一种链霉菌0728-27及其应用的制作方法

1.本发明涉及环境治理微生物领域，具体涉及一种链霉菌0728-27及其应用。


背景技术：

2.藻类物质在水产养殖中起着初级生产力的作用，为鱼虾等提供了溶解氧以及一定的养分。但藻类迅速繁殖将引起赤潮，是全球性的海洋自然灾害之一。过去几十年，赤潮对渔业、生态系统以及公众健康，带来了严重的负面影响，也很严重的影响了人类的生活质量。
3.为了调控赤潮，多种措施已被用于解决赤潮问题。这些措施包括化学、物理和生物学方法。化学方法中，通常利用金属、除草剂和其他化学品来控制赤潮；物理方法通常利用膜过滤技术、吸附等技术。然而，物理和化学法在实际应用中显现出了一些不足。例如物理方法中的絮凝法需要较大的剂量才能起到抑制的效果，这在一定程度上增加了操作的难度和成本的投入。同时由于物理法对藻类没有彻底去除，藻类的后期可能再次爆发。一些化学方法如杀藻剂，在杀灭藻类的同时，也给其它生物带来了直接或间接的危害，容易造成二次污染而且容易对水生生物和人类造成毒性。
4.对藻类有调控作用的微生物，作为水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分。无毒、高效、专一性强的微生物治理有害藻华越来越引起更多研究者的注意。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种链霉菌0728-27及其应用。
6.本发明第一目的在于提供一种自主筛选的具有高抑藻活性的streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株，分类命名为streptomyces tirandamycinicus，该菌株已于2022年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25118，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7.本发明所述的streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株是从防城港区域海水中分离纯化获得的原始菌株，所述的streptomyces tirandamycinicus0728-27的筛选方法包括以下步骤：
8.(1)取防城港区域海水，采用无菌水对海水进行梯度稀释：101、102、103、104、105、106，每个梯度稀释液取0.1ml涂布在固体培养基上，30℃培养5-7天。
9.(2)挑取不同菌落，划线于新鲜固体培养基上，置于30℃培养3-5天。观察分离菌落是否纯化。若有杂菌，重复该步骤直至纯培养。
10.(3)将上述纯化后的菌株接种于液体培养基中，50-100rpm,30℃振荡培养3-5天。
11.(4)取1ml上述菌液接种于20ml指数生长的无菌球形棕囊藻培养液中，于20
±
1℃，12h光照,12h黑暗，2400lux光照强度条件下，培养2天，液体培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行，检测叶绿素a含量，判断藻细胞的数量，从而筛选出有抑藻活性的streptomyces tirandamycinicus0728-27。
12.根据本发明实施方案，所述固体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml。
13.根据本发明实施方案，所述液体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
14.本发明的第二目的在于提供一种streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株在球形棕囊藻治理中的应用。具体将streptomyces tirandamycinicus0728-27进行发酵培养得到streptomyces tirandamycinicus0728-27菌液，分离提取上清液并将所述发酵上清液应用于球形棕囊藻治理；所述上清液中streptomyces tirandamycinicus菌株分泌的活性物质分子量小于300。
15.本发明第三目的在于提供一种streptomyces tirandamycinicus0728-27上清液的制备方法，包括以下步骤：
16.将菌株streptomyces tirandamycinicus0728-27接入固体培养基中进行活化，培养温度为30-35℃，静置培养3-7d；活化后的斜面菌株接入一级种子培养基中，进行一级种子扩大培养，培养温度为30-35℃，转速100-200rpm，培养3-7d；按1％的接种量将一级种子液转接至发酵培养基，30-35℃，转速50-100rpm，培养3-7d，得到发酵液；将发酵液0～5℃3000-5000rpm离心10～20min，上清液经过0.2μm滤膜过滤后得到无菌上清液。
17.根据本发明实施方案，所述固体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml。
18.根据本发明实施方案，所述一级种子培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
19.根据本发明实施方案，所述发酵培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.本发明提供了一种具有抑藻活性菌株的制备方法，接种斜面菌种至新的培养基，经培养后，获得streptomyces tirandamycinicus0728-27的发酵液。经过离心及过滤处理，发酵上清液也具有明显抑藻作用，且发酵液中抑藻物质属于极性物质。因此发酵液及上清液均可应用于水体富营养化抑制藻类爆发领域。
22.本发明的streptomyces tirandamycinicus0728-27作为一种基本菌株，成本低廉；发酵液中的抑藻物质可开发成制剂。发酵液或其中的抑藻物质均采用天然生物材料，环境亲和性强，使用中无二次污染，有利于实际应用，为利用生物方法处理水体藻华问题提供新的方法和方向。
附图说明
23.图1为本发明多株streptomyces tirandamycinicus菌株抑藻效率对比图。
24.图2为本发明streptomyces tirandamycinicus菌种在固体培养基上形态。
25.图3为streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株发酵液不同处理方式的抑藻效果。
26.图4为streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株发酵上清液用不同有机试剂处理后的抑藻效果。
27.图5为streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株发酵上清液不同透析袋处理后的抑藻效果。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
29.实施例1：
30.1、菌株的筛选
31.(1)取防城港区域的海水样品10ml，溶解于湿热灭菌后的90ml无菌水中，混匀。采用无菌水对海水进行梯度稀释：101、102、103、104、105、106，每个梯度稀释液取0.1ml涂布在固体培养基上(培养基配方为：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml)，30℃培养5-7天。
32.(2)挑取不同菌落，划线于新鲜固体培养基上(培养基配方为：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml)，置于30℃培养3-5天。观察分离菌落是否纯化。若有杂菌，重复该步骤直至纯培养。
