基因MoUPE5在调控稻瘟菌致病力中的应用

基因moupe5在调控稻瘟菌致病力中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域。更具体地，涉及基因moupe5在调控稻瘟菌致病力中的应用。


背景技术：

2.由稻瘟菌(magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产上最重要的病害之一。
3.稻瘟菌在水稻的整个生育期及其各组织部位皆可进行侵染，根据其发病时期部位的不同又可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等不同的类型。稻瘟病的大面积传播依赖于稻瘟病菌完备的侵染循环，主要包括分生孢子附着到寄主叶片的表面、分生孢子萌发产生芽管并形成侵染所需的附着胞、附着胞成熟形成侵染钉穿透寄主表皮和侵染菌丝在寄主细胞内进一步扩展等四个过程。在此循环中包含许多稻瘟菌致病因子，充分挖掘稻瘟菌致病相关基因并开展其功能研究，有助于全面了解稻瘟菌的致病分子机理，为稻瘟菌的防控提供理论基础，对稻瘟菌的防治具有重要的价值和意义。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供基因moupe5在调控稻瘟菌致病力方面的应用。
5.本发明的第二个目的是提供抑制基因moupe5表达的试剂在降低稻瘟菌致病力中的应用。
6.本发明的第三个目的是提供抑制基因moupe5表达的试剂在制备降低稻瘟菌致病力的产品中的应用。
7.本发明的第四个目的是提供基因moupe5的敲除载体在降低稻瘟菌致病力中的应用。
8.本发明的第五个目的是提供基因moupe5的敲除载体在制备降低稻瘟菌致病力的产品中的应用。
9.本发明的第六个目的是提供抑制基因moupe5表达的试剂在影响稻瘟菌细胞壁完整性中的应用。
10.本发明的第七个目的是提供抑制基因moupe5表达的试剂在制备影响稻瘟菌细胞壁完整性的产品中的应用。
11.本发明的第八个目的是提供基因moupe5的敲除载体在影响稻瘟菌细胞壁完整性中的应用。
12.本发明的第九个目的是提供基因moupe5的敲除载体在制备影响稻瘟菌细胞壁完整性的产品中的应用。
13.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
14.本发明通过基因敲除等试验鉴定得到了一个可调控稻瘟菌对水稻致病力的基因，命名为基因moupe5，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码区序列如seq id no.2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。鉴于敲除稻瘟菌中的基因moupe5可影响
其细胞壁完整性，显著降低稻瘟菌对水稻的致病力。因此，本发明申请保护以下应用：
15.本发明请求保护基因moupe5在调控稻瘟菌致病力方面的应用。
16.本发明还请求保护抑制基因moupe5表达的试剂在降低稻瘟菌致病力中的应用。
17.本发明还请求保护抑制基因moupe5表达的试剂在制备降低稻瘟菌致病力的产品中的应用。
18.敲除基因moupe5和抑制基因moupe5表达均可以使基因moupe5的表达受影响，从而使部分功能被屏蔽，进而对稻瘟菌造成影响。因此，抑制基因moupe5表达的试剂也可用于降低稻瘟菌致病力。
19.可选地，所述抑制基因moupe5表达的试剂为sirna，其可以通过抑制稻瘟菌中的基因moupe5的表达来实现降低稻瘟菌致病力目的。
20.含有抑制基因moupe5表达的试剂的用于防治稻瘟病的产品也应在本发明的保护范围之内。
21.本发明还请求保护基因moupe5的敲除载体在降低稻瘟菌致病力中的应用。
22.本发明还请求保护基因moupe5的敲除载体在制备降低稻瘟菌致病力的产品中的应用。
23.可选地，所述基因moupe5的敲除载体是利用丝状真菌表达载体pct74进行构建。
24.具体地，上述应用为降低稻瘟菌对水稻的致病力方面的应用。
25.本发明还请求保护抑制基因moupe5表达的试剂在影响稻瘟菌细胞壁完整性中的应用。
26.本发明还请求保护抑制基因moupe5表达的试剂在制备影响稻瘟菌细胞壁完整性的产品中的应用。
27.可选地，所述抑制基因moupe5表达的试剂为sirna，其可以通过抑制稻瘟菌中的基因moupe5的表达来实现影响稻瘟菌细胞壁完整性的目的。
28.本发明还请求保护基因moupe5的敲除载体在影响稻瘟菌细胞壁完整性中的应用。
