负载工程化外泌体和多种抗结核药物的水凝胶支架及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及负载工程化外泌体和多种抗结核药物的水凝胶支架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.一个理想的植入性抗结核支架除了要满足局部缓释抗结核药物，还应具有与天然骨组织相似的结构，良好的骨传导性以及骨诱导性，促进病灶清除后骨缺损的修复。目前常用的植骨材料包括：自体骨、同种异体骨、人工骨，前两者因取材有限、伴有感染风险、成本高等而限制了其使用，在迫切的需求下，骨组织工程应运而生，骨组织工程是将骨再生相关细胞作为种子细胞接种在支架上，构成仿生支架，模拟天然骨组织，然后一并移植到骨缺损处以诱导形成新的骨组。而目前的抗结核支架材料大多只追求载药方面的改进，如zhou等将inh和rfp分散于pva中再黏附在羟基磷灰石支架上
1.；zhu等通过3d打印技术inh和rfp负载于介孔活性陶瓷中，再通过3d打印技术与phbhhx相结合
2.，这些研究缺乏组织工程的理念，具有仿天然骨组织结构的抗结核支架的研究仍处于空白。
3.参考文献：
4.[1]zhou cx,li l,ma yg,et al.a bioactive implant in situ and long-term releases combined drugs for treatment of osteoarticular tuberculosis.biomaterials.2018sep；176:50-59.
[0005]
[2]zhu m,li k,zhu y,et al.3d-printed hierarchical scaffold for localized isoniazid/rifampin drug delivery and osteoarticular tuberculosis therapy.acta biomater.2015apr；16:145-55.


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供负载工程化外泌体和多种抗结核药物的水凝胶支架及其制备方法和应用，构建一个基于工程化外泌体包载多种抗结核药并缓慢释放的仿生水凝胶支架，通过药物缓慢释放，具备优良抗结核性能，从而为治疗骨关节结核提供新选择。
[0007]
本发明提供了一种促进结核性骨缺损修复的水凝胶，所述水凝胶的前体物质包括羧甲基壳聚糖和醛基化透明质酸；
[0008]
所述水凝胶负载有工程化外泌体。
[0009]
优选的，所述水凝胶的制备原料中还包括纳米羧基磷灰石。
[0010]
优选的，在所述水凝胶内部通过化学键交联有载药纳米囊泡，所述载药纳米囊泡所载药物包括抗结核药物中的至少一种。
[0011]
优选的，所述工程化外泌体的制备方法，包括以下步骤：将脊髓间充质干细胞在含fe3o4的培养基中培养，并在培养过程中给与交变磁场，培养后分离得到的外泌体即所述工程化外泌体。
[0012]
优选的，所述培养基中fe3o4的浓度不高于100μg/ml；
[0013]
所述交变磁场的磁场频率为50hz，交变磁场的amf环境为1～5mt。
[0014]
本发明还提供了上述水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将羧甲基壳聚糖、醛基化透明质酸、纳米羟基磷灰石、若干种载药纳米囊泡和工程化外泌体混合，交联得所述水凝胶。
[0015]
优选的，将醛基化透明质酸和若干种载药纳米囊泡溶于pbs中，得前体溶液1；
[0016]
将羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石和工程化外泌体与pbs混合，得前体溶液2；
[0017]
将前体溶液1和前体溶液2等体积混合，交联得所述水凝胶。
[0018]
优选的，所述载药纳米囊泡包括分别载药利福平、异烟肼和吡嗪酰胺的载药纳米囊泡。
[0019]
