防控蓟马的引物组dsFoTOF/Rs、DNA、dsRNA、试剂盒及应用与方法

防控蓟马的引物组dsfotof/rs、dna、dsrna、试剂盒及应用与方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及防控蓟马的引物组dsfotof/rs、dna、dsrna、试剂盒及应用与方法。


背景技术：

2.西花蓟马frankliniella occidentalis(pergande)是世界范围内的重要经济害虫，可以取食寄主作物的几乎所有部位，例如叶片、花、幼嫩的果实和茎等，严重影响作物的产量和质量，造成重大经济损失，还可传播多种植物病毒，造成更大的危害。目前在生产中对西花蓟马的防治主要以化学防治为，但随着杀虫剂的广泛使用，导致西花蓟马对药剂产生了不同程度的抗性，变得更加难以防治，因此寻找一种绿色高效的防治方法尤为重要。
3.rnai技术现已被广泛用作研究基因功能的工具，并显示出开发新型害虫管理策略的巨大潜力。
4.关于利用rnai技术通过降低蓟马产卵量来防控蓟马的产品和方法，本领域尚未见报道。


技术实现要素：

5.为了开发一种基于rnai技术通过降低蓟马产卵量来防控蓟马的产品和方法，本发明提供防控蓟马的引物组dsfotof/rs、dna、dsrna、试剂盒及应用与方法。
6.本发明的技术方案如下：
7.防控蓟马的引物组dsfotof/rs，其特征在于，选自下述引物对的一对或两对：
8.序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；
9.序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。
10.防控蓟马的dna，其特征在于，由引物对扩增获得；所述引物对选自下述引物对的一对或两对：
11.序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；
12.序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。
13.防控蓟马的dsrna，其特征在于，以引物对扩增获得的dna为模板合成；所述引物对选自下述引物对的一对或两对：
14.序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；
15.序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。
16.所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；
17.优选地，所述蓟马为西花蓟马。
18.活性成分选自：所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，所述的防控蓟马的dna、和/或，所述的防控蓟马的dsrna。
19.所述的防控蓟马的试剂盒，还包括：辅助试剂；所述辅助试剂选自由下述试剂组成
的组：扩增试剂、电泳试剂、dsrna合成试剂；
20.优选地，所述扩增试剂包括：pcr反应混合液；
21.优选地，所述pcr反应混合液为2
×
es taq mix；
22.优选地，dsrna合成试剂包括：转录反应缓冲液、rna酶抑制剂、rna聚合酶、dntp；
23.优选地，转录反应缓冲液为10
×
transcription reaction buffer；
24.优选地，rna酶抑制剂为riboguard rnase inhibitor；
25.优选地，rna聚合酶为t7 rnapolymerase；
26.优选地，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；
27.优选地，所述蓟马为西花蓟马。
28.所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，所述的防控蓟马的dna、和/或，所述的防控蓟马的dsrna、和/或，所述的防控蓟马的试剂盒防控蓟马的应用。
29.采用引物组dsfotof/rs的引物对扩增获得防控蓟马的dna；
30.优选地，以防控蓟马的dna为模板合成防控蓟马的dsrna；
31.优选地，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马；
32.优选地，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；
33.优选地，所述蓟马为西花蓟马。
34.防控蓟马的方法，其特征在于，采用所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，所述的防控蓟马的dna、和/或，所述的防控蓟马的dsrna、和/或，所述的防控蓟马的试剂盒进行防控。