29.本发明还请求保护基因moupe5的敲除载体在制备影响稻瘟菌细胞壁完整性的产品中的应用。
30.可选地，所述基因moupe5的敲除载体是利用丝状真菌表达载体pct74进行构建。
31.本发明具有以下有益效果：
32.本发明提供了一个未被表征的稻瘟菌蛋白moupe5及其编码基因moupe5的新功能，即基因moupe5可调控稻瘟菌的致病力。本发明通过构建稻瘟菌基因moupe5的敲除载体并将其导入稻瘟菌原生质体发现，敲除基因moupe5可以影响稻瘟菌细胞壁的完整性，显著降低稻瘟菌对水稻的致病力，而通过将基因moupe5回补回去则可使稻瘟菌基因moupe5敲除突变体的致病力恢复至野生型水平。因此，可将基因moupe5作为靶标基因开发稻瘟菌的杀菌剂，用于稻瘟病的防治。
33.本发明不仅有助于深入阐明稻瘟菌的致病分子机制，同时为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。
附图说明
34.图1为稻瘟菌moupe5基因敲除载体的构建示意图。
35.图2为利用hph基因特异性引物对部分潮霉素抗性转化子进行pcr验证分析的验证结果；其中，m：dl 2000marker；1：阳性对照(稻瘟菌野生型)；2～5，含潮霉素抗性的转化子δmoupe5-5、δmoupe5-9、δmoupe5-15、δmoupe5-44。
36.图3为利用moupe5基因特异性引物对部分潮霉素抗性转化子进行pcr验证分析的验证结果；其中，m：dl 2000marker；1：阳性对照(稻瘟菌野生型)；2～5，含潮霉素抗性的转化子δmoupe5-5、δmoupe5-9、δmoupe5-15、δmoupe5-44。
37.图4为利用moupe5基因特异性引物对部分博来霉素抗性转化子进行pcr验证分析的验证结果；其中，m：dl 5000marker；1～3：博来霉素抗性转化子δmoupe5-9-com-3、δmoupe5-9-com-5和δmoupe5-9-com-7；4：阴性对照(ddh2o)。
38.图5为稻瘟菌moupe5基因敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com在cm培养基和见里培养基上的菌落形态观察及生长速率测定结果；其中，图a为所述敲除突变体和回补突变体在cm和见里培养基上的菌落形态观察；图b为所述敲除突变体和回补突变体在cm培养基上的生长速率统计结果；数值为基于三个独立实验的平均值(
±
se)，采用duncan新复极差法分析(p＜0.05)，不同字母表示差异显著。
39.图6为稻瘟菌moupe5基因敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com在不同胁迫条件下的生长情况。
40.图7为稻瘟菌moupe5基因敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com在不同胁迫条件下的菌落生长抑制率；其中，图a为所述敲除突变体和回补突变体在cr胁迫下的菌落生长抑制率；图b为所述敲除突变体和回补突变体在cfw胁迫下的菌落生长抑制率；图c为所述敲除突变体和回补突变体在sds胁迫下的菌落生长抑制率；图d为所述敲除突变体和回补突变体在nacl胁迫下的菌落生长抑制率；图e为所述敲除突变体和回补突变体在山梨醇(sor)胁迫下的菌落生长抑制率；图f为所述敲除突变体和回补突变体在h2o2胁迫下的菌落生长抑制率；数值为基于三个独立实验的平均值(
±
se)，通过duncan新复极差法进行数据分析(p＜0.05)，不同字母表示差异显著。
41.图8为稻瘟菌moupe5基因敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com对水稻的致病性测定结果及病情指数统计结果；其中，图a为水稻的致病性测定结果；图b为病情指数统计结果；采用duncan新复极差法分析(p＜0.05)，不同字母表示差异显著。
具体实施方式
42.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
43.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
44.实施例1稻瘟菌moupe5基因的敲除和回补
45.1、实验材料
46.(1)供试菌株及植物
47.本发明实施例所用供试菌株为稻瘟菌(magnaporthe oryzae)广东省优势小种zc
13
，供试水稻为感病籼稻品系co39。
48.(2)宿主菌及质粒载体
