一种HILIC-MS/MS同时测定糖和糖醇的方法与流程

一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法
技术领域
1.本发明属于分析化学及生物科学领域，具体涉及一种基于hilic-ms/ms对17种糖和糖醇类物质进行定性和定量分析的方法，并最终将之应用于果汁类样品中该类物质的分析。


背景技术：

2.糖和糖醇是水果果实生长发育过程中的重要物质，其含量影响果实的甜味口感，而且是评价水果品质的参考值，其中最主要的可溶性糖是果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，也含有少量的麦芽糖、阿拉伯糖等。不同水果中所含的糖的种类不同，不同种类糖分的相对比例也会影响水果整体的甜度。作为植物品质的重要组成部分，可溶性糖和糖醇的含量和甜度值是评价水果品质的重要因素，因此，建立果汁样品中多种糖和糖醇同时测定的方法，对评价果汁类样品的品质和食品安全质量控制具有重要意义。已有的方法(包括液质联用方法)中尚无一种针对多种糖和糖醇类物质的简便通用的分析方法。
3.本发明尝试同时检测多种糖和糖醇物质，最终列出二级质谱的色谱图及标准曲线分别用于定性及定量研究，其分析结果经过统计学分析，找出待分析物质与果汁的甜度值存在的关系，证实了果汁样品的甜味物质基础。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对果汁样品中常见的17种糖和糖醇类物质(果糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖和鼠李糖，山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、核糖醇、半乳糖醇、肌醇和麦芽糖醇)提供一种简便、快捷和准确的定性、定量分析方法，具体是提供一种hilic-ms/ms同时测定17种糖和糖醇的方法，并将其应用于果汁样品中糖和糖醇类物质的定性定量分析，最终结果通过统计分析后，确定该类物质与样品的甜度值之间的关系。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种hilic-ms/ms(亲水作用液相色谱-串联质谱)同时测定糖和糖醇的方法，其特点在于：将待测样品预处理后，进行hilic-ms/ms分析，获得待测样品中每种糖和糖醇各自的二级质谱的色谱峰面积，并根据各糖或糖醇的浓度与色谱峰面积的标准关系曲线，确定待测样品中每种糖和糖醇的浓度。所述糖包括果糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖和鼠李糖，所述糖醇包括山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、核糖醇、半乳糖醇、肌醇和麦芽糖醇，所有物质均在25分钟内出峰完全。
7.进一步地，所述预处理的方法为：取待测样品1.0g，用超纯水定容至40ml，室温超声提取10min，5000rpm离心10min；取离心后上清液1ml注入氨基spe小柱(500mg
×
3ml)(预先依次用5ml甲醇及5ml超纯水平衡)净化，用水洗脱，所得洗脱液再过0.22μm水相滤膜，收集5ml滤液并加超纯水定容至10ml，获得样品进样液。
8.进一步地，所述标准关系曲线的确定方法为：以超纯水为溶剂，将10种糖和7种糖
醇组成的混合标准品通过梯度稀释配制成一系列标准工作溶液；对系列标准工作溶液依次进行uplc-ms/ms分析，然后以各糖或糖醇的色谱峰面积为纵坐标、以各糖或糖醇的浓度为横坐标，绘制每一种糖及糖醇的标准关系曲线。
9.进一步地，所述hilic-ms/ms分析的条件为：
10.(1)超高效液相色谱流动相：a：0.1％氨水乙腈溶液，b：0.1％氨水溶液；梯度洗脱；
11.(2)色谱柱为亲水型acquityuplc beh酰胺柱，其尺寸为150mm
×
3.0mm，填料粒度1.7μm，进样体积5μl，柱温35℃，流速为0.5ml/min；
12.(3)质谱阴离子模式条件：氮气做干燥气，氮气温度350℃，流速10l/min，雾化器压力40psi；毛细管电压：阴离子4500v，cav 7v；动态mrm模式检测，质量采集范围：阴离子模式0.05-1kd。
13.更进一步地，所述梯度洗脱的程序为：
14.0-14min：87％a相；
15.14-24min：87％a-60％a；
16.24-30min：60％a；
17.30-31min：60％a-87％a；
18.31-40min：87％a。
19.进一步地，所述待测样品可为果汁类样品。所述果汁类样品包括天然果汁和果汁香精。根据待测样品中每种糖和糖醇的浓度，按照甜度值公式(以蔗糖甜度值为基准1.00，查阅文献得出其他物质甜度值，如果糖1.75、葡萄糖0.7等，甜度值＝果糖含量*1.75+蔗糖含量*1+葡萄糖含量*0.7+
……
+糖醇含量*对应甜度值)，计算获得待测样品的甜度值。将分析结果进行统计学分析，可找出待分析物质与果汁的甜度值存在的相关性关系。
20.本发明的有益效果体现在：
21.1.本发明使用hilic-ms/ms色谱仪，采用外标法校准曲线，并基于响应面设计优化了待测样品的提取和净化条件，消除了质谱离子化过程中因基质效应给目标物定量产生的影响，能够同时测定果汁等样品中的10种可溶性糖与7种糖醇，具有结果准确、干扰少、灵敏度高及重复性好等优点。
