-化疗治疗效果，具有重要的研究意义。但目前尚未报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现存问题，提供光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物。
6.本发明的第二个目的是提供光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的制备方法。
7.本发明的第三个目的是提供光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.本发明的技术方案概述如下：
9.光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
10.1)将活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物溶解于第一种有机溶剂中，制成浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的溶液a；
11.2)将活性氧响应的两亲性聚合物前药溶解于第二种有机溶剂中，制成浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的溶液b；
12.3)按体积比1：0.5～1的比例，将溶液a和溶液b混合，得到溶液c，在超声波或搅拌下，按体积比1：2～5的比例，将溶液c滴加到去离子水中，通过透析除去有机溶剂，得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物；
13.所述活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物如式i所示：
[0014][0015]
其中：
[0016]
m1为1-5之间的整数；
[0017]
m2为1-5之间的整数；
[0018]
n1为2-20之间的整数；
[0019]
n2为10-60之间的整数；
[0020]
x1为o或nh；
[0021]
x2为o或nh；
[0022]
x3为o或nh；
[0023]
x4为o或nh；
[0024]
r1为重均分子量1000～10000的聚乙二醇单甲醚；r2为-h、-ch3或-ch2ch3；
[0025]
r3为-h、-ch3或-ch2ch3；
[0026]
r4为
[0027][0028]
所述活性氧响应的两亲性聚合物前药如式ⅱ所示：
[0029][0030]
其中：
[0031]
m3为1-5之间的整数；
[0032]
m4为1-5之间的整数；
[0033]
n3为6-60之间的整数；
[0034]
x5为o或nh；
[0035]
x6为o或nh；
[0036]
r5为重均分子量1000～10000的聚乙二醇单甲醚；
[0037]
r6为-h、-ch3或-ch2ch3；
[0038]
r7为
[0039][0040]
第一种有机溶剂优选为四氢呋喃、乙醇或n,n-二甲基甲酰胺。
[0041]
第二种有机溶剂优选为二甲基亚砜、四氢呋喃、乙醇和n,n-二甲基甲酰胺中至少两种。
[0042]
上述制备方法制备得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物。
[0043]
上述光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0044]
本发明的优点：
[0045]
实验证明，本发明的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物经光照射触发光敏剂产生活性氧，使缩硫酮键与苯硼酸酯键响应断裂，释放化疗药物的同时，产生醌甲基中间体消耗过表达的谷胱甘肽，减少活性氧损耗，协同增强光动力-化疗治疗效果。
附图说明
[0046]
图1为实施例1中所述的活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物的核磁共振氢谱。
[0047]
图2为实施例1中所述的活性氧响应的两亲性聚合物前药的核磁共振氢谱。
[0048]
图3为实施例1中所制备的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物透射电子显微镜图像。
[0049]
图4为实施例1中所制备的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物紫外光谱。
[0050]
图5为实施例6中光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物中不同激光照射时间下化疗药物释放率。
[0051]
图6为实施例7中为用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(dcfh-da)检测光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物在细胞内产生活性氧的荧光定量分析。
[0052]
图7为实施例8中为用谷胱甘肽检测试剂(thioltrace violet)检测光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物消耗细胞内谷胱甘肽的荧光定量分析。
[0053]
图8为实施例9中为用mtt法检测光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物处理后肿瘤细胞存活率情况分析。
具体实施方式
[0054]
本发明中涉及到的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物由活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物与活性氧响应的两亲性聚合物前药共组装得到。