本发明还提供了上述水凝胶在制备骨修复材料中的应用。
[0020]
本发明还提供了上述水凝胶在制备结核性骨缺损修复材料中的应用。
[0021]
有益效果：本发明提供了一种促进结核性骨缺损修复的水凝胶，选择自愈性水凝胶作为支架材料，用聚合物囊泡分别包裹抗结核药物利福平、异烟肼、吡嗪酰胺，再通过化学键交联至水凝胶内部来实现三种一线抗结核药物的共载与缓释，并加入羟基磷灰石以更大程度仿生，最终获得基于工程化外泌体的多载药水凝胶支架。本发明所述水凝胶支架不仅实现药物联合缓释，增加病灶药物浓度达到长效药物治疗，减少因全身给药的毒副反应、提供患者依从性；还在成骨分化、细胞增殖迁移和血管生成中也具有优良诱导性能，最终促进结核性骨缺损的修复。本发明构建得到一个基于工程化外泌体包载多种抗结核药并缓慢释放的仿生水凝胶支架，通过药物缓慢释放，具备优良抗结核性能，从而为治疗骨关节结核提供新选择。
附图说明
[0022]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0023]
图1为骨髓间充质干细胞表征结果图，图中a：骨髓间充质干细胞形态图；b：骨髓间充质干细胞bmsc标志蛋白验证结果图；
[0024]
图2为外泌体表征结果图，图中a：外泌体透射电镜图；b：western blot鉴定外泌体膜蛋白；c：nta分析外泌体粒径分布；
[0025]
图3为外泌体与bmscs共培育后茜素红染色结果图；
[0026]
图4为显微镜下的fe3o4和bmscs关系图；
[0027]
图5为fe3o4及磁场对细胞增殖的影响结果图；
[0028]
图6为不同处理组外泌体成骨相关mirnas表达结果图；
[0029]
图7为水凝胶的凝胶形态图，图中a：三通阀联通注射器；b：水凝胶；c：含hap水凝胶；
[0030]
图8为ha、oha、cmcs及oha@cmcs凝胶的红外谱图；
[0031]
图9为水凝胶sem图像，图中a:空白水凝胶；b:oha2/cmcs2/hap8水凝胶；c：oha3/cmcs3/hap8水凝胶；d:oha4/cmcs4/hap8水凝胶；
[0032]
图10为水凝胶凝胶时间结果图，图中a:水凝胶溶液；b:水凝胶；
[0033]
图11为水凝胶自愈性结果图，图中a:水凝胶；b:切开之后的水凝胶；c:一段时间后愈合的水凝胶；
[0034]
图12为水凝胶的溶胀曲线；
[0035]
图13为水凝胶流变学曲线，g’：储能模量；g”:损耗模量；
[0036]
图14为聚合物囊泡表征结果图，图中a：空载囊泡电镜图；b：载药囊泡电镜图；c：空载囊泡的dls粒径分析；d：载pza囊泡的dls粒径分析；e：载rfp囊泡的dls粒径分析；f:载inh囊泡的dls粒径分析。
具体实施方式
[0037]
本发明提供了一种促进结核性骨缺损修复的水凝胶，所述水凝胶的前体物质包括羧甲基壳聚糖和醛基化透明质酸；
[0038]
所述水凝胶负载有工程化外泌体。
[0039]
本发明所述工程化外泌体的制备方法，优选包括以下步骤：将脊髓间充质干细胞(bmscs)在含fe3o4的培养基中培养，并在培养过程中给与交变磁场，培养后分离得到的外泌体即所述工程化外泌体。
[0040]
本发明对所述bmscs的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行制备或提取均可。本发明优选将所述bmscs在含有磁性纳米粉fe3o4的培养基中培养，所述培养基优选为含10％胎牛血清的dmem培养基，且在加入所述胎牛血清时，优选取出胎牛血清中的外泌体，更优选将胎牛血清利用100000g超离18个小时，除去外泌体，得到不含外泌体的血清，用含10％无外泌体血清的dmem培养液培养bmscs。本发明所述磁性纳米粉fe3o4的粒径为200nm。
[0041]
