一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取装置和应用

1.本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取装置和应用。


背景技术：

2.核酸提取广泛应用于基因工程、分子生物学研究、核酸检测等多个领域，是一项重要的基础技术。微流控芯片又称片上实验室，可以把样品前处理、反应、检测等操作基本单元集成在一块芯片上，具有液体可控、消耗试样和试剂极少、分析速度快、集成化的优点，在核酸的即时检测、现场检测等方面有很大的应用前景。
3.在核酸检测领域，为满足现场检测、户外检测的需求，对于病毒或病原菌的检测更加强调速度快、装置简单、操作便捷，而核酸提取正是影响整体检测时间、操作步骤及装置设计复杂性的重要因素之一。这主要是因为核酸提取包括细胞裂解、吸附、洗涤、洗脱4步，这为集成式核酸检测装置的设计增加了难度；同时，核酸提取尤其是细胞裂解这一步耗费了大量时间。
4.商用核酸提取试剂盒中最常用的细胞裂解方法是化学法，但是其通常需要加热孵育10～30min，且由于裂解液大多含有苯酚、胍盐、蛋白酶k等扩增抑制物，所以需要后续的纯化及洗涤等多个步骤以去除裂解液中的抑制物。
5.电穿孔技术可以使细胞膜在高强度电场中发生介电击穿，在膜上形成不可逆的孔洞，进而导致细胞膜破裂。这种技术主要用于癌细胞治疗及核酸、蛋白等细胞内容物提取。电穿孔裂解作为一种物理裂解方法，不会引入扩增抑制物，且相比于传统的热、机械等物理裂解方法，裂解所需时间更短，效率更高，操作更方便。
6.不可逆电穿孔的发生要满足跨膜电势大于等于1v和持续大于等于1v两个要求。而大于等于1v的跨膜电势是由高电场强度诱导产生的。直流和交流电压都可以用于电穿孔，最常施加的是直流脉冲或高频交流电压，这主要是为了防止电解作用产生的气泡、电极剥蚀及焦耳热。
7.在传统的电穿孔装置中，为达到电穿孔所需的高电场强度，需要在电极上施加几百上千伏的高压，这对于电源装置的要求较高，且不安全，同时也不满足现场检测、户外检测的需求。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中电穿孔核酸提取技术需要高电压，不安全，且无法用于现场、户外检测等缺陷和不足，提供一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取装置，并由此再提供一种集核酸提取、扩增、检测于一体的微流控芯片。
9.本发明的目的是提供一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取装置。
10.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
11.一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取装置，包括电裂解室；所述电裂解
室底部设有叉指电极，电裂解室顶部两端分别设有进样孔和进气孔，所述叉指电极与直流电源相连；所述进气孔用于平衡电裂解室内外气压。
12.本发明的核酸快速提取装置基于不可逆电穿孔的原理，通过叉指电极搭配直流电源，使细胞在流经直流叉指电极表面的过程中持续受到交替变化的高强度电场作用，进而发生破裂并释放核酸。
13.本发明之所以采用叉指电极搭配直流电源，主要是考虑到核酸检测微流控芯片，为了防止样品污染和非特异性扩增，芯片仅做一次性使用，且进样量少、流经电极时间短，所以电解作用的负面影响可以不用考虑，因此可电池供电、电源装置简单便携、可用于户外现场检测的连续直流电压是一个更好的选择。并且，与传统脉冲和交流电压相比，连续的直流电压具有更高的电穿孔效率。因为在电压幅度不变的情况下，对于频率为10
