基于相分离监测活细胞组蛋白甲基化水平动态变化的方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于荧光显微成像检测活细胞组蛋白甲基化水平动态变化的方法及其应用。


背景技术：

2.哺乳动物染色质具有高度复杂的层级结构和多样的动态过程，以控制复杂的生命活动。其中高度压缩的染色质使得各种调控因子难以接触到dna，阻碍转录、dna复制等过程，因此细胞进行多种生命活动都要求染色质结构的快速变化，这些过程中常常伴随着组蛋白翻译后修饰。组蛋白存在多种翻译后修饰类型，包括甲基化、磷酸化、乙酰化等，其中，甲基化修饰是研究较多的修饰类型，所有组蛋白均可甲基化，一个组蛋白往往有多个甲基化位点。在异染色质形成、dna损伤修复、转录调控等过程中发挥着不可替代的作用，与多种疾病如癌症、重金属中毒和神经退行性疾病等密切相关。多种组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶都已经成为抗癌药物热门靶点。细胞组蛋白甲基化水平也时刻处于变化之中，因此开发一种在活细胞中检测组蛋白甲基化动态的方法，对研究组蛋白甲基化在各种生命过程中的功能机制以及开发抗癌药物十分必要。
3.目前现有的检测细胞内甲基化水平的技术包括免疫荧光、聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色质免疫沉淀、质谱法等等。但这些方法的局限在于须先固定或者裂解细胞，因而不能实时监测活细胞中组蛋白翻译后修饰动态。因此，开发在活细胞中检测组蛋白翻译后修饰的工具十分必要。研究者已经开发了一些能够在活细胞中检测组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化的探针，根据检测的原理主要有三类：基于fret原理，基于荧光蛋白技术和基于抗原抗体识别的技术。
4.基于fret原理检测活细胞组蛋白翻译后修饰的探针，已经在多种场景中得到应用。该探针的一端负责感应甲基转移酶活力的是一段包含组蛋白的肽段，探针另一端的结构域可以结合被甲基化修饰后的组蛋白，探针的中间部分是两种可以发生fret的荧光蛋白。当在细胞内过表达相应的甲基转移酶时，能观察到fret信号的增加。但是，由于细胞内组蛋白翻译后修饰水平变化幅度有限，因此探针的fret信号变化幅度也不足，从而影响探针的灵敏度和准确性，这导致基于fret的组蛋白翻译后修饰探针都未曾用于活体动物成像，因为动物组织对光存在散射和吸收，对探针的信号变化幅度有更高的要求。这也说明目前检测组蛋白翻译后修饰的方法仍有改进的空间。
5.除了基于fret原理设计的探针，还有一些荧光蛋白技术也可以用来检测组蛋白修饰，例如双分子荧光互补技术(bifc)。这类方法往往将荧光蛋白切割成两部分，分别融合到两个蛋白中，若这一对蛋白存在相互作用而结合，会导致荧光蛋白的两段重新拼合成一个完整的荧光蛋白。然而，由于绝大部分荧光蛋白拼合后便不会再分开，所以bifc系统是不可逆的，难以实时反映组蛋白翻译后修饰的动力学状态。
6.最后一种是基于抗原结合片段(fab)的方法检测组蛋白修饰。该方法是另外一种思路，先获得纯化的抗体，再通过蛋白酶消化制备fab，接着用荧光染料标记，最后利用显微
注射技术注入活细胞。与整个igg分子相比，fab的优势在于尺寸较小，结合力弱，对细胞正常功能的干扰少。但fab技术方法也有明显的缺点，比如制备过程非常复杂，显微注射难度较大，并且对细胞有较大损伤。且外源蛋白在细胞内存活时间短，不利于长时程成像。虽然利用基因编码的fab可以比较好地解决这个问题，但伴随的另外一个缺点是该策略无法进行定量分析，因为无论fab是否结合内源的组蛋白甲基化位点，细胞核内的总荧光强度都保持不变。
7.因此，为了提高检测活细胞内组蛋白甲基化水平的灵敏度和准确率，推进相关药物的研发，本领域迫切需要开发一种可以检测活细胞组蛋白甲基化动态变化过程的方法。


技术实现要素：