本发明优选在上述含10％无外泌体血清的dmem培养液中加入终浓度不高于100μg/ml的fe3o4，并应用电磁发生器，固定磁场频率为50hz，通过控制电流大小，将培养bmscs的amf环境设置为1～5mt，通过cck-8法检测bmscs的生长和增殖情况。结果显示，所述fe3o4的最佳浓度为25μg/ml，amf环境设置为3mt。本发明所述电磁发生器优选购自湖南省派生科技有限公司，正弦磁场的磁场强度可调范围：0～5mt。
[0042]
本发明利用上述培养的细胞提取外泌体时，优选每次收集5
×
108个细胞培养48h后的上清液约1000ml，先用100kd的滤器按照5000g
×
40min的离心条件进行超滤，得到浓缩的液体约100ml(10:1浓缩)，然后再按照经典差速超速离心法进行超速离心：300g
×
10min
→
2000g
×
10min
→
10000g
×
30min，以除去死细胞和细胞碎片，所得上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液于120000g离心70min，所得沉淀物用pbs重悬之后再次120000g离心70min，最终得到的沉淀物即为外泌体。本发明所述工程化外泌体，在制备时通过磁性fe3o4纳米颗粒联合磁场，可以刺激bmscs向成骨方向分化，并且其分化程度与外泌体浓度呈剂量依赖性，并且外泌体相关基因调控发生改变，如相关成骨mirnas表达明显增加(最高可提高150多倍)，将此种外泌体运用到治疗中，能从基因水平起治疗作用。本发明将所述工程化外泌体应用到骨修复材料上，外泌体具有与供体细胞相似的功能，并且不存在mhc
‑ⅰ
和mhc
‑ⅱ
蛋白，可以规避细胞移植的风险，因此利用羧甲基壳聚糖与醛基化透明质酸作为前体物质制备得到的水凝胶，在负载上述工程化外泌体后，对于骨修复效果更优。
[0043]
本发明还在所述水凝胶中加入纳米羟基磷灰石提高水凝胶的机械强度及更大程
度地仿生(羟基磷灰石是机体骨骼的主要无机成分)，水凝胶上还负载有纳米囊泡与工程化外泌体，从而应用于制备多药联用、缓慢释放、具有骨修复作用的抗结核水凝胶支架。
[0044]
本发明所述水凝胶的前体物质包括羧甲基壳聚糖和醛基化透明质酸，所述醛基化透明质酸(oha)优选由透明质酸(ha)氧化得到，其中醛基含量达到30％～65％即可。本发明优选将所述oha溶解于pbs配制凝胶前体溶液1，且所述凝胶前体溶液1中oha的体积分数优选为2～4％。
[0045]
本发明在所述水凝胶内部通过化学键交联有载药纳米囊泡，所述载药囊泡优选载抗结核药物，更优选载药利福平(rfp)、异烟肼(inh)和吡嗪酰胺(pza)。本发明所述载药的方式优选包括包裹，更优选采用cho-peg-pcl共聚物自组装形成囊泡后再与水凝胶前体溶液共同交联。在本发明中，所述载药囊泡的制备方法，优选包括将两亲性嵌段共聚物pcl-peg-cho分别与rfp、inh和pza混合后，于60℃水浴水化，得到载有不同药物的载药囊泡溶液，用超滤管超滤以除去未包裹的药物。在本发明中，peg分子量应在2000以上，且peg所代表的亲水链段应在整个聚合物链中所占比重为20％～40％之间，实施例中所用cho-peg-pcl购自西安瑞禧生物科技有限公司。
[0046]
本发明选择自愈性水凝胶作为支架材料，用聚合物囊泡分别包裹抗结核药物利福平、异烟肼、吡嗪酰胺，再通过化学键交联至水凝胶内部来实现不同药物的共载与缓释，并加入羟基磷灰石以更大程度仿生，最终获得基于工程化外泌体的多载药水凝胶支架。这种支架不仅实现药物联合缓释，增加病灶药物浓度达到长效药物治疗，减少因全身给药的毒副反应、提供患者依从性；还在成骨分化、细胞增殖迁移和血管生成中也具有优良诱导性能，最终促进结核性骨缺损的修复。
[0047]
本发明所述抗结核水凝胶支架，可提高骨结核病灶的药物浓度并且实现更全面的抗结核治疗。在骨结核的治疗中，病灶组织被严重破坏，血液循环受阻，导致常规全身用药存在着周期长、副反应大等缺点，结合术后需要人工骨材料填补骨缺损，本发明提供的所述骨修复支架材料，可以原位缓慢释放药物，增加病灶药物浓度并长效治疗，减少因全身给药造成的毒副反应、患者依从性差等问题。另一方面，所述抗结核水凝胶支架的结构中包括载药纳米囊泡，可实现多药联合递送，可以应对不同状态的结核杆菌，实现更全面的抗结核治疗