4-107hz的高频交流电场，其诱导产生的跨膜电势随频率的升高而明显降低；而对于脉冲电场，当脉冲宽度小于临界时间(细胞膜的弛豫时间)时，将形成可逆电穿孔，无法实现细胞裂解。但不连续或不恒定的电压通常需要更高的电场强度或更长的电场持续时间才可以形成不可逆电穿孔。而叉指电极是一种指状或梳状的面内有周期性图案，正负极交替排列的平面微电极，由于电极正负极的间隙在微米级别，且平面电极的边缘通常产生高强度电场，所以仅需几十伏电压即可达到裂解细胞所需的电场强度，从而用低电压直流电即可实现细胞裂解。从而不需要像传统电穿孔装置，为达到电穿孔所需的高电场强度，需要在电极上施加几百上千伏的高压。本发明利用交替低压直流电穿孔的方式持续稳定地裂解细胞并释放核酸，工作电压在30v以下，可用电池供电，在1s内完成细胞裂解，简化了核酸提取步骤，进而加快了核酸检测的速度。
14.目前现有技术中的叉指电极主要是作为电信号传输核心部件，从而广泛应用于生物医疗检测、环境在线监测，食品安全检测，公共安全等重要领域，基于叉指电极的电化学传感器通过与被测目标分析物发生反应，并产生与目标分析物浓度成比例的电信号来工作。目前还未见将叉指电极用于电裂解提取核酸中的报道。
15.优选地，所述叉指电极为平面电极，由两个相同的梳子状的电极交错排列而成，每根叉指的形状大小及叉指间隙均相同。
16.优选地，所述叉指电极的电极材料包括但不限于金、铂或碳材料中的任一种。
17.优选地，所述电极材料的厚度为0.1～1μm。
18.优选地，所述叉指电极的叉指对数为5～50对。
19.优选地，所述叉指电极的叉指间隙为10～50μm。
20.优选地，所述直流电源的工作电压为5～30v。
21.进一步优选地，所述直流电源包括但不限于电池，还包括例如蓄电池、直流发电机、直流稳压电源中的任一种。
22.本发明还提供一种集核酸提取、扩增、检测于一体的微流控芯片，包括芯片主体，所述芯片主体中设有上述任一所述核酸快速提取装置、储液室、单组隔离室和扩增室或多组并行的隔离室和扩增室，电裂解室、储液室、单组隔离室和扩增室或多组并行的隔离室和扩增室之间通过贯穿的通道依次连通；所述储液室用于储存电裂解室中提取得到的核酸，所述隔离室内含有用于分隔储液室与扩增室的试剂，所述扩增室内装有核酸扩增反应试剂和指示剂；所述微流控芯片的储液室可与单组隔离室及扩增室或多组并行的隔离室及扩增
室连通，从而组成单通道或多通道检测芯片。
23.本发明微流控芯片的电裂解室用于电裂解生物样本提取核酸，储液室用于储存电裂解室提取得到的核酸，隔离室用于隔离储液室与扩增室，扩增室中的试剂用于对提取到的核酸进行扩增和显色反应。所述微流控芯片可在1s内完成细胞裂解，可在15min内完成核酸提取、扩增和可视化检测，有望在户外或现场使用。
24.优选地，所述隔离室内的试剂为油或蜡块；所述油包括但不限于矿物油、石蜡油、植物油，所述蜡块包括但不限于石蜡、大豆蜡、椰子蜡。且当所述隔离室内为油时，所述储液池中含有磁珠和结合液；当所述隔离室内为蜡块时，所述储液池中没有液体。
25.进一步地，所述磁珠为具有超顺磁性的纳米粒子，表面修饰基团为羧基或氨基，所述磁珠直径包括100～1000nm，磁珠用于吸附核酸。
26.进一步地，所述核酸扩增反应试剂含有引物、dna聚合酶、指示剂和扩增缓冲液。特别地，对于rna的扩增，所述核酸扩增反应试剂还包括逆转录酶，以启动rna逆转录。
27.进一步地，所述dna聚合酶为链置换dna聚合酶；所述扩增缓冲液中含有本领域常规的dntps、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween 20等；所述指示剂包括但不限于苯酚红。
28.优选地，所述通道在电裂解室的高度为5～50μm；即通道位于电裂解室底部上方5～50μm处，高于电裂解室内核酸提取时的液面高度。
29.本发明还提供上述任一所述的微流控芯片在快速提取并检测生物样本中单种或多种细胞或微生物的核酸中的应用。
30.本发明还提供一种快速提取并检测生物样本中细胞或微生物的核酸的方法，包括如下步骤：
31.s1.将生物样本溶液离心，取其沉淀重悬于裂解缓冲液中；
32.s2.打开直流电源，将重悬后的溶液经进样孔注入微流控芯片的电裂解室中，使其流经电裂解室被裂解后进入储液室；
33.s3.加热微流控芯片，将储液室中的液体或磁珠经隔离室移动到扩增室中，静置，完成核酸扩增反应和显色。
34.所述裂解缓冲液是一种有助于打开细胞的溶液，通常在细胞中提取dna或蛋白质进行分析时都需要使用裂解缓冲液来辅助完成。细胞裂解缓冲液种类有很多，其中较常见的一种是tris-hcl缓冲液和edta，tris-hcl可以保持细胞裂解缓冲液的最佳ph值，主要作为裂解缓冲液的主要成分；所述edta有助于降低蛋白酶或dna酶的活性水平。
