一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法及延长产蛋期的方法

1.本发明涉及家禽饲养技术领域，尤其是涉及一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法及延长产蛋期的方法。


背景技术：

2.随着家禽业集约化程度的提高，养殖环境与动物生物学特性背离的增加，以及各种环境应激造成的机体与组织活性氧(ros)的增加，使机体产生氧化应激反应，最终会导致家禽的生产性能下降。
3.蛋鸡的产蛋性能主要取决于卵巢中生殖细胞以及卵泡的生长发育水平，而卵泡内数量、比重以及功能最多的细胞是颗粒细胞，其增殖分化和凋亡主导卵泡的发育，决定卵泡的闭锁，闭锁卵泡的数量直接影响产蛋率的高低。目前，有关蛋鸡的卵巢氧化应激的研究其系统性、探究的机理性并不完善，多数研究只针对如何建立体内氧化应激模型或体外氧化应激模型进行研究，研究方面单一，并未对引起蛋鸡氧化应激的机制作出解释，也未给出如何缓解蛋鸡卵巢的氧化应激，即当前建立蛋鸡卵巢氧化应激模型与缓解氧化应激均为单独的研究，二者并没有很好的结合起来。有研究对褪黑素缓解氧化应激作出了研究，但是并未解释褪黑素如何缓解蛋鸡卵巢氧化应激。因此，为了探究氧化应激造成蛋鸡卵巢功能损伤从而降低产蛋期的机制，以及褪黑素缓解蛋鸡卵巢氧化应激从而延长产蛋期的机制，亟需一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法及延长产蛋期的方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法及延长产蛋期的方法，能够探究蛋鸡卵巢衰老的原因，通过褪黑素延长蛋鸡的产蛋期，并在基因水平上做出解释。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法，包括体内氧化应激模型的建立和体外氧化应激模型的建立。
6.优选的，所述体内氧化应激模型的建立，包括以下步骤：选取高产期蛋鸡，连续注射地塞米松15d，剂量为20mg/kg，后15d注射等量生理盐水；进行预实验7d，试验期30d，饲粮为玉米-豆粕型基础饲粮；
7.所述预实验和试验期温度均为21-25℃，相对湿度为55-75％，光照条件为16l：8d，试验期间所有蛋鸡自由采食、自由饮水。
8.优选的，所述饲粮包括以下质量份的原料组成：玉米62份，豆粕24份，大豆油1份，鱼粉2份，磷酸氢钙1份，石粉9份，氯化钠0.32份，蛋氨酸0.12份，苏氨酸0.1份，氯化胆碱0.1份，预混料0.3份，植酸酶0.02份，赖氨酸0.04份。
9.优选的，所述体外氧化应激模型的建立，包括以下步骤：分离培养蛋鸡卵巢原代颗粒细胞，接种于培养板，采用50umol/l的h2o2处理卵巢原代颗粒细胞6h。
10.本发明还提供了一种蛋鸡卵巢氧化应激延长产蛋期的方法，在建立上述的体内氧化应激模型的同时，选取相同数量的高产期蛋鸡，连续注射地塞米松15天，剂量为20mg/kg，
后15天注射等量褪黑素；进行预实验7d，试验期30d，饲量为基础日粮；通过生产性能、蛋品质、血液指标、不同发育阶段卵泡数量、细胞凋亡相关基因、抗氧化基因、foxo1表达、卵巢bcl-2、sod1、foxo1蛋白表达趋势对产蛋期进行检测；
11.优选的，所述生产性能包括每天产蛋总数、总蛋重、每周饲粮消耗量、平均蛋重、产蛋率、平均日采食量、料蛋比；
12.优选的，所述蛋品质包括蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度；
13.优选的，所述血液指标包括血液中丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、氧自由基、8-羟基脱氧鸟苷和褪黑素的含量。
14.本发明还提供了一种蛋鸡卵巢氧化应激延长产蛋期的检测方法，在建立上述的体外氧化应激模型后，添加100umol/l的褪黑素处理24h，通过细胞增值情况、细胞凋亡率、细胞ros水平、foxo1与抗氧化基因的结合活性、qrt-pcr、蛋白的表达水平情况对产蛋期进行检测
15.因此，本发明采用上述一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法及延长产蛋期的方法，其技术效果：建立了体内氧化应激模型和体外氧化应激模型，并通过褪黑素进行缓解，在体内氧化应激和体外氧化应激两个方面均具有有效效果，并明确了褪黑素缓解卵巢氧化应激的机理，能够有效延长蛋鸡的产蛋期。