8.为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种信背比高、特异性强、普适性和生物相容性良好的检测细胞内甲基化水平动态变化的方法。该方法基于相分离的原理，实时、精准定量地检测活细胞组蛋白甲基化的动态变化水平，具有诸多优点：首先是相分离液滴通过相分离的原理显著提高液滴内部的探针浓度，因此具有很高的信背比，方便识别和统计，适合活体动物成像；其二，探针特异性强，当甲基化位点被突变或者细胞内组蛋白甲基化水平降低时，相分离液滴减少甚至消失，相分离液滴数目与细胞内组蛋白甲基化水平呈正相关，而其他位点甲基化水平并不影响相分离液滴数目；其三是该探针具有良好的普适性，在不同物种、不同细胞系中探针表现一致；其四，探针具有良好的生物相容性，对细胞没有毒害作用，也不会影响细胞的增殖速度。
9.本发明所提供的基于相分离监测活细胞组蛋白甲基化水平动态变化的方法在本文中被简称为5k9，所用到的探针称为5k9探针。
10.在本发明的第一方面，提供一种基因编码的基于相分离原理实时监测活细胞组蛋白甲基化水平动态变化的荧光探针，其主要由两部分组成：甲基化传感器和相分离报告器。其中，探针的甲基化传感器(参见图1中的n片段)上的甲基化反应底物是从组蛋白h3的n端截取的一段短肽(seq id no：1)，含有组蛋白h3的甲基化位点h3k9。探针的相分离报告器(参见图1中的c片段)采用的是果蝇hp1α的染色质结合结构域(seq id no：2)，对h3k9me3肽段的平衡解离常数为10μm。同时为了增强探针的柔性，利于相分离的发生，此处并没有用到hp1的全长序列。另外在甲基化传感器和相分离报告器上分别连接了人工设计的寡聚化短肽i和ii(例如hotag3和hotag6短肽)，这两个短肽可以聚集成多聚体。当细胞内的甲基转移酶含量升高的时候，探针的甲基化传感器被甲基化修饰后，和相分离报告器特异性结合，从而产生相分离的液滴；反之当细胞内的去甲基酶含量升高的时候，探针的甲基化传感器被去甲基化修饰之后，相分离报告器序列不再结合甲基化传感器，相分离液滴逐渐消失，原理详见图1。
11.为了验证本发明活细胞组蛋白甲基化水平动态变化方法的有效性，首先利用影响甲基化和去甲基化的化学试剂来改变细胞内的组蛋白甲基化水平。在本发明的实施例中，分别通过药物iox1和ciclopirox通过抑制去甲基化酶的活性来提高h3k9me3水平，通过药物chaetocin抑制甲基转移酶的活性来降低h3k9me3水平，之后动态观察相分离水平的变化。但本发明不限制任何影响h3k9me3水平的方式。
12.其中，活细胞组蛋白甲基化探针由两部分组成：甲基化传感器和相分离报告器，两
个片段在同一个质粒上表达，由柔性氨基酸接头p2a序列连接，其中p2a序列也可以替换成scfv、myc等任意的柔性氨基酸接头，蛋白表达后经自剪切分为两段，整个探针基因总长度不超过1800bp。为提高p2a剪切效率，防止自聚集，在p2a两端添加了gsg三肽序列。在本发明的一个实施例中，n片段和c片段分别含有c-myc和sv40核定位序列，它们的序列分别aakrvkld(seq id no：9)和pkkkrkv(seq id no：10)，这两种核定位序列可以互相交换位置，或者采用相同的核定位序列，或者替换成其他任意具有核定位功能的肽段，确保探针在细胞核中富集。hotag3和hotag6是人工设计的短肽，它们的序列分别为geiakslkeiakslkeiawslkeiakslkg(seq id no：3)和tlreieellrkiiedsvrsvae lediekwlkki(seq id no：4)，长度分别为30和33个氨基酸。hotag3在细胞中能够自发形成六聚体，hotag6能自发形成四聚体。单独表达hotag3或者hotag6不足以导致相分离，但如果两肽段之间因存在多价相互作用而结合，则可导致相分离，其中这两个肽段的位置可以互相交换，也可以被其他可以自聚的氨基酸序列替代。