35.优选地，所述裂解缓冲液为含有5～15mm tris-hcl、0.5～2mmol/l edta的水溶液。
36.优选地，所述生物样本包括但不限于唾液、牙垢、胃液、血液、尿液，以及细胞、细菌、真菌的培养液。
37.优选地，所述直流电源的工作电压为5～30v，所述经进样孔注入芯片的方式包括但不限于注射泵灌入、滴管挤入、微量移液器注入。
38.优选地，步骤s3中，当所述储液室内仅有液体没有磁珠时，65℃加热后隔离室内蜡块熔化，用手挤压将储液室内液体连同熔化后的蜡液移动到扩增室中，蜡液不溶于水且浮于水上；当所述储液室内有磁珠时，则将磁铁贴于储液室下方芯片外壁处静置1min，之后沿
通道滑行，吸引磁珠穿过隔离室的油进入扩增室中，撤掉磁铁。且所述步骤s3中，所述静置时间为10～40min，所述核酸扩增反应为环介导等温核酸扩增反应。
39.以采用唾液作为生物样本为例，应用于唾液中细菌的核酸提取检测，本发明微流控芯片的原理为：
40.(1)受检人的唾液经过离心后，去除上清液，初步去除唾液中的扩增抑制物，唾液中的细菌存在于沉淀中，用裂解缓冲液重悬沉淀，将重悬后的溶液吸入滴管或吸入微量移液器或装入注射泵中。缓冲液在电穿孔过程参与跨膜电势的形成且不影响扩增反应。
41.(2)完成样本采集和装载后，打开直流电源，为叉指电极施加电压；同时用滴管挤压或开启注射泵或用微量移液器注入，使样本溶液被注入电裂解室中；样本溶液流经叉指电极区域，细菌在电场中被诱导产生跨膜电势；当跨膜电势持续大于等于1v时，细菌发生不可逆电穿孔，细胞膜破损，细菌被裂解；且由于注射泵的推动，样品溶液中的细菌经历多对电极的反复的电穿孔作用，使细菌裂解得更加彻底。裂解后的样本溶液进入储液室。
42.(3)将芯片放在65℃加热板上预热2min。当隔离室内为蜡块时，储液室内只有裂解后的样品溶液，预热的过程中，蜡块熔化成液体，用手挤压芯片将储液室内液体和熔化后的蜡液一同挤入扩增液中；由于蜡液密度小，因此浮于扩增室内溶液表面且不溶于水，而裂解后的样品溶液与核酸扩增反应试剂混合；当隔离室内为油时，储液室内有裂解后的样品溶液，及预装的结合液、磁珠，磁珠在结合液中可将核酸吸附于表面，之后将磁铁贴于储液室下方芯片外壁处静置1min，并沿通道滑行，吸引磁珠穿过隔离室的油进入扩增室中；此时撤掉磁铁，磁珠分散在核酸扩增反应试剂中，吸附在磁珠上的核酸可以作为核酸扩增的模板。静置10～40min，等待完成核酸扩增。
43.(4)边反应边观察扩增室中溶液的颜色，从而判定核酸检测结果，最快10min可观察到颜色变化。当指示剂为苯酚红时，苯酚红可以指示溶液中h
+
浓度的变化，而核酸扩增过程中，核酸链上每结合一个核苷酸会释放1个h
+
，因此苯酚红可以作为核酸检测的指示剂。当扩增反应中有目标物存在时，苯酚红由红变黄。
44.与现有技术相比，本发明的有益效果：
45.本发明的核酸快速提取装置基于不可逆电穿孔的原理，利用交替低压直流电穿孔的方式连续稳定地裂解细胞并释放核酸，工作电压在30v以下；相比于传统电穿孔方法所需电压大幅降低；相比于直流脉冲或高频交流电穿孔，本发明裂解效率更高，电场更稳定，且可用简单的电池供电，无需配合函数发生器或交流放大器，适合户外、现场检测；相比于普通的直流电压连续电穿孔，本发明不需进行复杂的通道设计或精准的微流体控制，且细胞在流动过程中经历的方向交替变化的电场提高了裂解效率。
46.本发明提供的核酸快速提取装置，可在1s内完成核酸释放，且无需引入含有扩增抑制物的裂解液，获得的核酸无需多步洗涤即可用于扩增，极大地缩短了核酸提取时间，简化了核酸提取步骤，进而加快了核酸检测的速度，最快15min完成核酸提取、扩增和可视化检测。
47.本发明微流控检测芯片，将核酸提取、扩增、检测集成到一个微流控芯片中，操作简单，芯片装置便携，可视化检测结果易辨别，可实现单指标或多指标的同时检测，有望在户外或现场使用。
附图说明
48.图1为本发明基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取技术的集核酸提取、扩增、检测于一体的单通道微流控芯片的组成示意图。
