腺病毒7型的LAMP检测引物组和检测方法与应用、试剂盒与流程

腺病毒7型的lamp检测引物组和检测方法与应用、试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及腺病毒7型的lamp检测引物组和检测方法与应用、试剂盒。


背景技术：

2.腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成，每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链dna分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。由于每条dna链的5'端同相对分子质量为55x103da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链dna的环状结构。
3.人体腺病毒已知有52种，分别命名为adl～ad52，研究最详细的是ad2。腺病毒基因组转录产生mrna，已知的转录单位至少有5个：eⅰ区位于病毒基因组左侧，可再分成eⅰa和eⅰb，与细胞转化有关；eii区编码dna结合蛋白，参与病毒的复制；eⅲ区编码出现在宿主细胞表面的一种糖蛋白；eⅳ区位于ad2基因组右端，受eii区编码的dna结合蛋白质调控；第5个转录单位在病毒感染中期合成ad2蛋白质ⅳ。
4.腺病毒对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞。使细胞转化只需要腺病毒基因组的一部分，这些基因位于基因组的左端，约占整个基因组的7％～10％。尽管腺病毒分布很广，但对人体不出现致癌性。人体细胞是一类允许细胞(permissive cell)，即这类细胞允许感染入侵的病毒在细胞内复制增殖，最后细胞裂解死亡而释放出大量子代病毒。在体外培养的多种人体肿瘤细胞中均未查出腺病毒颗粒，但在人的1号染色体上有adl2的整合位点，这意味着人体细胞对于腺病毒也可能是非允许细胞，即这类细胞在病毒感染后，病毒不能在细胞内复制增殖，但可整合在受感染细胞的基因组内。这些细胞被病毒转化，表型发生改变，且可在体外无限期地培养传代。
5.腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。
6.呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等，包括以下4种不同的综合征。
7.1.急性发热性咽喉炎通常为婴儿和儿童发病，由c组病毒引起，出现咳嗽，鼻塞、发热和咽喉部溃疡等症状，这些表现难以与其他病毒引起的轻型呼吸道感染鉴别。
8.2.咽结膜热(pharyngoconjunctival fever)症状与急性发热性咽喉炎相似，但常同时发生结膜炎。咽结膜热有暴发流行倾向，如游泳池结膜炎，多由b组腺病毒3和7型所致，愈后尚好，一般无后遗症。
9.3.急性呼吸道疾病(acute respiratory diseases，ard)这一综合征由咽炎、发热、咳嗽和全身不适为特点，多因突然紧张、劳累、聚集等所致。此感染多由腺病毒4、7型引起，也可见于3型。
10.4.肺炎，腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10％，多由腺病毒3、7型引起；在青年人腺
病毒肺炎的病死率为8％～10％；肺炎也是新兵急性呼吸道疾病的一种严重表现。
11.环介导的等温核酸扩增技术(lamp)是由t.notomi(notomi t,okayama h,masubuchih,et al.loop-mediated isothermal amplification of dna.nucleic acids res 2000；28(12):63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的dna聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。masaki imai等人(imai m，ninomiya a，minekawa h，et al.rapid diagnosis of h5n1 avian influenza virus infection by newly developed influenza h5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method.j virol methods.2007；141(2):173-80.)利用lamp建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；nobuyuki hayashi等人(hayashi n,arai r,tada s,taguchi h,ogawa y.detection and identification of brettanomyces/dekkera sp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method.food microbiol.2007；24(7-8):778-85.)针对四种香酒酵母的its序列设计了lamp特异性引物，建立了高效的lamp检测体系。lamp还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(vhs)、巨细胞病毒(cmv)、埃博拉病毒(ebov)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(ebv)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(工hhnv)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测腺病毒7型的lamp专用引物与试剂盒问世。