13.其中，两种肽段的生物相容性以及辅助相分离的能力已经得到验证。探针中甲基化反应底物是从组蛋白h3的n端截取的一段短肽，含有h3k9位点，肽段序列为artaqtarkstgg(seq id no：1)，与内源h3肽段相比，h3k4赖氨酸位点被突变成了丙氨酸，以排除h3k4甲基化的干扰。
14.其中，探针的甲基化传感器具体组成元件如下：首先，为了提高探针的灵敏度，在探针的n端将3～8段相同的含有h3k9位点的肽段序列串联起来，串联的肽段数目越高，相分离的现象越明显，超过八个以上的重复肽段会对细胞本身的正常功能产生影响，这些序列之间依次通过由三到四个柔性氨基酸(脯氨酸和丝氨酸)组成的肽段序列连接，之后通过一段肽段序列(例如gglesglrsgsgggdi，seq id no：6)连接egfp(增强绿色荧光蛋白)，其中egfp可以被其他任何荧光蛋白替代，例如mcherry、dsred、mstrawberry、morange和mcitrine等；之后又通过一段序列为gsgsaggsaggsaggsaggsaggsaggsr(seq id no：7)的接头序列连接hotag3和核定位序列sv40，其中这段接头序列也可以替换成其他柔性氨基酸连接成的序列。以上的各组分就是活细胞组蛋白甲基化探针的甲基化传感器的所有元件，甲基化传感器的序列通过p2a序列连接相分离报告器的序列，p2a序列为atnfslkqagdveenpgp(seq id no：5)，其中p2a序列可以替换成别的任意柔性接头。
15.其中，本发明探针的相分离报告器的元件中用来识别并结合被三甲基化修饰的h3肽段的是果蝇hp1α的染色质结合结构域，对三甲基化肽段h3k9me3的平衡解离常数kd为10μm，但对单甲基化肽段h3k9me1和二甲基化肽段h3k9me2不具有亲和力。为了精简探针的结构，使探针具有更高的柔性，有利于相分离，同时也减少外源表达的hp1对细胞正常功能的干扰，此处不用全长hp1蛋白，所采用的肽段序列为eeeyavekiidrrvrkgkveyylkwkgypetentwepennldcqdliqqyeasrkd(seq id no：2)，最后通过一段具有柔性的肽段接头连接hotag6和核定位序列sv40，其中这段柔性肽段接头的氨基酸序列为gsgsaggsaggsaggsaggsaggsaggsaggsr(seq id no：8，这段接头序列也可以被其他柔性氨基酸连接成的序列替代。以上即是活细胞组蛋白甲基化探针的相分离报告器的所有组成元件。
16.上述活细胞组蛋白甲基化探针的表达盒，以及含有所述活细胞组蛋白甲基化探针的编码基因的载体、宿主菌或细胞系均在本发明的保护范围内。
17.由此，本发明提供了一种信背比高，特异性强，普适性和生物相容性良好的检测细
胞内组蛋白甲基化水平动态变化的方法，流程图详见图1，对于任意因素导致的h3k9me3水平的变化，均可以通过以下步骤进行定量检测：
18.(1)构建表达所述活细胞组蛋白甲基化探针的质粒，通过慢病毒法对细胞进行活细胞组蛋白甲基化探针质粒转染，将探针在细胞内进行表达。
19.(2)流式细胞仪分选出表达了荧光蛋白的细胞继续培养，并根据荧光强弱分选出表达量不同的细胞系，以避免因细胞内转染质粒的量不同而影响探针在细胞内的表达量，进而影响相分离现象的程度。
20.(3)对于选定的细胞系，改变细胞内的甲基化水平，观察并拍摄不同条件下细胞中相分离液滴数目和大小变化的图像。
21.(4)统计细胞内相分离液滴数目，其中小液滴的数目可以反映出细胞内的甲基化水平的变化。
22.优选的，在步骤(4)中利用imagej统计细胞内相分离液滴数目。先将显微图片转化成8bit格式，再设置阈值将液滴与细胞核内荧光背景区分开，最后根据液滴直径将大液滴与小液滴区分开，统计小液滴数目，其中液滴直径大于1.5微米被归为大液滴之所以不统计大液滴的数目，是因为细胞核中的大液滴往往存在于核仁周围，由于核仁周围富含异染色质，内源hp1在此形成聚集体，招募大量探针的甲基化传感器，容易形成大液滴，这些大液滴的产生不能反映细胞内的甲基化水平的动态变化。
23.本发明的有益效果包括：
