一种融合多肽及其用途的制作方法

1.本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种融合多肽及其用途。


背景技术：

2.il-15是一种细胞因子，在免疫反应中起关键作用，例如il-15可以促进免疫细胞的增殖。然而，il-15的受体信号需要il-15ra结合il-15才能更为有效的激活，于是il-15-il-15ra的设计以融合蛋白或者在免疫细胞膜上表达的形式应用于肿瘤免疫治疗。在免疫细胞治疗领域的应用中，il-15-il-15ra本身不会在其表达细胞内产生信号，只对其他细胞产生激活作用。
3.因此本领域急需一种具有内源信号活性的il-15-il-15ra多肽，以更好的保存或者富集表达il-15-il-15ra的细胞群体，使il-15发挥更长效的作用或者使得表达il-15-il-15ra的细胞群产生更强的功能。


技术实现要素：

4.本技术提供了一种融合多肽，表达本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有选自以下组的特征：(1)提高的细胞增殖能力；(2)增强的细胞因子分泌能力；(3)提高的细胞杀伤能力；(4)提高的细胞长期增殖能力。
5.一方面，本技术提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及stat家族蛋白成员或其功能活性片段。
6.一方面，本技术提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及siglec家族蛋白成员或其功能活性片段的跨膜域和/或胞内域。
7.一方面，本技术提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及il-21受体或其功能活性片段的胞内域。
8.另一方面，本技术提供了一种核酸，所述核酸编码本技术的融合多肽。
9.另一方面，本技术提供了一种载体，所述载体包含本技术的核酸。
10.另一方面，本技术提供了一种细胞，包含本技术的融合多肽、本技术的核酸和/或本技术的载体。
11.另一方面，本技术提供了一种本技术的融合多肽的制备方法，所述方法包括在使得所述融合多肽表达的条件下，培养本技术的细胞。
12.另一方面，本技术提供了一种组合物，所述组合物包含本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、和/或本技术的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
13.另一方面，本技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、和/或本技术的组合物。
14.另一方面，本技术提供了一种刺激免疫应答的方法，包含施用本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、本技术的组合物和/或本技术的试剂盒。
15.另一方面，本技术提供了本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本申
请的细胞、本技术的组合物和/或本技术的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
16.另一方面，本技术提供了一种预防、缓解和/或治疗肿瘤方法，包含施用本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、本技术的组合物和/或本技术的试剂盒。
17.另一方面，本技术提供了本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、本技术的组合物和/或本技术的试剂盒，其用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
18.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
19.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
20.图1显示的是，各组t细胞的增殖能力。
21.图2显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的细胞因子的分泌情况。
22.图3显示的是，各组t细胞的增殖能力。
23.图4至5显示的是，各组t细胞的细胞因子的分泌情况。
24.图6显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的增殖能力。
25.图7显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的细胞因子的分泌情况。
26.图8显示的是，各组t细胞的增殖能力。
27.图9至11显示的是，各组t细胞的增殖能力。
28.图12至14显示的是，各组t细胞的细胞杀伤能力。
29.图15至16显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的细胞因子的分泌情况。
30.图17显示的是，各组t细胞的细胞长期增殖情况。
31.图18显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的增殖能力。
32.图19显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的细胞因子的分泌情况。
33.图20显示的是，各组t细胞的增殖能力。
34.图21至23显示的是，各组t细胞的增殖能力。
35.图24至29显示的是，各组t细胞的细胞杀伤能力。
36.图30至31显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的细胞因子的分泌情况。
37.图32显示的是，各组t细胞的细胞长期增殖情况。
具体实施方式
38.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。
39.术语定义
40.在本技术中，术语“stat”通常是指一种信号转导和转录激活因子。例如，本技术的stat可以包含stat5a和stat5b。在本技术中，术语“stat5a”通常是指一种stat蛋白。例如，stat5a可以见于uniprot登记号p42229。本技术的stat5a蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含stat5a的功能活性片段的物质。例如，本技术的stat5a可以包含stat5a的功能活性片段以及其它任意的结构域。
41.在本技术中，术语“siglec家族蛋白成员”通常是指唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族的一种或多种蛋白。例如，siglec家族蛋白成员siglec1至7的成员。在本技术中，术语“siglec15”通常是指一种siglec家族蛋白成员。例如，siglec15可以见于uniprot登记号q6zmc9。本技术的siglec15蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含siglec15的功能活性片段的物质。例如，本技术的siglec15可以包含siglec15的功能活性片段以及其它任意的结构域。
42.在本技术中，术语“il-21受体”通常是指il-21蛋白的受体。例如，il-21受体可以包含il-21rβ。例如，il-21rβ可以见于uniprot登记号q9hbe5。本技术的il-21rβ蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含il-21rβ的功能活性片段的物质。例如，本技术的il-21rβ可以包含il-21rβ的功能活性片段以及其它任意的结构域。
43.在本技术中，术语“白介素”或“白细胞介素”通常是指一种细胞因子。例如，白介素可以激活与调节免疫细胞，介导t细胞、b细胞活化、增殖或分化，以及可以在炎症反应中起重要作用。本技术中，白介素可以涵盖未加工的白介素、任何形式加工的白介素、白介素的变体或包含白介素的功能活性片段的物质。