技术实现要素：

12.有鉴于此，本发明的目的是提供腺病毒7型的lamp检测引物组和检测方法与应用、试剂盒，可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到腺病毒7型。
13.本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
14.本发明的第一方面在于提供了一种腺病毒7型的lamp检测引物组，所述lamp检测引物组基于如seq id no.1所示的腺病毒7型的特异性保守基因序列设计，用于定性检测待测样品中的腺病毒7型。
15.结合第一方面，在一些实施方式中，所述lamp检测引物组包括：
16.如seq id no.2所示的正向内引物fip；
17.如seq id no.3所示的反向内引物bip；
18.如seq id no.4所示的正向外引物f3；
19.如seq id no.5所示的反向外引物b3；
20.以及，如seq id no.6所示的环引物lf。
21.结合第一方面，在一些实施方式中，所述正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、环引物lf的摩尔比为8:8:1:1:4。
22.本发明的第二方面在于提供了腺病毒7型的lamp检测方法，包括以下步骤：
23.获取待测样本的基因组dna；
24.配制lamp反应体系，所述lamp反应体系中包含如权利要求1-3任一项所述的lamp检测引物组；
25.以待测样本的基因组dna为模板，在lamp反应体系中进行lamp扩增反应，得到反应液；
26.lamp扩增反应后进行结果判读。
27.结合第二方面，在一些实施方式中，所述lamp反应体系包括：2μl待测物的基因组dna，20mm ph为8.8的tris
·
hcl，10mm kcl，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱，8mm mgso4，1.4mm dntp each，8u bst dna 聚合酶，以及引物加入量为：40pmol正向内引物fip和反向内引物bip，20pmol环引物lf，5pmol正向外引物f3和反向外引物b3。
28.结合第二方面，在一些实施方式中，所述lamp扩增反应条件为：置于60℃～67℃恒温反应55～60min。
29.结合第二方面，在一些实施方式中，所述结果判读操作如下：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在腺病毒7型，橙色表示待测样品中不存在腺病毒7型；
30.或者直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在腺病毒7型，浊度无变化表示待测样品中不存在腺病毒7型。
31.结合第二方面，在一些实施方式中，所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，所述钙黄绿素指示剂包含有0.5mm钙黄绿素和10mm氯化锰。
32.本发明的第三方面在于提供了上述腺病毒7型的lamp检测引物组在制备用于检测腺病毒7型的试剂或试剂盒中的应用。
33.本发明的第四方面在于提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述腺病毒7型的lamp检测引物组。
34.本发明具有以下有益效果：
35.(1)高特异性，5条引物对腺病毒7型靶序列的7个特异区域的识别保证了lamp扩增的高度特异性，即lamp能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；
36.(2)高灵敏度，灵敏度比普通pcr高10倍；
37.(3)结果鉴定简便，可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；
38.(4)操作简单，只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果；
39.(5)快速、高效扩增，整个lamp扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/ml。
40.本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到腺病毒7型，不需要复杂仪器，为腺病毒7型的检测提供了一个新的技术平台，可用于农业生产单位筛查和检测腺病毒7型，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
附图说明
41.图1是本发明腺病毒7型的lamp检测方法的最佳温度筛选结果图；
42.图2是本发明腺病毒7型的lamp检测方法特异性的浊度仪检测结果图；
43.图3是本发明腺病毒7型lamp检测方法灵敏度的浊度仪检测结果图；
44.图4是本发明腺病毒7型lamp检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂染色检测结果图；
45.图5是本发明腺病毒7型lamp检测方法灵敏度的pcr检测结果图。
具体实施方式
46.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
47.以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用原料、设备或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
48.本技术的腺病毒7型的lamp检测引物组基于如seq id no.1所示的腺病毒7型的特异性保守基因序列设计，用于定性检测待测样品中的腺病毒7型。该lamp检测引物组包括5条专用引物，具体如表1所示，其中，正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、环引物lf的摩尔比为8:8:1:1:4。
49.本技术的腺病毒7型的lamp检测方法，包括以下步骤：
50.步骤一，获取待测样本的基因组dna；
51.步骤二，配制lamp反应体系，lamp反应体系中包含上述的lamp检测引物组；
52.步骤三，以待测样本的基因组dna为模板，在lamp反应体系中进行lamp扩增反应，得到反应液，lamp扩增反应条件为：置于60℃～67℃恒温反应55～60min，优选65℃恒温反应60min；
