一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌及其应用

1.本发明涉及纳米抗体筛选技术，具体而言，涉及一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌及其应用。


背景技术：

2.抗体具有高度特异性的抗原结合能力，可用于检测和操纵目的蛋白，因此在基础研究以及靶向药物治疗中发挥着重要作用。纳米抗体(nbs)，也称为vhhs或单域抗体(sdabs)，源于骆驼单链抗体(hcabs)的可变域。纳米抗体的体积仅为传统抗体的十分之一，但仍然保留了高亲和力和特异性。此外，纳米抗体表现出高温耐受(60-80℃)、抗蛋白酶酶解等特点，而且在组织穿透能力、隐蔽表位可及性和蛋白稳定性方面优于传统抗体。因此，纳米抗体在不同领域获得广泛应用。
3.抗体的抗原结合能力对于抗体的功能发挥极为重要，然而，通过噬菌体文库筛选等方法直接得到的原始纳米抗体，特别是通过天然文库或人工合成文库筛选得到的纳米抗体的抗原亲和力往往难以满足需要。高亲和力纳米抗体多通过严格的筛选方法或在筛选出的原始纳米抗体的基础上进一步优化获得。对关键结合位点的饱和突变结合展示筛选技术是常用的优化方法，但该方法基于蛋白质结构信息，极大地限制了其使用范围。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于：提供一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌及其应用。
5.为实现本发明的目的，提供技术方案如下：
6.本发明提供一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌，所述工程菌为含有双表达载体的大肠杆菌；所述双表达载体中含有目的抗原蛋白的序列、纳米抗体的序列、以及氨苄青霉素抗性基因tem-1型β-内酰胺酶的两个片段blf1和blf2的序列。
7.进一步，所述大肠杆菌的菌株为origami(de3)。
8.进一步，所述双表达载体为prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2；其中，所述prsfduet-1为载体质粒，所述poi为目的抗原蛋白的序列，所述nb为纳米抗体的序列。
9.本发明还提供一种如上述的用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
10.s1、合成c端含有linker的片段blf1-linker，所述blf1-linker片段的序列如seq id no:1所示；再将所述blf1-linker片段、所述目的抗原蛋白的dna片段与prsfduet-1进行连接，测序正确后，得到载体prsfduet-1-blf1-linker-poi；
11.s2、合成n端含有linker的片段linker-blf2，所述linker-blf2片段的序列如seq id no:3所示；将所述纳米抗体的dna片段、所述linker-blf2片段与载体prsfduet-1-blf1-linker连接，测序正确后，得到所述双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2；
12.s3、将所述双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2转入所述origami(de3)中。
13.进一步，所述blf1-linker片段的5’端和3’端分别带有bamhi和psti酶切位点，所述blf1-linker片段编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；
14.所述linker-blf2片段的5’端和3’端分别带有kpni和xhoi酶切位点，所述linker-blf2片段编码的氨基酸序列如seq id no:4所示。
15.进一步，将bamhi和psti酶切的所述blf1-linker片段、psti和hindiii酶切的所述目的抗原蛋白的dna片段与所述载体prsfduet-1连接，得到prsfduet-1-blf1-linker-poi；再将ndei和kpni酶切的所述纳米抗体的dna片段、kpni和xhoi酶切的所述linker-blf2片段连接至所述prsfduet-1-blf1-linker-poi上得到所述双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2。
16.本发明还提供一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的应用，采用如上述的工程菌比较不同纳米抗体的抗原亲和力，或采用如上述的工程菌构建纳米抗体文库，并采用所述纳米抗体文库筛选高亲和力纳米抗体。
17.进一步，所述比较不同纳米抗体的抗原亲和力的步骤为：将至少两种所述工程菌培养并调整为od
600
值相同的待测菌液，将至少两种待测菌液分别在含有氨苄青霉素的培养基上进行等体积点板培养；根据菌落生长情况好坏判断纳米抗体的抗原亲和力高低；