49.本发明实施例所用克隆载体为pmd18-t vector，基因敲除载体为丝状真菌表达载体pct74，基因回补载体为pctzn(由华南农业大学植物病理生理学研究室在pct74质粒基础上改造得来，即将pct74上的sgfp和hph基因替换成博来霉素(zeocin)基因)。
50.2、实验方法
51.(1)稻瘟菌moupe5基因上下游同源片段的扩增
52.所述稻瘟菌moupe5基因的核苷酸序列如下(seq id no.1)所示，下划线部分为编码区序列(seq id no.2)。
53.agcccgtcttccgtgctgagacatgaactagacaagaagccagcagtctcacaagtagagttctctgcctttaattcagtcaacactccagcaatttccacttccagccaaccagatttctatcttcctcattgacaaaatcgtcatcatgaagttcctcggcctcaccaccctcctggccctcccgctggccatggctgcaccagccgccgagctcgtcgcaggcaatgtcttcatctgcacccagtcaggctggggtggagagtgccgtaacctctttgtcggcgccgccacaggggactggaggacgcaatgccagcgcctcccggagaactacgtccggaacattggctcggcgggtcccgatgcgggcgccctctgcaggctgtttgacaacgaccacagcgactgcaccggctccggcctcgccatcctgtccaggccgggaagcgacaacctgggagctgcgggtaagcaagctgtgtacatctcatgtgtcacttgcaccaactgcacctagaggagactgttagtctagtccactctagggctgcaggtataatgggtgtttaatgccacggtcgttgctggttggtggagcatggtgagcatgcagttagttgggcaacacagcccgagtggttgtggtcaattaatgtttcaatggatctggcttaatcggtgttagttagcttggttagctcgaattccatataatgtcttttttcctaaattagaaatgatcgtaggccctagaagtaggcggtttctgtattacaactgaggccatgtttttcgggaatttcacttgaaaacctggtcaggccggtgtaccgtcacgcgtggtattgat
54.其编码的分泌蛋白moupe5的氨基酸序列如下(seq id no.3)所示：
55.mkflglttllalplamaapaaelvagnvfictqsgwggecrnlfvgaatgdwrtqcqrlpenyvrnigsagpdagalcrlfdndhsdctgsglailsrpgsdnlgaagkqavyiscvtctnct
56.通过在ncbi数据库中比对，在moupe5基因的上游和下游各选取长度大小为1500bp左右的序列(分别命名为同源臂a片段和同源臂b片段)，并设计相应的扩增引物，用于构建基因敲除载体。稻瘟菌moupe5基因敲除载体的构建示意图如图1所示，通过同源重组将基因替换为gfp和hph基因片段，从而实现基因的敲除。本发明设计的稻瘟菌moupe5基因同源臂a片段和b片段的扩增引物如表1所示。
57.表1moupe5基因同源臂a片段和b片段的扩增引物
[0058][0059]
用真菌dna提取试剂盒(omega fungal dnakit)提取稻瘟菌基因组dna；以所得基因组dna为模板，用引物moupe5-af和moupe5-ar进行pcr扩增，获得moupe5基因的同源臂a片段(moupe5-a)；用引物moupe5-bf和moupe5-br进行pcr扩增，获得moupe5基因的同源臂b片段(moupe5-b)。
[0060]
pcr反应体系为：模板dna 0.5μl，moupe5-af/bf(10μmol/l)0.5μl，moupe5-ar/br(10μmol/l)0.5μl，2
×
tsingke master mix 12.5μl，ddh2o加至25.0μl。
[0061]
pcr反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min。
[0062]
反应结束后，用omega cycle pure kit试剂盒对pcr扩增产物进行清洁回收。
[0063]
(2)moupe5基因敲除载体的构建
[0064]
