一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳的制备方法与用途

1.本发明涉及海洋生物医用材料领域，具体涉及一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳制剂的方法与用途。


背景技术：

2.藻蓝胆素(phycocyanobilin，pcb)，是存在于蓝藻中的一种捕光色素，具有线性四吡咯结构，分子量为586.7。在蓝藻中，藻蓝胆素通过硫醚键与藻蓝蛋白亚基共价结合。藻蓝胆素与其它藻胆素功能相似，在光合作用中起吸收光能及传递能量的作用。
3.除了捕光功能外，藻蓝胆素已经被国内外大量文献证明具有优异的抗氧化和抗炎特性。研究表明，藻蓝胆素可以去除受损神经细胞中的自由基，避免dna氧化损伤，防止自由基引起的神经细胞凋亡；并且能够抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)氧化酶的活性，从而有助于预防和治疗受损组织中由nadph氧化酶引起的疾病。此外，藻蓝胆素还具有抗炎作用，其可通过抑制炎症信号通路降低促炎因子的产生。由于藻蓝胆素的上述生物活性，有望成为治疗动脉粥样硬化、多发性硬化症(ms)、缺血性中风(is)和干预脑卒中保护神经损伤等各种疾病的新型有效药物。
4.但是，由于藻蓝胆素的特殊结构，导致藻蓝胆素对光、热、氧敏感，易发生降解或异构化。并且藻蓝胆素难溶于水，而易溶于脂类。藻蓝胆素的不稳定性和脂溶性使其在水溶液体系中的应用受到严重限制。将藻蓝胆素制成微乳液制剂，提高其稳定性和水溶性，将有利于藻蓝胆素的进一步开发和应用。
5.微乳(microemulsion，me)是由油、水、表面活性剂和助表面活性剂按比例混合后自发形成的热力学稳定的分散体系。通常呈透明或半透明状液体，具有丁达尔效应。微乳的主要性质评价指标为载水量、粒径和稳定性。