49.图2为商用核酸提取试剂盒与采用本发明的交替低压直流电穿孔技术分别提取的幽门螺旋杆菌核酸的扩增结果比较图。
50.图3为本发明基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取技术的集多指标的核酸提取、扩增、检测于一体的多通道微流控芯片的组成示意图。
51.图注：1-电裂解室，2-储液室，3-隔离室，4-扩增室，5-叉指电极，6-进样孔，7-进气孔，31-第一隔离室，32-第二隔离室，33-第三隔离室，41-第一扩增室，42-第二扩增室，43-第三扩增室。
具体实施方式
52.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
53.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
54.实施例1
55.如图1所示，一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及检测微流控芯片，芯片主体结构由上下两层片基组成，其芯片主体中设有电裂解室1、储液室2、隔离室3和扩增室4，电裂解室1、储液室2、隔离室3及扩增室4通过贯穿的通道依次连通。所述电裂解室底部为叉指电极5，顶部两端分别设有进样孔6和用于平衡外部气压的小孔7，所述电裂解室1中的叉指电极5与直流电源相连；所述储液室2用于储存电裂解室1中提取得到的核酸；所述隔离室3内含有用于分隔储液室2与扩增室4的油或石蜡块；所述扩增室4内装有核酸扩增反应试剂和指示剂。
56.所述叉指电极为平面电极，由两个相同的梳子状的电极交错排列而成，每根叉指的形状大小及叉指间隙均相同。
57.所述叉指电极的电极材料包括但不限于金、铂或碳材料中的任一种。
58.所述电极材料的厚度为0.1～1μm。
59.所述叉指电极的叉指对数为5～50对。
60.所述叉指电极的叉指间隙为10～50μm。
61.所述直流电源的工作电压为5～30v。
62.所述直流电源包括但不限于电池。
63.所述通道在电裂解室的高度为5～50μm；即通道位于电裂解室底部上方5～50μm处，高于电裂解室内核酸提取时的液面高度。
64.所述油包括但不限于矿物油、石蜡油、植物油，所述蜡块包括但不限于石蜡、大豆蜡、椰子蜡。且当所述隔离室内为油时，所述储液池中含有磁珠和结合液；当所述隔离室内为蜡块时，所述储液池中没有液体。
65.所述磁珠为具有超顺磁性的纳米粒子，表面修饰基团为羧基或氨基，所述磁珠直径包括100～1000nm，磁珠用于吸附核酸。
66.所述核酸扩增反应试剂含有引物、dna聚合酶、指示剂和扩增缓冲液。特别地，对于rna的扩增，所述核酸扩增反应试剂还包括逆转录酶，以启动rna逆转录。
67.所述dna聚合酶为链置换dna聚合酶；所述扩增缓冲液中含有本领域常规的dntps、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween 20等；所述指示剂包括但不限于苯酚红。
68.所述基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及检测芯片的应用，包括如下步骤：
69.s1、将生物样本溶液离心，取其沉淀重悬于裂解缓冲液中；
70.s2、打开直流电源，将重悬后的溶液经进样孔注入微流控芯片的电裂解室中，使其流经电裂解室被裂解后进入储液室；
71.s3、加热微流控芯片，将储液室中的液体或磁珠移动到扩增室中，静置，完成核酸扩增反应和显色。边反应边观察扩增室4中溶液的颜色，从而判定核酸检测结果，最快10min可观察到颜色变化。
72.实施例2
73.如图1，本实施例提供了一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及检测微流控芯片，与实施例1基本相同，其中所述储液室2内含有结合液和磁珠；所述隔离室3内含有用于分隔储液室2与扩增室4的矿物油；所述扩增室4内装有环介导等温核酸扩增反应试剂。应用于快速提取并扩增检测牙垢样本中的幽门螺旋杆菌，扩增目标物为幽门螺旋杆菌的urec基因片段。
74.其中，电裂解室1、储液室2、隔离室3及扩增室4是由一条通道贯通的，且所述通道在电裂解室1的高度为30μm；所述叉指电极5的电极材料为金，厚度为0.2μm，叉指对数为25对，叉指间隙为20μm。