44.在本技术中，术语“白介素-15”或“il-15”通常是指细胞因子的一种。例如，il-15可以见于genbank登记号p40933。本技术的il-15蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含il-15的功能活性片段的物质。例如，本技术的il-15可以包含il-15的功能活性片段以及其它任意的结构域。在本技术中，术语“功能活性片段”通常是指具有全长蛋白质或核酸的部分区域，但保留或部分保留全长蛋白质或核酸的生物活性或功能的片段。例如，功能活性片段可以保留或部分保留全长蛋白质结合另一种分子的能力。例如，il-15的受体可以是il-15ra。例如，il-15ra可以见于genbank登记号q13261。例如，il-15ra胞外结构域可以包含il-15ra的功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含il-15ra的功能活性片段的物质。例如，本技术il-15ra胞外结构域可以具有结合il-15或其片段的功能。
45.在本技术中，术语“il-15结构域”通常是指包含il-15的功能活性片段的结构域。例如，本技术的il-15结构域可以涵盖il-15的功能活性片段及其变体。例如，本技术包含il-15结构域的物质可以具有il-15调节免疫细胞的功能。
46.在本技术中，术语“信号肽”通常是指作为n-端肽存在于蛋白前体形式上的前肽。信号肽的功能是促进连接至内质网的表达多肽的易位，以及将目的蛋白表达于细胞膜上，信号肽通常可以在该过程中被切除。例如，本技术的抗原结合蛋白不具有信号肽也可以不影响其生物活性。信号肽对于用于产生多肽的生物体可以是异源的或同源的。
47.在本技术中，术语“突变”通常是指序列相对于野生型发生改变。例如，至少一种已
有氨基酸残基被一个或多个氨基酸残基置换、插入、缺失或者重复。所述氨基酸残基可以是“天然存在的氨基酸残基”，并且选自以下组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、蛋氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)。
48.在本技术中，术语“胞外域”通常是指分子的胞外部分。在本技术中，术语“胞内域”通常指分子的细胞内部分。在本技术中，术语“跨膜结构域”通常是指横跨细胞膜的部分。在本技术中，术语“信号肽结构域”通常是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链。
49.在本技术中，术语“cd3ζ”通常是指cd247或t-cell surface glycoprotein cd3 zeta chain。cd3ζ”可以见于uniprot编号为p20963的内容下。该术语包括其变体、同源物、和其功能活性片段。
50.在本技术中，术语“免疫细胞”通常是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫细胞的示例包括但不限于t细胞、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、肥大细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞。例如，本技术的免疫细胞可以包含源于人工多能干(ips)细胞的细胞、pbmc细胞和/或肿瘤浸润淋巴细胞。例如，本技术的免疫细胞可以是由ips细胞分化而获得。该术语还包括工程化的免疫细胞，如通过将dna或rna形式的外源遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的免疫细胞。
51.在本技术中，术语“杀伤能力”是指通过使所述细胞接触有效量的抗体、t细胞、免疫缀合物、双特异性/多特异性分子或组合物从而杀伤细胞来实现。例如，本技术的融合多肽可以增强细胞的杀伤能力。例如，表达本技术的融合多肽的细胞可以体现出增强的杀伤能力。例如，表达本技术的融合多肽的细胞与其它免疫细胞、抗体、免疫缀合物(例如靶向免疫检查点的结合分子与其它活性分子的缀合物)、和/或双特异性/多特异性分子的组合可以体现出增强的杀伤能力。所述方法可以包括杀伤抗原表达阳性的细胞，任选地在效应细胞存在下进行杀伤，例如通过cdc、凋亡、adcc、吞噬作用或通过两种或更多种这些机制的组合。
52.在本技术中，术语“直接或间接连接”是指通过肽键直接的连接，或者通过连接子或者通过非肽连接实现间接连接。
53.在本技术中，术语“pbmc”或“人外周血单核细胞”通常是指外周血中具有单个核的细胞。例如具有圆形核的任何血细胞(即，淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞)。这些血细胞是免疫系统抵抗感染并适应入侵者的关键组分。淋巴细胞群由cd4
+
和cd8
+
t细胞、b细胞和自然杀伤细胞、cd14
+
单核细胞和嗜碱性粒细胞/嗜中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/树突细胞组成。通常，使用ficoll
tm
(使血液分层的亲水多糖)，从全血分离这些细胞，其中单核细胞和淋巴细胞在血浆层下形成血沉棕黄层。例如，“pbmc”指至少包含t细胞，以及任选地包含nk细胞、nkt细胞和抗原递呈细胞的细胞群。
54.在本技术中，术语“增殖”指细胞分裂(细胞的对称或不对称分裂)的增加。“增殖”可以指t细胞的对称或不对称分裂。当与未处理的样本中的细胞相比，处理的样本中的细胞数存在增加时，发生“增殖增加”。
55.在本技术中，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊
椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，可以是哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
56.在本技术中，术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本技术抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
57.在本技术中，术语“药物”通常是指当将其正确给予患者时，能够诱导期望的治疗效果的化学化合物或组合物。
58.在本技术中，术语“组合物”表示含有一种或多种本技术所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散剂、脂质体或适合高抗体浓度的其他有序结构。可以通过将活性化合物(即抗体或抗体部分)以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合在适宜的溶剂中并入，根据需要，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。
59.在本技术中，术语“载体”通常是指能够转运与它连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指其他dna区段可以连接入其中的环状双链dna环。另一类载体是病毒载体，其中其他dna区段可以连接入病毒基因组。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组，从而与宿主基因组一起复制，如不能自主复制的裸rna多核苷酸、裸dna多核苷酸、在同一链中由dna和rna构成的多核苷酸、聚-赖氨酸-偶联的dna或rna、肽-偶联的dna或rna、脂质体-偶联的dna等。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。这类载体在本技术中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，用于重组dna技术中的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
60.在本技术中，术语“佐剂”通常是指辅助或调节药物作用的任何物质，包括但不仅限于免疫学佐剂，它使对抗原的免疫反应增强或免疫反应多样化。
61.在本技术中，术语“肿瘤”或“肿瘤细胞”通常是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。肿瘤的例子包括但不限于，癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌和黑素瘤。“肿瘤细胞”进一步可以包括“实体瘤”，其指的是选自下组的肿瘤：胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、以及头颈癌。
62.发明详述
