双苄基丁烷型木脂素氧甲基转移酶及其应用

1.本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，特别地涉及参与五味子双苄基丁烷型木脂素生物合成的氧甲基转移酶及其应用。


背景技术：

2.双苄基丁烷型木脂素是由两个c6-c3单元经过8和8’位偶联形成的一类非环状木脂素。在五味子科、大戟科、樟科等多科中均分离得到。现代药理研究表明，该类天然产物具有抗氧化活性，且其多种衍生物具有抗hiv活性。基于该类化合物链状的结构特点，可以经过不同的环化方式形成其他结构类型的木脂素，因此在二聚化木脂素的生物合成途径上处于靠前的位置。
3.五味子(schisandra chinensis)中分离得到了丰富的双苄基丁烷型木脂素，及环化的联苯环辛烯型木脂素，在结构上都包含了多种氧甲基取代，因此在五味子中一定包含功能性的氧甲基转移酶(o-methyltransferases)，而目前还未有相关报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种多肽分子，其氨基酸序列选自：(a)seq id no.2；(b)seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列；以及(c)(a)或(b)的截短体；其中，所述多肽分子具有催化木脂素甲基化修饰的活性，进一步地，所述多肽分子具有催化木脂素酚羟基甲基化的活性。
5.如上所述的多肽分子，其中所述木脂素为双苄基丁烷型木脂素。
6.如上所述的多肽分子，所述木脂素为前戈米辛(pregomisin)。
7.一种多核苷酸分子，其编码如上任一所述的多肽分子，所述多核苷酸分子选自：(a)seq id no.1；(b)与seq id no.1具有80％以上同源性的核酸序列；以及(c)(a)或(b)的截短体。
8.一种重组载体，包括：如上所述的多核苷酸分子；以及表达载体。
9.一种融合细胞，包括：如上所述的重组载体；以及表达细胞。
10.一种制备用于催化双苄基丁烷型木脂素甲基化修饰的蛋白质的方法，包括：将如上4所述的核酸分子转化入表达细胞；在表达细胞内表达所述多肽分子的蛋白质；以及纯化所述多肽分子的蛋白质。
11.如上任一所述的多肽分子在催化双苄基丁烷型木脂素甲基化修饰方面的应用。
12.五味子木脂素化合物d(schisandrathera d)的制备方法，所述方法包括：利用以下群组中的一者或多者催化前戈米辛(pregomisin)：如上任一所述的多肽分子；如上所述的核酸分子编码的多肽分子；如上所述的重组载体表达的多肽分子；如上所述的融合细胞获得的多肽分子；以及如上所述的方法制备的多肽分子。
13.由上述方法制备的五味子木脂素化合物d(schisandrathera d)。
14.本技术的双苄基丁烷型木脂素甲基化修饰酶可将双苄基丁烷型木脂素甲基化，可
用于探究具有新型功能的木脂素，为五味子中木脂素多样化的合成生物学研究奠定基础，具有重大的应用价值。双苄基丁烷型木脂素多样的甲基化修饰为其他环化木脂素的生成提供了更多的底物选择，研究结果为药用活性木脂素的合成生物学研究提供候选基因，对阐明化合物结构多样性的形成机制、活性分子开发等具有重要的实际应用意义。使用本技术的双苄基丁烷型木脂素氧甲基转移酶获得的化合物或将其作为中间体而得到的化合物可成为医药的有效成分、功能性食品材料等，使得本技术的木脂素氧甲基转移酶在医药行业及食品业中均具有积极的应用前景。
附图说明
15.下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：
16.图1是根据本发明的一个实施例的schomt7蛋白的sds-page电泳图，其中：m：蛋白分子质量标准；泳道1：schomt7的上清液；泳道2：schomt7的沉淀菌体；泳道3：schomt7的纯化蛋白；
17.图2是根据本发明的一个实施例的schomt7以前戈米辛为底物的酶活催化反应的hplc图谱；其中，酶活催化反应以空载体的催化反应作为对照；以及
18.图3是根据本发明的一个实施例的schomt7以前戈米辛为底物的酶活催化反应的lc-ms图谱及反应式；其中，图3a为根据本发明一个实施例的schomt7以前戈米辛为底物的酶活催化反应的lc-ms图谱；图3b为根据本发明一个实施例的schomt7以前戈米辛为底物的酶活催化反应式。
具体实施方式