22.2.本发明的方法所需流动相配比简单易得、成本低、性质稳定，在所建立梯度下所有目标物质均在25min内出峰，且响应信号明显，不同物质峰互不影响，即分离效率和分离速度都满足分析要求。
23.3.本发明的该方法用于果汁类样品中糖和糖醇的定性、定量分析，考察果汁样品中糖和糖醇类物质的含量与样品甜度值的关系，为食品的品控和口味物质研究提供依据。
附图说明
24.图1为17种糖和糖醇混合标准品溶液的tic模式下uplc-ms色谱图。
25.图2为17种糖和糖醇混合标准品溶液的mrm模式下uplc-ms/ms色谱图。
26.图3为nfc苹果汁样品的mrm模式下uplc-ms/ms色谱图。
27.图4为菠萝蜜香精样品的mrm模式下uplc-ms/ms色谱图。
28.图5为果汁样品的糖和糖醇类物质含量与甜度值的相关性分析图。
29.图中峰编号分别代表以下物质：1.鼠李糖；2.核糖；3.赤藓糖醇；4.木糖；5.阿拉伯
糖；6.核糖醇；7.木糖醇；8.果糖；9.甘露糖；10.山梨醇；11.葡萄糖；12.半乳糖醇；13.蔗糖；14.肌醇；15.麦芽糖醇；16.麦芽糖；17.棉子糖。
具体实施方式
30.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
31.实施例1
32.本实施例提供一种hilic-ms/ms同时测定测17种糖和糖醇的方法，包括以下步骤：
33.一、实验部分
34.1.试剂与仪器
35.糖和糖醇类混标(果糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、鼠李糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、核糖醇、半乳糖醇、肌醇和麦芽糖醇)；甲醇；乙腈；超纯水；氨水。
36.液相色谱仪：agilent 1290infinityⅱ超高效液相色谱仪(美国agilent公司)，配二元泵、自动进样器、柱温箱；agilent 6460三重四极杆质谱仪，esi离子源；色谱柱为acquityuplc beh酰胺柱，其尺寸为150mm
×
3.0mm，填料粒度1.7μm；电子天平；超声仪；离心机。
37.2.液相色谱-质谱条件：
38.流动相：a：0.1％氨水乙腈溶液，b：0.1％氨水溶液。梯度洗脱：0-14min：87％a相；14-24min：87％a-60％a；24-30min：60％a；30-31min：60％a-87％a；31-40min：87％a。色谱柱为acquity uplc beh amide柱，其尺寸为150mm
×
3.0mm，填料粒度1.7μm，进样体积5μl，柱温35℃，流速为0.5ml/min。
39.质谱阴离子模式条件：氮气做干燥气，氮气温度350℃，流速10l/min，雾化器压力40psi；毛细管电压：阴离子4500v，cav 7v；质量采集范围：阴离子模式0.05-1kd。
40.3.定性分析
41.将17种糖和糖醇混合标准品依次稀释配制成六种浓度的标准工作溶液，所有物质的浓度(μg/ml)见表1。选取高浓度(浓度5)混标溶液进行hilic-ms/ms分析，进行峰识别并导出二级质谱的色谱图。
42.表1
[0043][0044]
4.稳定性考察
[0045]
取在4℃条件下存储的混标溶液(浓度3)放置0、4、12、24h，分别进样进行uplc-ms/ms分析，根据同一物质不同时间点的峰面积变化考察所建立方法的稳定性。
[0046]
5.精密度考察
[0047]
取中间浓度混标溶液(浓度3)连续进样三次，进行hilic-ms/ms分析，根据同一物质的峰面积变化考察所建立方法的精密度。
[0048]
6.检测限考察
[0049]
将混标溶液进一步稀释，并对稀释液进行hilic-ms/ms分析，由信噪比3:1和10:1分别确定各物质的定量限和检测限。
[0050]
7.定量分析
[0051]
将6个不同浓度的标准溶液依次进行hilic-ms/ms分析，以hilic-ms/ms色谱峰面积为纵坐标，每种物质的浓度为横坐标绘制标准曲线。
[0052]
8.果汁样本检测应用
[0053]
天然果汁来自当地超市购买的农夫山泉nfc橙汁、农夫山泉nfc苹果汁、汇源橙汁、汇源葡萄汁、汇源苹果汁、汇源番茄汁、味全橙汁、如果葡萄汁、杜氏樱桃番茄汁、杜氏黄番茄汁10种。浓缩果汁香精样品取自安徽中烟技术中心，由广东省茂名市德威圣科技有限责任公司生产。
[0054]
对各待测果汁样品进行定性定量分析：将待测果汁样品预处理后，进行hilic-ms/
ms分析，获得待测果汁样品中每种糖和糖醇各自的质谱峰面积，并根据各糖或糖醇的浓度与质谱峰面积的标准关系曲线，确定待测果汁样品中每种糖和糖醇的浓度。预处理的方法为：取待测样品1.0g，用超纯水定容至40ml，室温超声提取10min，5000rpm离心10min；取离心后上清液1ml注入氨基spe小柱(500mg
×
3ml)(预先依次用5ml甲醇及5ml超纯水平衡)净化，用水洗脱，所得洗脱液再过0.22μm水相滤膜，收集5ml滤液并加超纯水定容至10ml，获得样品进样液。
[0055]
二、实验结果
[0056]
1.分离结果
[0057]
本法分析速度快，所分析17种物质样品峰相互不受影响。
[0058]
2.检测结果
[0059]
1)17种物质的精密度、稳定性结果(以rsd％)如表2所示。
[0060]
表2
[0061][0062]
[0063]
2)17种物质的标准曲线及检测限如表3所示。
[0064]
表3