技术实现要素：

6.本发明是为了改善藻蓝胆素的稳定性和水溶性，利用经济易得、无毒的原料作为基质，提供了一种稳定性高，增溶性好的藻蓝胆素微乳制剂的制备方法。相较于传统微乳，本发明提供的藻蓝胆素微乳剂是利用超声匀质法制备，以琼脂糖作为修饰稳定剂，具有粒径小、稳定性强的特点；并且使用非离子表面活性剂和助表面活性剂复配为乳化剂，在油脂与乳化剂的协同作用下实现藻蓝胆素的高效溶解，提高了微乳剂中藻蓝胆素含量及稳定性。
7.本发明是通过以下技术方案实现的，一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳液制剂，其包括以下组分：藻蓝胆素0.1～5wt％，琼脂糖0.01～0.1wt％，油脂2～10wt％，抗氧化剂0～2wt％，表面活性剂13～60wt％，助表面活性剂13～59wt％，其余为去离子水。
8.本发明中，藻蓝胆素可以为化学合成法、蓝藻天然提取法或者生物发酵法制备的基因重组藻蓝胆素；油脂可以为棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯；抗氧化剂可以
为抗环血酸；表面活性剂可以为聚氧乙烯蓖麻油el、peg-40氢化蓖麻油、tween类非离子表面活性剂或其复配表面活性剂；助表面活性剂可以为无水乙醇、1,2-丙二醇、正丁醇、二乙二醇单乙基醚transcutol hp或者上述混合物。
9.一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳的方法与用途，其特征在于包括以下步骤：
10.(1)将微乳液组分中的油相成分加热得到熔融的油相溶液；
11.(2)将微乳液组分中的表面活性剂与助表面活性剂水浴加热搅拌至形成均一稳定的乳化剂相溶液；
12.(3)将乳化剂相溶液加入油相中搅拌至溶液混合均匀后，加入藻蓝胆素，超声使藻蓝胆素完全溶解，得到藻蓝胆素、油、乳化剂混合溶液；
13.(4)将微乳液组分中的琼脂糖加入水中，加热至95℃使琼脂糖完全溶解，获得水相溶液；
14.(5)向(3)中藻蓝胆素混合溶液加入冷却后的水相溶液，超声匀质处理10～1000s至蓝色透明即可。
15.本发明提供的一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳制剂，通过微乳液中乳化剂形成的界面膜对藻蓝胆素油滴包埋，在以琼脂糖交联作用修饰的水介质中将藻蓝胆素与氧气进行隔绝，不仅可以有效提高藻蓝胆素的水溶性，而且还能有效提高藻蓝胆素稳定性。因此，该微乳液不仅能够维持藻蓝胆素自身较高的抗氧化能力，而且能够有效的应用于水溶液体系中，有利于藻蓝胆素作为抗氧化剂、抗炎活性成分等领域的应用研究。
附图说明
16.图1为实施例1的含藻蓝胆素微乳剂粒径的分布图。
17.图2为实施例2的含藻蓝胆素微乳剂经离心和4℃处理的粒径分布图。
18.图3为实验例1的增溶实验对藻蓝胆素微乳剂粒径影响图。
19.图4为实验例2的含藻蓝胆素微乳剂对dpph清除率的变化图。
20.图5为摘要附图。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图、实施例和实验例，对本发明进一步详细说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
22.实施例
23.实施例1：各组分质量百分比如表1所示。
24.表1：各组分含量单位为wt％
25.成分含量肉豆蔻酸异丙酯3.1藻蓝胆素0.5聚氧乙烯蓖麻油14无水乙醇14琼脂糖0.02
去离子水余量
26.制备方法：
27.将肉豆蔻酸异丙酯加热至40℃，得到流动性好的油相溶液；
28.将聚氧乙烯蓖麻油加热至40℃后，加入等量无水乙醇，室温下迅速搅拌成无色透明液体，得到乳化剂相溶液；
29.将上述乳化剂相溶液加至油相溶液中，搅拌至均匀后，加入藻蓝胆素，通过超声使藻蓝胆素完全溶解；
30.将琼脂糖加入去离子水中加热至95℃，使琼脂糖完全溶解，冷却至室温；
31.将琼脂糖水溶液加入到油相-乳化剂-藻蓝胆素混合成的均匀溶液中，超声匀质得到藻蓝胆素微乳液。
32.制备好的藻蓝胆素微乳液，澄清透明，呈现为蓝色透明液体。通过动态光散射仪测得平均粒径为27.11nm，pdi为0.322。证明所制备的微乳液粒径小，符合微乳粒径特征，并且分散度好，粒径分布均匀。图1为该藻蓝胆素微乳剂粒径分布情况。
33.实施例2：各组分质量百分比如表2所示。
34.表2：各组分含量单位为wt％
35.成分含量棕榈酸异丙酯4藻蓝胆素0.5聚氧乙烯蓖麻油20无水乙醇25琼脂糖0.02去离子水余量
36.制备方法：
37.将棕榈酸异丙酯使用55℃水浴加热为流动性强的液态油，得到熔融的油相溶液；
38.将聚氧乙烯蓖麻油通过水浴加热至45℃，加入无水乙醇，迅速搅拌成无色透明液体，得到乳化剂相溶液；
39.将上述乳化剂相溶液加至油相溶液中，搅拌至均匀后，加入藻蓝胆素，通过震荡或超声使藻蓝胆素完全溶解；
40.将琼脂糖加入去离子水中加热至95℃，使琼脂糖完全溶解，冷却至室温；
41.将琼脂糖水溶液加入到油相-乳化剂-藻蓝胆素混合成的均匀溶液中，超声匀质得到藻蓝胆素微乳液。