24.(1)本发明开发了一种基于相分离原理的活细胞组蛋白甲基化探针，该探针通过相分离液滴的形成和解聚来反映活细胞中组蛋白甲基化状态。该探针可识别性强，相分离液滴信号背景比高，液滴数目方便统计。
25.(2)本发明的探针具有良好的特异性，探针的相分离依赖甲基化传感器h3k9位点的三甲基化，且不受其他位点甲基化或乙酰化水平的影响。
26.(3)本发明的探针具有良好的普适性，活细胞组蛋白甲基化探针普适性强，除了hela细胞外，在其他物种的细胞系中也具有良好性能，在较大的浓度范围内，探针都可以发生相分离。最后，该探针具有良好的生物相容性。探针对细胞无毒害作用，短期内不会导致细胞的凋亡或者坏死，也不影响细胞活力，经过长期培养探针也不会影响细胞的增殖速度。因此，相比于基于fret原理检测活细胞组蛋白翻译后修饰的探针，具有更高的灵敏度；相比基于bifc原理设计的探针，可以实时反映组蛋白翻译后修饰的动力学状态；相比基于fab的检测方法，可以长时程对细胞进行检测并进行定量分析。该探针广泛适用于定量检测因疾病、衰老、药物或者基因编辑等各种原因造成的细胞甲基化水平的变化，在分子生物学和临床诊断中具有非常广阔的应用前景。
附图说明
27.图1为本发明针对活细胞组蛋白甲基化探针原理图，其中：a为甲基化探针各部分结构示意图；b为相分离液滴的形成与解聚原理示意图。
28.图2为本发明实施例2中5k9探针的特异性的验证实验结果，其中：a为表达5k9探针的hela细胞经过chaetocin处理前后，用免疫荧光检测细胞内h3k9me3分布情况；b为a中细胞内h3k9me3水平定量结果，n＝15；c为5k9对不同组蛋白甲基化和乙酰化激动剂的反应。比
例尺10微米。
29.图3为本发明实施例2中5k9探针对细胞正常功能影响的验证实验结果，其中：a为实验各组细胞经凋亡染色后流式分析的散点图，每组分析10000个细胞，阳性对照组嘌呤霉素(puromycin)浓度为1μg/ml(低于半数致死浓度)；b为各组细胞凋亡坏死比例的比较；c为各组细胞通过cck-8实验分析各组细胞活力；d为5k9探针后对细胞增殖速度的影响。比例尺10微米。
30.图4为本发明实施例2中使用不同倍数物镜观察相分离液滴的效果，其中：a为使用激光共聚焦显微镜在不同倍数物镜下对同一个细胞成像效果图；b为a中对应不同物镜显微成像图的荧光分布。比例尺10微米。
具体实施方式
31.下面将结合附图，通过实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
32.实施例1.5k9探针质粒的构建。
33.(一)材料
34.1.trans5α感受态细胞
35.2.高保真dna聚合酶
36.(二)步骤
37.本发明5k9探针的甲基化传感器和相分离报告器的各部分元件主要采取gibson连接法来构建质粒。具体步骤包括：
38.1.dna片段扩增。设计合适的引物用于扩增目的基因，引物结合模板区域序列的tm值一般在60-66℃之间，在模板结合区域另加一段15-25bp的同源片段，用于后续同源重组反应。根据经验，扩增长度小于4kb的dna片段，用phanta max super-fidelity dnapolymerase酶体系。扩增程序为：95℃预变性30秒，之后以95℃变性15秒，55-65℃退火15秒，72℃延伸若干秒为一个循环单位，进行35个循环，之后72℃延伸5分钟，最后降至室温即可。
39.其中，有些情况下需要扩增长dna片段(》4kb)，比如由于载体上缺乏特异性酶切位点，只能对整个载体进行扩增，为了保证效率，可以使用2
×
phanta flash master mix进行扩增。反应程序如下：98℃预变性30秒，循环阶段，98℃变性10秒，退火5秒，72度延伸若干秒，进行35个循环，之后72度延伸1分钟，最后降至室温即可。
40.对于100bp以下的超短基因片段，则直接合成一对互补dna单链，然后变性退火形成双链，退火程序为，95℃加热1分钟，然后按照每分钟退火5℃的速度缓慢降温，直到降至25℃。反应产物可以直接用于后续同源重组反应，但需要稀释到适当浓度。