63.一方面，本技术提供了一种融合多肽，所述融合多肽可以包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及stat家族蛋白成员或其功能活性片段。
64.例如，所述融合多肽可以包含il-15结构域。例如，所述il-15结构域可以是il-15全长或其功能活性片段。例如，所述il-15结构域可以包含如seq id no：9所示的氨基酸序
列。
65.例如，本技术的融合多肽可以包含il-15结构域和il-15受体或其功能活性片段。例如，所述融合多肽还可以包含il-15受体或其功能活性片段。例如，所述il-15受体可以包含il-15rα。例如，本技术的il-15受体可以包含il-15受体的全长或其功能活性片段。例如，本技术的il-15受体可以包含il-15受体的sushi结构域、铰链域、跨膜域和/或胞内域。
66.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的sushi结构域。例如，所述il-15rα的sushi结构域可以包含如seq id no：22所示的氨基酸序列。
67.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的铰链域。例如，所述il-15rα的铰链域可以包含如seq id no：23所示的氨基酸序列。
68.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的跨膜域。例如，所述il-15rα的跨膜域可以包含如seq id no：24所示的氨基酸序列。
69.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的胞内域。例如，所述il-15rα的胞内域可以包含如seq id no：25所示的氨基酸序列。
70.例如，所述il-15结构域与所述il-15受体或其功能活性片段可以直接或间接连接。例如，所述间接连接可以包含通过连接子连接。例如，所述连接子可以包含选自以下组所示的氨基酸序列：seq id no：10-16、(seq id no：17)
l
、(ap)m、(ep)n、(kp)
p
、和(seq id no：21)q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
71.例如，所述stat家族蛋白成员可以包含stat5a。例如，所述stat家族蛋白成员可以包含stat5。例如，所述stat家族蛋白成员可以包含stat5a、其变体或其功能活性片段。
72.例如，所述stat5a可以包含第298位氨基酸的突变和/或第710位氨基酸的突变。
73.例如，所述stat5a可以包含第298位氨基酸的突变为r(精氨酸)和/或第710位氨基酸的突变为f(苯丙氨酸)。
74.例如，所述stat5a的第298位氨基酸可以为r(精氨酸)和第710位氨基酸可以为f(苯丙氨酸)。例如，所述stat5a可以包含如seq id no：32所示的氨基酸序列。
75.例如，所述stat5a的第710位氨基酸可以为f(苯丙氨酸)。例如，所述stat5a可以包含如seq id no：33所示的氨基酸序列。
76.例如，所述白介素-15(il-15)或其功能活性片段与stat家族蛋白成员或其功能活性片段可以直接或间接连接。例如，所述il-15rα与stat家族蛋白成员或其功能活性片段可以直接或间接连接。例如，所述间接连接可以包含通过自剪切肽连接。例如，自剪切肽可以是本领域已知的可以使一条转录产物产生多种蛋白的肽。例如，所述自剪切肽可以包含2a肽或其功能活性片段。例如，所述自剪切肽可以包含如seq id no：33所示的氨基酸序列。
77.例如，所述融合多肽可以从n端到c端依次包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、铰链域、跨膜域和胞内域、自剪切肽、以及stat5a，所述stat5a的第298位氨基酸为r(精氨酸)和第710位氨基酸为f(苯丙氨酸)。
78.例如，所述融合多肽可以从n端到c端依次包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、铰链域、跨膜域和胞内域、自剪切肽、以及stat5a，所述stat5a的第710位氨基酸为f(苯丙氨酸)。
79.例如，所述融合多肽还可以包含信号肽。例如，所述信号肽可以包含如seq id no：8所示的氨基酸序列。
80.例如，所述融合多肽可以包含如seq id no：6-7中任一项所示的氨基酸序列。
81.另一方面，本技术提供了一种融合多肽，所述融合多肽可以包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及siglec家族蛋白成员或其功能活性片段的跨膜域和/或胞内域。
82.例如，所述融合多肽可以包含il-15结构域。例如，所述il-15结构域可以是il-15全长或其功能活性片段。例如，所述il-15结构域可以包含如seq id no：9所示的氨基酸序列。
83.例如，本技术的融合多肽可以包含il-15结构域和il-15受体或其功能活性片段。例如，所述融合多肽还可以包含il-15受体或其功能活性片段。例如，所述il-15受体可以包含il-15rα。例如，本技术的il-15受体可以包含il-15受体的全长或其功能活性片段。例如，本技术的il-15受体可以包含il-15受体的sushi结构域、铰链域、跨膜域和/或胞内域。
84.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的sushi结构域。例如，所述il-15rα的sushi结构域可以包含如seq id no：22所示的氨基酸序列。
85.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的铰链域。例如，所述il-15rα的铰链域可以包含如seq id no：23所示的氨基酸序列。
86.例如，所述il-15结构域与所述il-15受体或其功能活性片段可以直接或间接连接。例如，所述间接连接可以包含通过连接子连接。例如，所述连接子可以包含选自以下组所示的氨基酸序列：seq id no：10-16、(seq id no：17)
l
、(ap)m、(ep)n、(kp)
p
、和(seq id no：21)q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
87.例如，所述siglec家族蛋白成员可以包含siglec15。例如，所述siglec家族蛋白成员可以包含siglec15、其变体或其功能活性片段。
88.例如，所述融合多肽还可以包含siglec15的跨膜域。例如，所述融合多肽还可以包含siglec15的胞内域。例如，所述siglec15的跨膜域和胞内域可以包含如seq id no：26所示的氨基酸序列。
89.例如，所述融合多肽可以从n端到c端依次包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、以及siglec15的跨膜域和胞内域。
90.例如，所述融合多肽可以从n端到c端依次包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域和铰链域、以及siglec15的跨膜域和胞内域。
91.例如，所述融合多肽还可以包含信号肽。例如，所述信号肽可以包含如seq id no：8所示的氨基酸序列。
92.例如，所述融合多肽可以包含如seq id no：1-2中任一项所示的氨基酸序列。
93.另一方面，本技术提供了一种融合多肽，所述融合多肽可以包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及il-21受体或其功能活性片段的胞内域。
94.例如，所述融合多肽可以包含il-15结构域。
95.例如，所述融合多肽可以包含il-15结构域。例如，所述il-15结构域可以是il-15全长或其功能活性片段。例如，所述il-15结构域可以包含如seq id no：9所示的氨基酸序列。
96.例如，本技术的融合多肽可以包含il-15结构域和il-15受体或其功能活性片段。例如，所述融合多肽还可以包含il-15受体或其功能活性片段。例如，所述il-15受体可以包
含il-15rα。例如，本技术的il-15受体可以包含il-15受体的全长或其功能活性片段。例如，本技术的il-15受体可以包含il-15受体的sushi结构域、铰链域、跨膜域和/或胞内域。
