一种粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qPCR检测方法

一种粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qpcr检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种检测技术，尤其是一种肠道菌群的qpcr检测，属于微生物检验技术领域。


背景技术：

2.活泼瘤胃球菌(ruminococcus gnavus)隶属于瘤胃球菌科瘤胃球菌属，可在新生儿出生后的第3天、第4天在体内定植，并可在90％以上成年人的粪便样本中检出。目前，r.gnavus已被证实与宿主代谢健康密切相关，它可以降解结肠黏蛋白，并分泌一种具有鼠李糖主链和葡萄糖侧链的复杂葡糖鼠李聚糖多糖，有效诱导树突细胞分泌炎性细胞因子tnfα，是诱发克罗恩病(crohn's disease)的重要原因之一。此外，也有大量研究表明r.gnavus会促进致病菌的共生、破坏肠道粘膜免疫环境、影响葡萄糖稳态及胰岛素敏感性，与人类炎症性肠病、前列腺癌、代谢综合征、肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、衰弱、营养不良、covid-19感染等相关。因此，通过对活泼瘤胃球菌的检测，可以有效预测健康水平，以便进行针对性医护。
3.r.gnavus的丰度与机体健康水平密切相关，在健康的肠道中，r.gnavus通常占肠道微生物群的0.1％左右，但在某些疾病状态下，其丰度会显著升高，如在克罗恩病的某些爆发期，其在肠道菌群的相对丰度可以从不足0.1％跃升至超过5069％，从而引起肠粘膜层聚糖的消耗及肠黏液层的物质平衡紊乱，进而影响患者肠道通透性及疾病进展。此外，r.gnavus丰度在其他疾病发生期也显著变化，如在纤维囊肿患者中升高21倍，在冠心病病人中升高3倍，在肾结石患者中升高2.9倍，在肥胖患者中升高2.74倍，而在二型糖尿病人中可升高至1.86％。因此对其进行精确定量对预测健康水平和进行针对性医疗具有重要意义。
4.目前，rt-qpcr(real-time qpcr；qpcr)是微生物定量的主要手段，该技术通过靶向16s rdna基因进行检测。但是，现有的粪便样品的瘤胃球菌的qpcr方法需要进行样本前处理，核酸提取、核酸扩增等多个步骤，过程繁琐冗长，其灵敏度和特异度也难以满足需求。据申请人了解，目前尚未有非提取式qpcr活泼瘤胃球菌一步式检测方法在专利或文献中报道，因此在该领域仍有探索和发展的空间。