16.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
17.图1为褪黑素对地塞米松氧化应激模型蛋鸡氧化应激相关指标的影响；
18.图2为褪黑素对地塞米松氧化应激模型蛋鸡氧化应激相关指标的影响；
19.图3为褪黑素对地塞米松氧化应激模型蛋鸡卵巢卵泡数量的影响；
20.图4为褪黑素对地塞米松氧化应激模型中蛋鸡bcl-2、caspase-3、bim和bax凋亡相关基因的影响；
21.图5为褪黑素对地塞米松氧化应激模型中蛋鸡抗氧化应激相关基因cat、sod1、gpx3和prdx3的影响；
22.图6为褪黑素对地塞米松诱导的氧化应激下蛋鸡foxo1表达的影响；
23.图7为褪黑素对地塞米松诱导的氧化应激下蛋鸡卵巢bcl-2、sod1、foxo1蛋白的影响；
24.图8为不同浓度h2o2及不同时间处理对颗粒细胞增殖的影响；
25.图9为不同浓度h2o2及不同时间处理对颗粒细胞ros的影响；
26.图10为不同浓度h2o2及不同时间处理对颗粒细胞sod的影响；
27.图11为不同浓度h2o2及不同时间处理对颗粒细胞mda的影响；
28.图12为不同浓度h2o2及不同时间处理对颗粒细胞cat的影响；
29.图13为褪黑素通过foxo1信号通路对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞增殖的影响；
30.图14为褪黑素通过foxo1信号通路对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞凋亡的影响；
31.图15为褪黑素通过foxo1信号通路对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞ros的影响；
32.图16为褪黑素对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞foxo1免疫荧光的影响；
33.图17为褪黑素对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞抗氧化相关基因的影响；
34.图18为褪黑素对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞凋亡相关基因的影响；
35.图19为褪黑对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞foxo1基因表达的影响；
36.图20为褪黑对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白的影响；
37.图21为chip染色质免疫共沉淀技术：检测foxo1与抗氧化基因的结合活性。
具体实施方式
38.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
39.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
40.实施例一
41.体内氧化应激模型
42.选取40周龄蛋鸡360只，分为3个组，每组8个重复，每重复15只。对照组不作注射处理(ns)；试验ⅱ组连续注射地塞米松15天，剂量为20mg/kg后15天注射等量生理盐水(dex+ns)；试验ⅲ组连续注射地塞米松15天，剂量为20mg/kg，后15天注射褪黑素(dex+tel)。所有注射处理都在每天同一时间(16：00小时)进行。预实验期7天，试验期30天。控制温度条件为21-25℃，相对湿度为55-75％，严格控制光照条件为16l：8d，试验期间自由采食，自由饮水。基础日粮和化学组成如表1所示。试验结束后，屠宰取出部分卵巢组织在体视镜下分离等级卵泡，分离不同等级的卵泡。剩余卵巢一部分制作组织切片进行卵泡计数，另一部分立即放入液氮中进行速冻后转入-80℃冰箱，进行后续测定。
43.表和图中的实验数据以平均值
±
标准差表示。使用单因素方差分析对各组(ns、dex+ns和dex+mel)之间的差异进行统计分析，然后使用ibm spss21.0进行邓肯多重比较检验。使用独立样本t检验来比较d15和d30不同时间的血液指标。a/b，*，p《0.05表示有显著性。a/b，**，p＜0.01表示极显著性。
44.表1基础日粮组成和营养成分
45.组分含量(％)营养水平c)含量(％)玉米62.00me/(mj/kg)11.44豆粕24.00cp17.00大豆油1.00ca3.57鱼粉2.00tp0.54磷酸氢钙1.00ap0.34石粉9.00lys0.90氯化钠0.32met0.41蛋氨酸0.12