75.所述基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及检测微流控芯片用于牙垢中幽门螺旋杆菌的检测，包括如下步骤：
76.s1、用牙线取牙垢样本，将牙线剪断置于装有缓冲液的离心管中，使牙垢悬浮于缓冲液中，并将悬浮后的溶液装入注射泵中。其中，所述缓冲液为含有10mm tris-hcl、1mmol/l edta的水溶液，且ph为8.0。
77.s2、打开电池盒开关，同时开启注射泵，重悬后的溶液流经电裂解室1被裂解后进入储液室2。其中，所述直流电源的工作电压为20v，所述注射泵的流速根据细菌流经叉指电极的时间设置，所述时间设置为5ms。
78.s3、65℃加热所述芯片2min，隔离室3内蜡块熔化为液体，用手挤压将储液室2内液体连同熔化的蜡液一同移动到扩增室4中，此时，蜡液浮于溶液表面且不溶于水，静置10～40min，等待完成环介导等温核酸扩增反应。其中，所述扩增室4内预装有核酸扩增反应试剂，含有6条引物(fip、bip、lf、lb、f3、b3)、链置换dna聚合酶、苯酚红、dntps、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween 20。
79.其中，所述6条引物的脱氧核苷酸序列及其在所述环介导等温核酸扩增反应中的终浓度如下所示：
80.fip：5
’‑
caagtgagcgcgttagtgttacaaaggggtttaacg caac-3’，终浓度为1.6μm；
81.bip：5
’‑
caccaaaccatcgcctgttttgaataaagccaattt tggagg-3’，终浓度为1.6μm；
82.lf：5
’‑
gaaagcaagcaggtaagc-3’，终浓度为0.8μm；
83.lb：5
’‑
tcgctaaaaatgatatgccc-3’，终浓度为0.8μm；
84.f3：5
’‑
actaggctttgggggtat-3’，终浓度为0.2μm；
85.b3：5
’‑
agtttgtgagcgaatgca-3’，终浓度为0.2μm。
86.其中，所述链置换dna聚合酶、dntps、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween 20在所述环介导等温核酸扩增反应中的终浓度分别为0.32u/μl、1.4mm、20mm、10mm、50mm、8mm和0.1％(质量分数)。
87.s4、边反应边观察扩增室4中溶液的颜色，从而判定核酸检测结果，最快10min可观察到颜色变化。其中，当样本中存在目标物时，可观察到所述颜色变化为由红变黄。
88.如图2所示，分别利用本实施例中的基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及检测微流控芯片和商用dna提取试剂盒来提取牙垢样本中幽门螺旋杆菌的dna，并进行环介导等温核酸扩增，发现二者扩增曲线中的起峰时间相近，说明本实施例中的基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及检测微流控芯片的dna提取性能与商用dna提取试剂盒相当。
89.实施例3
90.如图1，本实施例提供了一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及检测微流控芯片，与实施例1基本相同，所述储液室2内含有结合液和磁珠；所述隔离室3内含有用于分隔储液室2与扩增室4的矿物油；所述扩增室4内装有环介导等温核酸扩增反应试剂。应用于快速提取并扩增检测唾液样本中的白色念珠菌，扩增目标物为白色念珠菌的28s rdna基因片段。
91.其中，所述电裂解室1、储液室2、隔离室3及扩增室4是由一条通道贯通的，且所述通道在电裂解室1的高度为30μm；所述叉指电极5的电极材料为金，厚度为0.2μm，叉指对数为25对，叉指间隙为20μm。
92.所述基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及检测微流控芯片应用于唾液中白色念珠菌的检测，包括如下步骤：
