一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌突变株及其应用

1.本发明涉及微生物诱变育种技术领域，具体是一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌突变株及其应用。


背景技术：

2.褐藻胶是存在于褐藻细胞壁中的一种高分子多糖，主要由β-d-甘露糖醛酸(β-d-mannuronate acid，m)与其c5差向异构体α-l-古罗糖醛酸(α-l-guluronic acid，g)通过1,4糖苷键随机排列聚合而成。目前，褐藻胶已成为产量仅次于纤维素的可持续发展资源，具有巨大的应用价值。褐藻胶裂解酶是制备褐藻寡糖的关键工具酶，褐藻胶裂解酶通过β消除反应作用单体间的1,4-糖苷键；微生物来源的褐藻胶裂解酶大多数是同时具备降解两种糖醛酸片段的能力，其降解产生的不饱和键可能会改善褐藻寡糖的某些理化性质，从而提高寡糖的生物活性。
3.除褐藻外，少数细菌如假单胞菌属(pseudomonas)、固氮菌属(azotobacter)、弧菌属(vibrio)也会产生褐藻胶裂解酶；由于现有微生物的产酶量少、酶活低，限制了其进一步开发应用，因此寻找新的高效产酶菌、提高菌株发酵酶活力是迫切需要解决的问题。
4.诱变是提高微生物发酵产酶水平的有效方法之一，已成为微生物诱变育种的重要技术。常温常压等离子体(atmosphe ricandroom temperature plasma，artp)诱变育种，是指在常温常压环境下通过产生高活性的等离子体射流，致使细胞受到多样性的损伤，其富含高能化学活性粒子，可对微生物造成遗传物质的损伤、引起细胞膜的结构和通透性改变、引起蛋白结构的改变等，从而引起基因突变，导致微生物性状和代谢产生变化；硫酸二乙酯(diethyl sulfate，des)是一种化学诱变剂，可以诱导微生物的碱基发生变化，引起基因突变。artp和des诱变育种都是一种微生物基因组高效快速诱变育种技术，操作简便、成本低、效率高。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌突变株，申请人以弗氏弧菌c1(vibrio furnissii c1)为出发菌株，经过四次artp诱变和两次des诱变，筛选获得褐藻胶裂解酶产量明显提高的突变菌株，酶活力较野生菌株提升了41％，且遗传特性稳定，将其命名为弗氏弧菌c3-2(vibrio furnissii c3-2)。
6.本发明技术方案如下：
7.一株弗氏弧菌c3-2(vibrio furnissii c3-2)，该菌株于2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2023411，地址：中国，武汉，武汉大学。
8.其中，所述弗氏弧菌c3-2是以弗氏弧菌c1为出发菌株，通过artp诱变和des诱变的方法筛选获得。
9.优选的，所述弗氏弧菌c3-2的培养方法，包括如下步骤：
10.将弗氏弧菌c3-2划线分纯后，挑取单菌落接种于种子培养基中，28
±
2℃，150～
200r/min条件下恒温培养，得弗氏弧菌c3-2菌液。
11.优选的，所述种子培养基的组分为：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，海藻酸钠2.0g，磷酸高铁0.01g，海水缓冲液1l，ph 7.4～7.6；其中，所述海水缓冲液的组分为：海盐30g，去离子水1l。
12.上述弗氏弧菌c3-2可以应用于生产褐藻胶裂解酶，且褐藻胶裂解酶产量相比于原始菌株弗氏弧菌c1明显提高。
13.优选的，所述弗氏弧菌c3-2生产褐藻胶裂解酶的方法，包括如下步骤：
14.将上述弗氏弧菌c3-2菌液接种至发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的1～5％，28
±
2℃，150～200r/min条件下恒温发酵，得发酵液，离心取上清，上清液即为褐藻胶裂解酶粗酶液。
15.优选的，所述发酵培养基的组成为：磷酸二氢钾(kh2po4)1.5g，蛋白胨6.0g，褐藻酸钠4.0g，硫酸亚铁(fe2so4)0.01g，七水硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.01g，海水缓冲液1l，ph 7.0；其中，所述海水缓冲液的组分为：海盐30g，去离子水1l。
