可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器的制作方法

1.本发明属于骨组织工程再生医学及细胞生物力学领域，具体涉及一种对骨软骨一体化支架分层灌流的生物反应装置，可以分层培养软骨层和下骨层的种子细胞。


背景技术：

2.近年来，随着组织工程再生医学的不断发展，为骨软骨损伤后的修复与再生带来了新的希望。组织工程再生医学主要包括三个因素：生物支架、种子细胞和生长因子，其中生物支架作为骨软骨缺损修复再生过程中种子细胞和周围正常组织细胞生长、增殖和分化的基础，利用合适的组织工程骨软骨一体化支架，可以优先帮助解决骨软骨损伤后的修复和再生难题。但是在实际应用中，由于支架为种子细胞提供的微环境与实验动物体内的局部微环境相差甚远，所以骨软骨一体化支架在植入人体之前，需要先在体外进行培养，模拟细胞在动物体内真实的生长环境。组织工程生物反应器是一种为离体组织或器官体外培养提供合适培养环境的人工装置，最终目的是为组织或器官培养模拟出和体内相同或相近的生理环境。
3.现有的生物反应器基本上都是对单独软骨层的支架整体进行灌流培养，对骨软骨一体化支架灌流的生物反应器较少，没有很好的实现不同层区支架的分层灌流培养，所得到的结果与细胞在人体中正常生长的结果有较大差距。


