一种诊断结核感染的标志物及其应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，一种诊断结核感染的标志物及其应用。


背景技术：

2.结核是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病。该疾病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一，具有传染性强、复发率高、易发展为耐多药结核病，增加疾病的治疗难度。因此，早诊断、早治疗是控制结核病传播的关键所在。
3.目前，临床上诊断肺结核的实验技术主要有病原学、分子生物学、及免疫学方法。病原学方法主要有涂片法和细菌培养法，涂片法简便、快速，但检测敏感性低，细菌学培养周期长，不利于临床结核病的早期诊断；分子生物学诊断集中在以核酸扩增为核心的检测技术的应用上，如xpert mtb/rif、恒温扩增技术(lamp)、pcr技术等。而免疫学诊断方法以γ-干扰素体外释放试验(interferon-gamma release assays，igras)为主，为结核病的诊断带来了新的进步，在临床检测中得到了一定程度的应用。其检测原理是人体感染结核分枝杆菌后，产生记忆性t淋巴细胞，当特异性结核抗原再次入侵时，记忆细胞就会迅速增殖活化形成大量的效应t淋巴细胞，释放γ-干扰素(ifn-γ)及其它多种细胞因子，进一步通过酶联免疫吸附检测(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)或者酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay，elispot)的方法进行检测来判断体内是否存在结核分枝杆菌感染。近年来，igras在结核病的诊断中得到了广泛的应用，其具有良好的敏感度及特异性，能提高疾病的诊断率。
4.现阶段，以检测ifn-γ为主的免疫反应，虽然具有较好的敏感度，但是也具有一定的局限性，临床研究表明：由于结核病患者免疫应答的差异，大概有10-15％的结核病患者igras检测是阴性的，当外周血单个核细胞受到结核特异性抗原刺激后，会释放多种炎性标志物，这些炎性标志物的释放与机体抗结核感染的免疫应答相关，并最终导致了结核感染的不同结局。因此，寻找ifn-γ以外的诊断标志物，来提高诊断的敏感性是临床所期望的。随着luminex悬液芯片技术的发展，可以同时对多种生物标志物进行检测和筛选，为结核病的临床诊断和治疗提供参考依据。
5.在专利cn113748342a中公开了生物标志物ifnγ、il-10、cd120b和cd14的组合用于诊断活动性分枝杆菌感染和/或监测活动性分枝杆菌感染进展的用途，用于诊断活动性分枝杆菌感染和/或监测活动性分枝杆菌感染的进展或用于诊断不存在分枝杆菌感染，特别是结核病。
6.趋化因子是一类高度保守的蛋白家族(相对分子质量8000-12000)，参与许多生物过程，包括趋化细胞迁移、免疫细胞脱颗粒、造血和血管生成(miller mc，mayo kh.chemokines from a structural perspective.int j mol sci，2017，18(10)：2088.doi：10.3390/iimsl8102088.)。趋化因子通常根据其高度保守的半胱氨酸残基的顺序定位被分为3个亚家族，分别是cc模体(c-c motif，cc)趋化因子、cxc模体(c-x-c motif，cxc))趋化因子、c-x3-c模体(c-x3-cmotif，cx3c)趋化因子。趋化因子的生物学功能大多被
归类为炎性因子，它们在炎性反应中控制免疫细胞募集过程中起着关键作用，即趋化因子在组织免疫反应方面发挥着重要作用(zlotnik a，yoshieo.the chemokine superfamily revisitedimmunit，2012，36(5)：705—716doi：10.1016/j.immuni.2012.05.008.)。黎友伦等认为趋化因子在人体内与自身相对应的靶细胞上的受体结合，通过诱导g蛋白的by亚基解离的方式激活相应的信号通路，发挥其生物学功能。不同类型的趋化因子其分工也各不相同，cc趋化因子主要趋化单核细胞，cxc趋化因子主要趋化中性粒细胞，c趋化因子可对淋巴细胞起趋化作用，cx3c亚家族主要参与巨细胞和淋巴细胞的迁移和活化。除此之外，趋化因子在mtb感染过程中发挥作用，趋化因子对于招募和协调免疫细胞进入mtb感染肺部这一过程至关重要。单核细胞募集和定位可以有效控制细菌的增长，防止其发展为弥漫性的粒细胞炎症。如干扰素诱导蛋白10(ip-10/cxcl10)可以通过与靶细胞的受体结合来介导人体内免疫细胞的迁移和活化，在抗结核免疫中发挥重要的作用。但同时，某些趋化因子和细胞因子则加剧感染的扩散及组织的破坏，对于抗mtb感染过程的作用是双重的，在特定条件下，趋化因子也会导致不呈比例的炎症和肺损伤，从而加速肺部疾病和空洞化的进展。