41.其中，dna片段酶切步骤中，需要在37℃的温度下酶切1小时即可保证酶切效果。
42.2.用琼脂糖凝胶电泳检验目的片段扩增效果，包括片段长度和特异性。之后用相应的试剂盒进行dna回收。此步骤要注意避免乙醇残留，以免降低后续dna连接效率。
43.3.重组酶连接。各dna片段使用量按照此公式粗略计算：最适使用量＝[0.02
×
片
段碱基对数]ng。为了确保加样的准确性，如dna回收产物浓度过高，可提前稀释，使各组分加样体积不低于0.5μl，并于冰上配制同源重组反应体系。在50℃下反应15分钟，产物用于后续的感受态细胞转化。对于超过4片段的同源重组反应，为提高连接成功率，需要使用非连接酶依赖型的多片段一步克隆试剂盒，配制好反应体系后，在37℃下放置30分钟完成反应。
[0044]
4.将同源重组反应后产物加入大肠杆菌trans5α感受态菌株进行热激转化，得到单克隆菌株。
[0045]
5.挑选单克隆菌落进行菌落pcr验证。
[0046]
6.培养细菌，提取质粒，进行测序验证。
[0047]
实施例2.5k9探针相对定量表征hela细胞内的h3k9me3水平的变化。
[0048]
(一)材料
[0049]
1.细胞系：hela细胞
[0050]
2.opti-mem是无血清培养基，用于细胞转染的试剂。
[0051]
3.chaetocin是suv39h1/2的抑制剂，是表观遗传领域降低h3k9me3水平最常用的药物，本实验中chaetocin工作浓度为50nm，高于其半数抑制浓度ic50。
[0052]
4.iox1是h3k9me3去甲基化酶kdm3和kdm4的抑制剂。
[0053]
5.ciclopirox是多种h3k9me3去甲基化酶抑制剂，包括kdm4b。
[0054]
6.cck-8检测试剂盒，含有wst-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)，在电子载体存在的情况下wst-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成水溶性的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。cck-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比
[0055]
色检测法
[0056]
7.annexin v-alexa fluor 647，用于检测细胞凋亡。
[0057]
(二)步骤
[0058]
1.慢病毒法构建细胞系
[0059]
首先将细胞状态良好的hela铺到六孔板上培养，转染时密度在60％-80％为宜。转染前更换新鲜培养基，继续培养5小时。在200μl opti-mem培养基中加入pspax2、pmd2.g以及目标质粒。按照1:1比例加入neofect转染试剂，充分混匀。在室温下孵育15分钟。将转染溶液加入到hela细胞中，轻轻晃动混匀。继续培养18个小时，在荧光显微镜下检查转染是否成功。更换3ml新鲜的dmem培养基。培养48小时后，收集上清液以500
×
g的速度离心5分钟。利用0.45μm的滤膜过滤，得到病毒液。一般情况下，病毒液无需浓缩。病毒液与新鲜培养基按照1:2体积混合，加入到待感染的细胞中，培养12小时以上。更换新鲜培养基，继续培养72小时以上。通过流式细胞仪分选出表达了荧光蛋白的细胞继续培养，也根据荧光分选出表达量不同的细胞系。
[0060]
2.细胞药物刺激
[0061]
为了进一步验证探针的特异性，通过加药刺激改变细胞内h3k9me3水平并观察探针分布的变化。提前配置l-多聚赖氨酸溶液，浓度为0.1mg/ml。将多聚赖氨酸铺在35mm玻底皿上，37℃孵育20分钟。弃去溶液，吸干培养皿中残留的溶液，在细胞操作台中放置10分钟，
让培养皿彻底干燥。铺细胞，密度在40％以下。细胞培养12小时以上，待细胞贴壁牢固。在ep管中配制不同浓度的含药物培养基，如chaetocin，ciclopirox，dmso等等，充分混匀。弃去培养皿中的培养基，立即加上包含药物的培养基。细胞在培养箱中继续培养，培养时间按照实验要求而定。细胞样品直接用显微镜成像。