18.其中，每种所述工程菌中的双表达载体含有相同的目的抗原蛋白序列和不同的纳米抗体序列。
19.进一步，将阳性对照组菌液与至少两种所述待测菌液同时在所述培养基上等体积点板并培养；所述阳性对照组菌液的od
600
值与所述待测菌液的od
600
值相同；
20.所述阳性对照组菌液中的菌株为与所述工程菌相同的大肠杆菌菌株；其中，所述阳性对照组菌液的大肠杆菌中含有tem-1型β-内酰胺酶的全长序列载体；
21.筛选方式为，将至少两个待测菌落与所述阳性对照菌落进行对比，菌落形态最接近所述阳性对照菌落的待测菌落为生长情况最好的菌落。
22.进一步，采用所述纳米抗体文库筛选高亲和力纳米抗体的步骤为：将所述纳米抗体文库工程菌的待测菌液在培养基上培养至生长菌落，所述培养基中含有氨苄青霉素；
23.筛选的方式为，所述菌落的生长情况越好，则所述待筛选纳米抗体与其对应的所述目的抗原蛋白的亲和力越强，所述菌落的生长情况越差，则所述待筛选纳米抗体与其对应的所述目的抗原蛋白的亲和力越弱。
24.本发明的有益效果为：
25.(1)本发明的工程菌，采用大肠杆菌，更适于表达缺少带有n-连接寡糖的fc片段的纳米抗体；
26.(2)本发明的工程菌，其中的双表达载体基于蛋白质互补分析技术，将目的抗原蛋白与其所对应的纳米抗体分别与氨苄青霉素抗性基因tem-1型β-内酰胺酶的blf1和blf2片段融合；该双表达载体更加有利于对纳米抗体进行筛选；
27.(3)本发明的筛选方法，采用本发明的工程菌筛选高亲和力纳米抗体，该工程菌的菌液在固体培养基上涂布后菌落生长状况直接反映其氨苄青霉素的抗性强弱，同时表征纳米抗体的抗原蛋白亲和力高低；具有操作简单、易于推广的优点；
28.(4)本发明的筛选方法，相对于噬菌体文库筛选等方法，不仅具有培养成本低、效率高等优点，同时具有良好的可靠性。
附图说明
29.图1为本发明的用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌中，双表达载体的构建示意图；
30.图2为本发明的高亲和力纳米抗体的筛选方法中，实施例2中，利用已知纳米抗体检测筛选可靠性及考察抗生素浓度对筛选严格度影响时，得到的菌落生长情况图片；其中，图2中a为含有50μg/ml卡那霉素的培养基，图2中b为含有100μg/ml氨苄青霉素的培养基，图2中c为含有20μg/ml氨苄青霉素的培养基，图2中d为含有10μg/ml氨苄青霉素的培养基；
31.图3为本发明的高亲和力纳米抗体的筛选方法中，实施例3中，利用nbalfa检测表征纳米抗体亲和力高低的可靠性时，得到的菌落生长情况图片；其中，图3中a为含有50μg/ml卡那霉素的培养基，图3中b为含有10μg/ml氨苄青霉素的培养基；
32.图4为本发明的高亲和力纳米抗体的筛选方法中，实施例3中，利用gbp及其不同突变形式变体检测表征纳米抗体亲和力高低的可靠性时，得到的菌落生长情况图片；图4中a为含有50μg/ml卡那霉素的培养基，图4中b为含有100μg/ml氨苄青霉素的培养基；
33.图5为本发明的高亲和力纳米抗体的筛选方法中，实施例4中，利用随机突变文库验证gbp
r36k/e45k
回复突变检测筛选可靠性时，得到的菌落生长情况图片；图5中a为含有50μg/ml卡那霉素的培养基，图5中b为含有100μg/ml氨苄青霉素的培养基。
具体实施方式
34.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
35.本发明的用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌为含有双表达载体的大肠杆菌；双表达载体中含有目的抗原蛋白序列、纳米抗体序列、氨苄青霉素抗性基因tem-1型β-内酰胺酶的两个片段blf1和blf2的序列。
36.本发明基于蛋白质互补分析技术，将目的抗原蛋白与其纳米抗体的dna片段分别与氨苄青霉素抗性基因tem-1型β-内酰胺酶的blf1和blf2片段融合并构建入双表达载体，转入大肠杆菌表达菌株中，构建用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌。该工程菌同时也适于其他可原核表达的互作蛋白筛选，其筛选严格度可根据抗生素浓度进行可控调节。
37.本发明采用大肠杆菌，主要是由于纳米抗体缺少带有n-连接寡糖的fc片段，适于在大肠杆菌中进行表达。另外，大肠杆菌还具有基因工程操作简单、培养成本低廉的优点。
38.采用本发明的工程菌筛选高亲和力纳米抗体，该工程菌的菌液在固体培养基上涂布后菌落生长状况直接反映其氨苄青霉素的抗性强弱，同时表征纳米抗体的抗原蛋白亲和力高低。
39.其中，blf1和blf2的氨基酸序列来自文献报道，具体为：
40.blf1的序列如seq id no:5所示：
41.ahpetlvkvkdaedqlgarvgyieldlnsgkilesfrpeerfpmmstfkvllcgavlsridagqeqlgrrihysqndlveyspvtekhltdgmtvrelcsaaitmsdntaanlllttiggpkeltaflhnmgdhvtrldrwepe