ꢀꢀ
苏氨酸0.10
ꢀꢀ
氯化胆碱0.10
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预混料0.30
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植酸酶0.02
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赖氨酸0.04
ꢀꢀ
总计100.00
ꢀꢀ
46.注：预混料提供：va10000 iu，vd3000 iu、ve29 mg、vb13 mg、vb28 mg、vb66 mg、vb1230 ug、烟酸50mg、叶酸1.5mg、铜12.5mg、铁90mg、锌82.8mg、锰95.4mg、碘0.19mg/千克饲料；营养水平是计算值。
47.(1)生产性能
48.测定在相同管理条件下，以重复为单位，记录每天产蛋总数和总蛋重；每周测定饲粮消耗量；计算平均蛋重、产蛋率、平均日采食量、料蛋比。
49.褪黑素对地塞米松诱导的氧化应激下蛋鸡生产性能的影响如表2所示。第15天，地塞米松注射后产蛋率显著降低(p《0.05)，但褪黑素治疗后，dex+mel组的产蛋率显著高于dex+ns组(p《0.05)。dex+mel组的平均日采食量(adfi)与ns组和dex+ns组相比显著增加(p《0.05)；第30天，dex+mel组的产蛋率显著逆转，显著高于ns组和dex+ns组(p《0.05)。
50.表2褪黑素对地塞米松氧化应激模型蛋鸡生产性能的影响
[0051][0052]
(2)蛋品质
[0053]
每天于下午16：00记录产蛋个数并每组收集10枚鸡蛋用于蛋品质测定。
[0054]
蛋形指数：利用蛋形指数测定仪(orka，nfn385)进行测定，测量鸡蛋最大纵径和横径，选取mm做单位。
[0055]
蛋壳强度：采用蛋壳强度分析仪(orka，efr-01)进行测定，将鸡蛋钝端向上，锐端朝下放到蛋壳强度测定仪上，探头向下移动，当蛋壳发出第一道裂纹时即为蛋壳的强度。压缩速度为10mm/min。
[0056]
蛋壳厚度：采用游标卡尺进行测定，剥离蛋壳膜后，取钝端，锐端，中间部位3点进行测定，取平均值，选取mm做单位。
[0057]
褪黑素对地塞米松诱导的氧化应激下蛋鸡蛋品质的影响如表3所示。dex+ns组和dex+mel组对母鸡产蛋质量无影响(p＞0.05)。
[0058]
表3褪黑素对地塞米松氧化应激模型蛋鸡蛋品质的影响
[0059][0060]
(3)血液指标
[0061]
在第15天和第30天，每组随机取10只鸡进行翅下静脉采血，3000r/min离心15min，将分离的血浆储存在-20℃下，用于后续研究。按照试剂盒说明书进行操作，检测血液中丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、过氧化氢酶(cat)、氧自由基(ros)、8-羟基脱氧鸟苷(8-ohdg)和褪黑素(mel)的变化。
[0062]
褪黑素对地塞米松诱导的蛋鸡氧化应激相关指标的影响如图1和图2所示。图1显示，在第15天，dex+ns和dex+mel组的sod、gsh-px和cat水平比ns组显著降低(p《0.01)，而在第30天，补充褪黑素后，dex+mel组sod、gsh px和cat水平比不补充褪黑素的dex+ns组显著升高(p《0.01)，dex+ns和dex+mel组在第15天的mda水平显著高于ns组(p《0.01)，而在第30天，其水平高于ns组和dex+tel组(p《0.01)。
[0063]
图2显示，第15天，dex+ns和dex+mel组的褪黑素水平与ns组相比极为降低(p《0.01)，而第30天，dex+ns组的褪黑激素水平与其他两组相比显著降低(p《0.01，而dex+ns组在第30天的水平明显高于ns组和dex+mel组(p《0.01)。
[0064]
(4)不同发育阶段卵泡数量的统计
[0065]
在第30天，每组随机抽取10只鸡，每个重复随机取5只鸡进行解剖，打开蛋鸡腹腔，无菌条件下取出整个卵巢，使用游标卡尺(mitutoyo，410300，japan)测量卵泡直径进行分类，分类标准：排卵前卵泡(pf＞10mm)，黄色小卵泡(syf，8-10mm)，白色大卵泡(lwf，6-8mm)，中白卵泡(mwf，4-6mm)，小白卵泡(swf，2-4毫米)，初级卵泡(pe＜2mm)。根据卵泡直径进行计数后，分别放入盛有高压灭菌过的生理盐水的平皿中。用无菌眼科镊子简单剥离卵泡上的系膜，然后刺破卵泡，冲出卵黄，用镊子夹住颗粒细胞层在pbs水中轻轻晃动冲洗干净，完整的颗粒层就能分离下来。分别分离不同等级的卵泡颗粒层，然后将样品放入液氮中预冻后置于-80℃冰箱保存。