35.采用引物组dsfotof/rs的引物对扩增获得防控蓟马的dna；
36.优选地，以防控蓟马的dna为模板合成防控蓟马的dsrna；
37.优选地，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马；
38.优选地，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；
39.优选地，所述蓟马为西花蓟马；
40.优选地，采用序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r扩增获得的dna为模板合成的dsrna为dsfoto6；
41.优选地，采用序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r扩增获得的dna为模板合成的dsrna为dsfoto24；
42.优选地，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马指：采用dsfoto6和/或dsfoto24饲喂蓟马；
43.优选地，每微升所述扩增的反应体系包括：0.5μl 2
×
es taq mix、10μmol/l上游引物、10μmol/l下游引物、0.42μl cdna模板，其余为水；
44.优选地，所述扩增的反应程序包括：95℃5min；以95℃30s、58℃
45.45s、72℃1min/kb为一个循环，共35个循环；72℃10min；
46.优选地，每微升所述合成的反应体系包括：0.05μg/μl dna模板、0.1μl10
×
transcription reaction buffer、0.125μl riboguard rnase inhibitor、0.1μl t7rnapolymerase、100mmol dntp、其余为水；
47.优选地，所述合成的步骤包括：37℃金属浴1h-3h，按每微升反应体系加入0.05μl rnaes-free dnase，37℃金属浴30min；按每微升反应体系加入0.05μl 5m醋酸铵，放在冰上15min，4℃13000rpm离心15min；
48.优选地，所述合成的步骤还包括：离心后去除上清液，将沉淀用1ml 70％的乙醇洗涤，4℃8000rpm离心10min；倒掉乙醇溶液，晾干；加入200μlnuclease-free water。
49.本发明随机设计了大量的rnai引物形成rnai引物池，并从中验证、筛选得到2对rnai引物对：dsfoto6f/r和dsfoto24f/r。经饲喂实验证实，以这2对引物对扩增形成的cdna为模板合成的dsrna分别饲喂或联合饲喂西花蓟马都可以使蓟马的产卵量显著性降低，可有效达到调控西花蓟马数量的目的。采用本发明的引物组及其相关产品(dsrna和/或试剂盒)及防控方法在调控西花蓟马繁殖中发挥重要作用，并对西花蓟马产卵量的降低率达到33％-80％。本发明对于开发一种绿色防控西花蓟马的策略具有重要的应用价值。
50.采用本发明引物组及其相关产品(dsrna和/或试剂盒)及防控方法能够显著降低西花蓟马的产卵量，从技术原理上推测可能的机理是：本发明提供的2对引物对，它们各自扩增的产物分别为413bp大小、209bp大小的片段(因这些片段的具体序列涉及的下一步研发计划尚处于保密阶段，本文暂时不便公开)，以这些片段为模板合成的dsrna，被蓟马取食后，dsrna在蓟马体内可能选择性地下调蓟马的生长发育所必须的基因，导致西花蓟马的繁殖能力发生改变。因尚不明确具体被沉默的基因，此部分机理相关的内容不做展开叙述，及时但并不影响本发明内容的清楚完整性。本发明提供的引物组及其相关产品(dsrna和/或试剂盒)及防控方法为防治田间西花蓟马提供了新的防治手段和防治策略。
附图说明
51.图1为本发明实验例2.1.1部分的西花蓟马饲喂dsfoto6的rnai对产卵量影响的分析结果图。
52.图2为本发明实验例2.1.2部分的西花蓟马饲喂dsfoto24的rnai对产卵量影响的分析结果图。
53.图3为本发明实验例2.1.3部分的西花蓟马联合饲喂dsfoto6和dsfoto24的rnai对产卵量影响的分析结果图。
54.图中标记列示如下：dsfoto6指饲喂dsfoto6的实验组蓟马，dsfoto24指饲喂dsfoto24的实验组蓟马，dsfoto6&dsfoto24指联合饲喂dsfoto6和dsfoto24的实验组蓟马，dsegfp指饲喂dsegfp的阳性对照组蓟马，control指不饲喂任何dsrna的空白对照组蓟马。
具体实施方式
55.下面结合具体实施例、实验例对本发明的内容做进一步详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
56.生物材料的来源
57.一、本发明实验例使用的西花蓟马来自中国农业科学院蔬菜花卉所实验室饲养种群；西花蓟马为公知的害虫，可采集自任何发生西花蓟马虫害的农田或大棚。