参考pmd 18-t vector cloning kit(takara公司)试剂盒说明书，将扩增得到的同源臂a片段(moupe5-a)和同源臂b片段(moupe5-b)分别与t载体连接，分别获得重组质粒pmd18t-moupe5-a和pmd18t-moupe5-b。
[0065]
具体的：取1μl pmd18-t载体，分别加入4μl pcr回收产物(同源臂a片段或同源臂b片段)和5μl solution i，16℃连接过夜；取10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上放置30min；42℃水浴热击90s后再冰上冷却5min；加入800μl lb液体培养基，37℃、150rpm振荡培养45min；4000rpm离心5min，弃上清，留100μl菌液与沉淀混匀，涂布于lb固体培养基(含50μg/ml amp)；37℃培养8～12h。挑取具有amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒dna并进行测序鉴定，保存经测序确认序列无误的重组质粒及其菌液。
[0066]
用sma i和spe i分别对pmd18t-moupe5-b和pct74载体进行双酶切，回收同源臂b片段和线性化的pct74载体；用t4 dna连接酶将同源臂b片段与pct74连接，采用与前述相同的方法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，获得重组质粒pct74-moupe5-b。用xho i分别酶切重组质粒pmd18t-moupe5-a和pct74-moupe5-b，回收同源臂a片段和线性化的重组质粒pct74-moupe5-b；用in-fusion hd cloning kit(takara 121416)连接酶将同源臂a片段与pct74-moupe5-b连接，转化大肠杆菌dh5α；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pct74-moupe5-ko。
[0067]
(3)moupe5回补片段的扩增
[0068]
在moupe5基因的上游选取长度1034bp的启动子序列，下游选取长度为1113bp的终止子序列，并设计相应的扩增引物，如表2所示：
[0069]
表2moupe5基因回补片段的扩增引物
[0070][0071]
用真菌dna提取试剂盒(omega fungal dnakit)提取稻瘟菌基因组dna；以该基因组dna为模板，用引物moupe5-com-f和moupe5-com-r进行pcr扩增，获得moupe5基因的回补片段(moupe5-com)。
[0072]
pcr反应体系为：模板dna1.0μl，moupe5-com-f(10μmol/l)1.0μl，moupe5-com-r(10μmol/l)1.0μl，10
×
taq buffer(mg
2+
plus)5.0μl，dntps(2.5mmol/l)4.0μl，extaq(5u/μl)0.25μl，ddh2o补足50.0μl。
[0073]
pcr反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，55℃反应30s，72℃反应4min，共35个循环；72℃反应10min。
[0074]
反应结束后，用omega cycle pure kit试剂盒对pcr扩增产物进行清洁回收。
[0075]
(4)moupe5基因回补载体的构建
[0076]
用sma i和spe i分别对moupe5-com和pctzn载体进行双酶切，回收moupe5-com片段和线性化的pctzn载体；用t4 dna连接酶将moupe5-com片段与pctzn连接并转化大肠杆菌dh5α；获得重组质粒pctzn-moupe5-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pctzn-moupe5-com。
[0077]
(5)稻瘟菌原生质体的制备
[0078]