[0055]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0056]
活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物如式ⅰ所示：
[0057][0058]
活性氧响应的两亲性聚合物前药如式ⅱ所示：
[0059][0060]
表1-1
[0061][0062]
表1-1中的ⅲ、ⅳ和v的结构如下：
[0063][0064]
表1-2
[0065]
[0066]
其中的ⅵ、ⅶ和
ⅷ
的结构如下：
[0067][0068]
表1-1和表1-2中的5000是指重均分子量5000的聚乙二醇单甲醚；其它如1000、2000、10000等同此解释。
[0069]
活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物是按常规手段制备。
[0070]
活性氧响应的两亲性聚合物前药是按常规手段制备。
[0071]
实施例1
[0072]
光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
[0073]
1)将活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物(式ⅰ，见图1)溶解于四氢呋喃中，制成浓度为0.75mg/ml的溶液a；
[0074]
2)将活性氧响应的两亲性聚合物前药(式ⅱ，见图2)溶解于二甲基亚砜与四氢呋喃按体积比1：5的比例组成的混合液中，制成浓度为0.5mg/ml的溶液b；
[0075]
3)按体积比1：1的比例，将溶液a与溶液b混合，得到溶液c，在搅拌下，按体积比1：2的比例，将溶液c滴加到去离子水中，通过透析除去四氢呋喃与二甲基亚砜，得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物。其形貌通过透射电镜图进行表征，见图3；通过紫外光谱进行表征，如图4所示，480纳米处出现化疗药物的紫外吸收特征峰，670纳米处出现光敏剂的紫外吸收特征峰。式i、式ii见表1-1和表1-2。
[0076]
实施例2
[0077]
光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
[0078]
1)将活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物(式ⅰ)溶解于四氢呋喃中，制成浓度为0.5mg/ml的溶液a；
[0079]
2)将活性氧响应的两亲性聚合物前药(式ⅱ)溶解于二甲基亚砜与四氢呋喃按体积比1：2的比例组成的混合液中，制成浓度为0.5mg/ml的溶液b；
[0080]
3)按体积比1：0.5的比例，将溶液a和溶液b混合，得到溶液c，在搅拌下，按体积比1：5的比例，将溶液c滴加到去离子水中，通过透析除去四氢呋喃与二甲基亚砜，得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物。式i式ii见表1-1和表1-2。
[0081]
实施例3
[0082]
光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
[0083]
1)将活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物ⅰ溶解于乙醇中，制成浓度为5mg/ml的溶液a；
[0084]
2)将活性氧响应的两亲性聚合物前药ⅱ溶解于二甲基亚砜与乙醇按体积比1：1的比例组成的混合液中，制成浓度为2mg/ml的溶液b；
[0085]
3)按体积比1：1的比例，将溶液a和溶液b混合，得到溶液c，在搅拌下，按体积比1：2的比例，将溶液c滴加到去离子水中，通过透析除去乙醇与二甲基亚砜，得到光触发活性氧
增强联合治疗肿瘤的纳米药物。式i、式ii见表1-1和表1-2。
[0086]
实施例4
[0087]
光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
[0088]
1)将活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物ⅰ溶解于四氢呋喃中，制成浓度为2.5mg/ml的溶液a；
[0089]
2)将活性氧响应的两亲性聚合物前药ⅱ溶解于二甲基亚砜与四氢呋喃按体积比1：10的比例组成的混合液中，制成浓度为1.5mg/ml的溶液b；
[0090]
3)按体积比1：0.5的比例，将溶液a和溶液b混合，得到溶液c，在搅拌下，按体积比1：5的比例，将溶液c滴加到去离子水中，通过透析除去四氢呋喃与二甲基亚砜，得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物。式i、式ii见表1-1和表1-2。
[0091]
实施例5
[0092]
光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
[0093]
1)将活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物ⅰ溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，制成浓度为1mg/ml的溶液a；
[0094]
2)将活性氧响应的两亲性聚合物前药ⅱ溶解于二甲基亚砜与n,n-二甲基甲酰胺按体积比1：1的比例组成的混合液中，制成浓度为5mg/ml的溶液b；
[0095]
3)按体积比1：1的比例，将溶液a和溶液b混合，得到溶液c，在超声波下，按体积比1：2的比例，将溶液c滴加到去离子水中，通过透析除去n,n-二甲基甲酰胺与二甲基亚砜，得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物。式i、式ii见表1-1和表1-2。
[0096]
实施例6
[0097]
药物释放实验：