[0048]
本发明还提供了上述水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将羧甲基壳聚糖、醛基化透明质酸、纳米羟基磷灰石、载药纳米囊泡和上述工程化外泌体混合，交联得所述水凝胶。
[0049]
本发明所述制备方法，优选包括：将醛基化透明质酸和若干种载药纳米囊泡溶于pbs中，得前体溶液1；
[0050]
将羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石和工程化外泌体与pbs混合，得前体溶液2；
[0051]
将前体溶液1和前体溶液2等体积混合，交联得所述水凝胶。
[0052]
本发明优选将上述前体溶液1和前体溶液2按照1:1体积比进行混合，简单搅拌即可成胶。如所述载药凝胶的原料中包含oha、cmcs、hap以及外泌体时，hap在对应前体溶液中的体积分数固定为8％，cmsc在对应前体溶液中的体积分数为2～4％。
[0053]
利用所述制备方法制备得到的水凝胶在混合前呈可流动态，混合后可以适应模具形状快速成胶(30s)，并且拥有良好的自愈性及流变性能，表明所述水凝胶可作为良好的骨修复支架材料。将骨组织工程理念与载药抗结核支架相结合，构建一个既能抗结核治疗又
能模拟天然骨组织的复合支架材料。
[0054]
本发明还提供了上述工程化外泌体或上述水凝胶在制备骨修复材料中的应用。
[0055]
在本发明中，采用羧甲基壳聚糖与醛基化透明质酸作为水凝胶的前体物质，二者通过希夫碱反应交联形成水凝胶，并且加入纳米羟基磷灰石提高水凝胶的机械强度及更大程度地仿生(羟基磷灰石是机体骨骼的主要无机成分)，水凝胶上还负载有纳米囊泡与工程化外泌体。纳米囊泡是由醛基接枝的cho-peg-pcl分别包裹inh、rfp、pza而形成，共同参与水凝胶交联实现多组分多重载药，对比传统的水凝胶载药(混合于前体溶液后直接交联)，除了可以避免多种药物之间性质不同而造成的突释和不稳定，还可以延长药物的缓释作用(药物释放需要突破囊泡及水凝胶两重障碍)；工程化外泌体由fe3o4和交变磁场(amf)双重刺激的bmscs所产生，可代替bmscs发挥促骨和血管生成的作用，相比于普通外泌体，组织修复作用更强，与骨植入支架相结合，为治疗骨缺损提供一种新策略。
[0056]
本发明还提供了上述水凝胶在制备结核性骨缺损修复材料中的应用。
[0057]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的负载工程化外泌体和多种抗结核药物的水凝胶支架及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0058]
实施例1
[0059]
工程化外泌体及其表征分析
[0060]
1.1分离培养骨髓间充质干细胞(bmsc)
[0061]
1.1.1bmsc的分离
[0062]
取6只sd大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下剪去大鼠双侧股骨及胫骨骨骺端，暴露骨髓腔，采用5ml注射器吸取pbs反复冲洗骨髓腔，过滤除去大块组织碎片，收集冲洗液并用吸管吹打均匀，500g
×
5min离心，弃去上清，沉淀用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基重悬接种于培养瓶中。
[0063]
1.1.2bmsc的培养、纯化及传代
[0064]
将细胞置于37℃、体积分数5％co2培养箱中开始培养，48h后全量换液，以后每隔3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化，待细胞长至80～90％融合时，用胰酶进行消化传代。
[0065]
1.1.3bmsc的表面标志物鉴定
[0066]