93.s1、唾液离心，取其沉淀重悬于缓冲液中。其中，所述缓冲液为含有10mm tris-hcl、1mmol/l edta的水溶液，且ph为8.0。
94.s2、打开电池盒开关，同时滴管吸取重悬后的溶液并将其挤入进样孔中，使其流经电裂解室1被裂解后进入储液室。其中，所述直流电源的工作电压为30v。
95.s3、晃动芯片2min，使储液室2中的磁珠、结合液与裂解后的样本溶液混合，磁珠吸附核酸，将磁铁贴于储液室2下方芯片外壁处静置1min，之后沿通道滑行，吸引磁珠穿过隔离室3中的矿物油进入扩增室4中，撤掉磁铁，芯片在65℃静置10-40min，等待完成环介导等温核酸扩增反应。其中，所述磁珠表面修饰基团为羧基，磁珠直径为300nm，所述结合液的成分为聚乙二醇和nacl。
96.其中，所述扩增室4内预装有核酸扩增反应试剂，含有6条引物(fip、bip、lf、lb、f3、b3)、链置换dna聚合酶、苯酚红、dntps、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween 20。
97.其中，所述6条引物的脱氧核苷酸序列及其在所述环介导等温核酸扩增反应中的终浓度如下所示：
98.fip：5
’‑
ggacgccaaagacgccagatttcagggattgcctca gtagc-3’，终浓度为1.6μm；
99.bip：5
’‑
aagaaggtatctttgggcccggttctcaccctctgt gacgt-3’，终浓度为1.6μm；
100.lf：5
’‑
gcttttgccgcttcactcg-3’，终浓度为0.4μm；
101.lb：5
’‑
cttgtctatgttccttggaacagg-3’，终浓度为0.4μm；
102.f3：5
’‑
agcggaggaaaagaaaccaa-3’，终浓度为0.2μm；
103.b3：5
’‑
ggtcatctcatcgcacgg-3’，终浓度为0.2μm。
104.其中，所述链置换dna聚合酶、dntps、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween 20在所述环介导等温核酸扩增反应中的终浓度分别为0.32u/μl、1.4mm、20mm、10mm、50mm、8mm和0.1％(质量分数)。
105.s4、边反应边观察扩增室4中溶液的颜色，从而判定核酸检测结果，最快10min可观察到颜色变化。其中，当样本中存在目标物时，可观察到所述颜色变化为由红变黄。
106.实施例4
107.如图3所示，本实施例提供了一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及多通道检测的微流控芯片，芯片主体结构由上下两层片基组成，其芯片主体中设有电裂解室1、储液室2、第一隔离室31、第二隔离室32、第三隔离室33和第一扩增室41、第二扩增室42、第三扩增室43，电裂解室1、储液室2通过贯穿的通道连通，储液室2分别与第一隔离室31、第二隔离室32、第三隔离室33通过贯穿的通道连通，第一隔离室31与第一扩增室41、第二隔离室32与第二扩增室42、第三隔离室33与第三扩增室43同样通过贯穿的通道连通；所述储液室2内含有结合液和磁珠；所述第一隔离室31、第二隔离室32、第三隔离室33内含有用于分隔储液室2与第一扩增室41、第二扩增室42、第三扩增室43的矿物油；所述第一扩增室41、第二扩增室42、第三扩增室43内装有环介导等温核酸扩增反应试剂，由此组成多通道检测芯片。应用于快速提取并扩增检测唾液样本中的幽门螺旋杆菌，扩增目标物为幽门螺旋杆菌的多个基因片段16srdna、caga、vaca多个基因片段，扩增目的为实现多指标检测幽门螺旋杆菌、区分致病菌。
108.所述基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及多通道检测芯片的应用，操作步骤与实施例3基本相同，包括样本溶液的离心，重悬于裂解液中注入电解室1内，裂解后进入储液室2，加热芯片，储液室2中的液体分别经第一隔离室31、第二隔离室32、第三隔离室33后均匀移动到第一扩增室41、第二扩增室42、第三扩增室43中完成扩增反应和显色。通过第一扩增室41、第一扩增室42、第一扩增室43中溶液颜色，判定检测结果，最快10min可观察到颜色变化。