[0098]
实验分为2组。
[0099]
第1组：取实施例1制备的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物2ml，以20mw/cm2的660纳米照射0分钟后转移至截留分子量为3500的透析袋中，将透析袋置于15ml ph＝6.5的pbs缓冲溶液中。透析体系在摇床中37℃，80转/分钟转速进行透析。在不同的时间点(0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时和48小时)，取1ml透析袋外的缓冲液进行定量分析，测定阿霉素ⅵ的浓度。然后计算药物释放量并绘制药物释放曲线。
[0100]
第2组：取实施例1制备的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物2ml，以20mw/cm2的660纳米照射20分钟后转移至截留分子量为3500的透析袋中，将透析袋置于15ml ph＝6.5的pbs缓冲溶液中。透析体系在摇床中37℃，80转/分钟转速进行透析。在不同的时间点(0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时和48小时)，取1ml透析袋外的缓冲液进行定量分析，测定阿霉素ⅵ的浓度。然后计算药物释放量并绘制药物释放曲线。
[0101]
如图5所示，实施例1制备的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物在酸性环境中(模拟肿瘤微环境)，经过激光照射20分钟后激活光敏剂(式ⅲ)产生单线态氧促进药物释放(第二组)，48小时内释放的药物近50％，而在未经激光照射条件下(第一组)，药物释放率小于15％。
[0102]
实施例7
[0103]
肿瘤细胞内活性氧产生的检测：
[0104]
实验分为2组。
[0105]
第1组：将4t1小鼠乳腺癌细胞(商品)按1
×
105每孔的密度接种到12孔板中，37℃孵育24小时待细胞完全贴壁后，更换不含有光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的新鲜完全培养基(完全培养基配方按rpmi-1640培养基、胎牛血清(fbs)和青/链霉素混合抗生素按照体积比90：10：1的比例混合配制)，37℃孵育6小时，弃去培养基，用pbs缓冲液(ph7.2-7.4，0.01m)洗涤细胞3次，去除洗涤液。每孔加入10微摩dcfh-da探针(商品)，每组用660纳米激光以100mw/cm2照射3分钟，37℃继续孵育30分钟，再次用pbs缓冲液(ph7.2-7.4，0.01m)洗涤3次，最后用荧光共聚焦显微镜成像(激发波长488纳米/发射波长525纳米)，并分析其荧光强度。
[0106]
第2组：将4t1小鼠乳腺癌细胞按1
×
105每孔的密度接种到12孔板中，37℃孵育24小时待细胞完全贴壁后，更换含有光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物(实施例1制备)的新鲜完全培养基(光敏剂(式ⅲ)浓度1.5μm，阿霉素(式ⅵ)浓度3μm)，37℃孵育6小时。弃培养基，用pbs缓冲液(ph7.2-7.4，0.01m)洗涤3次后，去除洗涤液，每孔加入10微摩dcfh-da探针，每组用660纳米激光以100mw/cm2照射3分钟，37℃继续孵育30分钟，再次用pbs缓冲液(ph7.2-7.4，0.01m)洗涤3次，最后用荧光共聚焦显微镜成像(激发波长488纳米/发射波长525纳米)，并分析其荧光强度。
[0107]
如图6所示，实施例1制备的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物处理组的绿色荧光强度远高于空白对照组(本实施例的第1组)，证实其诱导活性氧生成的能力强。
[0108]
实施例8
[0109]
肿瘤细胞内谷胱甘肽消耗的检测：
[0110]
实验分为2组。
[0111]
第1组：将4t1小鼠乳腺癌细胞按1
×
105每孔的密度接种到12孔板中，37℃孵育24小时待细胞完全贴壁后，更换不含有光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的新鲜完全培养基，37℃孵育6小时。每组用660纳米激光以100mw/cm2照射3分钟，37℃继续孵育20分钟，弃培养基，用完全培养基洗涤3次，更换含有thioltrace violet探针的完全培养基，37℃孵育30分钟后，用完全培养基洗涤3次，最后用荧光共聚焦显微镜成像(激发波长405纳米/发射波长525纳米)，并分析其荧光强度。
[0112]
第2组：将4t1小鼠乳腺癌细胞按1
×
105每孔的密度接种到12孔板中，37℃孵育24小时待细胞完全贴壁后，更换含有光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物(实施例1制备)的新鲜完全培养基(光敏剂(式ⅲ)浓度0.5μm，阿霉素(式ⅵ)浓度3μm)，37℃孵育6小时。每组用660纳米激光以100mw/cm2照射3分钟，37℃继续孵育20分钟，弃培养基，用完全培养基洗涤3次，更换含有thioltrace violet探针的完全培养基，37℃孵育30分钟后，用完全培养基洗涤3次，最后用荧光共聚焦显微镜成像(激发波长405纳米/发射波长525纳米)，并分析其荧光强度。
[0113]
如图7所示，光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物处理组的荧光强度明显低于空白对照组(本实施例的第1组)，谷胱甘肽消耗效果最强。
[0114]
实施例9
[0115]
光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物杀伤肿瘤细胞检测：
[0116]
实验分为2组。
[0117]
第1组：将4t1小鼠乳腺癌细胞按5000每孔的密度接种到96孔板中，37℃孵育24小