取第4代bmsc，消化吹打至细胞脱落，收集细胞悬液400g低温离心5min，弃上清，加入pbs吹打成单细胞悬液，加入单克隆抗体cd90、cd44、cd73、cd29、cd34、cd45，并设立阴性对照组，充分吹打混匀，低温孵育35min后离心去上清，pbs清洗两次以除去为结合抗体，再用pbs吹打细胞，上流式细胞仪进行检测分析。
[0067]
结果如图1所示，于sd大鼠骨髓腔分离得到骨髓间充质干细胞(图1中a)，为成纤维细胞型梭形样，阳性表达间充质干细胞特征性标志cd73、cd90；cd34、cd45阴性(图1中b)。
[0068]
1.2工程化外泌体(exoeng)
[0069]
1.2.1外泌体的分离和纯化
[0070]
首先将胎牛血清100000g超离18个小时，除去外泌体，得到不含外泌体的血清，用含10％无外泌体血清的dmem培养液培养bmsc。每次收集5
×
108个细胞培养48h后的上清液约1000ml，先用100kd的滤器按照5000g
×
40min的离心条件进行超滤，得到浓缩的液体约
min，之后用pbs清洗，为定量测定基质钙化，样品加入10％十六烷基氯化铵在10mm磷酸钠溶液中脱色30min，562nm处测定吸光度；
[0082]
⑤
免疫印迹检测成骨蛋白表达。
[0083]
将bmscs来源的外泌体与bmscs以不同浓度共培养培养7天，然后进行茜素红染色，间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节，钙离子与茜素红螯合，被染成红色或者紫红色。结果如图3所示，在外泌体的刺激下，bmscs能够分泌出更多的矿化基质，有大量钙化结节形成，表明其向成骨细胞分化，并且其分化程度与外泌体浓度呈剂量依赖性。
[0084]
对bmscs施以25μg/mlfe3o4培养基体系、每日一小时3mt动态磁场刺激，收集其细胞上清，提取其外泌体，采用rt-pcr技术，检测各组bmscs衍生外泌体的成骨相关mirnas表达。mir-30d，mir-21，mir125b均为文献报道的成骨相关mirna，其表达量与成骨呈正相关。结果如图6所示，加入磁性fe3o4纳米颗粒或联合磁场组的外泌体相关成骨mirnas表达明显增加(最高可提高150多倍)，证明磁性fe3o4纳米颗粒与磁场可改变外泌体相关基因调控。
[0085]
表1成骨相关mirna的引物信息
[0086][0087][0088]
实施例2
[0089]
多药共载缓释水凝胶(rfp/inh/pza@hap hydrogel)的制备、释药特征、表征分析
[0090]
2.1oha/cmcs/hap水凝胶的制备及表征分析
[0091]
2.1.1水凝胶的制备
[0092]
(1)制备氧化透明质酸(oha):取洁净的圆底烧瓶，加入搅拌子和ha粉末，再加入适量蒸馏水使得ha以10mg/ml的浓度充分溶解。按照1：2的naio4/ha重量比，naio4浓度为0.25mol/l，往圆底烧瓶中逐滴滴加naio4溶液，室温避光反应24h，加入过量乙二醇终止反
应。将反应液转移至透析袋中，蒸馏水透析3d，每天至少换3次水以除去残留的naio4和乙二醇，冷冻干燥获得纯净的氧化透明质酸。采用碱消耗法测定醛基含量，oha的氧化度为48.9％，表明成功制备氧化透明质酸；ftir分析特征峰(图8)。
[0093]
(2)制备oha/cmcs/hap hydrogel：将oha溶解于pbs中配置成凝胶前体溶液1(使oha最终的体积分数分别为2％-4％(2％、3％、4％))，将含有纳米羟基磷灰石(hap)和羧甲基壳聚糖(cmcs)溶解于pbs中配置成前体溶液2(使hap体积分数固定为8％，cmsc体积分数为2％-4％(2％、3％、4％))。将两前体溶液分别置于不同针管中(图7)，通过同时注射挤出(1:1)，氧化透明质酸上的醛基可以和壳聚糖上的氨基快速动态交联形成腙键，从而凝固成胶，所得水凝胶呈半透明状，含纳米羟基磷灰的水凝胶呈乳白色，表面湿润，施压可回弹。体积分数不同的水凝胶分为记为：
[0094]
①
oha2/cmcs2/hap8
②
oha3/cmcs3/hap8
③
oha4/cmcs4/hap8。(3)复合外泌体水凝胶制备：将exo混悬液与cmsc溶液混合，重复步骤(2)即可。