19.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.在以下的详细描述中，可以参看作为本技术一部分用来说明本技术的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本技术的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本技术的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本技术的实施例进行结构、逻辑或者电性的改变。
21.本文所述专业名词具有以下含义：
22.本文所述“木脂素”是指一类由2分子或3分子苯丙素衍生物以不同形式聚合而成的天然有机化合物，多分布于被子植物和裸子植物。可分为两大类：由两分子苯丙基衍生物通过其侧链β-位聚合的化合物称为木脂素；由一分子苯丙基的侧链，与另一分子的苯环连接，或两部分以氧原子连接的化合物称为新木脂素。从植物界已分得200多个木脂素，100多个新木脂素。中药五味子、刺五加、络石、牛蒡子、远志、连翘、红花、细辛等，都含有木脂素。许多木脂素类成分由于饱和的环状结构部分可能有立体异构体存在。已经见到某些中药中存在的木脂素成分性质不稳定，受酸或碱的影响，容易异构化，转变为其立体异构体。已发现具有抗癌、抗真菌、杀虫、升白细胞、降低谷丙转氨酶、保肝、止咳、泻下等活性的各种木脂
素，但作为药用的不多。鬼臼木脂素的衍生物用作抗癌药，五味子中的木脂素有降谷丙转氨酶作用，用以治疗肝炎。
23.本文所述“五味子”是指schisandra chinensis，五味子科五味子属木本植物。有研究表明，五味子具有广泛的药用价值，包括：抗肝损伤作用、广泛的中枢抑制作用、强心作用、增强机体对非特异性刺激的防御能力、对炭疽杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌等均有抑制作用等。其中，木脂素是五味子的主要有效成分，五味子果实中总木脂素含量为18.1％，茎中含总木脂素10.25％。其中的木脂素成分具有明显的抗氧化作用，可以保护心脏免受脂质过氧化的损伤。
24.本文所述“甲基化”是指从活性甲基化合物上将甲基催化转移到其他化合物的过程，可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸加工。
25.本文所述“omt7”属于omts家族，是一种氧甲基转移酶(o-methyltransferases)。氧甲基转移酶(omt)是一类依赖于s-腺苷甲硫氨酸催化多种次级代谢产物如类黄酮、生物碱、植保素等生成的重要的酶,在植物生长发育的各个阶段、抵御外来病菌入侵等方面发挥着重要作用。omt通常以基因家族的形式存在于动植物体内。
26.本发明的蛋白质，例如seq id no.2所示的氨基酸序列，包含(a)具有seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白质，或(b)具有上述氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，且具有催化前戈米辛的酚羟基甲基化功能的蛋白质，或(c)上述两者的截短体，如截短n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸，或延长n端或c端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸，且具有催化前戈米辛的酚羟基甲基化功能的蛋白质。
27.本文所述“替换、缺失或添加一个或多个碱基”或“替换、缺失或添加一个或多个氨基酸”是指使用定位诱变法[hashimoto-gotoh，gene 152，271-275(1995)其他]等公知的突变方法，使得核苷酸序列或者氨基酸序列突变成与原序列具有至少80％同源性的序列。例如，突变后的序列与原序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或者80％的同源性。在一些实施例中，上述蛋白质和基因中，术语“95％以上的同源性”可为至少96％、97％、98％的同一性。术语“90％以上的同源性”可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。术语“85％以上的同源性”可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。术语“80％以上的同源性”可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
[0028]