97.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的sushi结构域。例如，所述il-15rα的sushi结构域可以包含如seq id no：22所示的氨基酸序列。
98.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的铰链域。例如，所述il-15rα的铰链域可以包含如seq id no：23所示的氨基酸序列。
99.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rα的跨膜域。例如，所述il-15rα的跨膜域可以包含如seq id no：24所示的氨基酸序列。
100.例如，所述il-15结构域与所述il-15受体或其功能活性片段可以直接或间接连接。例如，所述间接连接可以包含通过连接子连接。例如，所述连接子可以包含选自以下组所示的氨基酸序列：seq id no：10-16、(seq id no：17)
l
、(ap)m、(ep)n、(kp)
p
、和(seq id no：21)q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
101.例如，所述il-21受体可以包含il-21rβ。例如，本技术的il-21受体可以包含il-21受体的全长或其功能活性片段。例如，所述il-21rβ的胞内域可以包含如seq id no：30所示的氨基酸序列。
102.例如，所述融合多肽还可以包含il-15rβ的胞内域。例如，所述il-15rβ的胞内域可以包含如seq id no：27所示的氨基酸序列。
103.例如，所述融合多肽还可以包含4-1bb的胞内域。例如，所述4-1bb的胞内域可以包含如seq id no：28所示的氨基酸序列。
104.例如，所述融合多肽还可以包含受体酪氨酸的激活基序，例如cd3ζ的信号域。例如，所述cd3ζ的信号域可以包含如seq id no：29所示的氨基酸序列。
105.例如，所述融合多肽还可以从n端到c端依次包含il-15rβ的胞内域、4-1bb的胞内域和il-21rβ的胞内域。
106.例如，所述融合多肽还可以从n端到c端依次包含il-15rβ的胞内域和il-21rβ的胞内域。
107.例如，所述融合多肽还可以从n端到c端依次包含il-15rβ的胞内域、4-1bb的胞内域和cd3ζ的信号域。
108.例如，所述融合多肽可以从n端到c端依次包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、铰链域和跨膜域、以及il-15rβ的胞内域、4-1bb的胞内域和il-21rβ的胞内域，以及任选地包含cd3ζ的信号域。
109.例如，所述融合多肽可以从n端到c端依次包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、铰链域和跨膜域、以及il-15rβ的胞内域和il-21rβ的胞内域，以及任选地包含cd3ζ的信号域。
110.例如，所述融合多肽还可以包含信号肽。例如，所述信号肽可以包含如seq id no：8所示的氨基酸序列。
111.例如，所述融合多肽可以包含如seq id no：4-5中任一项所示的氨基酸序列。
112.例如，本技术提到的序列包含与该序列至少约95％同源的序列。例如，本技术提到的序列包含与该序列至少约95％、该序列至少约96％、该序列至少约97％、该序列至少约98％、该序列至少约99％同源的序列。
113.一方面，本技术提供了一种核酸，所述核酸编码本技术的融合多肽。
114.一方面，本技术提供了一种载体，所述载体可以包含本技术的核酸。
115.一方面，本技术提供了一种细胞，可以包含本技术的融合多肽、本技术的核酸和/或本技术的载体。
116.例如，所述细胞可以包含免疫细胞。例如，所述细胞可以包含nk细胞、nkt细胞和/或t细胞。例如，所述细胞可以包含源于人工多能干(ips)细胞的细胞、pbmc细胞和/或肿瘤浸润淋巴细胞。例如，本技术的细胞可以是由ips细胞分化而获得。
117.一方面，本技术提供了一种本技术的融合多肽的制备方法，所述方法包括在使得所述融合多肽表达的条件下，培养本技术的细胞。
118.一方面，本技术提供了一种组合物，所述组合物可以包含本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、和/或本技术的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
119.一方面，本技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒可以包含本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、和/或本技术的组合物。
120.一方面，本技术提供了一种培养细胞的方法，可以包含提供本技术的本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、本技术的组合物、和/或本技术的试剂盒。例如，本技术的培养细胞的方法可以是将表达本技术融合多肽的载体转导到该细胞中。
121.一方面，本技术提供了本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、本技术的组合物和/或本技术的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物可以用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
122.一方面，本技术提供了本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、本技术的组合物和/或本技术的试剂盒，其可以用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
123.一方面，本技术提供了一种预防、缓解和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包含提供本技术的融合多肽、本技术的核酸、本技术的载体、本技术的细胞、本技术的组合物和/或本技术的试剂盒。
124.技术方案
125.1.一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及
126.stat家族蛋白成员或其功能活性片段。
127.2.如技术方案1所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域。
128.3.如技术方案2所述的融合多肽，所述il-15结构域包含如seq id no：9所示的氨基酸序列。
129.4.如技术方案1-3中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15受体或其功能活性片段。
130.5.如技术方案4所述的融合多肽，所述il-15受体包含il-15rα。
131.6.如技术方案5所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的sushi结构域。
132.7.如技术方案6所述的融合多肽，所述il-15rα的sushi结构域包含如seq id no：22
133.所示的氨基酸序列。
134.8.如技术方案5-7中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的铰链
域。
135.9.如技术方案8所述的融合多肽，所述il-15rα的铰链域包含如seq id no：23所示的氨基酸序列。
136.10.如技术方案5-9中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的跨膜域。
137.11.如技术方案10所述的融合多肽，所述il-15rα的跨膜域包含如seq id no：24所示的氨基酸序列。
138.12.如技术方案5-11中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的胞内域。
139.13.如技术方案12所述的融合多肽，所述il-15rα的胞内域包含如seq id no：25所示的氨基酸序列。
140.14.如技术方案4-13中任一项所述的融合多肽，所述il-15结构域与所述il-15受体或其功能活性片段直接或间接连接。
141.15.如技术方案14所述的融合多肽，所述间接连接包含通过连接子连接。