在见里培养基(酵母浸膏5.0g，可溶性淀粉22g，琼脂粉17.0g，蒸馏水定容至1l)平板上活化稻瘟病菌，28℃倒置培养10d左右；用灭菌镊子镊取见里培养基上的菌丝碎片，移至yps培养基(酵母提取物6g，水解酪蛋白6g，蔗糖10g，蒸馏水定容至1l)中，28℃、120rpm振荡培养2d；将上述培养物用200目细胞筛过滤，将其倒入灭菌的研钵中研碎，再将其转移至yps液体培养基中，28℃、120rpm振荡培养1d；用200目细胞筛过滤菌丝，用无菌水冲洗菌丝2次，再用无菌的0.8mol/l nacl溶液冲洗1次，用灭菌镊子将菌丝夹至灭菌培养皿中称重；向离心管中加入10mg/ml溶壁酶酶液，30℃、80～110rpm振荡消解1h左右；用灭菌无尘纸过滤收集消解液，装于预冷的离心管中，4℃条件下，3500rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于预冷的stc(含1.2m山梨醇，10mm tris-hcl，ph 7.5，50mm cacl2)；4℃、5000rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于1ml stc；用血球计数板计算原生质体浓度；加入适量预冷的stc，并使原生质体终浓度控制在1
×
107个/ml。
[0079]
稻瘟菌敲除突变体原生质体的获得参照上述稻瘟菌原生质体的制备步骤进行。
[0080]
(6)稻瘟菌原生质体的转化
[0081]
用xba i对敲除载体pct74-moupe5-ko进行单酶切，获得a-hph-sgfp-b片段；将10μg的a-hph-sgfp-b片段与200μl原生质体混匀；或将pctzn-moupe5-com质粒与稻瘟菌敲除突变体原生质体混匀；冰浴20min；加入ptc转化缓冲液(60％ peg4000，50mmol/l cacl2，10mmol/l tris-hcl，ph7.5)，混匀后于室温下放置20min；4℃下5000rpm离心10min；弃上清，用再生液体培养基(酵母提取物6.0g，水解酪蛋白6.0g，蔗糖200.0g，蒸馏水定容至1l)重悬沉淀，转移至灭菌的康宁管中，加入再生液体培养基，28℃、100rpm轻摇复苏培养16～18h；将复苏原生质体加入再生固体培养基(再生液体培养基中含1.5％琼脂粉和200μg/ml潮霉素)中，混匀倒板，于28℃条件下倒置培养3～4d；挑取含潮霉素抗性的转化子单菌落用于鉴定。
[0082]
(7)稻瘟菌敲除突变体的pcr验证分析
[0083]
按照真菌dna提取试剂盒(omega fungal dna kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组dna，进行pcr验证分析；分别用引物hph-f/hph-r进行hph基因片段的pcr扩增；用引物moupe5-f/moupe5-r进行moupe5基因片段的pcr扩增分析。
[0084]
hph-f：5
′‑
ttctgcgggcgatttgtgta-3
′
，
[0085]
hph-r：5
′‑
aaaaagcctgaactcaccgc-3
′
；
[0086]
moupe5-f：5
′‑
ggtggaaagtacgacccctg-3
′
，
[0087]
moupe5-r：5
′‑
ggctgtgttgcccaactaac-3
′
；
[0088]
pcr反应体系为：模板dna0.5μl，moupe5-f/hph-f(10μmol/l)0.5μl，moupe5-r/hph-r(10μmol/l)0.5μl，2
×
tsingke master mix 12.5μl，ddh2o补足25.0μl。
[0089]
pcr反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共35
个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。
[0090]
(8)moupe5回补突变体的pcr验证分析
[0091]
按照真菌dna提取试剂盒法(omegafungal dna\kit)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组dna，进行pcr验证分析；用引物moupe5-f/moupe5-r进行基因片段moupe5的pcr扩增。
[0092]
pcr反应体系为：模板dna0.5μl，moupe5-f/hph-f(10μmol/l)0.5μl，moupe5-r/hph-r(10μmol/l)0.5μl，2
×
tsingke master mix 12.5μl，ddh2o补足25.0μl。
[0093]
pcr反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。
[0094]
3、实验结果
[0095]