[0062]
从图2中a可以看出，表达5k9探针的hela细胞经过25nm的chaetocin处理之后，细胞核中的小液滴完全消失。保持实验条件一致，利用免疫荧光对chaetocin处理前后细胞中h3k9me3水平进行比较。统计每个细胞单位面积荧光强度来反映h3k9me3的水平。从图2中b可以看出，与dmso处理组相比，经过chaetocin处理之后的细胞总体的h3k9me3水平下降了约40％。从图2中c可以看出，对于5k9探针，用unc1999处理后降低细胞内h3k27me3的水平，或者用tsa提高细胞内组蛋白乙酰化水平，对于5k9探针的相分离并无影响。
[0063]
3.细胞凋亡比例检测
[0064]
作为基因编码的活细胞探针，基本原则之一是不影响细胞的正常功能，否则会严重限制探针的使用。由于5k9探针h3肽段与内源的组蛋白序列几乎一致并且表达量较高，与内源的hp1等蛋白存在相互作用，极有可能干扰细胞内正常信号通路。因此有必要检测5k9探针对细胞正常功能的影响。可检测的指标有多种，包括细胞凋亡和坏死比例，细胞活力以及细胞生长速度。首先进行细胞凋亡速率的比较。
[0065]
细胞凋亡比例是评价细胞健康程度的重要指标，不少有害因素如紫外线、缺氧、微生物污染等均会导致凋亡。检测细胞凋亡采用的是广泛应用的annexin v染色技术。早期凋亡的细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸外翻，能够被annexin v结合，而晚期凋亡和坏死的细胞对于细胞染料pi具有通透性，annexin v和pi双染色就可以分析细胞凋亡和坏死比例。
[0066]
首先将细胞铺在培养皿中，让细胞贴壁牢固。用不含edta的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性，也不能过短，以防细胞未脱离培养皿，用移液枪吹打过程造成细胞损伤。对于hela细胞，消化时间为3分钟。细胞悬液用300
×
g速度离心5分钟，收集细胞。pbs洗涤细胞1次，以300
×
g，4℃离心5分钟。加入250μl
[0067]1×
binding buffer重悬细胞，稀释细胞密度至大约1
×
106个/ml。取100μl细胞悬液于ep管中，加入5μl annexin v-alexa fluor 647，轻轻混匀。避光条件下室温反应15分钟。用1
×
binding buffer再洗涤一次，4℃下以300
×
g速度离心5分钟。加入400μlbinding buffer混匀，一小时内用流式细胞仪分析。在进行流式分析前再加入pi染色液，混匀后进行流式分析。整个实验过程中务必保持吹打轻柔，防止对细胞造成损伤。用flowjo等软件进行分析，绘制散点图，alexa fluor 647为横坐标，pi为纵坐标。每个样品采集10000个细胞的数据。
[0068]
从图3中a可以看出，为验证实验的可靠性，阳性对照组用低剂量嘌呤霉素(puromycin)处理hela细胞。经过流式细胞术分析可知，经过嘌呤霉素处理24小时后，阳性对照组细胞死亡和凋亡比例达16％，而表达了5k9的细胞系与野生型hela细胞系凋亡坏死比例均不到3％，从图3中b可以看出无统计学上差异。由此可见，表达
[0069]
5k9并不会增加细胞凋亡或者坏死比例。
[0070]
4.细胞活力比较
[0071]
检测细胞活力采用cck-8实验，这是一种常见的评价细胞活力实验。实验中无色的wst-8被线粒体中的脱氢酶还原为高度水溶性的橙黄色甲瓒产物，最大吸收波长为450纳
米，可以通过酶标仪读取。细胞活力越强，则线粒体功能越强，能将更多的wst-8转化为甲瓒产物，溶液吸光度值越高。当细胞数量一定时，反应后溶液吸光度与细胞活力成正比。
[0072]