技术实现要素：

5.本发明提出了一种粪便中菌群核酸释放技术，并通过此技术建立了活泼瘤胃球菌的qpcr技术。
6.该技术方案可解决目前粪便样品中活泼瘤胃球菌检测灵敏度和特异度低的问题，为后期的粪便样本的便捷检测提供技术基础。
7.为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：一种粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qpcr检测方法，包括以下步骤：
8.1)使用粪便菌群核酸释放技术：取适量粪便，加入10倍体积pbs缓冲液，充分震荡
摇匀，使细菌分散破损；
9.2)通过-80度冻存，极大保留菌群，随后迅速加热致100度3分钟，灭活大部分病原体以及酶的活性；也通过急剧的温度变化，使细菌破裂，使核酸完全释放；
10.3)通过3000g离心5分钟去除研磨珠和杂质等，使核酸保留于上清中；
11.4)取上清液作为模板，配置反应体系，使用qpcr方法进行检测，20μl体系包括：模板(上清液)2μl、扩增酶0.5μl、mgcl
2 5.5mm、dntps0.4mm、sybr 1μl、引物、水；用于检测粪便样本中的活泼瘤胃球菌16srdna检测的引物序列为：正向引物(seq id no:1)为5
′‑
atggcatggatgatcgtatc-3
′
，反向引物(seq id no:2)为5
′‑
ttattcttcctttgctttcagcag-3
′
。
12.优选的，检测粪便样本中的活泼瘤胃球菌，使用的是非提取核酸的pcr技术。
13.优选的，粪便样本的前处理方法促进样本中菌群核酸的释放，有利于进一步开展qpcr检测；建立适用于非提取核酸式的活泼瘤胃球菌的qpcr技术。
14.优选的，包括如下步骤：
15.(1)取所述粪便菌群核酸释放技术获取的上清模板20μl，与扩增酶apexdirect dna polymerase 0.5μl、mgcl2 5.5mm、dntps0.4mm、sybr 1μl、引物各0.5μl和水配置成扩增反应体系；
16.(2)进行荧光定量pcr扩增：将配制好的扩增反应体系置于荧光定量pcr仪中进行扩增反应和信号采集，所述扩增的条件为：95℃3分钟；95℃5秒，60℃30秒并采集荧光信号40个循环；
17.(3)结果判定：扩增结束后，获得对应瘤胃球菌的扩增曲线，有s型扩增曲线并且ct值小于36则说明测试样本含有活泼瘤胃球菌r.gnavus。
18.通过该技术方案的实施，可以有效提高检测灵敏度和特异性，为后期粪便样本的便捷检测提供技术基础。
19.本发明的有益效果：
20.可以灵敏、特异的检测到粪便样本的活泼瘤胃球菌。
21.减少检测程序：简化了提取核酸的步骤，大大缩减了检测时间，使方法更易被各类型机构及人员掌握。
22.对检测设备等应用场景要求减低，使活泼瘤胃球菌的检测更易推广。
附图说明
23.下面结合附图对本发明做进一步说明。
24.图1琼脂糖凝胶电泳筛选特异性引物图
25.图2优选耐受的扩增酶
26.图3mgcl2和dntps不同离子浓度下的qpcr扩增效率图4样本检测准确性
具体实施方式
27.实施例1
28.1、引物设计
29.根据r.gnavus 16s rdna序列，按照碱基互补配对等引物设计原则人工设计候选几种引物，并通过琼脂糖凝胶电泳筛选特异性引物，最终筛选出特异性引物：
30.引物1为：5
’‑
atggcatggatgatcgtatc-3’，长度为20个核苷酸的寡核苷酸，gc含量45％
31.引物2为5
’‑
ttattcttcctttgctttcagcag-3’,长度为24个核苷酸的寡核苷酸，gc含量33.3％。
32.如图1所示，使用该引物对含10ng活泼瘤胃球菌基因组dna的样本进行扩增实验。分析琼脂糖凝胶电泳结果，扩增目的片段大小为288bp，扩增条带明亮且无杂带，表明扩增效率高，灵敏度高；且以对照细菌基因组dna和水为模板扩增不出其他dna条带，说明本方法有较好的特异性。
33.图1图注
34.m-dl5000marker
35.上述模板分别为：
36.1：活泼瘤胃球菌(ruminococcus gnavus，atcc 29149)
37.2：普拉梭菌(faecalibacterium prausnitzii，atcc 27766)
38.3：大肠杆菌(escherichia coli，atcc 15597)
39.4：双蒸水
40.2直接扩增酶及检测体系的优化
41.对于pcr反应而言，dna聚合酶的性质、辅因子镁离子(mg2+)及底物dntps浓度对于扩增效果至关重要。我们对rt-qpcr反应体系中酶种类、mgcl2及dntps含量进行优化，依据ct值和相对荧光单位(rfu)即实时荧光信号的相对强度(rn值)确定反应的进展情况，最终优选mgcl
2 5.5mm、dntps0.4mm。方法如下：
42.使用购自湖南艾科瑞生物工程有限公司的apexdirect dna polymerase ag12205；购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司的hieff hotstart direct taq dna polymerase；购自彬谷科技(上海)有限公司的versataq direct pcr polymerase(affymetrix)、购自takara(日本)公司的terra pcr direct聚合酶四种直扩酶，以及不同浓度的mgcl2、dntps进行活泼瘤胃球菌的qpcr扩增实验。结果如图2所示，直接扩增酶a反应最为灵敏，其所在体系：apexdirect dna polymerase，mgcl2离子5.5mm，dntps 0.4mm的扩增效率最高，在30个循环时，rn值便高达300，000，远超其他扩增酶所在体系十数倍。
43.图2图注
44.直接扩增酶的选择:
45.a:apexdirect dna polymerase
46.b:hieff hotstart direct taq dna polymerase
47.c:versataq direct pcr polymerase(affymetrix)
48.d:terra pcr direct聚合酶
49.3、粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qpcr检测方法，包括以下步骤：
50.1)使用粪便菌群核酸释放技术：取适量粪便，加入10倍体积pbs缓冲液，充分震荡摇匀，使细菌分散破损；
51.2)通过-80度冻存，极大保留菌群，随后迅速加热致100度3分钟，灭活大部分病原
体以及酶的活性；也通过急剧的温度变化，使细菌破裂，使核酸完全释放；
52.3)通过3000g离心5分钟去除研磨珠和杂质等，使核酸保留于上清中；
53.4)取所述粪便菌群核酸释放技术获取的上清模板20μl，与扩增酶apexdirect dna polymerase 0.5μl、mgcl2 5.5mm、dntps0.4mm、sybr 1μl、引物各0.5μl和水配置成扩增反应体系；用于检测粪便样本中的活泼瘤胃球菌16srdna检测的引物序列为：正向引物(seq id no:1)为5
′‑
atggcatggatgatcgtatc-3
′
，反向引物(seq idno:2)为5
′‑
ttattcttcctttgctttcagcag-3
′
54.5)进行荧光定量pcr扩增：将配制好的扩增反应体系置于荧光定量pcr仪中进行扩增反应和信号采集，所述扩增的条件为：95℃3分钟；95℃5秒，60℃30秒并采集荧光信号40个循环；
55.6)结果判定：扩增结束后，获得对应瘤胃球菌的扩增曲线，有s型扩增曲线并且ct值小于36则说明测试样本含有瘤胃球菌r.gnavus。
56.4、验证测试对照
57.为了显示这些方法在临床检测上的一致性，对300例人群粪便中已鉴定过的活泼瘤胃球菌阳性、100例阴性样本来验证本研究中活泼瘤胃球菌qpcr检测方法的灵敏度和特异度，并用传统方法作为对照。结果如图4所示，300份活泼瘤胃球菌阳性样品检测到了298份阳性，灵敏度达98.7％；100份阴性样本中，检测出100份阴性，特异性达100％。
58.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。