[0066]
褪黑素对地塞米松诱导的氧化应激下蛋鸡卵巢卵泡数量的影响如图3所示。图3显示，在第15天，dex+ns和dex+mel组的卵泡数量极为少于ns组，而在第30天，补充注射褪黑素后，dex+tel组的卵泡数与未补充褪黑素的dex+ns组相比显著增加(p＞0.05)。
[0067]
(5)rna提取和实时定量pcr
[0068]
表4引物列表
[0069][0070][0071]
褪黑素对地塞米松诱导的氧化应激下蛋鸡细胞凋亡相关基因的影响如图4所示。图4显示了褪黑素对地塞米松氧化应激下蛋鸡bcl-2、caspase-3、bim和bax凋亡基因的影响。结果显示，在pe、swf、mwf、syf和卵巢中，dex+mel组的bcl-2水平高于ns组(p《0.01)，lwf和pf组(p《0.05)。而在dex+ns组中，swf、mw、syf及卵巢中bcl-2的表达显著低于dex+mel组(p《0.01)、lwf及pf组(p《0.05)，dex+ns和dex+mel组的胱天蛋白酶-3的表达水平显著高于ns组(p《0.01)。而在swf、mwf、lwf、syf和卵巢中，dex+mel组的半胱氨酸蛋白酶-3表达水平比dex+ns组极为降低(p《0.01)，dex+ns组bim的表达水平高于ns组(p《0.01)，而dex+mel组bim表达水平与ns组相比显著降低(p《0.01)，dex+mel组的卵巢比ns组明显减少(p《0.01)，而dex+ns组的卵巢明显增强(p《0.01)。与dex+ns和mel+ns组相比，pe、swf、mwf、lwf中bax基因的表达显著降低，蛋白质分析显示，bcl-2的蛋白质表达率随着mrna的表达而下降(图7)。这些结果表明褪黑素可以抑制地塞米松引起的细胞凋亡。
[0072]
褪黑素对地塞米松诱导的氧化应激下蛋鸡抗氧化应激相关基因的影响如图5所示。图5显示了褪黑素对蛋鸡地塞米松氧化应激模型中cat、sod1、gpx3和prdx3抗氧化应激相关基因的影响，表明地塞米松治疗抑制了这些基因的表达(p《0.05)，而褪黑素处理在不同程度上增强了它们的表达(p《0.05)。蛋白质分析表明，sod1比例的蛋白质表达随着mrna的表达而下降(图7)。这表明褪黑素可以恢复地塞米松引起的氧化应激。
[0073]
图6显示了褪黑素对地塞米松诱导的氧化应激下蛋鸡foxo1表达的影响。这表明，在swf、mwf、lwf、syf和卵巢中，与ns组相比，地塞米松治疗增加了foxo1基因的表达(p《0.01)，而褪黑素治疗抑制了其表达(p《0.01)，从而通过褪黑素治疗抵抗地塞米松诱导的氧化应激。
[0074]
由图7可知，蛋白表达趋势与mrna表达趋势一致。
[0075]
实施例二
[0076]
体外氧化应激模型
[0077]
分离培养蛋鸡卵巢原代颗粒细胞，以1
×
105个/ml接种于培养板，采用不同浓度的h2o2(0umol/l、12.5umol/l、25umol/l、50umol/l、100umol/l、200umol/l)以及不同时间点(3h、6h、9h)处理颗粒细胞，观察其对细胞活力、ros和抗氧化指标的影响，筛选确定最佳处理浓度和处理时间，建立氧化应激模型。随后正式试验分为4组，对照组(不作任何处理，con)，氧化应激组(添加50umol/l的h2o2，h2o2)，褪黑素+氧化应激组(50umol/l的h2o2和100umol/l的褪黑素共同处理，m+h2o2)，褪黑素组(添加100umol/l的褪黑素，m)。
[0078]
不同浓度h2o2及不同时间处理对颗粒细胞增殖的影响
[0079]
利用cck-8法检测了不同时间点(3h、6h、9h)以及不同浓度h2o2(0umol/l、12.5umol/l、25umol/l、50umol/l、100umol/l、200umol/l)对颗粒细胞增殖的影响，从图8可以看出，随着h2o2浓度的升高，颗粒细胞的增殖逐渐降低，50umol/l，100umol/l和200umol/l的h2o2显著低于对照组(p≤0.01)。
[0080]
不同浓度h2o2及不同时间处理对颗粒细胞ros的影响
[0081]
从图9可以看出，在3h，6h，9h，从50umol/lh2o2浓度开始，鸡颗粒细胞的ros极显著升高(p≤0.01)。
[0082]
不同浓度h2o2及不同时间处理对颗粒细胞sod、cat和mda的影响
[0083]