lneaipnderdtttpvamattlrklltge
42.blf2的序列如seq id no:6所示：
43.lltlasrqqlidwmeadkvagpllrsalpagwfiadksgagergsrgiiaalgpdgkpsrivviyttgsqatmdernrqiaeigaslikhw
44.优选的，大肠杆菌的菌株为origami(de3)。
45.优选的，双表达载体为prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2；其中，prsfduet-1为表达载体质粒，poi为目的抗原蛋白的序列，nb为目的抗原的待筛选纳米抗体的序列。
46.以下通过具体的实施例对本发明进行具体说明。
47.实施例1用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的构建
48.本实施例采用本发明的构建方法对用于筛选高亲和力纳米抗体的载体进行构建，再将构建的载体转入大肠杆菌。具体的构建步骤为：
49.s1、合成c端含有linker的片段blf1-linker，blf1-linker片段的序列如seq id no:1所示；再将blf1-linker片段、目的抗原蛋白的dna片段与prsfduet-1进行连接，测序正确后，得到载体prsfduet-1-blf1-linker-poi。
50.其中，blf1-linker片段的5’端和3’端分别带有bamhi和psti酶切位点，blf1-linker片段编码的氨基酸序列如seq id no:2所示。
51.s2、合成n端含有linker的片段linker-blf2，linker-blf2片段的序列如seq id no:3所示；将纳米抗体的dna片段、linker-blf2片段与载体prsfduet-1-blf1-linker连接，测序正确后，得到双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2。
52.其中，linker-blf2片段的5’端和3’端分别带有kpni和xhoi酶切位点，linker-blf2片段编码的氨基酸序列如seq id no:4所示。
53.s3、将双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2转入origami(de3)中。
54.在上述步骤，具体而言，将bamhi和psti酶切的blf1-linker片段、psti和hindiii酶切的目的抗原蛋白的dna片段与载体prsfduet-1连接，得到prsfduet-1-blf1-linker-poi；再将ndei和kpni酶切的纳米抗体的dna片段、kpni和xhoi酶切的linker-blf2片段连接至prsfduet-1-blf1-linker-poi上得到双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2。
55.本实施例使用的限制性内切酶bamhi、psti、kpni和xhoi均来自monad公司，t4连接酶来自genstar公司。
56.实施例2检测用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌在不同抗生素浓度下的筛选严格度
57.根据现有的文献记载，本实施例选取两对已知的抗原蛋白及其纳米抗体：增强型绿色荧光蛋白egfp与其纳米抗体gbp、alfa标签(psrleeelrrrlte)与其纳米抗体nbalfa。
58.将egfp/gbp、alfa/gbp、egfp/nbalfa、alfa/nbalfa四组抗原蛋白-纳米抗体分别按照上述实施例1的方法进行克隆构建并转入表达菌株。其中，alfa/gbp、egfp/nbalfa作为两组阴性对照，同时，将tem-1型β-内酰胺酶的全长克隆入载体作为阳性对照(blf组)。
59.将五组蛋白的表达菌株接菌后进行过夜培养，使用的培养基中含载体本身抗性抗
生素卡那霉素。
60.将上述的五组菌液od
600
统一调至0.3，该od
600
值为原始浓度，记为100。再将各组菌液分别按1:10进行梯度稀释，获得10-1
、10-2
、10-3
的稀释菌液。将各梯度菌液分别取5μl，在含50μg/ml卡那霉素(kan)以及100μg/ml、20μg/ml、10μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb固体培养基培养皿中点板，在37℃下过夜培养后，进行拍照记录，菌落生长情况结果如图2所示。
61.通过图2可以看出，在卡那霉素抗性下的菌落生长状况反映了其点板的菌液浓度。可见，五组样品菌液的od
600
一致。在不同浓度氨苄青霉素下，五组样品中，阳性对照blf组菌落生长最好；在100μg/ml氨苄青霉素浓度下，egfp/gbp和alfa/nbalfa组菌落生长较好，前者弱于后者，两组均弱于阳性对照组。阴性对照组alfa/gbp和egfp/nbalfa菌落即使在未稀释菌液100梯度时仍未生长，表明该浓度下筛选条件较为严格；而在20μg/ml氨苄青霉素浓度下，未稀释菌液100梯度的阴性对照组有微弱菌落生长，开始出现假阳性，且egfp/gbp和alfa/nbalfa组的强弱无法分辨；在10μg/ml氨苄青霉素浓度下，未稀释菌液100梯度的阴性对照菌落生长更为明显，而在10-1