7.本发明提供一组特异的生物标志物，用于诊断病原体结核分枝杆菌的感染与否。


技术实现要素：

8.第一方面，本发明提供一种诊断结核感染的的生物标志物，所述标志物为cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，当cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，其表达量分别高于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为结核分枝杆菌感染者；当cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，其表达量分别低于或等于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为非结核分枝杆菌感染者。
9.进一步的，所述cxcl9、cxcl10、ccl8的表达量临界值(pg/ml)分别是258.78、267.53、30.31。
10.进一步的，所述结核感染是包括病原体结核分枝杆菌的存在引起的感染。
11.进一步的，所述结核分枝杆菌感染包括：原发性感染、继发性感染、肺外感染。
12.第二方面，本发明提供一种评估抗结核感染的治疗功效的方法，包括：
13.s1从结核感染者中获得测试生物样品；
14.s2检测cxcl9、cxcl10、ccl8的生物标志物的含量；
15.s3将cxcl9、cxcl10、ccl8的含量的检测结果与其相应的临界值进行比较，当cxcl9、cxcl10、ccl8和cxcl10与ccl8组合中的一种或多种，其表达量分别高于该因子的临界值时，可以诊断该受试者为结核分枝杆菌感染者，说明该受试者抗结核感染治疗效果不佳或无效；当cxcl9、cxcl10、ccl8和cxcl10与ccl8的组合中的一种或多种，分别低于或等于该因子的临界值时，可以诊断该受试者为非结核分枝杆菌感染者，说明该受试者的抗结核感染治疗有效。
16.进一步的，所述生物样品可以为组织液或血液。
17.进一步的，所述cxcl9、cxcl10、ccl8的表达量临界值(pg/ml)分别是258.78、267.53、30.31。
18.第三方面，本发明提供一种用于诊断结核感染的试剂盒，所述试剂盒含有检测生物标志物的试剂、说明书等，所述标志物为cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种。
19.第四方面，本发明提供一种生物标志物在制备诊断结核感染制剂中的用途。
20.进一步的，所述生物标志物cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种。
21.进一步的，当cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，其表达量分别高于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为结核分枝杆菌感染者；当cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，其表达量分别低于或等于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为非结核分枝杆菌感染者。
22.更进一步的，所述cxcl9、cxcl10、ccl8的表达量临界值(pg/ml)分别是258.78、267.53、30.31。
附图说明
23.图1分别为健康对照(hc)，潜伏感染者(ltbi)，igra阳性结核病患者(tb igra+)和igra阴性结核病患者(tb igra-)外周血单核细胞受到结核抗原刺激后的趋化因子表达水平。
24.图2为mig/cxcl9的roc曲线分析图。
25.图3为ip-10/cxcl10的roc曲线分析图。
26.图4为mcp-2/ccl8的roc曲线分析图。
27.图5为ip-10/cxcl10和mcp-2/ccl8组合物的roc曲线分析图。
具体实施方式
28.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
29.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
30.本文提及的“cxcl9”即趋化因子干扰素-γ诱生单核因子(monokine induced by interferony，mig)，属于趋化因子的cxc家族，在体内主要由巨噬细胞经ifn-γ刺激产生，其结构特征为具有125个基酸的前体蛋白序列以及包含21个氨基酸的信号肤序列，相比于其他趋化因子包含超过50％的碱性氨基酸，因此分子量比大多数其他趋化因子更大。cxcl9的羟基末端易水解断裂，导致天然和重组cxcl9的大小存在一定差异性。cxcl9在白细胞运输中起关键作用，作用于活化的cd4