42.上述藻蓝胆素微乳液，经过8000rpm离心30min，未发生分层现象，经离心处理后的藻蓝胆素微乳液平均粒径为34.21nm，pdi为0.483；经4℃冷藏7天，微乳液未产生浑浊现象，冷藏处理后的藻蓝胆素微乳液平均粒径为32.61nm，pdi为0.415。表明该微乳体系具有良好的稳定性。经离心和4℃冷藏后测得粒径分布图如图2所示。
43.实施例3：各组分质量百分比如表3所示。
44.表3：各组分含量单位为wt％
45.成分含量棕榈酸异丙酯3
藻蓝胆素0.5氢化蓖麻油20无水乙醇20琼脂糖0.02去离子水余量
46.制备方法：
47.将棕榈酸异丙酯使用55℃水浴加热为流动性强的液态油，得到熔融的油相溶液；
48.将氢化蓖麻油使用55℃水浴加热为流动性强的液态油，常温下加入无水乙醇，迅速搅拌成无色透明液体，得到乳化剂相溶液；
49.将上述乳化剂相溶液加至油相溶液中，搅拌至均匀后，加入藻蓝胆素，通过震荡或超声使藻蓝胆素完全溶解；
50.将琼脂糖加入去离子水中加热至95℃，使琼脂糖完全溶解，冷却至室温；
51.将琼脂糖水溶液加入到油相-乳化剂-藻蓝胆素混合成的均匀溶液中，超声匀质得到藻蓝胆素微乳液。
52.取上述1ml藻蓝胆素微乳液，加去离子水稀释至10ml，室温下静置24h，未见油滴和藻蓝胆素析出，表明该藻蓝胆素微乳液包封效果好，有效提高了藻蓝胆素在水溶液中的溶解性和稳定性。
53.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
54.试验例
55.实验例1：在室温下对藻蓝胆素进行溶解度测定。其测定方法如下：
56.1.取足量藻蓝胆素加入2ml去离子水中，使其充分溶解后，通过8000rpm离心10min，分别取1ml藻蓝胆素上清溶液和1ml去离子水通过五位天平进行称重，重复三次，计算得到1ml去离子水中藻蓝胆素含量。
57.2.按照实施例1的方法配制乳化剂，加入油相混合后添加足量藻蓝胆素，通过超声使其溶解，通过8000rpm离心10min后，取上清加入琼脂糖水溶液，超声匀质90s使其微乳化，确定无藻蓝胆素析出后备用；同时按照同样条件制备未添加藻蓝胆素的空白微乳剂。分别取1ml藻蓝胆素微乳剂和1ml空白微乳剂通过五位天平进行称重，重复三次，计算得到1ml藻蓝胆素微剂中的藻蓝胆素含量。
58.结果显示，藻蓝胆素在去离子水中基本不溶解，1ml去离子水在室温下藻蓝胆素的溶解量约为1.19
±
0.35mg，而1ml藻蓝胆素微乳剂中藻蓝胆素含量高达96.04
±
5.92mg，约为去离子水中的80倍。因此，该微乳方法使藻蓝胆素在水环境中的溶解量得到较高提升。
59.实验例2：将上述实施例1～3所制得的微乳液分别进行载水量实验，其测定结果如图3所示，其测定方法如下：
60.1.取上述实施例1～3所制得的微乳液1ml，各稀释至10倍、20倍、50倍、80倍、100倍、150倍、200倍。
61.2.将稀释后的藻蓝胆素微乳室温静置10min后，观察微乳剂是否有藻蓝胆素和油滴析出，并通过动态光散射测定微乳粒径变化。
62.3.作为对照，取同质量藻蓝胆素加入与藻蓝胆素微乳同体积的水，
63.震荡混匀后，静置10min观察藻蓝胆素在水溶液中的溶解情况。
64.如图3所示，随着稀释倍数增大，三种微乳体系粒径呈现先减小再增大的趋势。当稀释至200倍时，实施例1、2、3三种微乳体系平均粒径分别为98.7nm、81.03nm、69.85nm。稀释后的微乳未见油滴和藻蓝胆素的析出，说明三种微乳体系增溶性好，载水量大。而藻蓝胆素水溶液不能完全溶解藻蓝胆素，并且静置后有藻蓝胆素吸附于管壁。因此，该藻蓝胆素微乳制备方法具有较大的载水量，藻蓝胆素的微乳化能有效解决藻蓝胆素在水溶液中难溶问题，提高了藻蓝胆素在水溶液环境中的稳定性。
65.实验例2：将上述实施例1～3所制得的微乳液通过室温避光保存，并进行dpph自由基清除率测定，其测定结果如图4所示，其测定方法如下：
66.1.准确称取dpph试剂3.5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2ml至100ml容量瓶中，摇匀得到浓度为0.0178mmol/l dpph贮备液，避光条件下置于4℃冰箱中备用。
67.2.吸取400μl藻蓝胆素微乳液和600μl 80％甲醇于ep管中作为对照液；吸取400μl藻蓝胆素微乳液和600μl dpph储备液于ep管中作为样本测定液；吸取400μl 80％甲醇和600μl dpph储备液于ep管中作为空白液。分别混匀后，于室温25℃避光静置30min后，4000rpm离心5分钟。
68.3.吸取对照液、样本测定液和空白液各800μl于比色皿中，使用无水乙醇进行校零，分别于517nm处测定吸光值，记作a
对照
、a
测定
和a
空白
。
69.4.按照下述公式计算样品中的dpph自由基清除率：
70.dpph自由基清除率(％)＝(1-(a
测定-a
对照
)/a
空白
)
×
100％
71.将上述实施例1～3中所制得的微乳液分别在第0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天时测定dpph自由基清除率，测定方法与上述方法相同，测定结果如图4所示。结果显示，在第七天时，实施例1、2、3中的藻蓝胆素微乳液的dpph清除率仍然保持在85％以上，且微乳液呈现为蓝色透明状态，未见藻蓝胆素和油滴的析出。因此，此方法制备的藻蓝胆素微乳液在室温下不仅可以保持稳定状态，且对藻蓝胆素的抗氧化活性保持有良好作用。