时待细胞完全贴壁后，更换不含有光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的新鲜完全培养基，37℃孵育6小时。每组用660纳米激光以100mw/cm2照射5分钟，37℃继续孵育48小时，向每孔加入10微升5mg/ml的甲基噻唑四氮唑(mtt)，继续培养4小时后移除上清液，加入150微升二甲基亚砜振荡15分钟，并在酶标仪中通过570纳米处的紫外吸收强度进行分析。
[0118]
第2组：将4t1小鼠乳腺癌细胞按5000每孔的密度接种到96孔板中，37℃孵育24小时待细胞完全贴壁后，更换含有光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物(实施例1制备)的新鲜完全培养基(光敏剂(式ⅲ)浓度0.1μm，阿霉素(式ⅵ)浓度0.5μm)，37℃孵育6小时。每组用660纳米激光以100mw/cm2照射5分钟，37℃继续孵育48小时，向每孔加入10微升5mg/ml的甲基噻唑四氮唑(mtt)，继续培养4小时后移除上清液，加入150微升二甲基亚砜振荡15分钟，并在酶标仪中通过570纳米处的紫外吸收强度进行分析。
[0119]
如图8所示，光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物处理组的细胞存活率明显低于空白对照组(本实施例的第1组)，证明光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物能够有效抗肿瘤。
[0120]
实验证明，实施例2-5所制备的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物其活性氧响应药物释放率、在细胞内产生活性氧以及消耗细胞内谷胱甘肽的效果与实施例1制备的一种光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物相似。
[0121]
本发明的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物经光照射触发光敏剂产生活性氧，使缩硫酮键与苯硼酸酯键响应断裂，释放化疗药物的同时，产生醌甲基中间体消耗过表达的谷胱甘肽，减少活性氧损耗，协同增强光动力-化疗治疗效果。

技术特征：
1.光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物的制备方法，其特征是包括如下步骤：1)将活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物溶解于第一种有机溶剂中，制成浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的溶液a；2)将活性氧响应的两亲性聚合物前药溶解于第二种有机溶剂中，制成浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的溶液b；3)按体积比1：0.5～1的比例，将溶液a和溶液b混合，得到溶液c，在超声波或搅拌下，按体积比1：2～5的比例，将溶液c滴加到去离子水中，通过透析除去有机溶剂，得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物；所述活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物如式(i)所示：其中：m1为1-5之间的整数；m2为1-5之间的整数；n1为2-20之间的整数；n2为10-60之间的整数；x1为o或nh；x2为o或nh；x3为o或nh；x4为o或nh；r1为重均分子量1000～10000的聚乙二醇单甲醚；r2为-h、-ch3或-ch2ch3；r3为-h、-ch3或-ch2ch3；r4为
所述活性氧响应的两亲性聚合物前药如式(ⅱ)所示：其中：m3为1-5之间的整数；m4为1-5之间的整数；n3为6-60之间的整数；x5为o或nh；x6为o或nh；r5为重均分子量1000～10000的聚乙二醇单甲醚；r6为-h、-ch3或-ch2ch3；r7为2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述第一种有机溶剂为四氢呋喃、乙醇或n,n-二甲基甲酰胺。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述第二种有机溶剂为二甲基亚砜、四氢呋喃、乙醇和n,n-二甲基甲酰胺中至少两种。4.权利要求1-3之一的制备方法制备得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物。
5.权利要求4的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明公开了光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物及制备方法，制备步骤为：将活性氧响应的光敏剂偶联的高分子聚合物溶解于第一种有机溶剂中，制成溶液A；将活性氧响应的两亲性聚合物前药溶解于第二种有机溶剂中，制成溶液B；将溶液A和溶液B混合，得到溶液C，在超声波或搅拌下，将溶液C滴加到去离子水中，通过透析除去有机溶剂，得到光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物；本发明的光触发活性氧增强联合治疗肿瘤的纳米药物经光照射触发光敏剂产生活性氧，使缩硫酮键与苯硼酸酯键响应断裂，释放化疗药物的同时，产生醌甲基中间体消耗过表达的谷胱甘肽，减少活性氧损耗，协同增强光动力-化疗治疗效果。化疗治疗效果。化疗治疗效果。


技术研发人员：王生 张鑫璐 张旭 陈姝彤
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/8/21