从图10-图12可以看出，不同浓度的h2o2对颗粒细胞的抗氧化指标产生了显著的影响，50umol/l、100umol/l和200umol/lh2o2浓度显著降低了sod和cat的水平(p≤0.01)，显著提高了mda的水平(p≤0.01)。
[0084]
通过上述结果发现，在h2o2浓度为50umol/l且处理6h时，颗粒细胞的增殖速率降低，凋亡显著增加，且抗氧化标志物sod和cat的表达显著上调，而mda显著下挑，所以选用50umol/l的h2o2浓度进行接下来的实验。
[0085]
采用单因素方差分析，tukey法进行多重比较，p＜0.05作为差异显著性检验水平。
[0086]
一、cck-8：检测细胞增殖情况
[0087]
将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为1
×
105个/ml的细胞悬液，按1
×
104个细胞/孔接种于96孔板，每孔加100μl，置于37℃5％co2培养箱中培养待细胞贴壁。将各组培养基更换为100μl无血清的含1％bsa的基础培养基，饥饿处理12h。将各组培养基更换为100μl细胞样品各自对应的含有一定浓度药物的培养基，对照组更换为含溶剂的培养基，并设置对应的空白调零孔(即只有相对应的培养基没有细胞的孔)，培养合适时间。所有孔中分别加入10μlcck-8溶液，培养箱中孵育2h。使用酶标仪测定450nm吸光值，以溶剂处理的细胞为对照组，空白调零孔为blank，按公式计算药物对细胞的存活率。
[0088]
抑制率％＝〔(对照组-blank)-(实验组-blank)〕/(对照组-blank)*100％增殖率％＝(实验组-blank)/(对照组-blank)
×
100％
[0089]
由图13可以看出，与对照组相比，h2o2组显著抑制了颗粒细胞的增殖(p≤0.01)，而褪黑素与h2o2共同处理或者褪黑素单独处理后，显著提高了颗粒细胞的增殖(p≤0.01)。
[0090]
二、tunel法：检测细胞凋亡率
[0091]
(1)将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为1
×
105个/ml的细胞悬液，按1
×
104个细胞/孔接种于96孔板，每孔加100μl，置于37℃5％co2培养箱中培养待细胞贴
壁。
[0092]
(2)倒去培养基，用pbs洗3次，每次5min。
[0093]
(3)4％多聚甲醛固定20min，用pbs洗3次，每次5min。
[0094]
(4)用组化笔画圈，防止后面过程孵育液流走，pbs洗。
[0095]
(5)配制破膜液，室温孵育10min，pbs洗3次，每次5min。
[0096]
(6)取试剂盒内tdt酶、cf488-dutp绿光反应液、eb平衡缓冲液，按顺序1：5：50混合，配制适量孵育液，避光37℃孵育1h～1.5h或4℃过夜。
[0097]
(7)pbs洗3次，每次5min，滴加dapi染核，室温避光孵育20～30min，pbs洗。
[0098]
(8)用抗荧光淬灭封片剂封片，显微镜下观察拍照。
[0099]
悬浮细胞需要先离心、涡旋、涂片处理后染色，具体步骤为：
[0100]
通过离心后去除上层液体，pbs洗3次，4％多聚甲醛固定20min，pbs洗3次，涡旋混匀后涂片，注意细胞密度，室温晾干或烘干后进行后续染色，注意不能多洗，容易掉片。
[0101]
由图14可以看出，h2o2组的颗粒细胞凋亡比率显著高于对照组(p≤0.01)，而添加褪黑素处理后，细胞凋亡被显著抑制(p≤0.01)。
[0102]
三、(dcfh-da探针)流式细胞仪法：检测细胞ros的水平
[0103]
(1)胰酶消化收集细胞，离心去上清，用0.5ml的无血清细胞培养液重悬细胞于ep管中。
[0104]
(2)加入0.5μl的dcfh-da染色液，颠倒混匀数次。
[0105]
(3)细胞培养箱中37℃孵育20min，每隔5min颠倒混匀一次。
[0106]
(4)37℃孵育结束后，300g4℃离心3-4min，沉淀细胞，弃上清。
[0107]
(5)无血清培养基洗涤细胞3次：300g4℃离心3-4min，沉淀细胞，弃上清。
[0108]
(6)重悬细胞后上流式细胞仪分析。
[0109]
同样，检测了褪黑素处理后颗粒细胞内的ros情况，由图15可以看出，h2o2组颗粒细胞中的ros显著高于对照组(p≤0.01)，而添加褪黑素处理后，细胞内的ros被显著抑制(p≤0.01)。
[0110]
四、染色质免疫共沉淀技术：检测foxo1与抗氧化基因的结合活性。
[0111]
(1)交联样本准备：
[0112]