[0065][0066][0067]
3.果汁样品检测应用
[0068]
按照上述处理方法和分析方法测定了10种天然果汁样品和16种果汁香精样品中的糖和糖醇类物质的含量，结果分别如表4和表5(部分样品)所示。
[0069]
表4(μg/g)
[0070][0071]
表5(μg/g)
[0072]
[0073][0074]
将分析结果经过统计学分析，得出待分析物质与甜度值的关系，如表6和表7所示。
[0075]
表6天然果汁样品中糖和糖醇与甜度值之间的相关性分析
[0076][0077]
表7果汁香精样品中糖和糖醇与甜度值之间的相关性分析
[0078][0079]
从相关性分析得出，糖和糖醇总量及可溶性糖的含量与甜度值具有高度相关性，而糖醇的含量与甜度值相关性低，这一方面是由于果汁样品中三种主要可溶性糖(果糖、葡萄糖和蔗糖)含量较高，另一方面是三种主要可溶性糖的甜度值系数要显著高于糖醇类。
[0080]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精
神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于：将待测样品预处理后，进行hilic-ms/ms分析，获得待测样品中每种糖和糖醇各自的质谱峰面积，并根据各糖或糖醇的浓度与色谱峰面积的标准关系曲线，确定待测样品中每种糖和糖醇的浓度。2.根据权利要求1所述的一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于：所述糖包括果糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖和鼠李糖，所述糖醇包括山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、核糖醇、半乳糖醇、肌醇和麦芽糖醇。3.根据权利要求1所述的一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于，所述预处理的方法为：取待测样品1.0g，用超纯水定容至40ml，室温超声提取10min，5000rpm离心10min；取离心后上清液1ml注入氨基spe小柱净化，用水洗脱，所得洗脱液再过0.22μm水相滤膜，收集5ml滤液并加超纯水定容至10ml，获得样品进样液。4.根据权利要求2所述的一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于：所述标准关系曲线的确定方法为：以超纯水为溶剂，将10种糖和7种糖醇组成的混合标准品通过梯度稀释配制成一系列标准工作溶液；对系列标准工作溶液依次进行hilic-ms/ms分析，然后以各糖或糖醇的色谱峰面积为纵坐标、以各糖或糖醇的浓度为横坐标，绘制每一种糖及糖醇的标准关系曲线。5.根据权利要求1或4所述的一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于，所述uplc-ms/ms分析的条件为：(1)超高效液相色谱流动相：a：0.1％氨水乙腈溶液，b：0.1％氨水溶液；梯度洗脱；(2)色谱柱为亲水型acquityuplcbeh酰胺柱，其尺寸为150mm
×
3.0mm，填料粒度1.7μm，进样体积5μl，柱温35℃，流速为0.5ml/min；(3)质谱阴离子模式条件：氮气做干燥气，氮气温度350℃，流速10l/min，雾化器压力40psi；毛细管电压：阴离子4500v，cav7v；动态mrm模式检测，质量采集范围：阴离子模式0.05-1kd。6.根据权利要求5所述的一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：0-14min：87％a相；14-24min：87％a-60％a；24-30min：60％a；30-31min：60％a-87％a；31-40min：87％a。7.根据权利要求1所述的一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于：所述待测样品可为果汁类样品。8.根据权利要求7所述的一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于：所述果汁类样品包括天然果汁和果汁香精。9.根据权利要求1或7所述的一种hilic-ms/ms同时测定糖和糖醇的方法，其特征在于：根据待测样品中每种糖和糖醇的浓度，按照甜度值公式，计算获得待测样品的甜度值。

技术总结
本发明公开了一种HILIC-MS/MS同时测定糖和糖醇的方法，是将待测样品预处理后，进行HILIC-MS/MS分析，获得待测样品中每种糖和糖醇各自的二级质谱的色谱峰面积，并根据各糖或糖醇的浓度与质谱峰面积的标准关系曲线，确定待测样品中每种糖和糖醇的浓度。本发明使用亲水作用色谱柱ACQUITYUPLCBEH分离，串联质谱检测，采用外标法校准曲线，并基于响应面设计优化了待测样品的提取和净化条件，消除了质谱离子化过程中因基质效应给目标物定量产生的影响，能够同时测定果汁等样品中的10种可溶性糖与7种糖醇，具有结果准确、干扰少、灵敏度高及重复性好等优点。重复性好等优点。


技术研发人员：宁勇 朱晓兰 贺增洋 徐志强 邵宁 李玉秀
受保护的技术使用者：安徽中烟工业有限责任公司
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/8/21