33.(3)将上述纯化后的菌株接种于液体培养基中(培养基配方为：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml)，50-100rpm，30℃振荡培养3-5天。
34.(4)取1ml上述菌液接种于20ml指数生长的无菌球形棕囊藻培养液中，于20
±
1℃，12h光照，12h黑暗，2400lux光照强度条件下，培养2天，液体培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行，检测叶绿素a含量，计算抑藻率。
35.筛选出抑藻活性的最高的菌株为streptomyces tirandamycinicus 0728-27，如图1所示。多株菌株通过抑制藻测试，结果显示，菌株0728-25、0728-26、0728-27、0728-28、0728-29均有一定抑藻作用，但0728-27菌株抑藻效率最高，达到87％。
36.2、菌种的鉴定
37.取上述抑藻效果最高的菌株0728-27，进行菌种鉴定。鉴定结果如下：孢子丝直，柔曲，钩状、紧密及松敞螺旋形；孢子圆形、柱形、椭圆；菌落呈白色如图2所示。
38.根据菌种的培养特征、显微特征、16srrna基因序列等实验数据综合分析，菌株的鉴定结果为：streptomyces tirandamycinicus。
39.所述streptomyces tirandamycinicus 0728-27的16s rrna序列如下(seq id no:1)：tcccttacgggttgggccaccggcttcgggtgttaccgactttcgtgacgtgacggcggtgtgtacaagcgggaacgtattcaccgcagcaatgctgatctgcgattactagcgactccgacttcatggggtcgagttgcagaccccaatccgaactgagaccggcttttgagattcgctccacctcacggtatcgcagctcattgtaccggccattgtagcacgtgtgcagcccaagacataaggggcatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccgagttgaccccgcggtctcc
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40.实施例2：抑藻机理的探索
41.(1)将streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株接入固体培养基中进行活化，培养温度为30℃，静置培养5d。所述固体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml。
42.(2)活化后的菌株接入1l摇瓶中进行一级种子扩大培养，装液量为400ml，培养温度为30℃，转速100rpm，培养5d。所述一级种子培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
43.(3)按1％的接种量将一级种子液接入2l瓶中进行发酵培养，装液量为1.2l，培养温度为35℃，转速80rpm，培养5d，得到发酵液。所述发酵培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
44.(4)将发酵液4℃3000rpm离心10min。对照组发酵液用移液器吹打重悬；将上清液经过0.2μm滤膜过滤后得到无菌上清液，菌体采用无菌水重悬。
45.(5)取1ml上述三种溶液(发酵液、上清液及菌体重悬液)分别接种于20ml指数生长的球形棕囊藻培养液中，于20
±
1℃，12h光照，12h黑暗，2400lux光照强度条件下，培养2天，检测叶绿素a含量，计算抑藻率。
46.如附图3所示，菌体的抑藻类为8.5％，上清液抑藻率达到70％。实验结果显示，抑藻活性物质主要在发酵上清液中，streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株抑藻方式为间接抑藻。
47.实施例3：抑藻物质的分离
48.(1)将streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株接入固体培养基中进行活化，培养温度为30℃，静置培养5d。所述固体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml。
49.(2)活化后的菌株接入1l摇瓶中进行一级种子扩大培养，装液量为400ml，培养温度为30℃，转速100rpm，培养5d。所述一级种子培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。(3)按1％的接种量将一级种子液接入2l瓶中进行发酵培养，装液量为1.2l，培养温度为35℃，转速80rpm，培养5d，得到发酵液。所述发酵培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
50.(4)发酵液4℃3000rpm离心10min，上清液经过0.2μm滤膜过滤后得到无菌上清液。将2ml上清液分别加入2ml乙酸乙酯、氯仿，混匀后静止分层，取水相进行抑藻测试。实验结果显示，乙酸乙酯的水相抑藻率为68％，氯仿的水相抑藻率也达60％，见图4。这表明streptomyces tirandamycinicus菌株分泌的活性物质即抑藻物质主要存在于水相中，属于极性物质。
51.实施例4：抑藻物质的分子量探索
52.(1)将streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株接入固体培养基中进行活化，培养温度为30℃，静置培养5d。所述固体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml。
53.(2)活化后的菌株接入1l摇瓶中进行一级种子扩大培养，装液量为400ml，培养温度为30℃，转速100rpm，培养5d。所述一级种子培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。(3)按1％的接种量将一级种子液接入2l瓶中进行发酵培养，装液量为1.2l，培养温度为35℃，转速80rpm，培养5d，得到发酵液。所述发酵培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
54.(4)将发酵液4℃3000rpm离心10min，上清液经过0.2μm滤膜过滤后得到无菌上清液。将2ml无菌上清液分别使用分子量为300、500、1000的透析袋中。随后透析袋放入纯化水中，4℃透析12小时。将透析袋中加入20ml藻培养液中，其中未经透析处理的无菌上清液为阳性对照，培养2天，取样测试抑藻效率。实验结果见图5，分子量300、500、1000透析袋内的溶液抑藻相比较于上清液抑藻效率大幅度下降。原因是菌株发酵后得到的上清液未经处理，上清液中的抑藻物质的含量较高，并且抑藻物质分子量较小。而不同分子量的透析袋，存在不同的孔径，透析袋内的活性物质可经过较大孔径的透析袋进入纯化水中，袋内的活性物质含量大幅度降低，抑藻活性液大幅度降低。实验结果显示，不同分子的透析袋内溶液的抑藻率均下降，其中，分子量300的透析袋内，抑藻活性也大幅度降低。这表明streptomyces tirandamycinicus分泌的活性物质分子量小于300。依据本次实验结果，可通过不同分子量的纳滤膜，将发酵液进行初步分离，得到纯度较高抑藻物质，较少储存体积且便于运输。