细胞生长至90％覆盖度，细胞计数，满足最终获得2～5mg蛋白样品的数量，约5～20
×
107细胞总数(2
×
t75细胞两瓶)，将细胞样本pbs洗涤数次后使用刮刀轻轻刮下，轻柔吹打重悬。300
×
g，4℃离心5min，弃上清。用1
×
预冷pbs洗两遍，弃上清。甲醛处理细胞，交联dna与dna结合蛋白，样本不进行后续实验可以-80℃冻存。加500μl细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂/dna酶抑制剂/rna酶抑制剂)重悬细胞，超声破碎细胞。破碎后的样本4℃下12000g离心10min，将上清转移到新的ep管中暂存。
[0113]
(2)磁珠与抗体准备：
[0114]
将抗体(阴性对照使用igg)加入磁珠中，4℃下，旋转混匀30min。将ep管放在磁力架上吸附磁珠2-3min，弃上清。加入200μl清洗缓冲液，4℃下，旋转混匀5min。将ep管放在磁力架上吸附磁珠2-3min，弃上清。重复清洗步骤3次。加入100μlpbs缓冲液重悬磁珠备用。
[0115]
(3)chip操作：
[0116]
①
将存放在-80℃的细胞裂解物或新鲜制备的裂解物超声断裂双链dna，超声条
件：2号探头，15％超声功率，4℃下超声on2sec/off4sec，总时间5min。
[0117]
②
超声之后的样本13500
×
g，4℃离心10min；
[0118]
③
取出500μl的样品作为“input”样本备份，-80℃保存备用；
[0119]
④
取250μl上清加入5μl目的蛋白抗体，进行抗体孵育，每个体系的体积为500μl；
[0120]
⑤
另取250μl上清加入5μligg抗体，进行抗体孵育，每个体系的体积为500μl；
[0121]
⑥
蛋白脱色摇床混匀，4℃混合过夜；
[0122]
⑦
短暂离心将样品甩到管底，向样品中加入活化的磁株，4℃孵育1h，置于磁力架上静置1min后取上清作为sample上清样本(origg上清样本)；
[0123]
⑧
加500μlnt-2，震荡混匀；
[0124]
⑨
短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清，重复5次；
[0125]
⑩
沉淀即为chip实验获得的样品(origg样本)，样本后续可进行pcr或qpcr或dna芯片、高通量测序等操作。
[0126]
(4)荧光定量pcr
[0127]
每个样品均作3个复孔，使用试剂盒进行：
[0128]
①
反应程序为：预变性95℃，3min
[0129]
循环(40次)95℃，10s
→
58℃，30s
→
72℃，30s
[0130]
熔解曲线仪器默认设置
[0131]
②
反应体系如表5：
[0132]
表5反应体系
[0133][0134][0135]
(5)普通pcr扩增
[0136]
①
pcr反应体系如表6
[0137]
表6pcr反应体系
[0138]
试剂使用量2*taqmastermix25.0μlforwardprimer(10μm)2.0μlreverseprimer(10μm)2.0μltemplatedna1.0μlrnasefreedh2oupto50.0μl
[0139]
②
pcr反应条件
[0140][0141]
③
凝胶制备及电泳
[0142]
50*tae，纯水配成1*tae工作液(980ml纯水+20ml50*tae)。称取1g西班牙琼脂糖，加100ml1*tae工作液，微波溶解，制成1％琼脂糖凝胶，冷却至60℃，加入10μlgoldviewi型核酸染色剂，混匀倒入槽中。拔梳，加入10μlpcr产物+2μl6*loading buffer。电压120v，30min，紫外仪下观察并拍照。
[0143]
(6)chip-qpcr操作
[0144]
(7)引物信息：
[0145]
序列如表7：
[0146]
表7引物序列
[0147][0148]
褪黑素对氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞foxo1免疫荧光的影响，如图16所示。
[0149]
五、qrt-pcr
[0150]
(1)rna提取
[0151]
用移液器小心吸去培养基，加入1ml4℃预冷的pbs溶液，小心摇晃洗去残余培养基，用移液器吸尽pbs溶液，加入1mltripure溶液，反复吹打培养瓶/培养基底部及四周，将细胞充分吹打到tripure中。加入250μl三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μl于1.5mlep管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1ml4℃预冷的75％乙醇，颠倒数次，清洗rna沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入100μlrnase-free water，充分溶解rna。