58.第1组实施例、本发明的引物组dsfotof/rs
59.本组实施例提供防控蓟马的引物组dsfotof/rs。本组所有实施例都具备如下共同特征：所述防控蓟马的引物组dsfotof/rs选自下述引物对的一对或两对：
60.序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；
61.序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。
62.任何克隆、扩增、扩繁、富集、合成、连接、转化、制备、生产、销售、许诺销售、进口、出口序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；和/或，序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r的行为均落入本发明的保护范围。
63.在一些实施例中，所述防控指降低蓟马的产卵量。
64.在具体的实施例中，所述蓟马指西花蓟马。
65.第2组实施例、本发明的dna
66.本组实施例提供防控蓟马的dna。本组所有实施例都具备如下共同特征：所述防控蓟马的dna由引物对扩增获得；所述引物对选自下述引物对的一对或两对：
67.序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；
68.序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。
69.任何克隆、扩增、扩繁、富集、合成、连接、转化、制备、生产、销售、许诺销售、进口、出口序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r的扩增产物；和/或，序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r的扩增产物的行为均落入本发明的保护范围。
70.在一些实施例中，所述防控指降低蓟马的产卵量。
71.在具体的实施例中，所述蓟马指西花蓟马。
72.第3组实施例、本发明的dsrna
73.本组实施例提供防控蓟马的dsrna。本组所有实施例都具备如下共同特征：所述供防控蓟马的dsrna以引物对扩增获得的dna为模板合成；所述引物对选自下述引物对的一对或两对：
74.序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；
75.序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。
76.任何克隆、扩增、扩繁、富集、合成、连接、转化、制备、生产、销售、许诺销售、进口、出口以seq id no.1和seq id no.2的引物对dsfoto6-f/dsfoto6-r的扩增产物为模板合成的dsrna；和/或，以seq id no.3和seq id no.4的引物对dsfoto24-f/dsfoto24-r的扩增产物为模板合成的dsrna的行为均落入本发明的保护范围。
77.在一些实施例中，所述防控指降低蓟马的产卵量。
78.在具体的实施例中，所述蓟马指西花蓟马。
79.第4组实施例、本发明的试剂盒
80.本组实施例提供防控蓟马的试剂盒。本组所有实施例都具备如下共同特征：所述防控蓟马的试剂盒包括：活性成分；活性成分选自：第1组实施例任一所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，第2组实施例任一所述的防控蓟马的dna、和/或，第3组实施例任一所述的防控蓟马的dsrna。
81.在进一步的实施例中，所述的防控蓟马的试剂盒还包括：辅助试剂；所述辅助试剂选自由下述试剂组成的组：扩增试剂、电泳试剂、dsrna合成试剂；
82.优选地，所述扩增试剂包括：pcr反应混合液；
83.优选地，所述pcr反应混合液为2
×
es taq mix；
84.优选地，dsrna合成试剂包括：转录反应缓冲液、rna酶抑制剂、rna聚合酶、dntp；
85.优选地，转录反应缓冲液为10
×
transcription reaction buffer；
86.优选地，rna酶抑制剂为riboguard rnase inhibitor；
87.优选地，rna聚合酶为t7 rnapolymerase；
88.优选地，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；
89.优选地，所述蓟马为西花蓟马。
90.第5组实施例、本发明引物组、dna、dsrna、试剂盒的应用
91.本组实施例提供第1组实施例任一所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，第2组实施例任一所述的防控蓟马的dna、和/或，第3组实施例任一所述的防控蓟马的dsrna、和/或，第4组实施例任一所述的防控蓟马的试剂盒防控蓟马的应用。