16.本发明弗氏弧菌c3-2生产的褐藻胶裂解酶的最适反应温度为20℃，且在15～40℃中可以发挥60％以上的酶活力；最适反应ph为8.0，在ph为7.0～9.0的底物环境中可以发挥60％以上的酶活性，且在ph 9.0的碱性环境中依然可以发挥80％左右的酶活力，这表明弗氏弧菌c3-2所产生的褐藻胶裂解酶对碱性环境的耐受性更强。
17.所述artp诱变和des诱变的方法，具体包括如下步骤：
18.s1，菌悬液制备：先将弗氏弧菌c1在固体平板上划线分纯，然后挑取长势良好的单菌落接种在种子培养基，培养至对数生长期，离心收集菌体，用等体积的海水缓冲液清洗两遍，然后用等体积的海水缓冲液重悬，稀释成od
600
为0.4左右的菌悬液；
19.s2，artp诱变处理：取s1中所述菌悬液10μl均匀涂布在artp诱变仪配套的无菌小铁片上；artp诱变仪功率设置120w，气流通量10slm(standard liter per minute)，冷却水循环系统为20℃，诱变时间为20s；诱变结束后，迅速用无菌尖头镊子取出小铁片，装到含有990μl无菌海水缓冲液的1.5ml离心管中，在漩涡振荡器震荡混匀1min，混匀后在超净工作台中用海水缓冲液稀释103倍，取100μl均匀涂布在固体平板上，每个时间梯度涂布3个固体平板作为平行，待平板表面的菌液晾干后，用封口膜封口倒置在恒温生化培养箱，28℃培养12h后进行后续筛选，以筛选到的酶活力最高的菌株为下一轮artp诱变的出发菌株，进行迭代诱变；
20.s3，des诱变处理：将筛选得到的artp诱变菌株划线分纯，待其长出单菌落后，接种在20ml种子培养基中，在28℃、200r/min的恒温摇床培养至od
600
为1.0左右；1ml种子液与1ml des溶液混合为反应液，在30℃、200r/min恒温摇床中诱变20min，然后迅速加入2ml的硫代硫酸钠溶液作为终止剂，并于漩涡振荡器混匀终止反应；反应液用海水缓冲液稀释103倍，取100μl均匀涂布在固体平板上，每个时间梯度涂布3个固体平板作为平行，待平板表面的菌液晾干后，用封口膜封口倒置于恒温生化培养箱，28℃培养12h后进行筛选得到相对酶活较高的菌株，以此菌株为下一轮des诱变的出发菌株，进行迭代诱变；
21.经过四次artp诱变和两次des诱变，结合平板初筛法与dns酶活测定法筛选出所需突变株弗氏弧菌c3-2(vibrio furnissii c3-2)，弗氏弧菌c3-2所产生褐藻胶裂解酶的酶活力较野生菌株弗氏弧菌c1提升了41％左右。
22.有益效果：本发明提供了一株高产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌c3-2，弗氏弧菌c3-2所产生褐藻胶裂解酶的酶活力较野生菌株提升了40％以上，且褐藻胶裂解酶对碱性环境的耐受性更强，同时遗传特性稳定，具有良好的工业发展前景。
附图说明
23.图1为第一轮artp诱变所得突变株与出发菌株弗氏弧菌c1的酶活测定结果；
24.图2为第二轮artp诱变所得突变株与出发菌株1-6的酶活测定结果；
25.图3为第三轮artp诱变所得突变株与出发菌株2-2的酶活测定结果；
26.图4为第四轮artp诱变所得突变株与出发菌株3-3的酶活测定结果；
27.图5为第一轮des诱变所得突变株与出发菌株c2的酶活测定结果；
28.图6为第二轮des诱变所得突变株与出发菌株c2-22的酶活测定结果；
29.图7为突变前后的菌株生长折线图；
30.图8为突变前后的菌株产酶折线图；
31.图9为突变前后的粗酶液酶活力柱状图；
32.图10为不同反应温度下的酶活力折线图；
33.图11为不同反应ph下的酶活力折线图。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例进行说明：
35.实施例：
36.本实施例所用野生菌株来源：弗氏弧菌c1(vibrio furnissii c1)，为本实验室前期筛选获得，经16s rdna鉴定，与gene bank中数据进行比对，与众多vibrio sp.有99％的相似性，结果显示与弗氏弧菌(vibrio furnissii)最接近，将其命名为弗氏弧菌c1。
37.本实施例所用实验试剂如下：
38.海水缓冲液(3％海盐)：海盐30g，去离子水(ddh2o)1l；