本发明利用利用同源重组方法，将基因敲除载体转化稻瘟菌原生质体，获得了48个潮霉素阳性转化子。利用hph基因特异性引物对其中发4个潮霉素阳性转化子进行了pcr验证分析，结果如图2所示；由图2可知，在所述的4个转化子中均扩增到了hph基因。在此基础上，进一步利用moupe5基因特异性引物，对上述pcr扩增到hph基因的4个阳性转化子进行moupe5的pcr验证分析，结果如图3所示；由图3可知，在所述的4个转化子中均没有扩增到moupe5基因。上述结果表明，所选的这4个转化子均为阳性转化子，即本发明成功获得了moupe5基因的敲除突变体δmoupe5。
[0096]
利用随机插入的方法，本发明将基因回补载体pctzn-moupe5-com转化稻瘟菌敲除突变体δmoupe5(δmoupe5-9)的原生质体，获得了5个博来霉素阳性转化子。经基因组dna的提取，利用moupe5基因特异性引物，对这些阳性转化子进行了pcr验证分析，结果如图4所示；由图4可知，获得的博来霉素阳性转化子中，有3个阳性转化子可扩增到目的基因片段，说明这3个转化含有moupe5基因，证实这3个转化子为阳性转化子，即本发明成功获得了moupe5基因的回补突变体δmoupe5-com。
[0097]
实施例2稻瘟菌敲除突变体和回补突变体的表型观察及抗胁迫能力分析
[0098]
1、菌落形态观察及生长速度测定
[0099]
将稻瘟菌野生型、敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com分别接种于见里培养基上和cm培养基上，于28℃黑暗条件下培养，在7d时采用十字交叉法测量菌落直径，并观察其菌落形态；每个处理设置3个重复。
[0100]
稻瘟菌moupe5基因敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com在cm培养基和见里培养基上的菌落形态观察及生长速率测定结果如图5所示，图5中的a为所述敲除突变体和回补突变体在cm和见里培养基上的菌落形态观察；图5中的b为所述敲除突变体和回补突变体在cm培养基上的生长速率统计结果。由图5可知，稻瘟菌moupe5基因敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com在cm和见里培养基上的菌落形态及生长速率与稻瘟菌野生型没有显著差异。
[0101]
2、抗胁迫能力分析
[0102]
(1)氧化胁迫分析
[0103]
将稻瘟菌野生型、敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com分别接种在含有20mmol/l h2o2的见里培养基上，于28℃培养箱倒置培养10d后，观察敲除突变体δmoupe5、回补突变体δmoupe5-com和野生型菌株的菌落生长情况。
[0104]
(2)细胞壁完整性分析
[0105]
将稻瘟菌野生型、敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com分别接种在含有400μg/ml刚果红(cr)和0.2mg/ml荧光增白剂(cfw)的见里培养基上，于28℃培养箱倒置培养10d后，观察敲除突变体δmoupe5、回补突变体δmoupe5-com和野生型菌株的菌落生长情况。
[0106]
(3)高渗透压胁迫分析
[0107]
将稻瘟菌野生型、敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com分别接种在含有1mol/l nacl、1mol/l山梨醇(sor)以及含有0.02％ sds的见里培养基上，于28℃培养箱倒置培养10d后，观察敲除突变体δmoupe5、回补突变体δmoupe5-com和野生型菌株的菌落生长情况。
[0108]
稻瘟菌moupe5基因敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com在不同胁迫条件下的生长情况如图6所示，其在不同胁迫条件下的菌落生长抑制率结果如图7所示，图7中a～f依次为所述敲除突变体和回补突变体在cr、cfw、sds、nacl、山梨醇(sor)和h2o2胁迫下的菌落生长抑制率；通过duncan新复极差法进行数据分析(p＜0.05)，不同字母表示差异显著。由图6和图7可知，在含20mmol/l h2o2、0.01％ sds、0.8mol/l nacl和0.8mol/l山梨醇的见里培养基中，与稻瘟菌野生型和回补突变体相比，δmoupe5敲除突变体的菌落生长情况相似，其菌落生长抑制率没有显著差异。在分别含200μg/ml刚果红和0.1mg/ml cfw的见里培养基中，与稻瘟菌野生型和回补突变体相比，敲除突变体δmoupe5的菌落明显变小，其菌落生长抑制率均显著大于野生型和回补突变体，说明moupe5的敲除影响了稻瘟菌的细胞壁完整性。