92.在具体的实施例中，采用第1组实施例任一所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，第2组实施例任一所述的防控蓟马的dna、和/或，第3组实施例任一所述的防控蓟马的dsrna、和/或，第4组实施例任一所述的防控蓟马的试剂盒进行防控；
93.优选地，采用引物组dsfotof/rs的引物对扩增获得防控蓟马的dna；
94.优选地，以防控蓟马的dna为模板合成防控蓟马的dsrna；
95.优选地，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马；
96.优选地，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；
97.优选地，所述蓟马为西花蓟马。
98.第6组实施例、本发明的防控蓟马的方法
99.本组实施例提供防控蓟马的方法。本组所有实施例都具备如下共同特征：采用第1组实施例任一所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，第2组实施例任一所述的防控蓟马的dna、和/或，第3组实施例任一所述的防控蓟马的dsrna、和/或，第4组实施例任一所述的防控蓟马的试剂盒进行防控。
100.在具体的实施例中，采用引物组dsfotof/rs的引物对扩增获得防控蓟马的dna；
101.优选地，以防控蓟马的dna为模板合成防控蓟马的dsrna；
102.优选地，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马；
103.优选地，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；
104.优选地，所述蓟马为西花蓟马；
105.优选地，采用序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r扩增获得的dna为模板合成的dsrna为dsfoto6；
106.优选地，采用序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r扩增获得的dna为模板合成的dsrna为dsfoto24；
107.优选地，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马指：采用dsfoto6和/或dsfoto24饲喂蓟马；
108.优选地，每微升所述扩增的反应体系包括：0.5μl 2
×
es taq mix、10μmol/l上游引物、10μmol/l下游引物、0.42μl cdna模板，其余为水；
109.优选地，所述扩增的反应程序包括：95℃5min；以95℃30s、58℃
110.45s、72℃1min/kb为一个循环，共35个循环；72℃10min；
111.优选地，每微升所述合成的反应体系包括：0.05μg/μl dna模板、0.1μl10
×
transcription reaction buffer、0.125μl riboguard rnase inhibitor、0.1μl t7rnapolymerase、100mmol dntp、其余为水；
112.优选地，所述合成的步骤包括：37℃金属浴1h-3h，按每微升反应体系加入0.05μl rnaes-free dnase，37℃金属浴30min；按每微升反应体系加入0.05μl 5m醋酸铵，放在冰上15min，4℃13000rpm离心15min；
113.优选地，所述合成的步骤还包括：离心后去除上清液，将沉淀用1ml 70％的乙醇洗涤，4℃8000rpm离心10min；倒掉乙醇溶液，晾干；加入200μlnuclease-free water。
114.本领域公知，dsrna有三种基本传递方法：显微注射法、饲喂法(口服传递法)、转基因植物法。本发明采用的是饲喂法，且经实验验证采用饲喂法用本发明的dsrna饲喂蓟马能够获得理想的降低产卵量的效果，说明饲喂法过程中dsrna较为稳定、未因降解等因素影响最终的防控蓟马效果。饲喂法更有效且易于进行。
115.在另一些实施例中，根据本发明的教导，本领域技术人员还可基于本发明提供的引物组dsfotof/rs使用转基因植物法来防控蓟马，具体为：采用引物组dsfotof/rs的任何一对引物对或两对引物对，以蓟马rna或dna为模板扩增出目的片段(本发明的dna)，与表达载体连接获得重组表达载体、和/或，将重组表达载体转化宿主细胞获得转化体、和/或，将重组表达载体和/或转化体通过转基因的方式转入蓟马取食的植物中获得转基因植物，再以该转基因植物作为蓟马取食的食源，能获得与本发明下述实验例同样的或近似的降低蓟马产卵量的效果。