142.16.如技术方案15所述的融合多肽，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：
143.seq id no：10-16、(seq id no：17)
l
、(ap)m、(ep)n、(kp)
p
、和(seq id no：21)q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
144.17.如技术方案1-16中任一项所述的融合多肽，所述stat家族蛋白成员包含
145.stat5a。
146.18.如技术方案17所述的融合多肽，所述stat5a包含第298位氨基酸的突变和/或第
147.710位氨基酸的突变。
148.19.如技术方案17-18中任一项所述的融合多肽，所述stat5a包含第298位氨基酸的突变为r(精氨酸)和/或第710位氨基酸的突变为f(苯丙氨酸)。
149.20.如技术方案17-19中任一项所述的融合多肽，所述stat5a的第298位氨基酸为r
150.(精氨酸)和第710位氨基酸为f(苯丙氨酸)。
151.21.如技术方案17-20中任一项所述的融合多肽，所述stat5a包含如seq id no：32
152.所示的氨基酸序列。
153.22.如技术方案17-21中任一项所述的融合多肽，所述stat5a的第710位氨基酸为f
154.(苯丙氨酸)。
155.23.如技术方案17-22中任一项所述的融合多肽，所述stat5a包含如seq id no：33
156.所示的氨基酸序列。
157.24.如技术方案1-23中任一项所述的融合多肽，所述白介素-15(il-15)或其功能活性片段与stat家族蛋白成员或其功能活性片段直接或间接连接。
158.25.如技术方案5-24中任一项所述的融合多肽，所述il-15rα与stat家族蛋白成员或其功能活性片段直接或间接连接。
159.26.如技术方案25所述的融合多肽，所述间接连接包含通过自剪切肽连接。
160.27.如技术方案26所述的融合多肽，所述自剪切肽包含2a肽或其功能活性片段。
161.28.如技术方案26-27中任一项所述的融合多肽，所述自剪切肽包含如seq id no：33
162.所示的氨基酸序列。
163.29.如技术方案1-28中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、铰链域、跨膜域和胞内域、自剪切肽、以及
164.stat5a，所述stat5a的第298位氨基酸为r(精氨酸)和第710位氨基酸为f
165.(苯丙氨酸)。
166.30.如技术方案1-29中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、铰链域、跨膜域和胞内域、自剪切肽、以及
167.stat5a，所述stat5a的第710位氨基酸为f(苯丙氨酸)。
168.31.如技术方案1-30中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含信号肽。
169.32.如技术方案31所述的融合多肽，所述信号肽包含如seq id no：8所示的氨基酸序列。
170.33.如技术方案1-32中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含如seq id no：6-7
171.中任一项所示的氨基酸序列。
172.34.一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及
173.siglec家族蛋白成员或其功能活性片段的跨膜域和/或胞内域。
174.35.如技术方案34所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域。
175.36.如技术方案35所述的融合多肽，所述il-15结构域包含如seq id no：9所示的氨基酸序列。
176.37.如技术方案34-36中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15受体或其功能活性片段。
177.38.如技术方案37所述的融合多肽，所述il-15受体包含il-15rα。
178.39.如技术方案38所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的sushi结构域。
179.40.如技术方案39所述的融合多肽，所述il-15rα的sushi结构域包含如seq id no：
180.22所示的氨基酸序列。
181.41.如技术方案38-40中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的铰链域。
182.42.如技术方案41所述的融合多肽，所述il-15rα的铰链域包含如seq id no：23所示的氨基酸序列。
183.43.如技术方案37-42中任一项所述的融合多肽，所述il-15结构域与所述il-15受体或其功能活性片段直接或间接连接。
184.44.如技术方案43所述的融合多肽，所述间接连接包含通过连接子连接。
185.45.如技术方案44所述的融合多肽，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：
186.seq id no：10-16、(seq id no：17)
l
、(ap)m、(ep)n、(kp)
p
、和(seq id no：21)q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
187.46.如技术方案34-45中任一项所述的融合多肽，所述siglec家族蛋白成员包含
188.siglec15。
189.47.如技术方案46所述的融合多肽，所述融合多肽还包含siglec15的跨膜域。
190.48.如技术方案46-47中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含siglec15的胞内域。
191.49.如技术方案46-48中任一项所述的融合多肽，所述siglec15的跨膜域和胞内域包含如seq id no：26所示的氨基酸序列。
192.50.如技术方案34-49中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、以及siglec15的跨膜域和胞内域。
193.51.如技术方案34-50中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域和铰链域、以及siglec15的跨膜域和胞内域。
194.52.如技术方案34-51中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含信号肽。
195.53.如技术方案52所述的融合多肽，所述信号肽包含如seq id no：8所示的氨基酸序列。
196.54.如技术方案34-53中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含如seq id no：1-2
197.中任一项所示的氨基酸序列。
198.55.一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及il-21受体或其功能活性片段的胞内域。
199.56.如技术方案55所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域。
200.57.如技术方案56所述的融合多肽，所述il-15结构域包含如seq id no：9所示的氨基酸序列。
201.58.如技术方案55-57中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15受体或其功能活性片段。
202.59.如技术方案58所述的融合多肽，所述il-15受体包含il-15rα。
203.60.如技术方案59所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的sushi结构域。
204.61.如技术方案60所述的融合多肽，所述il-15rα的sushi结构域包含如seq id no：
205.22所示的氨基酸序列。
206.62.如技术方案59-61中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的铰链域。
207.63.如技术方案62所述的融合多肽，所述il-15rα的铰链域包含如seq id no：23所示的氨基酸序列。