技术特征：
1.一种粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qpcr检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)使用粪便菌群核酸释放技术：取适量粪便，加入10倍体积pbs缓冲液，充分震荡摇匀，使细菌分散破损；2)通过-80度冻存，极大保留菌群，随后迅速加热致100度3分钟，灭活大部分病原体以及酶的活性；也通过急剧的温度变化，使细菌破裂，使核酸完全释放；3)通过3000g离心5分钟去除研磨珠和杂质等，使核酸保留于上清中；4)取上清液作为模板，配置反应体系，使用qpcr方法进行检测，20μl体系包括：模板(上清液)2μl、扩增酶0.5μl、mgcl
2 5.5mm、dntps0.4mm、sybr 1μl、引物、水；用于检测粪便样本中的活泼瘤胃球菌16srdna检测的引物序列为：正向引物(seq id no:1)为5
′‑
atggcatggatgatcgtatc-3
′
，反向引物(seq id no:2)为5
′‑
ttattcttcctttgctttcagcag-3
′
。2.根据权利要求1所述粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qpcr检测方法，其特征在于:检测粪便样本中的活泼瘤胃球菌，使用的是非提取核酸的pcr技术。3.根据权利要求1所述粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qpcr检测方法，其特征在于：粪便样本的前处理方法促进样本中菌群核酸的释放，有利于进一步开展qpcr检测；建立适用于非提取核酸式的活泼瘤胃球菌的qpcr技术。4.一种用于所述粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qpcr检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)取所述粪便菌群核酸释放技术获取的上清模板20μl，与扩增酶apexdirect dna polymerase 0.5μl、mgcl2 5.5mm、dntps0.4mm、sybr 1μl、引物各0.5μl和水配置成扩增反应体系；(2)进行荧光定量pcr扩增：将配制好的扩增反应体系置于荧光定量pcr仪中进行扩增反应和信号采集，所述扩增的条件为：95℃3分钟；95℃5秒，60℃30秒并采集荧光信号40个循环；(3)结果判定：扩增结束后，获得对应瘤胃球菌的扩增曲线，有s型扩增曲线并且ct值小于36则说明测试样本含有活泼瘤胃球菌r.gnavus。

技术总结
本发明公开了一种粪便样本中活泼瘤胃球菌的非核酸提取式qPCR检测方法，免核酸提取步骤，并优化了包括扩增酶、活泼瘤胃球菌荧光定量PCR反应体系和反应条件，可以检测出活泼瘤胃球菌，用于快速、准确地检测肠样本中的活泼瘤胃球菌。瘤胃球菌。瘤胃球菌。


技术研发人员：杨沛 徐婷 庄添驰 曹薇 季明辉 顾大勇 赵彦杰 顾逸博 赵文武 许勤 孙涛 李宁 刘云 张展
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/8/21