术语“编码基因”、“核酸分子”是指可编码特定氨基酸肽链的核糖核苷酸(rna)或脱氧核糖核苷酸(dna)序列。在一些实施例中，编码基因或核酸分子可通过全基因合成、pcr扩增、化学法合成等获得。本技术不对编码基因和核酸分子的获取方式限定。
[0029]
术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将dna或rna插入细胞中的载体、主要用于复制dna或rna的载体，以及主要用于dna或rna的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细
胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
[0030]
在本发明的一些实施例中，术语“重组载体”具体为将木脂素氧甲基转移酶的编码基因克隆到表达载体，如pet28a载体(其含有酶切位点，如酶切位点为bamhⅰ和xhoⅰ)之间后得到的重组载体。在另一些实施例中，表达载体选自下述载体中的一个或者多个：ppic9、ppic9k、ppiczαb、ppiczαb载体、pet系列载体、pgex系列载体、pmal系列载体、pqe系列载体、pbadmychis系列载体、ptrchis系列载体、ptxb系列、t系列载体等其他载体以及以上载体的改造载体。在一些实施例中，重组表达载体可选自pet系列、pgex系列、pcold系列等原核表达载体，ppic9、phil-d2、ppic3.5等酵母表达载体及pbi系列、pcambia系列等植物表达载体。本技术不限定获取重组载体的方式，通过其他方式获得的本技术重组载体也在本技术的保护范围内。
[0031]
术语“重组表达细胞”、“重组细胞”、“表达细胞”是指基因组内整合有外源基因的细胞，或者体内包含表达载体的宿主细胞。在一些实施例中，“重组表达细胞”、“重组细胞”、“表达细胞”可以为细菌、真菌、高等植物细胞等。在一些实施例中，可通过将木脂素氧甲基转移酶的编码基因导入所述大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母中后得到。
[0032]
本文所述“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由
……
组成”的含义。
[0033]
氧甲基转移酶(o-methyltransferases)作为一类重要的结构修饰酶，是五味子中药效活性化合物生物合成的一类关键酶。针对五味子联苯环辛烯木脂素生物合成途径研究，推断其路径是由双苄基丁烷型木脂素经过苯环相连形成联苯环辛烯型木脂素结构。甲基化修饰可能发生于偶联前或偶联后，是包含氧甲基的化合物合成途径中重要的一环。
[0034]
因此，本发明重点开展对五味子木脂素的结构修饰基因omts进行筛选鉴定。研究结果对阐明五味子的木脂素合成途径、化合物结构多样性的形成机制等具有重要的理论研究意义和实际应用意义。
[0035]
本发明的目的在于提供一个氧甲基转移酶基因及其编码的蛋白质，可参与五味子双苄基丁烷型木脂素的甲基化修饰。经研究发现，本发明得到的来自于五味子的甲基化修饰酶schomt7可以催化双苄基丁烷型木脂素前戈米辛的羟基甲基化。
[0036]
本发明提供的schomt7基因，其核苷酸序列为seq id no.1所示，或其突变序列。
[0037]
本发明提供的schomt7基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示，或其突变序列。
[0038]
本发明目的可通过如下技术方案实现：
[0039]
技术方案一：基于转录组的五味子双苄基丁烷型木脂素甲基化修饰关键酶基因筛选，步骤如下：
[0040]
1)uplc检测五味子果实、成熟茎、老叶和根中含氧甲基的双苄基丁烷型木脂素的含量差异。
[0041]
2)基于五味子基因组，鉴定五味子氧甲基转移酶omts基因家族成员，利用omt基因家族的hmm模型初步筛选五味子中氧甲基转移酶omts的关键酶蛋白序列。
[0042]
3)基于五味子不同组织部位转录组数据，分析差异基因表达，进一步筛选五味子双苄基丁烷型木脂素生物合成途径中修饰羟基甲基化的关键酶基因。
[0043]
技术方案二：关键酶基因schomt7的功能验证。采用原核表达体系，以前戈米辛为底物，体外鉴定氧甲基转移酶schomt7的功能。
[0044]