39.种子培养基：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，海藻酸钠2.0g，磷酸高铁0.01g，海水缓冲液1l，ph 7.4～7.6；
40.固体种子培养基：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，海藻酸钠2.0g，磷酸高铁0.01g，海水缓冲液1l，琼脂粉15g，ph 7.4～7.6；
41.筛选培养基：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，海藻酸钠5.0g，海水缓冲液1l，琼脂粉15g，ph7.4～7.6；
42.发酵培养基：磷酸二氢钾(kh2po4)1.5g，蛋白胨6.0g，褐藻酸钠4.0g，硫酸亚铁(fe2so4)0.01g，七水硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.01g，海水缓冲液1l，ph 7.0；
43.诱变剂：亚硫酸二乙酯1ml，ddh2o 99ml；
44.终止剂：硫代硫酸钠25g，ddh2o 75ml。
45.一、菌悬液制备：
46.先将弗氏弧菌c1在固体种子培养基上划线分纯，然后挑取长势良好的单菌落接种在种子培养基，培养至对数生长期，离心收集菌体，用等体积的海水缓冲液清洗两遍，然后用等体积的海水缓冲液重悬，稀释成od
600
为0.4的菌悬液。
47.二、artp诱变处理：
48.取10μl菌悬液均匀涂布在artp诱变仪配套的无菌小铁片上；artp诱变仪功率设置120w，气流通量10slm(standard liter per minute)，冷却水循环系统为20℃，诱变时间分别为0s，5s，10s，20s，30s，45s；诱变结束后，迅速用无菌尖头镊子取出小铁片，装到含有990μl无菌海水缓冲液的1.5ml离心管中，在漩涡振荡器震荡混匀1min，混匀后在超净工作台中用海水缓冲液稀释103倍，取100μl均匀涂布在固体平板上，每个时间梯度涂布3个固体平板作为平行，待平板表面的菌液晾干后，用封口膜封口倒置在恒温生化培养箱，28℃培养12h后进行后续筛选，以筛选到的酶活力最高的菌株为下一轮artp诱变的出发菌株，进行迭代诱变，通过平板初筛法与dns酶活测定筛选褐藻胶裂解酶高产菌株。
49.artp诱变时间的确定：随着诱变时间的增加，菌株的致死率明显增加，诱变时间为5s时致死率达67％左右，诱变20s时致死率达90％左右，诱变40s时致死率高达99.9％。研究表明，诱变致死率在90％左右时菌株正突变率较高，因此20s为最佳诱变时间。
50.artp诱变迭代效应：迭代轮次的增加对突变株可能存在累加效应，以上一轮筛选得到的最佳突变株为下一轮artp诱变的出发菌株，结合最佳诱变时间进行迭代诱变。对每次突变复筛得到的突变株与出发菌株的酶活进行统计分析，筛选过程分别如图1～4所示。
51.第一轮artp诱变所得突变株与出发菌株弗氏弧菌c1的酶活测定结果如图1所示，其中三角形标注代表每一轮诱变的出发菌株，圆形标注代表每一轮诱变后筛选到的酶活最高的突变株，第一轮artp诱变所得酶活最高的突变株为1-6，以突变株1-6为出发菌株进行第二轮artp诱变；
52.第二轮artp诱变所得突变株与出发菌株1-6的酶活测定结果如图2所示，第二轮artp诱变所得酶活最高的突变株为2-2，以突变株2-2为出发菌株进行第三轮artp诱变。
53.第三轮artp诱变所得突变株与出发菌株2-2的酶活测定结果如图3所示，第三轮artp诱变所得酶活最高的突变株为3-3，以突变株3-3为出发菌株进行第四轮artp诱变。
54.第四轮artp诱变所得突变株与出发菌株3-3的酶活测定结果如图4所示，第四轮artp诱变所得酶活最高的突变株为4-20；由图4可知，经过四轮迭代诱变后，菌株诱变出现“疲劳效应”，artp诱变不再使得酶活力出现大幅度增加；第四轮artp诱变筛选出活性最高的突变株4-20，经初步检测，酶活力相对于出发菌株弗氏弧菌c1提高约15％，将其命名为弗氏弧菌c2，将弗氏弧菌c2进行保存，并作为des诱变的出发菌株。
55.三、des诱变处理：
56.菌悬液制备：将筛选得到的突变株弗氏弧菌c2划线分纯，待其长出单菌落后，接种在20ml种子培养基中，在28℃、200r/min的恒温摇床培养至od
600
为1.0左右；