109.其中，所述电裂解室1与储液室2贯通、储液室2与第一隔离室31、第二隔离室32、第三隔离室33并列贯通，第一隔离室31与第一扩增室41贯通，第二隔离室32与第二扩增室42贯通，第三隔离室33与第三扩增室43贯通。且所述通道在电裂解室1的高度为30μm；所述叉指电极5的电极材料为碳材料，厚度为0.2μm，叉指对数为25对，叉指间隙为20μm。
110.所述基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取及多通道检测微流控芯片应用于唾液中幽门螺旋杆菌的多指标检测，包括如下步骤：
111.s1、唾液离心，取其沉淀重悬于缓冲液中。其中，所述缓冲液为含有10mm tris-hcl、1mmol/l edta的水溶液，且ph为8.0。
112.s2、打开电池盒开关，同时滴管吸取重悬后的溶液并将其挤入进样孔中，使其流经电裂解室1被裂解后进入储液室。其中，所述直流电源的工作电压为30v。
113.s3、晃动芯片2min，使储液室2中的磁珠、结合液与裂解后的样本溶液混合均匀且填满整个储液室2，磁珠吸附核酸，将大号磁铁贴于储液室2下方芯片外壁处静置1min，之后
保持沿通道平行移动，吸引磁珠同时穿过第一隔离室31、第二隔离室32、第三隔离室33中的矿物油，分别进入第一扩增室41、第二扩增室42、第三扩增室43中，撤掉磁铁，芯片在65℃静置10-40min，等待完成环介导等温核酸扩增反应。其中，所述磁珠表面修饰基团为羧基，磁珠直径为300nm，所述结合液的成分为聚乙二醇和nacl。
114.其中，所述扩增室41、42、43内预装有核酸扩增反应试剂，含有链置换dna聚合酶、苯酚红、dntps、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween 20，此外扩增室41内含有16s rdna的6条引物(fip、bip、lf、lb、f3、b3)、扩增室42内含有caga的4条引物(fip-c、bip-c、f3-c、b3-c)、扩增室43内含有vaca的4条引物(fip-v、bip-v、f3-v、b3-v)。
115.其中，所述16s rdna的6条引物、caga的4条引物、vaca的4条引物的脱氧核苷酸序列及其在所述环介导等温核酸扩增反应中的终浓度如下所示：
116.fip：5
’‑
tgttgcggtgaatacgttcccgaaggcaaacacaactcccat-3’，终浓度为1.6μm；
117.bip：5
’‑
ccagcttcatgcaggcgagtcgaagtggagccaatcttca-3’，终浓度为1.6μm；
118.lf：5
’‑
ttgtactcaccgcccgt-3’，终浓度为0.4μm；
119.lb：5
’‑
tgcagcctacaatccgaac-3’，终浓度为0.4μm；
120.f3：5
’‑
gggcagtagccaatttagca-3’，终浓度为0.2μm；
121.b3：5
’‑
tggggtgcacaaagagaag-3’，终浓度为0.2μm。
122.fip-c：5
’‑
cttgtgaaaattcggtaacggtagaatcttccacaaag-3’，终浓度为1.6μm；
123.bip-c：5
’‑
gtcccatcaaaacgatccggcattcaagcacgaag-3’，终浓度为1.6μm；
124.f3-c：5
’‑
tttaatcaacaaagacgct-3’，终浓度为0.2μm；
125.b3-c：5
’‑
tgctttttctttatcatcag-3’，终浓度为0.2μm。
126.fip-v：5
’‑
ccctaacaaggaagattgggggaatgccgctagcgtctt-3’，终浓度为1.6μm；
127.bip-v：5
’‑
gcgaagatataggcagtcaatctgacctagtgccagtttc-3’，终浓度为1.6μm；
128.f3-v：5
’‑
gagtttataagtccctac-3’，终浓度为0.2μm；
129.b3-v：5
’‑
cctccatcaatcttactggattt-3’，终浓度为0.2μm。