本技术涉及一种多肽分子，其氨基酸序列选自：(a)seq id no.2；(b)seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列；以及(c)(a)或(b)的截短体；其中，该多肽分子具有催化木脂素甲基化修饰的活性，进一步地，所述多肽分子具有催化木脂素酚羟基甲基化的活性。进一步地，上述多肽分子由编码基因编码，编码基因选自下列多核苷酸分子：(a)seq id no.1；(b)与seq id no.1具有80％以上同源性的核酸序列；以及(c)(a)或(b)的截短体。
[0045]
在一些实施例中，木脂素为双苄基丁烷型木脂素。进一步地，在一些实施例中，双苄基丁烷型木脂素为前戈米辛(pregomisin)。
[0046]
在一些实施例中，本技术涉及一种重组载体，该重组载体包括：前述的核酸分子，该核酸分子可表达前述多肽分子。在一些实施例中，该多肽分子具有催化木脂素甲基化修饰的活性；以及表达载体。在一些实施例中，所述多肽分子具有催化木脂素酚羟基甲基化的活性。在一些实施例中，表达载体可选自pet系列、pgex系列、pcold系列等原核表达载体，ppic9、phil-d2、ppic3.5等酵母表达载体及pbi系列、pcambia系列等植物表达载体。
[0047]
在一些实施例中，本技术涉及一种融合细胞，该融合细胞包括前述的重组载体；以及表达细胞。在一些实施例中，表达细胞可以为细菌、真菌、高等植物细胞等。在一些实施例中，可通过将木脂素氧甲基转移酶的编码基因导入所述大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母中后得到。
[0048]
在一些实施例中，前述多肽分子，或者编码前述多肽分子的多核苷酸分子可用于催化木脂素甲基化修饰。在一些实施例中，木脂素为双苄基丁烷型木脂素。进一步地，双苄基丁烷型木脂素为前戈米辛(pregomisin)。在一些实施例中，前戈米辛(pregomisin)在前述多肽分子的氧甲基催化活性下，可获得五味子木脂素化合物d(schisandrathera d)；
[0049]
在一些实施例中，五味子木脂素化合物d(schisandrathera d)具有如下结构式：
[0050][0051]
本发明公开了五味子中木脂素生物合成途径中催化羟基甲基化的氧甲基转移酶的编码基因schomt7的筛选及功能鉴定方法，schomt7可以催化前戈米辛的羟基甲基化生成五味子木脂素化合物d(schisandrathera d)，为五味子中多样的双苄基丁烷型木脂素的合成生物学研究奠定基础，具有重大的应用价值。
[0052]
本文将通过以下实施例对本技术的技术方案进行阐释。
[0053]
实施例1表达基因schomt7的克隆
[0054]
1.1ctab-pvp法提取五味子总rna
[0055]
(1)取新鲜的五味子植物材料(叶片或果实)，在液氮中迅速研磨成粉末。
[0056]
(2)用离心管估算装50-100mg粉末至提前预冷的2ml进口离心管中，加600-800μl 65℃预热的ctab-pvp提取液，放置于涡旋振荡器震荡30s使其充分裂解。
[0057]
上述ctab-pvp提取缓冲液配制方法如下：
[0058]
100mm tris
·
hcl(ph 8.0)，2％ ctab(w/v)，2％ pvp(w/v)，25mm edta，2m nacl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；溶液配置用depc处理过的双蒸水(ddh2o)，高压灭菌后备用。
[0059]
(3)65℃水浴30分钟，每隔10分钟颠倒混匀一次。
[0060]
(4)冷却至室温后加入600-800μl氯仿，颠倒混匀后在4℃13,000rpm离心10min。
[0061]
(5)取上清转至新的进口2ml的离心管，加入600-800μl氯仿，振荡混合均匀后4℃13,000rpm离心10min。
[0062]
(6)重复上步(即用氯仿抽提三次)。
[0063]
(7)小心吸取上清转至新的进口1.5ml离心管中，加入1/3体积的8m licl，-20℃静置过夜。
[0064]
(8)4℃13,000rpm离心10min，弃上清。
[0065]
(9)加入700μl 75％乙醇(depc水配制)洗涤沉淀2-3次。离心弃上清后挥干剩余乙醇。
[0066]
(10)加入30μl蛋白酶k(proteinase k)处理后的灭菌水溶解rna，制得总rna。使用biophotometer plus型号的核酸蛋白测定仪测定提取的rna浓度及质量。
[0067]
1.2schomt7基因全长扩增
[0068]
1.2.1引物设计
[0069]
利用软件snapgene在开放阅读框(orf)两侧设计全长引物schomt7-f/r，对基因进行扩增。
[0070]
1.2.2cdna合成