技术特征：
1.菌株streptomyces tirandamycinicus0728-27，其特征在于：分类命名为streptomyces tirandamycinicus，该菌株已于2022年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25118。2.如权利要求1所述streptomyces tirandamycinicus0728-27的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：取防城港区域海水，采用无菌水对海水进行梯度稀释：101、102、103、104、105、106，每个梯度稀释液取0.1ml涂布在固体培养基上，30℃培养5-7天；（2）挑取不同菌落，划线于新鲜固体培养基上，置于30℃培养3-5天；观察分离菌落是否纯化；若有杂菌，重复该步骤直至纯培养；（3）将上述纯化后的菌株接种于液体培养基中，50-100rpm,30℃振荡培养3-5天；（4）取1ml上述菌液接种于20ml指数生长的无菌球形棕囊藻培养液中，于20
±
1℃，12h光照,12h黑暗，2400lux光照强度条件下，培养2天，液体培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行，检测叶绿素a含量，判断藻细胞的数量，从而筛选出有抑藻活性的streptomyces tirandamycinicus0728-27。3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述固体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml。4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述液体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。5.如权利要求1所述的streptomyces tirandamycinicus0728-27菌株在球形棕囊藻治理中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将streptomyces tirandamycinicus0728-27进行发酵培养得到streptomyces tirandamycinicus0728-27菌液，分离提取上清液并将所述发酵上清液应用于球形棕囊藻治理；所述上清液中streptomyces tirandamycinicus菌株分泌的活性物质分子量小于300。7.一种制备权利要求6所述streptomyces tirandamycinicus0728-27上清液的方法，其特征在于，包括如下步骤：将菌株streptomyces tirandamycinicus0728-27接入固体培养基中进行活化，培养温度为30-35℃，静置培养3-7d；活化后的斜面菌株接入一级种子培养基中，进行一级种子扩大培养，培养温度为30-35℃，转速100-200 rpm，培养3-7 d；按1％的接种量将一级种子液转接至发酵培养基，30-35℃，转速50-100 rpm，培养3-7 d，得到发酵液；将发酵液0~5℃3000-5000rpm离心10~20min，上清液经过0.2μm滤膜过滤后得到无菌上清液。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述固体培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述一级种子培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基组成：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。

技术总结
本发明公开了一种链霉菌0728-27及其应用，所述的菌株Streptomyces tirandamycinicus0728-27由防城港海水中分离纯化获得原始菌株。经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定，分类命名为Streptomyces tirandamycinicus，保藏编号为CGMCC No.25118。本发明通过菌株Streptomyces tirandamycinicus0728-27液体发酵后的获得大量菌液，本发明的Streptomyces tirandamycinicus0728-27是高效抑藻微生物，具有较大的应用价值。具有较大的应用价值。具有较大的应用价值。


技术研发人员：王辉 裴嘉祺 汪辉
受保护的技术使用者：南京灿辰微生物科技有限公司
技术研发日：2022.11.30
技术公布日：2023/8/21