57.des诱变：1ml种子液与1ml 1％des溶液混合为反应液，在30℃、200r/min恒温摇床中分别诱变0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min，然后迅速加入2ml 25％硫代硫酸钠终止剂，并于漩涡振荡器混匀来终止反应；反应液用海水缓冲液稀释103倍，取100μl均匀涂布在固体平板上，每个时间梯度涂布3个固体平板作为平行，待平板表面的菌液晾干后，用封口膜封口倒置于恒温生化培养箱，30℃培养12h后进行筛选得到相对酶活较高的菌株，以此菌株为下一轮des诱变的出发菌株，通过平板初筛法与dns酶活测定法筛选褐藻胶裂解酶高产菌株。
58.des诱变时间的确定：通过对不同诱变时间的菌落进行计数以此计算诱变致死率，
诱变15min时致死率为87％，时长20min时致死率为96％，时长多于25min时致死率为100％；选择致死率为96％的20min为des诱变的最佳诱变时间。
59.des诱变迭代效应：迭代轮次的增加对突变株发酵活力可能存在累加效应，以上一轮筛选得到的最佳突变株为下一轮des诱变的出发菌株，结合最佳诱变时间进行迭代诱变。对每次突变复筛得到的突变株与出发菌株的酶活进行统计比较，筛选过程分别如图5～6所示。
60.第一轮des诱变所得突变株与出发菌株弗氏弧菌c2的酶活测定结果如图5所示，其中三角形标注代表每一轮诱变的出发菌株，圆形标注代表每一轮诱变后筛选到的酶活最高的突变株，第一轮des诱变所得酶活最高的突变株为c2-22，以突变株c2-22为出发菌株进行第二轮des诱变；
61.第二轮des诱变所得突变株与出发菌株c2-22的酶活测定结果如图6所示，第二轮des诱变所得酶活最高的突变株为c3-2；经过两轮迭代诱变后，菌株诱变出现“疲劳效应”，des诱变不再使得酶活力出现大幅度增加；第二次des诱变筛选出活性最高的c3-2菌株，经初步检测，酶活力相对于出发菌株弗氏弧菌c2提高约20％，将其命名为“弗氏弧菌c3-2(vibrio furnissii c3-2)”。
62.弗氏弧菌c3-2(vibrio furnissii c3-2)于2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2023411，地址：中国，武汉，武汉大学。
63.其中，平板初筛法的操作步骤如下：
64.将菌株点接于筛选培养基平板，28℃恒温培养24h至长出单菌落，经cacl2溶液处理静置30min显色，在菌落周围形成一定的海藻酸钠降解范围，肉眼可观察到白色水解圈，通过观察水解圈的大小，可以初步筛选到酶活升高的正突变株。
65.其中，dns酶活测定法的操作步骤如下：
66.菌株发酵液经4℃，12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液，取2ml 0.5％(w/v，g/ml)的海藻酸钠底物溶液、100μl粗酶液于25ml比色管中构建酶反应体系，对照组不加酶液，30℃水浴30min后加入2ml dns试剂，对照组补加酶液；沸水煮5～10min终止反应，冰水冷却至室温后，纯水定容至25ml；测定od
550
处的吸光度a，对照组测定od
550
处的吸光度b，酶活力的计算方式如下：
67.酶活力(u/ml)＝(a-b)
×
1000
×
n/k/t，式中：
68.a-b——产生的还原糖的吸光值；
69.n——酶液的稀释倍数；
70.t——酶反应时间；
71.k——标准曲线斜率。
72.实验例：
73.(1)产酶能力测定
74.菌株的突变可能会对菌株的生长状态及发酵产酶时间造成影响，生长过慢、产酶时间过长都会加大工业生产或实际应用中的成本损耗，因此菌株的生长量与产酶发酵时间都决定着菌株在工业生产中的实际价值。本实验对菌株的生长量及产酶时间进行测定，检测突变后菌株的生长量及发酵产酶时间，具体操作步骤如下：
75.将筛选得到的高产突变株弗氏弧菌c3-2与出发菌株弗氏弧菌c1、artp突变株弗氏
弧菌c2进行划线分纯，然后挑取长势良好的单菌落接种在种子培养基，28℃，200r/min的条件下恒温培养；将培养至对数生长期的种子液接种1ml到含有100ml无菌发酵培养基的三角瓶中，28℃、200r/min的恒温发酵；每两小时取样一次，测定菌株的生长量及酶活力，生长趋势如图7所示，产酶趋势如图8所示。