[0071]
以提取的五味子的总rna为模板，以primerscript rt master mix逆转录体系通过pcr技术获得cdna模板链。
[0072]
逆转录体系及逆转录程序如下：
[0073]
逆转录pcr体系：
[0074][0075]
逆转录程序：37℃,15min；
[0076]
85℃,15s。
[0077]
逆转录产物保存于-20℃，使用前稀释。
[0078]
1.2.3目的基因扩增
[0079]
以稀释的逆转录的五味子cdna为模板，以schomt7-f/r为引物进行扩增。
[0080]
扩增体系及扩增程序如下：
[0081][0082]
将以上组分加入200μl的pcr管中混合均匀，低速离心后放入pcr仪中按以下程序进行扩增：
[0083]
95℃,3min；
[0084]
95℃,15s；52℃,15s；72℃,45s，30个循环；
[0085]
72℃,5min。
[0086]
将pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示，将目的大小条带切胶回收。
[0087]
实施例2基因schomt7的表达载体构建
[0088]
2.1扩增带同源臂的schomt7片段
[0089]
以带同源臂的引物schomt7-pet28a-f/r对schomt7片段进行扩增。扩增体系与程序如实施例1所示。
[0090]
2.2同源重组构建表达载体
[0091]
2.2.1载体双酶切
[0092]
载体pet28a用bamh i与xho i进行酶切，酶切体系如下：
[0093][0094][0095]
酶切在37℃水浴反应30min。酶切产物加10
×
加样缓冲液(loading buffer)终止反应后进行琼脂糖凝胶电泳并选择合适的条带进行胶回收，胶回收方法同上，不再赘述。
[0096]
2.2.2同源重组、转化及阳性验证
[0097]
带同源臂的目的片段与酶切后的载体pet28a用同源重组试剂盒连接，体系如下：
[0098][0099]
将上述组分充分混匀后，37℃反应30min，立即置于冰上冷却。连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态。-80℃保存的大肠杆菌dh5α感受态细胞取出后置于冰上解冻，加入全部连接产物，轻轻吹打混匀，于冰上放置30min；42℃水浴中热击45s后迅速置于冰上2min，加入500μl无抗lb培养基后于37℃培养箱振荡培养1h，取200μl转化液涂布于lb固体培养基(含100μg/ml卡那霉素抗性)上，37℃静置培养12h-16h。
[0100]
挑取单克隆进行菌落pcr验证阳性，能扩增出明亮且单一的目的大小条带为阳性单克隆，将阳性克隆送测序，取测序正确的单克隆存菌并提取schomt7-pet32a质粒。将构建好的原核表达载体质粒热击法转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，转化、筛选与鉴定方法同上，不再赘述。
[0101]
实施例3基因蛋白表达及酶活功能分析
[0102]
3.1schomt7重组蛋白原核表达
[0103]
(1)挑取菌株schomt7-pet28a-bl21阳性克隆接种于4ml含卡那霉素(kana)抗性的lb培养基中，在37℃，110rpm摇床震荡培养过夜。
[0104]
(2)将培养好的菌液按1:100的比例接于200ml含kana抗性的培养基中，相同条件下培养至od
600
≈0.5。在菌液中加入0.3mm iptg，于16℃，110rpm摇床里培养16-18h诱导目的蛋白表达。
[0105]
(3)收菌：将菌液离心5000rpm,5min后弃上清。
[0106]
(4)洗涤：按照菌量向离心管中加入适量的结合缓冲液(binding buffer)洗涤液，使菌体重悬，5,000rpm，离心5min，收集菌体，洗涤两次后加15～20ml结合缓冲液(binding buffer)重悬菌体。
[0107]
(5)裂解：将菌液置于冰水混合物中，超声裂解菌体，4℃12,000rpm，离心20min后收集上清即为粗酶。
[0108]
3.2schomt7粗酶的功能验证
[0109]
schomt7进行体外酶活功能鉴定，以加入pet28a蛋白的反应体系为对照组。底物有前戈米辛、戈米辛j及戈米辛k1。酶活反应体系如下：
[0110][0111]
混匀上述组分，置于30℃反应过夜后，加50μl的甲醇终止反应，12,000rpm离心30min后取上清，采用hplc进行酶活反应分析。
[0112]