+
th1细胞，cd8
+
t细胞，il-2活化的t淋巴细胞和nk细胞。其受体cxcr3被激活后可被快速诱导产生并在th1型cd4
+
t细胞和效应cd8
+
t细胞如nk细胞和nkt细胞中维持高表达。因此cxcl9在许多疾病中发挥重要作用，包括外部感染、肿瘤治疗、自体免疫性疾病、移植排斥反应等。
31.本文提及的“cxcl10”是指c-x-c基序趋化因子10(cxcl10)，也称为干扰素γ诱导蛋白10(ip-10)或小诱导型细胞因子b10。cxcl10是8.7kda的蛋白质，其在人类中由cxcl10基因编码。cxcl10是属于cxc趋化因子家族的小细胞因子，经ien-y诱导后可由中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞、内皮细胞、基质细胞等产生。ip-10通过结合趋化因子受体cxcr3发挥作用，募集多种cxcr3*细胞至淋巴结或局部组织活化的t细胞、辅助性t细胞、tregs、浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，pdc)、单核细胞、nk细
胞。
32.本文提及的“ccl8”又称单核细胞趋化蛋白-2(monote chemoatactanproten-2mcp-2)，是趋化因子cc家族的重要成员，在b细胞、突状纽南成熟及t细分化的过程中扮演了重要色，参与th1及th2免反应，因此ccl 8在机体炎症反应、免疫反应及肿瘤免疫中发挥了重要的免疫调节作用。趋化因子(chemokines)是一大类具有高度同源三维结构的低相对分子质量蛋白质，最初被发现是由于其可以在引导白细胞迁移和增殖中发挥重要作用。趋化细胞因子家族共有27位成员，趋化因子是其中的一个亚家族，是细胞间通讯的一个重要组成部分。趋化因子可通过与七次跨膜的g蛋白偶联受体家族(gprotein-coupledreceptors，gpcrs)结合产生生物学效应。根据其n端半胱氨酸构建的不同，趋化因子通常又分为四个家族：cc、cxc、cx3c和xc。ccl8是cc趋化因子家族的成员，其编码基因是聚集在17号染色体q臂上的几种趋化因子基因之一。ccl8可参与免疫调节及炎症反应过程，与cc趋化因子家族其他成员结构基本相同，cc家族共同的结构特征为氨基酸结构中有由4个半胱氨酸残基形成的2个邻二硫键，ccl8的蛋白前体由109个氨基酸组成，成熟的ccl8蛋白由75个氨基酸组成。
33.本文提及的“结核感染”包括由病原体结核分枝杆菌的存在引起的感染，对结核感染者的提及包括对igra阳性结核病患者(tb igra+)、igra阴性结核病患者和潜伏性无症状结核病感染(ltbi)的提及。
34.本文所述：敏感度＝真阳性值/(真阳性值+假阴性值)；特异度＝真阴性值/(真阴性值+假阳性值)；阳性似然比＝真阳性值/(真阳性值+假阳性值)；阴性似然比＝真阴性值/(真阴性值+假阴性值)；准确度＝(真阳性值+真阴性值)/(真阳性值+真阴性值+假阴性值+假阳性值)；其中假阳性可以是指因为种种原因把不是结核病的患者误判为阳性的结果，假阴性是将结核病患者误判为不是结核病。
35.实施例1诊断结核感染的生物标志物的筛选方法
36.1.1病例收集
37.采集受试者标本，包括健康对照(hc)，潜伏感染者(ltbi)，igra阳性结核病患者(tb igra+)和igra阴性结核病患者((tb igra-)4组人群。
38.1.1.1活动性肺结核患者是指具有结核病的临床症状，经痰抗酸杆菌涂片或培养阳性，病理证实或痰分子生物学证实的确诊结核病患者，包括了igra阳性和阴性结核病。
39.1.1.2潜伏感染者入组标准：有结核感染的高危险因素，结核特异igra检测阳性，胸片无结核感染证据；
40.1.1.3健康对照：无结核感染的高危因素，胸片未见明显异常。
41.以上人群均排除肿瘤、服用免疫调节药物治疗、hiv感染及其他自身免疫性疾病。
42.1.2结核分枝杆菌特异性抗原esat-6和cfp-10刺激外周血细胞
43.1.2.1样本采集：早晨空腹采集每例受试者外周血4ml于含肝素钠抗凝的采血管中，采集后6个小时内加入细胞刺激培养管中刺激培养，不得冷冻和离心。
44.1.2.2样本分装：轻轻上下颠倒混匀采血管8次，分别吸取0.6ml人新鲜静脉抗凝血，加入细胞刺激培养管(n、t、p)中，上下颠倒混匀培养管5次。
45.1.2.3培养：将细胞刺激培养管置于37
±
0.5℃的恒温培养箱中培养20
±
2h，培养过程中保持培养管直立。
46.1.2.4分离：培养后的培养管可采用离心(1000g，5min)或其他方式分离血浆。
47.1.3液相悬浮芯片技术检测