76.由图7可知，突变株弗氏弧菌c2和弗氏弧菌c3-2在4小时左右达到了对数生长期，生长量大于出发菌株弗氏弧菌c1，在12～24h中弗氏弧菌c3-2的生长量也要明显大于弗氏弧菌c1；由图8可知，在发酵时长20h之后，弗氏弧菌c1产酶呈下降趋势，突变株的产酶能力依然保持上升趋势，且弗氏弧菌c3-2的产酶能力要高于弗氏弧菌c1。
77.(2)突变菌株遗传稳定性测定
78.由于刚筛选到的菌株稳定性未知，因此需要经过多次传代来检测其遗传稳定性，具体操作步骤如下：将筛选得到的高产突变株弗氏弧菌c3-2与出发菌株弗氏弧菌c1、artp突变株弗氏弧菌c2进行连续五次的传代，相同条件下检测其发酵液酶活力，结果如表1所示。
79.表1.突变株发酵酶活力实验结果
80.传代次数c1(％)c2(％)c3-2(％)0100100100199.8
±
1.02103.2
±
1.37102.77
±
2.312101.3
±
1.44100.3
±
2.01100.6
±
0.71397.8
±
1.7599.86
±
0.3498.37
±
0.954103.16
±
2.1498.36
±
1.5299.33
±
1.45598.5
±
0.8999.55
±
1.4198.67
±
0.49
81.由表1可得，在连续五次传代过程中，每代发酵液酶活力较第一代而言都保留了95％以上，因此筛选得到的突变株弗氏弧菌c3-2具有良好的遗传稳定性，具有较高的工业价值。
82.(3)酶活测定
83.在突变菌株稳定遗传的前提下，选择生长状态相同的出发菌株弗氏弧菌c1、artp突变株弗氏弧菌c2和弗氏弧菌c3-2三种菌株重新检测酶活力，首先进行划线分纯，然后挑取长势良好的单菌落接种在种子培养基，28℃、200r/min的条件下恒温培养；将培养至对数生长期的种子液接种1ml到含有100ml无菌发酵培养基的三角瓶中，28℃、200r/min的恒温发酵24小时，得发酵液，按照上述dns酶活测定法分别检测三种菌株的酶活力，检测结果如图9所示。
84.其中，dns酶活测定法测得弗氏弧菌c2的酶活力为203u/ml，较野生菌株弗氏弧菌c1(170u/ml)提升了19.4％；对弗氏弧菌c2进行两次des诱变得到一株遗传性能稳定的高产褐藻胶裂解酶突变株弗氏弧菌c3-2，弗氏弧菌c3-2的酶活力达到240u/ml，较野生菌株弗氏弧菌c1提升了41.2％。
85.(4)酶学性质测定
86.在突变过程中，碱基的缺失、移位都可能导致决定菌株酶学性质的关键氨基酸发生突变，从而导致酶的酶学性质发生变化；研究突变菌株酶的稳定性，可以避免酶在酶促反应中因温度和ph变化所造成的损失和浪费，在工业生产和实际应用中有着十分重要的意
义。为了考察突变株的酶学性质，本实验将筛选得到的突变菌株弗氏弧菌c3-2与出发菌株弗氏弧菌c1、artp突变株弗氏弧菌c2进行划线分纯，然后挑取长势良好的单菌落接种在种子培养基，28℃，200r/min条件下恒温培养12h，至对数生长期od
600
为1.0左右，并接种1ml种子液到含有100ml无菌发酵培养基的三角瓶中，28℃，200r/min条件下摇床发酵24h后离心，上清液即为粗酶液；对各酶在不同反应温度和ph的酶活力进行检测，具体操作步骤如下：
87.①
酶的最适温度检测：以磷酸缓冲液配制的0.5％(w/v，g/ml)海藻酸钠溶液作为底物，向25ml比色管中加入2ml海藻酸钠底物溶液和100μl的粗酶液，对照组不加酶液，构建酶反应体系；分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃反应30min，各加入2ml dns试剂，对照组补加酶液；沸水煮5min终止反应，冰水冷却至室温后，纯水定容至25ml；以最大酶活力为100％，测定不同反应温度下的相对酶活力；
88.结果如图10所示，突变株弗氏弧菌c2、弗氏弧菌c3-2与野生菌株弗氏弧菌c1的最适反应温度均为20℃，且在15～40℃反应均能发挥60％以上的酶活力，在60℃反应温度下酶几乎失活，这可能与实验菌株是来源于低温海洋环境的弗氏弧菌有关。
89.②
酶的最适ph检测：用不同ph的磷酸缓冲液配置海藻酸钠底物溶液，使得底物ph分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；分别向25ml比色管中加入2ml海藻酸钠底物溶液和100μl的粗酶液，对照组不加酶液，构建酶反应体系，20℃条件下反应30min；以最大酶活力为100％，测定不同反应ph下的相对酶活力；