208.64.如技术方案59-63中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rα的跨膜域。
209.65.如技术方案64所述的融合多肽，所述il-15rα的跨膜域包含如seq id no：24所示的氨基酸序列。
210.66.如技术方案58-65中任一项所述的融合多肽，所述il-15结构域与所述il-15受体或其功能活性片段直接或间接连接。
211.67.如技术方案66所述的融合多肽，所述间接连接包含通过连接子连接。
212.68.如技术方案67所述的融合多肽，所述连接子包含选自以下组所示的氨基酸序列：
213.seq id no：10-16、(seq id no：17)
l
、(ap)m、(ep)n、(kp)
p
、和(seq id no：21)q，以及上述的任意组合，其中l、m、n、p和q各自独立地至少为1。
214.69.如技术方案55-68中任一项所述的融合多肽，所述il-21受体包含il-21rβ。
215.70.如技术方案69所述的融合多肽，所述il-21rβ的胞内域包含如seq id no：30所示的氨基酸序列。
216.71.如技术方案55-70中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rβ的胞内域。
217.72.如技术方案71所述的融合多肽，所述il-15rβ的胞内域包含如seq id no：27所示的氨基酸序列。
218.73.如技术方案55-72中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含4-1bb的胞内域。
219.74.如技术方案73所述的融合多肽，所述4-1bb的胞内域包含如seq id no：28所示的氨基酸序列。
220.75.如技术方案55-74中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含cd3ζ的信号域。
221.76.如技术方案75所述的融合多肽，所述cd3ζ的信号域包含如seq id no：29所示的氨基酸序列。
222.77.如技术方案55-76中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rβ的胞内域、4-1bb的胞内域和il-21rβ的胞内域。
223.78.如技术方案55-77中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含il-15rβ的胞内域和il-21rβ的胞内域。
224.79.如技术方案55-78中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、铰链域和跨膜域、以及il-15rβ的胞内域、4-1bb的胞内域和il-21rβ的胞内域，以及任选地包含cd3ζ的信号域。
225.80.如技术方案55-79中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含il-15结构域、连接子、il-15rα的sushi结构域、铰链域和跨膜域、以及il-15rβ的胞内域和il-21rβ
226.的胞内域，以及任选地包含cd3ζ的信号域。
227.81.如技术方案55-80中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含信号肽。
228.82.如技术方案81所述的融合多肽，所述信号肽包含如seq id no：8所示的氨基酸序列。
229.83.如技术方案55-82中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含如seq id no：4-5
230.中任一项所示的氨基酸序列。
231.84.一种核酸，所述核酸编码技术方案1-83中任一项所述的融合多肽。
232.85.一种载体，所述载体包含技术方案84所述的核酸。
233.86.一种细胞，包含技术方案1-83中任一项所述的融合多肽、技术方案84所述的核
酸和/或技术方案85所述的载体。
234.87.如技术方案86所述的细胞，所述细胞包含免疫细胞。
235.88.如技术方案86-87中任一项所述的细胞，所述细胞包含nk细胞、nkt细胞和/或t
236.细胞。
237.89.如技术方案86-88中任一项所述的细胞，所述细胞包含源于人工多能干(ips)细胞的细胞、pbmc细胞和/或肿瘤浸润淋巴细胞。
238.90.一种技术方案1-83中任一项所述的融合多肽的制备方法，所述方法包括在使得所述融合多肽表达的条件下，培养技术方案86-89中任一项所述的细胞。
239.91.一种组合物，所述组合物包含技术方案1-83中任一项所述的融合多肽、技术方案84
240.所述的核酸、技术方案85所述的载体、和/或技术方案86-89中任一项所述的细
241.胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
242.92.一种试剂盒，所述试剂盒包含技术方案1-83中任一项所述的融合多肽、技术方案84
243.所述的核酸、技术方案85所述的载体、技术方案86-89中任一项所述的细胞、和/
244.或技术方案91所述的组合物。
245.93.一种培养细胞的方法，包含提供本技术的技术方案1-83中任一项所述的融合多肽、技术方案84所述的核酸、技术方案85所述的载体、技术方案86-89中任一项所述的细胞、技术方案91所述的组合物、和/或技术方案92所述的试剂盒。
246.94.技术方案1-83中任一项所述的融合多肽、技术方案84所述的核酸、技术方案85所述的载体、技术方案86-89中任一项所述的细胞、技术方案91所述的组合物和/或技术方案92所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
247.不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术的融合多肽、制备方法和用途等，而不用于限制本技术发明的范围。
248.实施例
249.实施例1
250.融合蛋白的序列信息
251.252.[0253][0254]
细胞来源和细胞培养
[0255]
免疫细胞来源于临床病人的肿瘤样本，肿瘤块经过研磨消化分选，从而获得免疫细胞，例如til细胞。免疫细胞在cd3抗体的刺激下，在商用的免疫细胞培养基中活化两天后进行转导。
[0256]
质粒构建
[0257]
携带融合多肽的逆转录病毒的质粒构建可以是合成本技术的融合多肽基因片段，序列如氨基酸列表中n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7所示，用ecori+noti酶切，回收外源片段融合多肽。用ecori+noti酶切质粒mp71，回收载体片段。用t4 ligase连接外源片段与载体片段，得到携带融合多肽的逆转录病毒的质粒。
[0258]
细胞转导
[0259]
转导前1天使用终浓度为10-20μg/ml的重组人纤维蛋白片段(retronectin，takara)包被24孔悬浮培养板，24孔板每孔250μl。避光，4℃过夜备用。取出包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％bsa封闭液500μl室温封闭30分钟。吸弃封闭液，用含2.5％hepes的洗板液500μl/孔洗板2次，吸弃洗板液。试验组用携带本技术的融合多肽的逆转录病毒进行转导。
[0260]
每孔加0.25-2ml逆转录病毒液，32℃，1000-2000g，离心1-2小时，阴性对照组不进行细胞转导。弃去24孔板上清液，24孔板每孔加入免疫细胞，例如til群，体积300-500μl，细胞浓度约为0.5-2
×
106个/ml。将培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养，得到转导后细胞。
[0261]
转导次日重悬细胞计数，按照细胞数til:滋养细胞＝1：40～1：400添加滋养细胞，滋养细胞可以是分离自健康供者的外周血单个核细胞。转导后3-6天视细胞生长状态适时补充含浓度为300-9000iu/ml(例如可以是1000-9000iu/ml)的il-2的新鲜培养基。其后每2-4天观察细胞，适时补液培养，使细胞浓度维持在1e6-2e6/ml。
[0262]
实施例2
[0263]
转导效率
[0264]
转导后的第4天开始，可以用流式细胞仪(beckman coulter)检测本技术免疫细胞的转导效率。
[0265]