48.对健康对照，潜伏感染者，irga阳性结核病患者和irga阴性结核病患者四组人群特异性抗原刺激后的血浆，采用bio-plex pro human chemokine panel40-plex试剂盒进行趋化因子或细胞因子检测，具体操作步骤如下：
49.1.3.1样品准备
50.细胞培养血浆：10000rpm，离心10min，取上清，用sample diluent进行4倍稀释，最终取50μl稀释好的样本进行检测。
51.1.3.2标准品准备
52.向标准品瓶中加入781μl的standard diluent，涡旋5s，冰浴30min，按照说明书进行倍比稀释标准品。
53.1.3.3样品孵育
54.(1)取微珠在振荡器上1400rpm，振荡30s，使用assay buffer稀释微珠；
55.(2)稀释后的微珠用振荡器，1400rpm，再次震荡30s，每孔50μl加入96孔板中，使用洗板机洗涤3次；
56.(3)取50μl准备好的标准品、样品、参照品和blank加入96孔板中，贴上封口膜，放置在平板振荡器上850rpm振荡，避光，室温，孵育1h。
57.1.3.4孵育检测抗体
58.(1)弃去样品，使用洗板机洗涤3次；
59.(2)使用antibody diluent按说明书要求稀释detectionantibody；
60.(3)每孔加入25μl稀释好的detectionantibody，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm振荡，避光，室温，孵育30min。
61.1.3.5显色
62.(1)弃去检测抗体，使用洗板机洗涤3次；
63.(2)使用assay buffer按说明书要求稀释streptavidin-pe；
64.(3)每孔加入50μl稀释好的streptavidin-pe，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm振荡，避光，室温，孵育10min；
65.(4)使用洗板机洗涤3次；
66.(5)每孔加入125μlassay buffer重悬，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm，室温，避光，振荡30s；
67.(6)送入已校正的bio plex 200机器中读值。
68.1.4数据结果
69.实验检测的样品与标准品经bio plex 200检测仪检测后，获得的荧光由软件自动计算与优化，形成excel格式的输出文件。
70.1.5筛选生物标志物
71.根据所检测的40种趋化因子或细胞因子在这4种人群中的表达量，从中筛选出在健康对照和结核感染患者中存在表达差异的趋化因子或细胞因子：结核特异性抗原刺激后的mig/cxcl9、ip-10/cxcl10、mcp-2/ccl8的表达在两组之间存在明显差异，可作为诊断的生物标志物(见图1)。
72.40种细胞因子和趋化因子如下：
73.ccl21、cxcl13、ccl27、cxcl5、ccl24、ccl26、ccl11、cx3cl1、cxcl6、gmcsf、cxcl1、cxcl2、ccl1、cxcl11、ifn-r、il-1b、il-2、il-4、il-6、cxcl8、il-10、il-16、cxcl10、ccl2、ccl8、ccl7、ccl13、ccl22、mif、cxcl9、ccl3、ccl15、ccl20、ccl19、ccl23、cxcl16、cxcl12、ccl25、ccl17、tnfa。
74.实施例2结核感染的生物标志物及组合物的诊断价值分析
75.为了进一步分析这些细胞因子或趋化因子的诊断价值，首先进行了受试者操作曲线(receiver-operating-characteristic，roc)的分析，用roc分析中的曲线下面积(aucs)来评价单个趋化因子或细胞因子对所在两组的区分能力。aucs值越大，说明该趋化因子的诊断效果越好。
76.2.1mig/cxcl9鉴别诊断价值分析
77.趋化因子mig/cxcl9鉴别诊断结核感染的auc为0.983(见图2)，诊断的敏感度为93.55％，特异度为100.00％。
78.2.2ip-10/cxcl10鉴别诊断价值分析
79.ip-10/cxcl10鉴别诊断结核感染的auc为0.968(见图3)，诊断的敏感度为90.32％，特异度为100.00％。
80.2.3mcp-2/ccl8鉴别诊断价值分析
81.mcp-2/ccl8鉴别诊断结核感染的auc为0.933(见图4)，诊断的敏感度为82.26％，特异度为95.00％。
82.2.4趋化因子ip-10/cxcl10和mcp-2/ccl8组合
83.采用logistic逐步回归模型计算趋化因子ip-10/cxcl10和mcp-2/ccl8组合鉴别结核感染的auc为0.952(见图5)，总体诊断的敏感度为88.71％，特异度为100.00％，均具有较高的诊断效能。