116.在一些实施例中，本领域技术人员还可基于本发明提供的引物组dsfotof/rs使用显微注射法来防控蓟马，具体为：将本发明提供的引物组dsfotof/rs中的任何一对引物对或两对引物对，以蓟马rna或dna为模板扩增出目的片段(本发明的dna)，经合成获得dsrna后，通过显微注射的方法将所述dsrna注入蓟马体内，同样能获得与本发明下述实验例类似的降低蓟马产卵量的效果。
117.上述实施例中的转基因植物法和/或显微注射法均为分子生物学领域普通技术人员所熟知的常规方法，具有常规的技术操作步骤，本领域技术人员可根据具体情况选择表达载体、宿主细胞、待转基因的植物并确定各个操作环节的具体操作参数。
118.出于篇幅、实验周期、研发及成果固定计划的协调性的考虑，本发明不再对转基因植物法和显微注射法提供具体的实验步骤和数据并展开描述。
119.本文中的rnai具有分子生物领域普通技术人员通常理解的常规技术含义，rnai又称rna干扰。
120.本文中的egfp是指增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein)基因，是分子生物学领域常用的内参基因，具有本领域技术人员所熟知的常规技术含义。本领域技术人员可通过常规技术手段(例如，检索、搜索、查找等)在大量已发表的文献或已公开的数据库中获取egfp基因的一级结构序列。
121.本领域技术人员可采用本发明下表1中载明的dsegfp-f和dsegfp-r引物序列扩增出dna模板合成dsrna对egfp基因进行基因沉默。该egfp基因沉默不影响蓟马的产卵量，如图1-图3所示，饲喂dsegfp的阳性对照组(dsegfp)与空白对照组(control)的产卵量无显著差异。
122.实验例、本发明引物组的效果验证
123.1材料与方法
124.1.1确定rnai沉默效率
125.1.1.1dsrna引物的设计与筛选
126.通过snapdragon-dsrna design
127.(http://www.flyrnai.org/cgi-bin/rnai_find_primers.pl)网站设计含有t7启动子序列的特异性dsrna引物，如下表1所示：
128.表1.本实验例使用的rnai引物
[0129][0130]
采用trizol法分别提取西花蓟马ivf03和nil-r种群5日龄雌成虫总rna，使用nanodrop 2000(thermo fisher scientific inc.,waltham,ma,usa)对rna的完整性、浓度和纯度进行检测，使用cdna合成试剂盒(primescripttmⅱ1st strand cdna synthesis kit，takara)和分别合成cdna。使用dsrna引物以cdna进行普通pcr，反应体系与反应程序分别如下表2和表3所示：
[0131]
表2.反应体系
[0132][0133]
表3.反应程序
[0134]
[0135][0136]
获得相应的基因片段，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，在bio-rad chemidoc xrs凝胶成像仪下观察是否有目的条带，使用promega胶回收试剂盒进行切胶回收，得回收产物。用nanodrop 2000测定纯化产物的浓度。-20℃保存。
[0137]
1.1.2dsrna的合成
[0138]
根据以上获得的产物使用t7 ribomax express rnai试剂盒进行dsrna合成，具体实验步骤如下：根据下表4，依次在1.5ml rnafree离心管中加入相关组分，37℃金属浴1h(可适当延长时间，以增加产量)；加入1μl rnaes-free dnase，37℃金属浴30min；加入等量的5m醋酸铵，放在冰上15min，4℃13000rpm 15min；去除上清液，将沉淀用1ml 70％的乙醇洗涤，4℃8000rpm 10min；倒掉乙醇溶液，晾干；加入200μl nuclease-free water，用nanodrop 2000检测浓度，置于-80℃保存备用。
[0139]
表4.dsrna合成体系
[0140][0141]
1.1.3确定最佳干扰时间点
[0142]
利用10％蔗糖溶液与dsrna配制成500ng/μl的dsrna饲喂液，饲喂初羽化的西花蓟马雌虫，实验装置如下：首先将10ml离心管底部1cm处切掉，置于酒精灯上微烤切口边缘至微融状态，然后迅速粘附在200目纱网上(保证装置具有良好的透气性)。取30头左右的初羽化西花蓟马雌虫放在rnai装置中，然后迅速将事先拉薄的parafilm封口膜附在管口，并加入200μl dsrna饲喂液，完毕后再用parafilm封口膜将加样孔封闭，底部遮光后放入培养箱中(25
±