[0152]
(2)第一链cdna合成
[0153]
第一链cdna的合成采用entilink
tm
1st strand cdna synthesis supermix进行(elkbiotechnology,eq031)，主要步骤如下：
[0154]
①
在冰上配置如下反应液
[0155]
表8反应液
[0156]
[0157][0158]
②
逆转录程序
[0159]
表9逆转录条件
[0160]
温度时间25℃5min42℃30min85℃5min
[0161]
(3)荧光定量pcr
[0162]
实时荧光定量pcr是在life technologies公司的quantstudio 6flex system pcr仪上完成，每个样品均作3个复孔，使用enturbo
tm
sybr green pcr supermix试剂盒进行(elk biotechnology,eq001)：
[0163]
①
反应程序为：预变性95℃，30s
[0164]
循环(40次)95℃，10s
→
58℃，30s
→
72℃，30s
[0165]
熔解曲线仪器默认设置
[0166]
②
反应体系为：
[0167]
表10反应体系
[0168]
试剂使用量2
×
mastermix5.0μl引物工作液(2.5μm)1.0μltemplate1.0μlddh2o2.0μlrox1.0μl
[0169]
(4)引物序列如下：
[0170]
表11引物序列
[0171]
[0172][0173]
检测了添加褪黑素后对h2o2导致的氧化应激模型中抗氧化相关基因的影响。由图17可以看出，h2o2显著降低了氧化指标sod1、sod2、cat、gpx3和prdx3的表达量(p≤0.01)，而添加褪黑素处理后，显著缓解了h2o2带来的氧化应激，m+h2o2共同处理组和m单独处理组的sod1、sod2、cat、gpx3和prdx3的表达量显著高于h2o2组(p≤0.01)。
[0174]
检测了添加褪黑素后对h2o2导致的氧化应激模型中抗凋亡相关基因的影响。由图18可以看出，h2o2显著提升了促凋亡相关基因bim、bax和caspase-3的表达量(p≤0.01)，显著抑制了抗凋亡基因bcl-2的表达(p≤0.01)，而m+h2o2共同处理组和m单独处理组的bim、bax和caspase-3的表达量显著低于h2o2组(p≤0.01)，而bcl-2的表达量显著高于h2o2组(p≤0.01)，表明褪黑素显著缓解了h2o2带来的对颗粒细胞的凋亡效应。
[0175]
检测了添加褪黑素后对h2o2导致的氧化应激模型中foxo1基因的影响。由图19可以看出，h2o2显著提升了foxo1基因的表达(p≤0.01)，而m+h2o2共同处理组和m单独处理组的foxo1的表达量显著低于h2o2组(p≤0.01)，表明褪黑素通过抑制foxo1基因的表达显著缓解了h2o2带来的对颗粒细胞的氧化应激。
[0176]
六、westernblot检测蛋白的表达水平
[0177]
用总蛋白提取试剂盒(sigma，美国)从颗粒细胞中提取总蛋白，用bca法测定蛋白浓度，用sds-page进行凝胶电泳分离，100v电泳6h电泳后，取出目的蛋白凝胶，置于缓冲液中平衡15min，转膜60min；将目的蛋白转印到pvdf膜中，用t-bst漂洗3次，每次5min，然后将其浸入5％脫脂奶粉封闭液中，摇床上室湿封闭2h；洗膜，一抗4℃孵育过夜，洗膜3次，每次5min，二抗goat anti-rabbit igg h&l(abcam 6721，稀释度1：5000)室温孵育2h，洗膜3次，每次5min，然后使用增强型化学发光试剂盒进行显色拍照，β-actin作为内参，对目的蛋白和β-actin条带行灰度值分析，计算二者比值，目的条带灰度与相应内参灰度的比值得到蛋白的相表达量。
[0178]
检测了cat、sod1、sod2、gpx3、prdx3、bim、bcl-2、caspase-3、bax和foxo1蛋白的表达，由图20可以看出，表达趋势与mrna的表达趋势一致。
[0179]
chip染色质免疫共沉淀技术：检测foxo1与抗氧化基因的结合活性。
[0180]