84.以所述筛选出在健康对照和结核感染患者之间细胞培养血浆差异表达的趋化因子。以此筛选出的趋化因子作为诊断标志物，应用液相芯片技术进行检测，可用于结核感染的快速检测中，具有较高的诊断效能，操作相对简便，可以提高结核感染的检出率(见表1)。
85.表1：趋化因子诊断价值分析
[0086][0087]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0088]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对
各种可能的组合方式不再另行说明。
[0089]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要不违背本发明的思想，同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.一种诊断结核感染的生物标志物，所述标志物为cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，当cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，其表达量分别高于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为结核分枝杆菌感染者；当cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，其表达量分别低于或等于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为非结核分枝杆菌感染者。2.如权利要求1所述诊断结核感染的生物标志物，其特征在于，所述cxcl9、cxcl10、ccl8的表达量临界值(pg/ml)分别是258.78、267.53、30.31。3.如权利要求1所述诊断结核感染的生物标志物，其特征在于，所述结核感染是所述结核感染是包括病原体结核分枝杆菌的存在引起的感染。4.如权利要求1所述诊断结核感染的生物标志物，其特征在于，所述结核感染包括：原发性感染、继发性感染、肺外感染。5.一种评估抗结核感染的治疗功效的方法，包括：s1从结核感染者获得测试生物样品；s2检测cxcl9、cxcl10、ccl8的生物标志物的含量；s3将cxcl9、cxcl10、ccl8的含量检测结果与其相应的临界值进行比较，当cxcl9、cxcl10、ccl8和cxcl10与ccl8组合中的一种或多种，其表达量分别高于该因子的临界值时，可以诊断该受试者为结核分枝杆菌感染者，说明该受试者抗结核感染治疗效果不佳或无效；当cxcl9、cxcl10、ccl8和cxcl10与ccl8的组合中的一种或多种，分别低于或等于该因子的临界值时，可以诊断该受试者为非结核分枝杆菌感染者，说明该受试者的抗结核感染治疗有效。6.一种用于诊断结核感染的试剂盒，所述试剂盒是含有检测生物标志物的试剂、说明书等，所述标志物为cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种。7.一种生物标志物在制备诊断结核感染制剂中的用途，所述生物标志物为cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，当cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，其表达量分别高于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为结核分枝杆菌感染者；当cxcl9、cxcl10、ccl8中的一种或多种，其表达量分别低于或等于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为非结核分枝杆菌感染者。

技术总结
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种诊断结核感染的标志物及其应用，所述一种诊断活动性结核病的生物标志物，所述标志物为CXCL9、CXCL10、CCL8中的一种或多种，当CXCL9、CXCL10、CCL8中的一种或多种，其表达量分别高于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为结核分枝杆菌感染者；当CXCL9、CXCL10、CCL8中的一种或多种，其表达量分别低于或等于该因子表达量的临界值时，可以诊断该受试者为非结核分枝杆菌感染者。本发明的生物标志物敏感性和特异性高、诊断效能高、操作简便，可以提高结核感染的诊断效率。诊断效率。


技术研发人员：逄宇 任卫聪 李强 高孟秋 李姗姗
受保护的技术使用者：北京市结核病胸部肿瘤研究所
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/8/21