[0095]
(4)载药水凝胶的制备：将分别载有rfp、inh、pza的囊泡与oha溶液混合，重复步骤(2)参与水凝胶得交联，即得载药水凝胶。
[0096]
2.1.2水凝胶表征分析
[0097]
将
①
oha2/cmcs2/hap8
②
oha3/cmcs3/hap8
③
oha4/cmcs4/hap8各组水凝胶进行以下表征实验，选定合适的比例继续进一步的实验。
[0098]
(1)sem观察水凝胶结构：将水凝胶样品冻干后截取部分断面涂于硅板上制备待测杨，使用sem电镜观察水凝胶内部形貌，孔径大小。
[0099]
sem检测结果如图9所示，水凝胶单个微孔呈现三维长圆柱状，孔径在50～200μm之间。水凝胶的交织网络结构可为细胞提供生长空间，营养支持及新陈代谢通道，适宜的孔径大小利于细胞生长与增殖。与复合水凝胶相比，空白水凝胶呈现光滑孔壁。纳米羟基磷灰石成功嵌入水凝胶中，形成粗糙壁面。随着前体溶液浓度的增加，水凝胶的孔更加致密，孔径更小。
[0100]
(2)ftir分析：冷冻干燥后的水凝胶复合材料压碎研磨至300目以下，取少量与溴化钾粉末充分混合压片，进行fitr分析，观察特征峰(图8)。
[0101]
(3)自愈性实验：将复合水凝胶制成圆形样品，切成两半后重新拼接，并在拼接处滴加pbs用于湿润表面，室温放置，观察水凝胶的自愈情况。
[0102]
结果如图11所示，设置不同时间点10s，20s，30s，40s等，倾置水凝胶溶液(图11中a)，oha可与cmcs在30s内交联成胶(图11中b)，此种动态快速交联可以更好地适应骨缺损处的病灶不规则形状。
[0103]
将制备好的水凝胶沿中线切开，之后将切开的两块水凝胶合并，往缝隙中滴加少量水，于室温条件下放置30分钟，观察水凝胶变化。结果如图11所示，被切开的两小块水凝胶已接近一整体，于垂直及水平方向进行上提并未出现掉落情况。席夫碱的存在，使得水凝胶具备自修复能力，即当水凝胶发生断裂时，通过接触可二次形成水凝胶。自修复能力结合其快速交联成胶的特点，可以更好更灵活地应对病灶处的活动摩擦，存在赋予此种水凝胶更高的生物仿生水平。
[0104]
(4)流变学：使用流变仪在37℃下测量水凝胶的流变性能。在1hz、10％应变、0.5mm间隔进行600s扫描测试，得到水凝胶的储能模量g’和损耗模量g”。
[0105]
通过应变扫描测试评估所得水凝胶在动态条件下的稳定性，该浓度下的水凝胶在广泛应变范围内表现非常稳定，并在骨骼承受应变范围内(《4％)，水凝胶在100％应变左右才开始变形(图13)。
[0106]
(5)溶胀率：水凝胶冻干后承重记录为w1，浸没于37℃的pbs中，于2、4、6、8、10小时取出滤纸吸干称重能够记录为w2，溶胀率表示为(w2-w1)/w1
×
100％。
[0107]
溶胀率是水凝胶材料的重要性能之一，它对水凝胶结构的维持起着重要作用，同时与药物在水凝胶结构中的吸附与解吸有着密切关系。通过称重法对水凝胶溶胀率进行测定，将不同前体浓度的水凝胶分别浸泡在水中。在设定时间点取出样品，滤纸吸干表面溶液，称重。结果如图12所示，oha2/cmcs2(gel2％)、oha3/cmcs3(gel3％)、oha4/cmcs4(gel4％)三种水凝胶都能快速溶胀，均在24h左右达到溶胀平衡，且均具有较高的溶胀率。溶胀能力有利于水凝胶在修复部位与周围组织紧密接触，便于营养和代谢废物的运输，增加与组织的亲和性，减少刺激性。
[0108]
2.2制备利福平rfp、异烟肼inh、吡嗪酰胺pza载药囊泡
[0109]
2.2.1载药囊泡的制备
[0110]
称取10mg两亲性嵌段共聚物pcl-peg-cho放置于圆底烧瓶中，加入4ml二氯甲烷，超声震荡混匀。将圆底烧瓶放置于旋转蒸发仪上，在室温下真空旋转以去除有机溶剂直至瓶壁上形成一层均匀薄膜。将圆底烧瓶放置于40℃真空干燥箱中处理8小时，以去除残余有机溶剂。在烧瓶中分别加入rfp、inh、pza溶液，于60℃水浴水化6小时得到载药囊泡溶液，用超滤管超滤4000g
×