90.结果如图11所示，突变前后菌株所产生褐藻胶裂解酶的最适反应ph未发生变化，均是在ph为8.0的底物环境中发挥最大活力，在ph为7.0～9.0的底物环境中可以发挥60％以上的酶活性；另外，突变后的弗氏弧菌c2与弗氏弧菌c3-2所产生的褐藻胶裂解酶在ph为9.0的碱性环境中依然可以发挥80％左右的酶活力，这表明突变后菌株所产生的褐藻胶裂解酶对碱性环境的耐受性更强。
91.综上，本发明提供了一株高产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌c3-2，弗氏弧菌c3-2所产生的褐藻胶裂解酶的酶活力较野生菌株提升了40％以上，且褐藻胶裂解酶对碱性环境的耐受性更强，同时遗传特性稳定，具有良好的工业发展前景。

技术特征：
1.一株弗氏弧菌c3-2(vibrio furnissii c3-2)，该菌株于2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2023411，地址：中国，武汉，武汉大学。2.权利要求1所述弗氏弧菌c3-2的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将弗氏弧菌c3-2划线分纯后，挑取单菌落接种于种子培养基中，28
±
2℃，150～200r/min条件下恒温培养，得弗氏弧菌c3-2菌液。3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述种子培养基的组分为：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，海藻酸钠2.0g，磷酸高铁0.01g，海水缓冲液1l，ph 7.4～7.6；其中，所述海水缓冲液的组分为：海盐30g，去离子水1l。4.权利要求1所述弗氏弧菌c3-2在生产褐藻胶裂解酶中的应用。5.一种生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，以权利要求1所述弗氏弧菌c3-2为发酵菌株。6.如权利要求5所述的生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：将弗氏弧菌c3-2菌液接种至发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的1～5％，28
±
2℃，150～200r/min条件下恒温发酵，得发酵液，离心取上清，上清液即为褐藻胶裂解酶粗酶液。7.如权利要求6所述的生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：磷酸二氢钾1.5g，蛋白胨6.0g，褐藻酸钠4.0g，硫酸亚铁0.01g，七水硫酸镁0.01g，海水缓冲液1l，ph 7.0；其中，所述海水缓冲液的组分为：海盐30g，去离子水1l。8.如权利要求5所述的生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，弗氏弧菌c3-2生产的褐藻胶裂解酶的反应温度为15～40℃，反应ph为7.0～9.0。9.如权利要求5所述的生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，弗氏弧菌c3-2生产的褐藻胶裂解酶的反应温度为20℃，反应ph为8.0。

技术总结
本发明提供了一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌C3-2(Vibrio furnissii C3-2)，该菌株于2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2023411，地址：中国，武汉，武汉大学；弗氏弧菌C3-2所产生的褐藻胶裂解酶的酶活力较野生菌株提升了40％以上，且褐藻胶裂解酶对碱性环境的耐受性更强，同时遗传特性稳定，具有良好的工业发展前景。具有良好的工业发展前景。具有良好的工业发展前景。


技术研发人员：常丽荣 姚艳艳 陈梅 闫梦迪 王晓辉 钱浩 陈晓丽
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学（山东省科学院） 荣成爱伦湾食品有限公司 荣成凯普生物工程有限公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/21