具体的实验流程首先将参与比对的细胞系铺在培养皿中，保持良好状态，保持细胞数目大致相近。消化收集细胞，用培养基重悬。使用细胞计数板来计算细胞密度。稀释细胞悬液至相同密度。将细胞铺到96孔板中，每孔加入约20000个细胞，每个孔之间的细胞数目保持一致，补充新鲜培养基至每孔总体积为100μl。在细胞培养箱中培养12-18小时，让细胞充分贴壁。轻轻沿着细胞孔壁向每孔加入10μl cck-8溶液，轻轻晃动，避免气泡产生。在培养箱中继续培养1-4小时。最后利用酶标仪测定450纳米波长处的吸光值。吸光度值即代表细胞活力大小。
[0073]
从图3中c可以看出，cck-8实验中依然用嘌呤霉素处理的hela细胞作为阳性对照组，根据统计结果，阳性对照组hela细胞活力显著下降达20％左右，而表达了5k9的细胞系与野生型的hela细胞活力并无统计学上差异。因此可以得出结论，表达5k9探针不会影响细胞的活力。
[0074]
5.细胞增殖速率的比较
[0075]
细胞增殖速度可用于评估探针表达对细胞长期功能的影响。
[0076]
将表达了5k9探针的细胞系与野生的hela细胞置于相同条件下培养一周，重悬细胞之后，取80μl细胞置于细胞计数板凹槽中，在显微镜下观察计数，物镜倍数为10倍。细胞计数板上有正方形网格区域，分为9个中方格，在计数时分别计算四角中方格内的细胞数目。在计数时，会有部分细胞位于方格边界线上，统一规定在上边界和左边界的细胞纳入计数，下边界和右边界不纳入计数。得到四个数值后得到平均数n，细胞密度为n
×
10 4
个/ml。取10 4
个细胞重新铺到12孔板中培养，待第二天重新计数。在计算细胞累积倍增数时，用第二天的细胞总数除以前一天铺下的细胞数目，再求2的对数即可得到倍增数，将每一天的倍增数值累积起来就可以得到累积倍增数(cpd)从而绘制细胞倍增曲线。
[0077]
从细胞倍增曲线可以看出，在表达了5k9之后，在一周的时间内，从图3中d可以看出，细胞系生长速度与野生型的hela细胞并无统计学意义上差别。因此可以确定，从长期效果看，表达5k9探针对于细胞增殖并无影响。
[0078]
6.使用不同倍数物镜观察相分离液滴的效果。
[0079]
显微成像时大倍率物镜可以观察更加精细的结构，但是视野小。小倍率物镜观察视野大，但是分辨率有限。使用激光共聚焦显微镜开展活体动物成像时，由于物镜工作距离的限制，往往不能使用最高倍数的物镜。即使某些活体动物如线虫可以使用高倍物镜，研究者也希望用更大视野的低倍镜观察多个细胞，获取更多信息。因此，有必要测试在不同倍率物镜下，相分离探针成像效果。针对同一个细胞，分别采用20倍、40倍、63倍和100倍物镜观察细胞，并分析液滴的荧光信背比。当使用63
×
和100
×
的油镜(数值孔径均为
[0080]
1.4)成像时，从图4中a可以看出，小液滴都清晰可见，信背比可达到4左右。当使用40
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水镜时(数值孔径1.2)，物镜的数值孔径减少，显微镜分辨率降低，但小液滴的信背比维持在2-3左右，从图4中b可以看出依然可以清晰分辨。如果物镜倍数降至20倍，荧光信背比和分辨率大幅下降，难以区分小液滴。综上所述，对5k9探针的液滴用激光共聚焦显微镜进行成像时，从图4中a可以看出物镜倍数至少为40倍。这为后续探针的应用提供了指南。

技术特征：
1.一种活细胞组蛋白甲基化探针，由甲基化传感器和相分离报告器两部分组成，所述甲基化传感器包括从组蛋白h3的n端截取的含有甲基化位点h3k9的短肽，以及荧光蛋白和寡聚化短肽i；所述相分离报告器包括果蝇hp1α的染色质结合结构域和寡聚化短肽ii；其中，所述含有甲基化位点h3k9的短肽的序列为artaqtarkstgg，所述果蝇hp1α的染色质结合结构域的序列为eeeyavekiidrrvrkgkveyylkwkgypetentwepennldcqdliqqyeasrkd；当所述甲基化传感器中的甲基化位点h3k9被三甲基化修饰后，被相分离报告器中的果蝇hp1α的染色质结合结构域识别并结合，并在寡聚化短肽i和ii的作用下，甲基化传感器和相分离报告器聚集成多聚体，产生相分离的液滴。2.