、10-2
梯度的阴性对照未见生长，且egfp/gbp和alfa/nbalfa组的强弱仍无法分辨。这表明，该体系能够表征纳米抗体的抗原蛋白亲和力高低，而且，可通过调整点板菌液浓度和氨苄青霉素浓度来提高其表征的准确性。
62.实施例3检测表征纳米抗体亲和力强弱的可靠性
63.根据文献中alfa与nbalfa的结构信息(gotzke h.,et al.,the alfa-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bioscience applications.nat commun,2019,10(1):4403.)，将相互作用关键氨基酸残基位点进行突变，得到3位点突变alfam1(如seq id no:7所示)：paalaeelrrrlte和在此基础上进一步突变得到的5位点突变alfam2(如seq id no:8所示)：paalaeelrralta(划线为突变位点)。
64.将两种alfa突变体按实施例1进行克隆，并转入表达菌株。按实施例2在10μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基培养皿中进行点板。结果如图3所示，在10-3
的稀释梯度未见菌落生长，综合100、10-1
、10-2
稀释梯度的结果，可见alfa、alfam1、alfam2对应的菌落生长依次变弱。表明该体系能够通过氨苄青霉素抗性下的菌落生长状况表征纳米抗体的抗原蛋白亲和力高低。
65.进一步地，根据文献信息(liu j.,et al.,the cooperative assembly of shelterin bridge provides a kinetic gateway that controls telomere length homeostasis.nucleic acids res,2021,49(14):8110-8119.)，相比于gbp，gbp的突变体gbp
r36k
、gbp
r36k/e45k
、gbp
e104q
与egfp的亲和力依次降低。
66.将上述突变体按实施例1进行克隆，并转入表达菌株。按实施例2在100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基培养皿中进行点板。结果如图4所示，在10-1
以下的稀释梯度，几乎未见菌落生长，在100稀释梯度，gbp、gbp
r36k
、gbp
r36k/e45k
、gbp
e104q
对应的菌落生长依次变弱。
67.本实施例再次表明了本发明体系表征纳米抗体的抗原蛋白亲和力的可靠性。
68.实施例4通过建库筛选回复突变验证本发明的工程菌筛选结果的可靠性
69.为了检测本发明的载体和工程菌系统筛选高亲和力纳米抗体的可靠性，本实施例采用gbp
r36k/e45k
制备随机突变文库，并经本发明建立的体系筛选，以期获得回复突变。
70.具体地，利用随机突变试剂盒(genstar)以gbp
r36k/e45k
为模板进行易错pcr扩增，通过ndei和kpni酶切将扩增片段文库克隆入prsfduet-1-egfp-linker-blf1-linker-blf2
中，并转入原核表达菌株。将含有上述菌株的菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基中，挑选较大菌落，接菌，按实施例2方法进行点板，点板后的培养结果图5所示。挑取优势生长菌落克隆进行测序，发现其中有含有gbp原本序列的克隆，表明该系统筛选到回复突变的克隆，证明了该系统筛选高亲和力纳米抗体的可靠性。
71.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌，其特征在于，所述工程菌为含有双表达载体的大肠杆菌；所述双表达载体中含有目的抗原蛋白的序列、纳米抗体的序列、以及氨苄青霉素抗性基因tem-1型β-内酰胺酶的两个片段blf1和blf2的序列。2.根据权利要求1所述一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的菌株为origami(de3)。3.根据权利要求2所述一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌，其特征在于，所述双表达载体为prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2；其中，所述prsfduet-1为载体质粒，所述poi为目的抗原蛋白的序列，所述nb为纳米抗体的序列。4.