130.其中，所述链置换dna聚合酶、dntps、tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、tween 20在所述环介导等温核酸扩增反应中的终浓度分别为0.32u/μl、1.4mm、20mm、10mm、50mm、8mm和0.1％(质量分数)。
131.s4、边反应边观察第一扩增室41、第二扩增室42、第三扩增室43中溶液的颜色，从而判定核酸检测结果，最快10min可观察到颜色变化。其中，当样本中存在目标物时，可观察到所述颜色变化为由红变黄。其中，第一扩增室41、第二扩增室42、第三扩增室43中发生的所述颜色变化分别对应了幽门螺旋杆菌的不同致病菌亚型。
132.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取装置，其特征在于，包括电裂解室(1)；所述电裂解室(1)底部设有叉指电极(5)，电裂解室(1)顶部两端分别设有进样孔(6)和进气孔(7)，所述叉指电极(5)与直流电源相连。2.根据权利要求1所述核酸快速提取装置，其特征在于，所述叉指电极(5)为平面电极，由两个相同的梳子状的电极交错排列而成，每根叉指的形状大小及叉指间隙均相同。3.根据权利要求1所述核酸快速提取装置，其特征在于，所述叉指电极(5)的电极材料为金、铂或碳材料中的任一种。4.根据权利要求3所述核酸快速提取装置，其特征在于，所述电极材料的厚度为0.1～1μm；所述叉指电极的叉指对数为5～50对；所述叉指电极的叉指间隙为10～50μm。5.根据权利要求1所述核酸快速提取装置，其特征在于，所述直流电源为干电池、蓄电池、直流发电机、直流稳压电源中的任一种。6.一种用于核酸检测的微流控芯片，其特征在于，包括芯片主体，所述芯片主体中设有权利要求1～5任一所述核酸快速提取装置、储液室(2)、单组或多组并行的隔离室(3)和扩增室(4)，电裂解室(1)、储液室(2)、单组或多组并行的隔离室(3)及扩增室(4)通过贯穿的通道依次连通；所述储液室(2)用于储存电裂解室(1)中提取得到的核酸，所述隔离室(3)内含有用于分隔储液室与扩增室的试剂，所述扩增室(4)内装有核酸扩增反应试剂和指示剂。7.权利要求6所述微流控芯片在快速提取并检测生物样本中细胞或微生物的单指标或多指标的核酸中的应用。8.一种快速提取并检测生物样本中细胞或微生物的核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1.将生物样本溶液离心，取其沉淀重悬于裂解缓冲液中；s2.打开直流电源，将重悬后的溶液经进样孔(6)注入微流控芯片的电裂解室(1)中，使其流经电裂解室被裂解后进入储液室(2)；s3.加热微流控芯片，将储液室(2)中的液体或磁珠经隔离室(3)移动到扩增室(4)中，静置，完成核酸扩增反应和显色。9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述裂解缓冲液为含有5～15mm tris-hcl、0.5～2mmol/l edta的水溶液。10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述直流电源的工作电压为5～30v。

技术总结
本发明公开了一种基于交替低压直流电穿孔的核酸快速提取装置和应用，所装置包括电裂解室，电裂解室底部设有叉指电极，顶部两端分别设有进样孔和进气孔，叉指电极与直流电源相连。所述核酸快速提取装置基于不可逆电穿孔原理，使细胞在流经直流叉指电极表面的过程中持续受到交替变化的高强度电场作用，进而发生破裂并释放核酸，工作电压在30V以下，相比传统电穿孔所需电压大幅降低。再提供一种集核酸提取、扩增、检测于一体的微流控芯片，包括电裂解室、储液室、单组或多组并行的隔离室和扩增室，可电池供电，在1s内完成细胞裂解，在15min内完成核酸提取、扩增和可视化检测，实现单指标或多指标的同时检测，有望在户外或现场使用。有望在户外或现场使用。有望在户外或现场使用。


技术研发人员：周建华 庞雪原 付荃莹 杨雨骁
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/21