1℃，16l:8d)，间隔24h添加一次饲喂液。在饲喂12h、24h、36h、48h、72h后收集样品，按照1.1.1的方法提取模板，进行qpcr，以确定dsfoto6与dsfoto24的最佳干扰时间点，即干扰效率最高的时段，作为其后rnai的干扰时间。饲喂dsfoto6或dsfoto24的蓟马为实验组(dsfoto6或dsfoto24或dsfoto6&dsfoto24)，饲喂dsegfp的蓟马为阳性对照组(dsegfp)，不进行任何dsrna饲喂的蓟马为空白对照组(control)
[0143]
1.2西花蓟马饲喂dsfoto6与dsfoto24进行rnai后的相关测定1.2.1测定rnai后西花蓟马的产卵量
[0144]
结合rnai最佳干扰时间点，处理西花蓟马初羽化雌成虫，将健康的甘蓝叶片制成直径为1cm的叶碟，把滤纸剪成与叶片同样大小，叶片与滤纸一起放入5ml离心管中，叶背朝上，用吸虫管将单头干扰后的雌虫以及正常的雄虫放入离心管中，盖上盖子，放在适温通风处，隔一天更替新鲜叶片，在显微镜(olympus，sz2-ilst)下观察在叶片上的产卵量并记录直至干扰处理后的第6d。
[0145]
2结果与分析
[0146]
2.1西花蓟马饲喂dsfoto6和dsfoto24的rnai效果
[0147]
2.1.1西花蓟马饲喂dsfoto6的rnai
[0148]
对西花蓟马初羽化雌虫饲喂dsfoto63d后，转到豆角继续饲喂，对饲喂至2d、4d、6d的成虫的产卵量进行观察，发现干扰处理后6d内的实验组(dsfoto6)总产卵量相比于阳性对照组(dsegfp)和空白对照组(control)显著降低(p《0.05)(图1)，而阳性对照组(dsegfp)和空白对照组(control)的蓟马总产卵量无显著差异。
[0149]
2.1.2西花蓟马饲喂dsfoto24的rnai
[0150]
西花蓟马敏感品系初羽化雌虫饲喂dsfoto243d后，转到豆角继续饲喂，对饲喂至2d、4d、6d的成虫的产卵量进行观察，发现干扰后6d内的实验组(dsfoto24)总产卵量相比于阳性对照组(dsegfp)和空白对照组(control)显著降低(p《0.001)(图2)，而阳性对照组(dsegfp)和空白对照组(control)的蓟马总产卵量无显著差异。
[0151]
2.1.3西花蓟马foto6与foto24基因的联合干扰
[0152]
西花蓟马敏感品系初羽化雌虫饲喂dsfoto6与dsfoto243d后，转到豆角继续饲喂，对饲喂至2d、4d、6d的成虫的产卵量进行观察，发现干扰后6d内的实验组(dsfoto6&dsfoto24)总产卵量相比于阳性对照组(dsegfp)和空白对照组(control)显著降低(p《0.001)(图3)，而阳性对照组(dsegfp)和空白对照组(control)的蓟马总产卵量无显著差异。
[0153]
3结论
[0154]
本研究结果表明，当饲喂西花蓟马dsfoto6与dsfoto24后，西花蓟马的产卵量显著性降低。因此，dsfoto6与dsfoto24可作为一种有效的防治手段，并在绿色防控西花蓟马方面，具有良好的应用前景。

技术特征：
1.防控蓟马的引物组dsfotof/rs，其特征在于，选自下述引物对的一对或两对：序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。2.防控蓟马的dna，其特征在于，由引物对扩增获得；所述引物对选自下述引物对的一对或两对：序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。3.防控蓟马的dsrna，其特征在于，以引物对扩增获得的dna为模板合成；所述引物对选自下述引物对的一对或两对：序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r；序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r。4.根据权利要求5所述的防控蓟马的dsrna，其特征在于，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；和/或，所述蓟马为西花蓟马。5.防控蓟马的试剂盒，包括：活性成分；其特征在于，活性成分选自：权利要求1所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，权利要求3所述的防控蓟马的dna、和/或，权利要求3或4所述的防控蓟马的dsrna。6.根据权利要求7所述的防控蓟马的试剂盒，其特征在于，还包括：辅助试剂；所述辅助试剂选自由下述试剂组成的组：扩增试剂、电泳试剂、dsrna合成试剂；和/或，所述扩增试剂包括：pcr反应混合液；和/或，所述pcr反应混合液为2
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estaqmix；和/或，dsrna合成试剂包括：转录反应缓冲液、rna酶抑制剂、rna聚合酶、dntp；和/或，转录反应缓冲液为10