技术实现要素：

4.本发明目的是针对现有骨软骨生物反应器基本上都是对单独软骨层的支架整体进行灌流培养，没有实现对不同层区支架的分层灌流培养进而与细胞在人体中正常生长的结果有较大差距的问题，提供一种可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器。本发明解决了骨软骨一体化支架由于同时存在下骨层和软骨层，而无法将支架整体进行灌流培养的问题。
5.本发明技术方案：
6.为了在体外对骨软骨一体化支架进行灌流培养，应当使支架内的种子细胞在体外培养的形式与种子细胞在体内生存的环境更加接近，并且应保证支架下骨层种子细胞培养液与软骨层种子细胞培养液相互隔离，这样才能得出更加准确的数据。
7.为实现上述发明目的，本发明提供的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器包括带有支架放置台(4)的加载底座(3)，软骨层培养室(1)套装在支架放置台上，加载底座上的支架放置台(4)上端放置有骨软骨一体化支架(14)，通过调整支架放置台的高度，使骨软骨一体化支架的软骨层支架(19)暴露在软骨层培养室(1)内、使下骨层支架(17)暴露在下骨层培养室(2)内，下骨层培养室与软骨层培养室的上方开口之间通过骨软骨一体化支架(14)和密封圈(11)封闭连接，下骨层培养室的上方设置有吻合密封盖(12)以及下骨营养液输入管(15)和下骨营养液输出管(16)。软骨层培养室上分别设置有软骨营养液输入管(7)和软骨营养液输出管(8)。所述软骨层培养室(1)内壁与支架放置台(4)间设置有隔板
(6)，隔板将软骨层培养室上设置的营养液输入管(7)和营养液输出管(8)分置于隔板两侧。所述隔板上方开设有与下骨层培养室(2)外周截面吻合的支撑槽，用于辅助支撑下骨培养室。所述软骨层培养室(1)通过底部的安装固定孔套装在支架放置台(4)上，软骨层培养室底部与加载底座之间的支架放置台上套装有软骨层培养室底部密封圈(5)。骨软骨一体化支架总高度为4.5mm，直径3.5mm。一共包括三层，其中，下骨层支架高2mm、钙化层支架高1mm和软骨层支架高1.5mm。软骨层支架直接和支架放置台接触。
8.所述下骨层培养室(2)通过底部的定位孔套装在骨软骨一体化支架(14)上。所述下骨层培养室(2)底部的定位孔与骨软骨一体化支架(14)间设置有下骨培养室密封圈(11)。下骨层培养室(2)顶部设有加载孔，使用密封盖(12)覆盖，在骨软骨一体化支架需要加载时，打开密封盖使加载棒直接作用在下骨层支架，使得下骨层支架承受较大的压缩载荷，软骨层支架承受较小的压缩力。所述软骨层培养室(1)和下骨层培养室(2)的环形固定沿相对一面上分别设置有用于定位的环形凹槽或凸槽(13)；所述软骨层培养室(1)和下骨层培养室(2)的环形固定沿上对应位置分别至少开设有两个以上固定螺栓孔并通过螺栓固定连接在一起。
9.本发明的优点和有益效果：
10.本发明可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器设置有两个相互密闭的培养室，可以实现骨软骨一体化支架双培养反应器的分层灌流培养，达到模拟动物体内软骨细胞和下骨细胞生长的效果；通过调节蠕动泵对骨软骨一体化支架双培养反应器进行不同灌流速度下的体外培养，可以更真实的模拟骨软骨一体化支架双培养反应器内种子细胞在动物体内的生长环境：从而能够更加精准的模拟骨软骨一体化支架双培养反应器内种子细胞在体内生长时的发育及分化情况；通过设计定制两个相互独立的培养室，避免了在进行灌流培养时由于只能对支架整体进行灌流，而舍弃下骨层支架只保留软骨层支架的实验操作，进而保证了支架结构的完整；使得体外培养骨软骨一体化支架双培养反应器内更接近体内软骨细胞真实生长的过程。
附图说明
11.图1是本发明可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器的整体结构示意图；
12.图2是本发明可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器x-z面(即软骨营养液输入管和软骨营养液输出管所在平面)的剖面示意图；
13.图3是本发明可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器的y-z面的剖面示意图；
14.图4是本发明图3中a部的加载底座结构局部放大示意图；
15.图5是本发明骨软骨一体化支架结构示意图；
16.图6是本发明可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器的软骨层培养室结构示意图；
17.图7是本发明可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器的下骨层培养室的示意图；
18.图中：1-软骨层培养室，2-下骨层培养室，3-加载底座，4-支架放置台，5-软骨培养室底部密封圈，6-隔板，7-软骨营养液输入管，8-软骨营养液输出管，9-螺栓孔，10-螺栓，
11-下骨培养室密封圈，12-吻合密封盖，13-定位凹槽，14-骨软骨一体化支架，15-下骨营养液输入管，16-下骨营养液输出管，17-下骨层支架，18-钙化层支架，19-软骨层支架。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
21.请参阅图1～图7，本发明实施例中提供的一种可在线灌流的骨软骨一体化支架(分层灌流的)双培养生物反应器，如图1图和图2所示，在加载底座(3)上设有柱状支架放置台(4)，软骨层培养室(1)通过底部的安装固定孔套装在支架放置台(4)上。软骨层培养室(1)内壁与支架放置台(4)间设置有隔板(6)，隔板(6)分别设置于支架放置台(4)的两侧，上方开设有与下骨层培养室(2)外周截面吻合的支撑槽，用于辅助支撑下骨层培养室，如图5所示。下骨层培养室(2)通过底部的定位孔套装在骨软骨一体化支架(14)上，骨软骨一体化支架(14)设置在支架放置台(4)上端，下骨层培养室的上方开口处设置有吻合密封盖(12)。
22.所述下骨层培养室(2)开口上缘设置有向外翻折的环形封闭固定沿，软骨层培养室(1)开口上缘同样设置有向外翻折的用于和下骨层培养室(2)固定连接的环形固定沿。软骨层培养室(1)的环形固定沿上表面设置有用于定位的环形凹槽(13)，如图6所示。下骨层培养室(2)的环形封闭固定沿的下表面上设置有用于和软骨层培养室(1)上的凹槽配合并定位的环形凸槽(13)，如图7所示。软骨层培养室(1)和下骨层培养室(2)的环形固定沿上对应位置分别至少开设有两个以上固定螺栓孔(9)，如图6和图7所示，本实施例设置有4个螺栓孔，并通过螺栓(10)将软骨层培养室(1)和下骨层培养室(2)固定连接在一起，使软骨层培养室(1)上端开口处呈封闭连接。
23.使用方法是，先将加载底座(3)固定，然后依次将软骨层培养室底部密封圈(5)和软骨层培养室(1)套装在支架放置台(4)上，再将下骨层培养室(2)放置在软骨层培养室(1)上，通过螺栓(10)和定位凹槽(13)将下骨层培养室(2)和软骨层培养室(1)固定连接在一起，如图2至图4所示。此时用注射器将制备好的软骨细胞悬液和成骨细胞悬液分别均匀地滴加到骨软骨一体化支架的软骨层(19)和下骨层(17)上，将细胞/骨软骨一体化支架复合体插入下骨层培养室(2)底部的定位孔中，使骨软骨一体化支架的软骨层支架(19)暴露在软骨层培养室(1)内、使下骨层支架(17)暴露在下骨层培养室(2)内，再将下骨层培养室密封圈(11)套装在骨软骨一体化支架(14)上，置入设计的双培养室内进行培养，然后盖上吻合密封盖(12)，最后再将软骨层培养室(1)上设置的营养液输入管(7)与营养液输出管(8)与外部的蠕动泵接通进行循环灌流。由于隔板和下骨层培养室封堵了培养液的流通路径，则培养液只能通过软骨层支架的空隙实现流通，使软骨层支架受到充分的流体剪切力。
24.加载底座和软骨层培养室之间放置密封圈，可防止营养液渗出。在加载底座上装配的支架放置台，可以根据软骨支架的高度来调整支架放置台的高度。
25.所述软骨层培养室主体内固定有隔板，并与支架放置台和下骨层培养室相吻合，营养液输入管和营养液输出管呈两侧分布，使培养液只能通过加载物处的空隙实现流通。
26.所述软骨层培养室顶部设置有凹槽与下骨层培养室顶部的凹槽相吻合，两个培养室顶部设置有四个螺栓孔，将下骨层培养室放置在软骨层培养室之上，下骨层培养室的高度大概在软骨层培养室的一半左右，在凹槽和紧固螺栓的限制下，两个培养室不会发生左右晃动和偏移，可以使培养过程更加准确稳定。
27.所述的下骨层培养室下端设置可以容纳支架的通孔，通孔上侧设置密封圈凹槽，凹槽内放置下骨层培养室密封圈(11)防止下骨层培养室内的培养液渗流，如图4所示。下骨层培养室顶部设置有密闭吻合盖，保证培养室无菌密封。
28.所述的软骨层培养室顶部设置有营养液输入管和输出管，输入输出管分别与外部蠕动泵的硅胶管道相连接，通过调节蠕动泵，进行不同灌流速度下的持续灌流培养，为骨软骨一体化支架内细胞提供有效的营养供给和气体交换。
29.尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内，且本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