在pbmc细胞中：
[0266]
免疫细胞增殖的促进作用
[0267]
转导第5天，30ng/ml anti-cd3抗体铺板，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，三天后进行扩增情况的检测。根据ctg试剂盒(celltiter-glo luminescent cell viability assay，promega)的说明书，将ctg底物(celltiter-glo substrate)与ctg缓冲液(celltiter-glo buffer)混合制备ctg反应液。将检测细胞悬液加入96孔微孔板中，50μl/孔，设置仅含培养基的孔作为荧光的背景值。每孔加入等体积的ctg
反应液，水平摇床震摇2分钟并室温避光静置10分钟使荧光信号稳定后，读取荧光值。
[0268]
图1显示的是，各组t细胞的增殖能力。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05。
[0269]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的扩增能力。
[0270]
细胞因子分泌的促进作用
[0271]
转导后的第5天开始，各组t细胞以相同的细胞总数重新铺板，30ng/ml anti-cd3抗体铺板，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
[0272]
细胞因子分泌检测方法可以参照细胞因子检测试剂盒(bd)的说明书，将人th1/th2/th17细胞因子标准品冻干粉(bd)使用2ml assay diluent稀释液(bd)复溶(标准品原液各细胞因子浓度均为5000pg/ml)并按顺序：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024梯度稀释，标记为“标准品管”。取1管仅含有assay diluent稀释液作为参照。按照2μl/beads/孔加入每种capture beads(bd)，然后按照10μl/孔加入pe detection reagent检测试剂(bd)并混合配制为混合物(mix)，按照22μl/孔加入v底96孔板内，随后按照10μl/孔加入各标准品和实验组的上清并混合，室温下避光孵育3小时。孵育结束，每孔加入200μl wash buffer(bd)，500g离心3分钟。离心结束，每孔加入100μl wash buffer(bd)重悬，进行流式分析。
[0273]
图2显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的细胞因子的分泌情况。
[0274]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的细胞因子分泌能力。
[0275]
在til细胞中：
[0276]
免疫细胞增殖的促进作用
[0277]
转导后的第10天开始，30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，3天后，进行扩增情况的检测。
[0278]
参照以上实施例进行细胞增殖能力的检测。
[0279]
图3显示的是，各组t细胞的增殖能力。相对于ctrl1组的显著性，***表示p《0.001，****表示p《0.0001。
[0280]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的扩增能力。
[0281]
细胞因子分泌的促进作用
[0282]
转导后的第10天开始30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
[0283]
参照以上实施例进行细胞因子分泌的检测。
[0284]
图4至5显示的是，各组t细胞的细胞因子的分泌情况。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05，***表示p《0.001。
[0285]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的细胞因子分泌能力。
[0286]
实施例3
[0287]
转导效率
[0288]
转导后的第4天开始，可以用流式细胞仪(beckman coulter)检测本技术免疫细胞的转导效率。
[0289]
在pbmc细胞中：
[0290]
免疫细胞增殖的促进作用
[0291]
转导后的第5天开始，30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，3天后，进行扩增情况的检测。
[0292]
参照以上实施例进行细胞增殖能力的检测。
[0293]
图6显示的是，各组t细胞的增殖能力。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05。
[0294]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的扩增能力。
[0295]
细胞因子分泌的促进作用
[0296]
转导后的第5天开始，30ng/ml anti-cd3抗体铺板，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
[0297]
参照以上实施例进行细胞因子分泌的检测。
[0298]
图7显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的细胞因子的分泌情况。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05。
[0299]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细可以具有显著增强的细胞因子分泌能力。
[0300]
在til细胞中：
[0301]
免疫细胞增殖的促进作用
[0302]
转导后的第10天开始30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，3天后，进行扩增情况的检测。
[0303]
参照以上实施例进行细胞增殖能力的检测。
[0304]
图8显示的是，各组t细胞的增殖能力。相对于ctrl1组的显著性，**表示p《0.01，****表示p《0.0001。
[0305]
转导后的第7天开始，30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，或者无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，3天后，进行扩增情况的检测。
[0306]
参照以上实施例进行细胞增殖能力的检测。
[0307]
图9至11显示的是，各组t细胞的增殖能力。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.0001。
[0308]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的扩增能力。
[0309]
肿瘤细胞连续杀伤的促进作用
[0310]
转导后的第7天开始，将a375肿瘤细胞系以2
×
104/孔铺于96孔板中(或者是hela细胞，1.5e4/孔)。次日，将各组til细胞以效靶比(til细胞：肿瘤细胞)为4:1或1:1的比例与上述肿瘤细胞共培养，每组至少五个孔。此后每三天每组取一个孔中的全部细胞用于流式检测，其他各组弃去一半上清，并根据流式检测结果补充等量的肿瘤细胞。流式检测分析步骤如下：首先将原有孔全部细胞吹打下来，吹匀取适量细胞至新的v底96孔板用于流式检
测，600g离心3min，弃上清；每孔加入100μl pbs洗涤一次，再次离心弃上清；然后每孔0.5μl流式抗体，以及50μl配制好的死活染料，4℃孵育30min。其中流式抗体包括bv510 anti-cd3、pc7 anti-cd45、pe anti-mcsp(或者是bv421-cd326)，每种抗体各加0.5μl/孔。孵育完成后，600g离心3min，弃上清；洗涤一次后，加入适量pbs重悬细胞，进行流式检测。
[0311]
根据流式结果，计算肿瘤细胞/til细胞比例，该数值越小表明肿瘤细胞的相对数量余越少，杀伤效果越好。图12至14显示的是，各组t细胞对于肿瘤细胞的连续杀伤能力。
[0312]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的肿瘤细胞连续杀伤能力。
[0313]