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transcriptionreactionbuffer；和/或，rna酶抑制剂为riboguardrnaseinhibitor；和/或，rna聚合酶为t7rnapolymerase；和/或，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；和/或，所述蓟马为西花蓟马。7.权利要求1所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，权利要求2所述的防控蓟马的dna、和/或，权利要求3或4所述的防控蓟马的dsrna、和/或，权利要求5或6所述的防控蓟马的试剂盒防控蓟马的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用引物组dsfotof/rs的引物对扩增获得防控蓟马的dna；和/或，以防控蓟马的dna为模板合成防控蓟马的dsrna；和/或，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马；和/或，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；和/或，所述蓟马为西花蓟马。9.防控蓟马的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的防控蓟马的引物组dsfotof/rs、和/或，权利要求2所述的防控蓟马的dna、和/或，权利要求3或4所述的防控蓟马的dsrna、和/或，权利要求5或6所述的防控蓟马的试剂盒进行防控。
10.根据权利要求9所述的防控蓟马的方法，其特征在于，采用引物组dsfotof/rs的引物对扩增获得防控蓟马的dna；和/或，以防控蓟马的dna为模板合成防控蓟马的dsrna；和/或，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马；和/或，所述防控蓟马指：降低蓟马的产卵量；和/或，所述蓟马为西花蓟马；和/或，采用序列如seq id no.1的dsfoto6-f和序列如seq id no.2的dsfoto6-r扩增获得的dna为模板合成的dsrna为dsfoto6；和/或，采用序列如seq id no.3的dsfoto24-f和序列如seq id no.4的dsfoto24-r扩增获得的dna为模板合成的dsrna为dsfoto24；和/或，用防控蓟马的dsrna饲喂蓟马指：采用dsfoto6和/或dsfoto24饲喂蓟马；和/或，每微升所述扩增的反应体系包括：0.5μl2
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estaqmix、10μmol/l上游引物、10μmol/l下游引物、0.42μlcdna模板，其余为水；和/或，所述扩增的反应程序包括：95℃5min；以95℃30s、58℃45s、72℃1min/kb为一个循环，共35个循环；72℃10min；和/或，每微升所述合成的反应体系包括：0.05μg/μldna模板、0.1μl10
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transcriptionreactionbuffer、0.125μlriboguardrnaseinhibitor、0.1μlt7rnapolymerase、100mmoldntp、其余为水；和/或，所述合成的步骤包括：37℃金属浴1h-3h，按每微升反应体系加入0.05μlrnaes-freednase，37℃金属浴30min；按每微升反应体系加入0.05μl5m醋酸铵，放在冰上15min，4℃13000rpm离心15min；和/或，所述合成的步骤还包括：离心后去除上清液，将沉淀用1ml70％的乙醇洗涤，4℃8000rpm离心10min；倒掉乙醇溶液，晾干；加入200μlnuclease-freewater。

技术总结
本发明防控蓟马的引物组dsFoTOF/Rs、DNA、dsRNA、试剂盒及应用与方法属于分子生物学领域。所述防控蓟马的引物组dsFoTOF/Rs选自下述引物对的一对或两对：序列如SEQ ID NO.1的dsFoTO6-F和序列如SEQ ID NO.2的dsFoTO6-R；序列如SEQ ID NO.3的dsFoTO24-F和序列如SEQ ID NO.4的dsFoTO24-R。以本发明引物组dsFoTOF/Rs的2对引物对扩增的DNA产物为模板合成的dsRNA饲喂蓟马可显著降低蓟马的产卵量。量。量。


技术研发人员：吴青君 钱康华 万岩然 郑晓斌 唐映曦
受保护的技术使用者：中国农业科学院蔬菜花卉研究所
技术研发日：2023.04.23
技术公布日：2023/8/21