[0109]
实施例3稻瘟菌敲除突变体和回补突变体的致病性分析
[0110]
分别取5ml稻瘟菌野生型、敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com的浓度为1
×
105个/ml分生孢子液(含0.05％ tween-20)，喷雾接种于四叶期水稻幼苗，于28℃条件下12h光照/12h黑暗并保湿培养，5d后进行调查水稻叶片的发病情况。
[0111]
稻瘟菌moupe5基因敲除突变体δmoupe5和回补突变体δmoupe5-com对水稻的致病性测定结果及病情指数统计结果如图8所示；图8中的a为水稻的致病性测定结果；图8中的b为病情指数统计结果。由图8中的a可知，在水稻叶片上，与稻瘟菌野生型相比，敲除突变体δmoupe5的病斑数量较少，而δmoupe5-com的致病力基本恢复到野生型水平。病情指数统计结果(图8中的b)表明回补突变体δmoupe5-com与稻瘟菌野生型的病情指数相似，说明回补突变体δmoupe5-com致病力恢复到野生型水平；同时，敲除突变体δmoupe5的病情指数显著低于野生型和回补突变体，说明敲除moupe5基因后，稻瘟菌致病力明显下降。
[0112]
由上述陈述可知，本发明提供的moupe5基因可以用于稻瘟病的防治，特别是由稻瘟菌所导致的稻瘟病。另本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是稻瘟病的药物。
[0113]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.基因moupe5在调控稻瘟菌致病力方面的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.抑制基因moupe5表达的试剂在降低稻瘟菌致病力中的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.抑制基因moupe5表达的试剂在制备降低稻瘟菌致病力的产品中的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。4.基因moupe5的敲除载体在降低稻瘟菌致病力中的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。5.基因moupe5的敲除载体在制备降低稻瘟菌致病力的产品中的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。6.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述应用为降低稻瘟菌对水稻的致病力方面的应用。7.抑制基因moupe5表达的试剂在影响稻瘟菌细胞壁完整性中的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。8.抑制基因moupe5表达的试剂在制备影响稻瘟菌细胞壁完整性的产品中的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。9.基因moupe5的敲除载体在影响稻瘟菌细胞壁完整性中的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。10.基因moupe5的敲除载体在制备影响稻瘟菌细胞壁完整性的产品中的应用，其特征在于，所述基因moupe5的核苷酸序列如seq id no.1所示。

技术总结
本发明公开了基因MoUPE5在调控稻瘟菌致病力中的应用。本发明通过构建稻瘟菌基因MoUPE5的敲除载体并将其导入稻瘟菌原生质体发现，基因MoUPE5可以影响稻瘟菌细胞壁的完整性，显著降低稻瘟菌对水稻的致病力，而通过将基因MoUPE5回补回去则可使稻瘟菌基因MoUPE5敲除突变体的致病力恢复至野生型水平。因此，可将基因MoUPE5作为靶标基因开发稻瘟菌的杀菌剂，用于稻瘟病的防治。本发明不仅有助于深入阐明稻瘟菌的致病分子机制，同时为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。杀菌剂提供了靶标基因。杀菌剂提供了靶标基因。


技术研发人员：李云锋 李冠军 聂燕芳 李洁玲 舒德扬 李华平
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/21