细胞因子分泌的促进作用
[0314]
转导后的第10天开始，30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
[0315]
参照以上实施例进行细胞因子分泌的检测。
[0316]
图15至16显示的是，各组t细胞的细胞因子的分泌情况。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.0001。
[0317]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的细胞因子分泌能力。
[0318]
细胞长期增殖的促进作用
[0319]
转导后的第8天开始，各组免疫细胞经过pbs洗涤一次后，用不含有il-2的细胞培养基培养重悬，以相同的密度(1e6个/ml)铺板到六孔板中，每孔3ml，即撤去il-2进行培养。每3天用细胞计数仪检测til细胞的密度及活率，如果活细胞密度超过2e6个/ml,则弃去适量体积的细胞悬液(弃之前再次吹打混匀)，补充适量新鲜培养基，是细胞密度维持在1-2e6个/ml，并记录弃去细胞的体积。各时间点细胞数目计算时也纳入了弃去的细胞悬液，得到各时间点总共应得的细胞数目。
[0320]
图17显示的是，各组t细胞的细胞长期增殖情况。
[0321]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的细胞长期增殖能力。
[0322]
实施例4
[0323]
转导效率
[0324]
转导后的第4天开始，可以用流式细胞仪(beckman coulter)检测本技术免疫细胞的转导效率。
[0325]
在pbmc细胞中：
[0326]
免疫细胞增殖的促进作用
[0327]
转导后的第5天开始，30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞在转导后第6天以1.5e5/孔铺于96孔板，3天后，进行扩增情况的检测。
[0328]
参照以上实施例进行细胞增殖能力的检测。
[0329]
图18显示的是，各组t细胞的增殖能力。
[0330]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的扩增能力。
[0331]
细胞因子分泌的促进作用
[0332]
转导后的第5天开始，30ng/ml anti-cd3抗体铺板，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
[0333]
参照以上实施例进行细胞因子分泌的检测。
[0334]
图19显示的是，各组t细胞在cd3抗体刺激后的细胞因子的分泌情况。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05。
[0335]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细可以具有显著增强的细胞因子分泌能力。
[0336]
转导后的第10天开始，，30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，3天后，进行扩增情况的检测。
[0337]
在til细胞中：
[0338]
免疫细胞增殖的促进作用
[0339]
参照以上实施例进行细胞增殖能力的检测。
[0340]
图20显示的是，各组t细胞的增殖能力。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.0001。
[0341]
转导后的第7天开始，30ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，3天后，进行扩增情况的检测。
[0342]
参照以上实施例进行细胞增殖能力的检测。
[0343]
图21至23显示的是，各组t细胞的增殖能力。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.0001。
[0344]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的扩增能力。
[0345]
肿瘤细胞连续杀伤的促进作用
[0346]
准备用于检测的各组获得的免疫细胞和用于共培养的靶细胞(例如hela肿瘤细胞或a375细胞)。
[0347]
参照以上实施例进行细胞杀伤能力的检测。
[0348]
图24至29的是，各组t细胞对于肿瘤细胞的连续杀伤能力。
[0349]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的肿瘤细胞连续杀伤能力。
[0350]
细胞因子分泌的促进作用
[0351]
转导后的第10天开始，0ng/ml anti-cd3抗体铺板作为刺激组，无anti-cd3抗体铺板作为未刺激组，第二天将转导组和对照组t细胞以1.5e5/孔铺于96孔板，24小时后取上清进行细胞因子分泌检测。
[0352]
参照以上实施例进行细胞因子分泌的检测。
[0353]
图30至31显示的是，各组t细胞的细胞因子的分泌情况。相对于ctrl1组的显著性，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.0001。
[0354]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的细胞因子分泌能力。
[0355]
细胞长期增殖的促进作用
[0356]
参照以上实施例进行细胞长期增殖的检测。
[0357]
图32显示的是，各组t细胞的细胞长期增殖情况。
[0358]
结果表明，转导了本技术的融合多肽的免疫细胞可以具有显著增强的细胞长期增殖能力。
[0359]
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本技术所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

技术特征：
1.一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及stat家族蛋白成员或其功能活性片段。2.一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及siglec家族蛋白成员或其功能活性片段的跨膜域和/或胞内域。3.一种融合多肽，所述融合多肽包含白介素-15(il-15)或其功能活性片段，以及il-21受体或其功能活性片段的胞内域。4.如权利要求1-3中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含如seq id no：1-2、4-5或6-7中任一项所示的氨基酸序列。5.一种核酸，所述核酸编码权利要求1-4中任一项所述的融合多肽。6.一种载体，所述载体包含权利要求5所述的核酸。7.一种细胞，包含权利要求1-4中任一项所述的融合多肽、权利要求5所述的核酸和/或权利要求6所述的载体。8.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-4中任一项所述的融合多肽、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的载体、和/或权利要求7所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。9.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-4中任一项所述的融合多肽、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的细胞、和/或权利要求8所述的组合物。10.权利要求1-4中任一项所述的融合多肽、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的细胞、权利要求8所述的组合物和/或权利要求9所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。

技术总结
本申请涉及一种融合多肽及其用途。具体涉及一种融合多肽，包含IL-15的功能活性片段以及胞内信号转导域。及胞内信号转导域。


技术研发人员：刘雅容 孙静玮 金家辉 王泉伟
受保护的技术使用者：珠海拓域生物科技有限公司 上海沙砾生物科技有限公司 珠海沙砾生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/8/21