结果如图2所示，与空白对照相比，schomt7可以催化双苄基丁烷型木脂素前戈米辛生成相应产物。
[0113]
3.3schomt7重组蛋白的纯化及功能验证
[0114]
重组蛋白的表达如3.1所述，破碎菌液的上清进行过柱纯化，留部分上清液准备sds-page，以观察蛋白表达情况。
[0115]
(1)分离：将收集的上清加入平衡过的ni-nta柱子中，待上清流完，加入一柱体积的洗脱液(含有20mm咪唑)洗掉杂蛋白，然后用5ml洗脱缓冲液(elution buffer)(含咪唑浓度为250mm)收集目的重组蛋白。
[0116]
(2)超滤：将洗脱下的蛋白液置于蛋白分子为30,000da规格的超滤管中，4,000rcf离心10min，并加入结合缓冲液(binding buffer)换液2-3次，然后浓缩目的蛋白。
[0117]
(3)将浓缩液吸取至2ml收集管中，测定蛋白浓度，并留样。
[0118]
(4)蛋白加10％甘油后，用液氮速冻并保存至-80℃冰箱备用。
[0119]
结合缓冲液(binding buffer)：分别称取2.42g tris-hcl、29.22g nacl，加水溶解，调ph8.0，定容至1000ml，灭菌后加入70μlβ-巯基乙醇，4℃保存。
[0120]
洗脱缓冲液(elution buffer)：分别称取2.42g tris-hcl、29.22g nacl、34gimidazole，加水溶解，调ph8.0，定容至1000ml，灭菌后加入70μlβ-巯基乙醇，4℃保存。
[0121]
纯化蛋白的活性验证如3.2所述，采用lc-ms进行酶活反应分析。结果如图3所示，经过纯化schomt7能高效地催化前戈米辛，且产生的产物分子量为加了一个甲基的分子量。
[0122]
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。

技术特征：
1.一种多肽分子，其氨基酸序列选自：(a)seq id no.2；(b)seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列；以及(c)(a)或(b)的截短体；其中，所述多肽分子具有催化木脂素酚羟基甲基化的活性。2.根据权利要求1所述的多肽分子，其中所述木脂素为双苄基丁烷型木脂素。3.根据权利要求2所述的多肽分子，所述木脂素为前戈米辛(pregomisin)。4.一种多核苷酸分子，其编码如权利要求1-3任一所述的多肽分子，所述多核苷酸分子选自：(a)seq id no.1；(b)与seq id no.1具有80％以上同源性的核酸序列；以及(c)(a)或(b)的截短体。5.一种重组载体，包括：如权利要求4所述的多核苷酸分子；以及表达载体。6.一种融合细胞，包括：如权利要求5所述的重组载体；以及表达细胞。7.一种制备用于催化双苄基丁烷型木脂素甲基化修饰的蛋白质的方法，包括：将如权利要求4所述的核酸分子转化入表达细胞；在表达细胞内表达所述多肽分子的蛋白质；以及纯化所述多肽分子的蛋白质。8.如权利要求1-3任一所述的多肽分子在催化双苄基丁烷型木脂素甲基化修饰方面的应用。9.五味子木脂素化合物d(schisandrathera d)的制备方法，所述方法包括：利用以下群组中的一者或多者催化前戈米辛(pregomisin)：如权利要求1-3任一所述的多肽分子；如权利要求4所述的核酸分子编码的多肽分子；如权利要求5所述的重组载体表达的多肽分子；如权利要求6所述的融合细胞获得的多肽分子；以及如权利要求7所述的方法制备的多肽分子。10.如权利要求9所述的方法制备的五味子木脂素化合物d(schisandrathera d)。

技术总结
本发明涉及一种多肽分子，其氨基酸序列选自：(A)SEQ ID NO.2；(B)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列；以及(C)(A)或(B)的截短体；其中，所述多肽分子具有催化木脂素甲基化修饰的活性。本申请的木脂素氧甲基转移酶可特异性催化双苄基丁烷型木脂素。双苄基丁烷型木脂素多样的甲基化修饰为其他环化木脂素的生成提供了更多的底物选择，研究结果为药用活性木脂素的合成生物学研究提供候选基因，对阐明化合物结构多样性的形成机制、活性分子开发等具有重要的实际应用意义。发等具有重要的实际应用意义。发等具有重要的实际应用意义。


技术研发人员：刘久石 刘海涛 李斌 熊睿琳 强亭燕
受保护的技术使用者：中国医学科学院药用植物研究所
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/8/21