技术特征：
1.一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳液，其特征在于，主要包括以下组分：包括藻蓝胆素0.1～5wt％，琼脂糖0.01～0.1wt％，油脂2～10wt％，抗氧化剂0～2wt％，表面活性剂13～60wt％，助表面活性剂13～59wt％，其余为去离子水。2.根据权利要求1所述的一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳液的制备方法，其特征在所述的油相选用无毒、生物相容性好，且对藻蓝胆素溶解性好的油脂。3.根据权利要求1所述的一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳液，其特征在于使用的表面活性剂为非离子表面活性剂。4.根据权利要求1所述的一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳液，其特征在于所述助表面活性剂为既有亲水性也有亲油性的助表面活性剂。5.一种权利要求1-4中任一项所述琼脂糖修饰的含藻蓝胆素微乳液的制备方法，其特征在包括以下步骤：(1)将微乳液组分中的油相成分加热得到熔融的油相溶液；(2)将微乳液组分中的表面活性剂与助表面活性剂水浴加热搅拌至形成均一稳定的乳化剂相溶液；(3)将乳化剂相溶液加入油相中搅拌至溶液混合均匀后，加入藻蓝胆素，超声使藻蓝胆素完全溶解，得到藻蓝胆素、油、乳化剂混合溶液；(4)将微乳液组分中的琼脂糖加入水中，加热至95℃使琼脂糖完全溶解，获得水相溶液；(5)向(3)中藻蓝胆素混合溶液加入冷却后的水相溶液，超声匀质处理10～1000s至蓝色透明即可。6.根据权利要求5所述的一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳液的制备方法，其特征在所述的乳化剂相包括hlb值为6-18的非离子型表面活性剂和助表面活性剂，所述水相为0.01～0.1wt％的琼脂糖水溶液。7.根据权利要求1所述的一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳液，其特征在于所述微乳制剂具有良好的抗氧化活性和稳定性，可用于食品或生物医药领域。

技术总结
本发明提供了一种琼脂糖修饰的富含藻蓝胆素稳定性微乳制剂的制备方法与用途，该方法可以显著提高藻蓝胆素在亲水相体系中的溶解性和稳定性，同时具有工艺简单、成本低等特点。相较于传统微乳剂，该富含藻蓝胆素稳定性微乳液以琼脂糖作为修饰性稳定剂，利用超声匀质法制备了粒径小、稳定性强的含藻蓝胆素微乳剂；且该微乳剂使用非离子表面活性剂和助表面活性剂复配为乳化剂，在油脂与乳化剂的协同作用下实现藻蓝胆素的高效溶解，提高了微乳剂中藻蓝胆素含量。该微乳液制剂可以使藻蓝胆素在水溶液中稳定均匀分散，解决了藻蓝胆素在水溶液中溶解度差和不稳定的问题。因此，该藻蓝胆素微乳体系可以进一步提高生物利用率，以满足不同的生产需求。同的生产需求。同的生产需求。


技术研发人员：葛保胜 郭宏达 孙海翔 秦松 李文军 陈鑫 张晓婧 P
受保护的技术使用者：中国科学院烟台海岸带研究所 永州中古生物技术有限公司
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/8/21