一种如权利要求3所述的用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、合成c端含有linker的片段blf1-linker，所述blf1-linker片段的序列如seq id no:1所示；再将所述片段blf1-linker、所述目的抗原蛋白的dna片段与prsfduet-1进行连接，测序正确后，得到载体prsfduet-1-blf1-linker-poi；s2、合成n端含有linker的片段linker-blf2，所述linker-blf2片段的序列如seq id no:3所示；将所述纳米抗体的dna片段、所述linker-blf2片段与载体prsfduet-1-blf1-linker连接，测序正确后，得到所述双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2；s3、将所述双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2转入所述origami(de3)中。5.根据权利要求4所述一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的构建方法，其特征在于，所述blf1-linker片段的5’端和3’端分别带有bamhi和psti酶切位点，所述blf1-linker片段编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；所述linker-blf2片段的5’端和3’端分别带有kpni和xhoi酶切位点，所述linker-blf2片段编码的氨基酸序列如seq id no:4所示。6.根据权利要求5所述一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的构建方法，其特征在于，将bamhi和psti酶切的所述blf1-linker片段、psti和hindiii酶切的所述目的抗原蛋白的dna片段与所述载体prsfduet-1连接，得到prsfduet-1-blf1-linker-poi；再将ndei和kpni酶切的所述纳米抗体的dna片段、kpni和xhoi酶切的所述linker-blf2片段连接至所述prsfduet-1-blf1-linker-poi，得到所述双表达载体prsfduet-1-blf1-linker-poi-nb-linker-blf2。7.一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的应用，其特征在于，采用如权利要求1～3任意一项所述的工程菌比较不同纳米抗体的抗原亲和力，或采用如权利要求1～3任意一项所述的工程菌构建纳米抗体文库，并采用所述纳米抗体文库筛选高亲和力纳米抗体。8.根据权利要求7所述一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的应用，其特征在于，所述比较不同纳米抗体的抗原亲和力的步骤为：将至少两种所述工程菌培养并调整为od
600
值相同的待测菌液，将至少两种待测菌液分别在含有氨苄青霉素的培养基上进行等体积点板培养；根据菌落生长情况好坏判断纳米抗体的抗原亲和力高低；其中，每种所述工程菌中的双表达载体含有相同的目的抗原蛋白序列和不同的纳米抗体序列。
9.根据权利要求8所述一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的应用，其特征在于，将阳性对照组菌液与至少两种所述待测菌液同时在所述培养基上等体积点板并培养；所述阳性对照组菌液的od
600
值与所述待测菌液的od
600
值相同；所述阳性对照组菌液中的菌株为与所述工程菌相同的大肠杆菌菌株；其中，所述阳性对照组菌液的大肠杆菌中含有tem-1型β-内酰胺酶的全长序列载体；筛选方式为，将至少两个待测菌落与所述阳性对照菌落进行对比，菌落形态最接近所述阳性对照菌落的待测菌落为生长情况最好的菌落。10.根据权利要求7所述一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌的应用，其特征在于，采用所述纳米抗体文库筛选高亲和力纳米抗体的步骤为：将所述纳米抗体文库的工程菌的待测菌液在培养基上培养至生长菌落，所述培养基中含有氨苄青霉素；筛选的方式为，所述菌落的生长情况越好，则所述待筛选纳米抗体与其对应的所述目的抗原蛋白的亲和力越强，所述菌落的生长情况越差，则所述待筛选纳米抗体与其对应的所述目的抗原蛋白的亲和力越弱。

技术总结
本发明涉及纳米抗体筛选技术，具体而言，涉及一种用于筛选高亲和力纳米抗体的工程菌及其应用。该工程菌为含有双表达载体的大肠杆菌；双表达载体中含有目的抗原蛋白序列、抗原蛋白的纳米抗体序列、氨苄青霉素抗性基因TEM-1型β-内酰胺酶的两个片段BLF1和BLF2的序列。该筛选方法将工程菌待测菌液在含有氨苄青霉素的培养基上培养至生长菌落，并根据菌落生长情况筛选亲和力高的纳米抗体。该方法操作简单、易于推广、培养成本低、效率高，且具有良好的可靠性。的可靠性。的可靠性。


技术研发人员：王文义 胡悦 霍莉 黄文娣 蒋诗越 杨佳敏
受保护的技术使用者：中南民族大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/21