技术特征：
1.一种可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于，包括带有支架放置台(4)的加载底座(3)，软骨层培养室(1)套装在支架放置台上，支架放置台(4)上端放置有骨软骨一体化支架(14)，通过调整支架放置台的高度，使骨软骨一体化支架的软骨层支架(19)暴露在软骨层培养室(1)内、使下骨层支架(17)暴露在下骨层培养室(2)内，下骨层培养室与软骨层培养室的上方开口之间通过骨软骨一体化支架(14)和密封圈(11)封闭连接，下骨层培养室的上方设置有吻合密封盖(12)以及下骨营养液输入管(15)和下骨营养液输出管(16)，软骨层培养室上分别设置有软骨营养液输入管(7)和软骨营养液输出管(8)。2.根据权利要求1所述的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于，所述软骨层培养室(1)内壁与支架放置台(4)间设置有隔板(6)，隔板将软骨层培养室上设置的软骨营养液输入管(7)和软骨营养液输出管(8)分置于隔板两侧，使软骨培养液只能通过软骨层支架附近的空隙实现流通。3.根据权利要求2所述的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于，所述隔板上方开设有与下骨层培养室(2)外周截面吻合的支撑槽，用于辅助支撑下骨层培养室。4.根据权利要求1任一项所述的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于，所述软骨层培养室(1)通过底部的安装固定孔套装在支架放置台(4)上，软骨层培养室底部与加载底座之间的支架放置台上套装有软骨层培养室底部密封圈(5)。5.根据权利要求1所述的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于，所述骨软骨一体化支架高4.5mm，直径3.5mm；一共包括三层，其中，下骨层支架(17)高2mm、钙化层支架(18)高1mm和软骨层支架(19)高1.5mm，软骨层支架直接和支架放置台接触。6.根据权利要求1所述的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于，所述下骨层培养室(2)通过底部的定位孔套装在骨软骨一体化支架(14)上。7.根据权利要求6所述的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于，所述下骨层培养室(2)底部的定位孔与骨软骨一体化支架(14)间设置有下骨层培养室密封圈(11)。8.根据权利要求1所述的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于：下骨层培养室(2)顶部设有加载孔，使用吻合密封盖(12)覆盖，在骨软骨一体化支架需要加载时，打开密封盖使加载棒直接作用在下骨层支架，使得下骨层支架承受较大的压缩载荷，软骨层支架承受较小的压缩力。9.根据权利要求8所述的可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，其特征在于，所述软骨层培养室(1)和下骨层培养室(2)的环形固定沿相对一面上分别设置有用于定位的环形凹槽或凸槽(13)；所述软骨层培养室(1)和下骨层培养室(2)的环形固定沿上对应位置分别至少开设有两个以上固定螺栓孔并通过螺栓固定连接在一起。

技术总结
一种可在线灌流的骨软骨一体化支架双培养反应器，涉及骨组织工程及细胞生物力学领域。该生物反应器包括无菌软骨层培养室、无菌下骨层培养室、带有支架放置台的加载底座和密封盖。下骨层培养室底部定位孔内放置骨软骨一体化支架，该支架与支架放置台相接触，使含有软骨细胞悬液的软骨层支架朝下并放置在软骨层培养室内，下骨层支架放置在下骨层培养室内。两个培养室相互独立且密闭，保证了支架结构的完整，这样有利于实现骨软骨一体化支架的分层灌流培养，达到体外模拟细胞生长和分化的效果。在无菌下骨层培养室上方设有密封盖，在需要对支架进行加载时打开该密封盖，加载装置通过上方孔洞，对支架进行加载。对支架进行加载。对支架进行加载。


技术研发人员：刘文彬
受保护的技术使用者：天津市天津医院
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/21