30min除去未包裹的药物。
[0111]
2.2.2载药囊泡相关表征
[0112]
(1)取出少量载药囊泡溶液，滴在有膜铜网上，待其干燥后用tem观察形态。
[0113]
(2)使用动态光散射(dls)测量载药囊泡的水合粒径。
[0114]
薄膜水化法制备所得的空载聚合物囊泡和载药聚合物囊泡tem结果如图13所示(a为空载囊泡，b为载药囊泡)，两亲性嵌段共聚物自组装而成的空载聚合物囊泡呈壳核泡状结构，其直径约为200nm(图14中a)与dls所测得的水合粒径结果一致(图14中c)。载药聚合物囊泡tem图中可明显观察到药物位于聚合物囊泡内部，表明药物被成功包裹(图14中b)。dls结果显示包裹三种药物的聚合物囊泡平均水合粒径在200nm内。
[0115]
2.3载药囊泡复合水凝胶(rfp/inh/pza@hap hydrogel)
[0116]
将载有rfp、inh、pza囊泡与氧化透明质酸混合后与cmcs混合形成载药水凝胶。
[0117]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种促进结核性骨缺损修复的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的前体物质包括羧甲基壳聚糖和醛基化透明质酸；所述水凝胶负载有工程化外泌体。2.根据权利要求1所述水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的制备原料中还包括纳米羧基磷灰石。3.根据权利要求1或2所述水凝胶，其特征在于，在所述水凝胶内部通过化学键交联有载药纳米囊泡；所述载药纳米囊泡所载药物包括抗结核药物中的至少一种。4.根据权利要求1所述水凝胶，其特征在于，所述工程化外泌体的制备方法，包括以下步骤：将脊髓间充质干细胞在含fe3o4的培养基中培养，并在培养过程中给与交变磁场，培养后分离得到的外泌体即所述工程化外泌体。5.根据权利要求4所述水凝胶，其特征在于，所述培养基中fe3o4的浓度不高于100μg/ml；所述交变磁场的磁场频率为50hz，交变磁场的amf环境为1～5mt。6.权利要求1～5任一项所述水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将羧甲基壳聚糖、醛基化透明质酸、纳米羟基磷灰石、若干种载药纳米囊泡和工程化外泌体混合，交联得所述水凝胶。7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，将醛基化透明质酸和若干种载药纳米囊泡溶于pbs中，得前体溶液1；将羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石和工程化外泌体与pbs混合，得前体溶液2；将前体溶液1和前体溶液2等体积混合，交联得所述水凝胶。8.根据权利要求6或7所述制备方法，其特征在于，所述载药纳米囊泡包括分别载药利福平、异烟肼和吡嗪酰胺的载药纳米囊泡。9.权利要求1～5任一项所述水凝胶在制备骨修复材料中的应用。10.权利要求1～5任一项所述水凝胶在制备结核性骨缺损修复材料中的应用。

技术总结
本发明公开了负载工程化外泌体和多种抗结核药物的水凝胶支架及其制备方法和应用，属于生物医疗技术领域。本发明选择自愈性水凝胶作为支架材料，还可以用聚合物囊泡分别包裹抗结核药物，再通过化学键交联至水凝胶内部，从而实现抗结核药物的共载与缓释，并加入羟基磷灰石以更大程度仿生，最终获得基于工程化外泌体的多载药水凝胶支架。本发明支架不仅实现药物联合缓释，增加病灶药物浓度达到长效药物治疗，减少因全身给药的毒副反应、提供患者依从性；还在成骨分化、细胞增殖迁移和血管生成中也具有优良诱导性能，最终促进结核性骨缺损的修复。修复。修复。


技术研发人员：胡春梅 黄嘉燕 唐秋莎 杭天星 刘莹 李涵 安艳丽
受保护的技术使用者：南京市第二医院
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/8/21