53.步骤四，lamp扩增反应后进行结果判读，结果判读包括两种方法：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在腺病毒7型，橙色表示待测样品中不存在腺病毒7型；或者直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在腺病毒7型，浊度无变化表示待测样品中不存在腺病毒7型，钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，钙黄绿素指示剂包含有0.5mm钙黄绿素和10mm氯化锰。
54.具体参照以下实施例：
55.实施例1用于对腺病毒7型进行lamp检测的引物设计
56.从美国基因数据库检索获得腺病毒7型基因序列，通过blast软件进行同源性分析，获得腺病毒7型的特异性保守基因序列，具体如seq id no.1所示。再根据该特异性保守基因dna序列，用软件primer design v4设计用于对腺病毒7型进行lamp检测的引物，设计出1套引物引物序列如表1所示。
57.表1用于对腺病毒7型进行lamp检测的引物pv-16
[0058][0059]
实施例2腺病毒7型的lamp检测方法的建立
[0060]
用实施例1获得的用于对腺病毒7型进行lamp检测的五条引物组合对腺病毒7型进行lamp检测，以获得最佳反应体系及反应条件，具体方法如下：
[0061]
一、最佳反应体系的确定
[0062]
在不同反应条件下对含腺病毒7型的基因组dna进行lamp检测，以确定最佳反应条件，具体方法包括以下步骤：
[0063]
1)以含腺病毒7型的基因组dna为模板，在实施例1获得的五条引物的引导下进行lamp扩增反应，其中，25ul lamp反应体系包括：含腺病毒7型的基因组dna 2μl，20mm tris
·
hcl(ph 8.8)，10mm kcl，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱(betaine)，8mm mgso4，1.4mm dntp each，8u bst dna聚合酶，加入的引物量为：40pmol fip和bip，20pmol lf，5pmol f3和b3。lamp的扩增条件为：置60℃-67℃恒温60min。
[0064]
2)结果判定
[0065]
反应结束后，用以下方法进行结果判定：
[0066]
方法一：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在腺病毒7型，橙色表示待测样品中不存在腺病毒7型；
[0067]
方法二：直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在腺病毒7型，浊度无变化表示待测样品中不存在腺病毒7型。
[0068]
本实施例采用方法二进行结果判定，判定结果如图1所示，检测结果表明，最佳的腺病毒7型lamp扩增条件为：置65℃恒温60min。
[0069]
实施例3腺病毒7型的lamp检测方法的特异性、灵敏性检测
[0070]
一、本发明腺病毒7型的lamp检测方法的特异性检测
[0071]
阳性对照用阳性菌株样本f5、f6，阴性菌株f1、f2、f3、f4基因组作为模板。检测实施例2获得的最佳的腺病毒7型的lamp检测方法的特异性，反应体系和反应条件与实施例2相同。
[0072]
腺病毒7型lamp检测方法特异性的浊度仪检测结果如图2所示，从图2中可以看出，只有腺病毒7型发生了lamp反应，其余均未发生；表明腺病毒7型的lamp检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到腺病毒7型。
[0073]
二、本发明腺病毒7型的lamp检测方法的灵敏度检测
[0074]
检测本技术的lamp检测方法和普通pcr方法检测腺病毒7型的灵敏度，方法为：提取腺病毒7型总dna后定量，然后以10倍梯度(1倍、10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍)进行稀释使模板中总dna的浓度分别为72ng/μl、7.2ng/μl、720pg/μl、72pg/μl、7.2pg/μl、0.72pg/μl、0.072pg/μl，再以经梯度稀释的dna为模板，分别用本技术的lamp检测方法与普通pcr方法(引物序列为f3和b3)进行灵敏度检测。
[0075]
本技术的腺病毒7型lamp检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图3所示(模板浓度分别为：72ng/μl、7.2ng/μl、720pg/μl、72pg/μl、7.2pg/μl、0.72pg/μl、0.072pg/μl、阴性对照)，本技术的腺病毒7型lamp检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂颜色反应检测结果如图4所示(从右到左，模板浓度分别为：72ng/μl、7.2ng/μl、720pg/μl、72pg/μl、7.2pg/μl、0.72pg/μl、0.072pg/μl、阴性对照)，本技术的病毒7型lamp检测方法灵敏度的pcr检测结果如图5所示(从左到右，模板浓度分别为：72ng/μl、7.2ng/μl、720pg/μl、72pg/μl、7.2pg/μl、0.72pg/μl、0.072pg/μl、阴性对照，目标片段为203bp，dnamarker d2000)，本技术的腺病毒7型的lamp检测方法可检测到0.72pg/μl，而普通pcr方法仅能检测到7.2pg/μl，而且钙黄绿素指示剂染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本技术的腺病毒7型的lamp检测方法比普通pcr检测方法的灵敏度高10倍。
[0076]
实施例4制备腺病毒7型的lamp检测试剂盒
[0077]
将lamp反应体系(含腺病毒7型扩增引物)、bst dna聚合酶、双蒸水、钙黄绿素指示剂和阳性对照共同包装，得到本发明腺病毒7型的lamp检测试剂盒。
[0078]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