如权利要求1所述的活细胞组蛋白甲基化探针，其特征在于，所述寡聚化短肽i是hotag3，所述寡聚化短肽ii是hotag6；或者，所述寡聚化短肽i是hotag6，所述寡聚化短肽ii是hotag3；其中：hotag3的序列为geiakslkeiakslkeiawslkeiakslkg，hotag6的序列为tlreieellrkiiedsvrsvaelediekwlkki。3.如权利要求1所述的活细胞组蛋白甲基化探针，其特征在于，所述荧光蛋白选自egfp、mcherry、dsred、mstrawberry、morange和mcitrine中的一种。4.如权利要求1所述的活细胞组蛋白甲基化探针，其特征在于，在所述甲基化传感器从n端到c端依次为：3～8段串联的所述含有甲基化位点h3k9的短肽，柔性肽段，荧光蛋白，柔性接头序列，寡聚化短肽i和核定位序列；所述相分离报告器从n端到c端依次为果蝇hp1α的染色质结合结构域，柔性接头序列，寡聚化短肽ii和核定位序列。5.如权利要求4所述的活细胞组蛋白甲基化探针，其特征在于，所述甲基化传感器和相分离报告器在同一个质粒上表达，二者之间由柔性氨基酸接头序列连接。6.如权利要求5所述的活细胞组蛋白甲基化探针，其特征在于，连接甲基化传感器和相分离报告器的氨基酸接头序列选自p2a、scfv、myc，其中p2a序列为atnfslkqagdveenpgp。7.如权利要求4所述的活细胞组蛋白甲基化探针，其特征在于，所述含有甲基化位点h3k9的短肽之间通过三到四个柔性氨基酸串联；所述含有甲基化位点h3k9的短肽与荧光蛋白之间的柔性肽段的序列为gglesglrsgsgggdi；所述荧光蛋白与寡聚化短肽i之间的柔性接头序列为gsgsaggsaggsaggsaggsaggsaggsr；所述果蝇hp1α的染色质结合结构域与寡聚化短肽ii之间的柔性接头序列为gsgsaggsaggsaggsaggsaggsaggsaggsr；所述核定位序列选自c-myc和sv40，其中c-myc的序列为aakrvkld，sv40的序列为pkkkrkv。8.权利要求1～7任一所述活细胞组蛋白甲基化探针的表达盒，含有所述活细胞组蛋白甲基化探针的编码基因的载体、宿主菌或细胞系。9.一种监测活细胞组蛋白甲基化水平动态变化的方法，包括以下步骤：1)构建表达权利要求1～7任一所述活细胞组蛋白甲基化探针的质粒，通过慢病毒法对细胞进行活细胞组蛋白甲基化探针质粒转染，将探针在细胞内进行表达；2)分选出表达荧光蛋白的细胞继续培养，并根据荧光强弱分选出表达量不同的细胞系；3)对于选定的细胞系，观察并拍摄不同条件下细胞中相分离液滴数目和大小变化的图像；4)统计细胞内相分离液滴数目，其中小液滴的数目反映出细胞内的甲基化水平的变化。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤4)利用imagej统计细胞内相分离液滴数目，先将显微图片转化成8bit格式，再设置阈值将液滴与细胞核内荧光背景区分开，统计直径≤1.5微米的小液滴数目。

技术总结
本发明公开了一种基于相分离监测活细胞组蛋白甲基化水平动态变化的方法。首先构建活细胞组蛋白甲基化探针，探针中的甲基化传感器包括含有甲基化位点H3K9的短肽、荧光蛋白和寡聚化短肽I，相分离报告器包括果蝇HP1α的染色质结合结构域和寡聚化短肽II，当H3K9位点被三甲基化修饰后，被果蝇HP1α的染色质结合结构域识别并结合，在寡聚化短肽I和II的作用下，甲基化传感器和相分离报告器聚集成多聚体，产生相分离的液滴。利用该探针可以实时、精准定量地检测活细胞组蛋白甲基化的动态变化水平，具有信背比高、特异性强、普适性和生物相容性良好的特点，可广泛适用于定量检测因疾病、衰老、药物或基因编辑等原因造成的细胞甲基化水平的变化，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。


技术研发人员：孙育杰 何仁喜 董甜
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/21