用foxo1抗体进行chip实验，对cat的启动子区域上游100bp的高gc含量，设计引物。富集到的dna进行qpcr检测，由图21可以看出，foxo1能够调控cat启动子的转录。
[0181]
因此，本发明采用上述一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法及延长产蛋期的方法，建立了体内氧化应激模型和体外氧化应激模型，并通过褪黑素进行缓解，在体内氧化应激和体外氧化应激两个方面均具有有效效果，并明确了褪黑素缓解卵巢氧化应激的机理，能够有效延长蛋鸡的产蛋期。
[0182]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法，其特征在于：包括体内氧化应激模型的建立和体外氧化应激模型的建立。2.根据权利要求1所述的一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法，其特征在于：所述体内氧化应激模型的建立，包括以下步骤：选取高产期蛋鸡，连续注射地塞米松15d，剂量为20mg/kg，后15d注射等量生理盐水；进行预实验7d，试验期30d，饲粮为玉米-豆粕型基础饲粮；所述预实验和试验期温度均为21-25℃，相对湿度为55-75％，光照条件为16l：8d，试验期间所有蛋鸡自由采食、自由饮水。3.根据权利要求2所述的一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法，其特征在于：所述饲粮包括以下质量份的原料组成：玉米62份，豆粕24份，大豆油1份，鱼粉2份，磷酸氢钙1份，石粉9份，氯化钠0.32份，蛋氨酸0.12份，苏氨酸0.1份，氯化胆碱0.1份，预混料0.3份，植酸酶0.02份，赖氨酸0.04份。4.根据权利要求1所述的一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法，其特征在于：所述体外氧化应激模型的建立，包括以下步骤：分离培养蛋鸡卵巢原代颗粒细胞，接种于培养板，采用50umol/l的h2o2处理卵巢原代颗粒细胞6h。5.一种蛋鸡卵巢氧化应激延长产蛋期的方法，其特征在于：在建立如权利要求1-3任一所述的体内氧化应激模型的同时，选取相同数量的高产期蛋鸡，连续注射地塞米松15天，剂量为20mg/kg，后15天注射等量褪黑素；进行预实验7d，试验期30d，饲量为基础日粮；通过生产性能、蛋品质、血液指标、不同发育阶段卵泡数量、细胞凋亡相关基因、抗氧化基因、foxo1表达、卵巢bcl-2、sod1、foxo1蛋白表达趋势对产蛋期进行检测。6.根据权利要求5所述的一种蛋鸡卵巢氧化应激延长产蛋期的方法，其特征在于：所述生产性能包括每天产蛋总数、总蛋重、每周饲粮消耗量、平均蛋重、产蛋率、平均日采食量、料蛋比。7.根据权利要求5所述的一种蛋鸡卵巢氧化应激延长产蛋期的方法，其特征在于：所述蛋品质包括蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度。8.根据权利要求5所述的一种蛋鸡卵巢氧化应激延长产蛋期的方法，其特征在于：所述血液指标包括血液中丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、氧自由基、8-羟基脱氧鸟苷和褪黑素的含量。9.一种蛋鸡卵巢氧化应激延长产蛋期的检测方法，其特征在于：在建立如权利要求1或4任一所述的体外氧化应激模型后，添加100umol/l的褪黑素处理24h，通过细胞增值情况、细胞凋亡率、细胞ros水平、foxo1与抗氧化基因的结合活性、qrt-pcr、蛋白的表达水平情况对产蛋期进行检测。

技术总结
本发明公开了一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法及延长产蛋期的方法，包括体内氧化应激模型的建立和体外氧化应激模型的建立。体内氧化应激模型的建立，包括：选取高产期蛋鸡，连续注射地塞米松15d，剂量为20mg/kg，后15d注射等量生理盐水。体外氧化应激模型的建立，包括：分离培养蛋鸡卵巢原代颗粒细胞，接种于培养板，采用50umol/L的H2O2处理卵巢原代颗粒细胞6h。本发明采用上述的一种蛋鸡卵巢氧化应激模型建立方法及延长产蛋期的方法，能够探究蛋鸡卵巢衰老的原因，通过褪黑素延长蛋鸡的产蛋期，并在基因水平上做出解释。并在基因水平上做出解释。并在基因水平上做出解释。


技术研发人员：郝二英 陈辉 刘雪露 艾嘉伟 黄晨轩 王德贺 陈一凡 石雷
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/8/21