技术特征：
1.腺病毒7型的lamp检测引物组，其特征在于，所述lamp检测引物组基于如seq id no.1所示的腺病毒7型的特异性保守基因序列设计，用于定性检测待测样品中的腺病毒7型。2.根据权利要求1所述的腺病毒7型的lamp检测引物组，其特征在于，所述lamp检测引物组包括：如seq id no.2所示的正向内引物fip；如seq id no.3所示的反向内引物bip；如seq id no.4所示的正向外引物f3；如seq id no.5所示的反向外引物b3；以及，如seq id no.6所示的环引物lf。3.根据权利要求1所述的腺病毒7型的lamp检测引物组，其特征在于，所述正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、环引物lf的摩尔比为8:8:1:1:4。4.腺病毒7型的lamp检测方法，其特征在于，包括以下步骤：获取待测样本的基因组dna；配制lamp反应体系，所述lamp反应体系中包含如权利要求1-3任一项所述的lamp检测引物组；以待测样本的基因组dna为模板，在lamp反应体系中进行lamp扩增反应，得到反应液；lamp扩增反应后进行结果判读。5.根据权利要求4所述的腺病毒7型的lamp检测方法，其特征在于，所述lamp反应体系包括：2μl待测物的基因组dna，20mm ph为8.8的tris
·
hcl，10mm kcl，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱，8mm mgso4，1.4mm dntp each，8u bst dna聚合酶，以及引物加入量为：40pmol正向内引物fip和反向内引物bip，20pmol环引物lf，5pmol正向外引物f3和反向外引物b3。6.根据权利要求4所述的腺病毒7型的lamp检测方法，其特征在于，所述lamp扩增反应条件为：置于60℃～67℃恒温反应55～60min。7.根据权利要求4所述的腺病毒7型的lamp检测方法，其特征在于，所述结果判读操作如下：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在腺病毒7型，橙色表示待测样品中不存在腺病毒7型；或者直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在腺病毒7型，浊度无变化表示待测样品中不存在腺病毒7型。8.根据权利要求7所述的腺病毒7型的lamp检测方法，其特征在于，所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，所述钙黄绿素指示剂包含有0.5mm钙黄绿素和10mm氯化锰。9.根据权利要求1-3任一项所述的腺病毒7型的lamp检测引物组在制备用于检测腺病毒7型的试剂或试剂盒中的应用。10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的腺病毒7型的lamp检测引物组。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及腺病毒7型的LAMP检测引物组和检测方法与应用、试剂盒，所述LAMP检测引物组基于如SEQ ID NO.1所示的腺病毒7型的特异性保守基因序列设计，用于定性检测待测样品中的腺病毒7型，该LAMP检测引物组包括5条专用引物，即正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LF。本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到腺病毒7型，不需要复杂仪器，为腺病毒7型的检测提供了一个新的技术平台，可用于农业生产单位筛查和检测腺病毒7型，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。适于大范围推广应用。适于大范围推广应用。


技术研发人员：刘冰 郝永建 高志丹
受保护的技术使用者：中国人民解放军火箭军特色医学中心
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/21