用于基因表达调节的非阴离子多核苷酸类似物的基于肽的转导的制作方法

用于基因表达调节的非阴离子多核苷酸类似物的基于肽的转导
1.本说明书涉及非阴离子多核苷酸类似物货物的细胞内递送。更具体地，本说明书涉及合成肽穿梭剂用于细胞内递送非阴离子多核苷酸类似物货物的用途。
2.本说明书引用了许多文献，将其内容通过引用以其整体并入本文。


背景技术：

3.大多数非阴离子多核苷酸类似物货物遭受与它们的细胞内递送相关的问题，经常需要它们与递送部分共价缀合，从而使它们的合成和商业化更加复杂。增加非阴离子多核苷酸类似物货物的胞质溶胶/细胞核递送的改善的方法是非常希望的。


技术实现要素：

4.合成肽穿梭剂表示一种最近定义的肽家族，其先前被报道为快速且高效地将蛋白质货物转导到许多种靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核中。与传统的基于细胞穿透肽的细胞内递送策略相反，合成肽穿梭剂不共价连接至其多肽货物。事实上，将穿梭剂共价连接至其货物通常对它们的转导活性有负面影响。wo/2016/161516中描述了第一代此类肽穿梭剂，其中所述肽穿梭剂包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作地连接的内体渗漏结构域(eld)。wo/2018/068135随后描述了基于一组十五个设计参数合理设计的其他合成肽穿梭剂，其唯一目的是改善蛋白质货物的转导，同时降低第一代肽穿梭剂的毒性。
5.虽然细胞穿透肽(cpp)已经在细胞内递送dna/rna的转染策略中使用了几十年，但含有源自cpp的cpd的第一代合成肽穿梭剂不能够高效地将质粒dna货物转导到细胞核中进行基因表达，其中dna货物大部分扔被捕获在内体中。随后的实验揭示了第二代合成肽穿梭剂也不适用于高效地将质粒dna转导到细胞核中进行基因表达。此外，涉及通过用带正电荷的小分子包被来中和dna/rna的带负电荷的磷酸骨架的策略未能显著改善穿梭剂介导的货物转导，内体捕获仍然是个问题。这表明穿梭剂介导的多核苷酸转导需要的不仅仅是电荷中和。
6.本公开文本涉及令人惊讶的发现，即合成肽穿梭剂具有快速且高效地将足够量的非阴离子多核苷酸类似物货物转导到胞质溶胶/细胞核隔室中以在真核细胞中进行基因表达修饰的能力。
7.在一方面，本文描述了一种组合物，所述组合物包含用于细胞内递送的非阴离子多核苷酸类似物货物和独立于或不共价连接至所述非阴离子多核苷酸类似物货物的合成肽穿梭剂，所述合成肽穿梭剂是包含具有带正电荷的亲水性外面和疏水性外面两者的两亲性α-螺旋基序的肽，其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，合成肽穿梭剂增加所述非阴离子多核苷酸类似物货物在真核细胞中的胞质溶胶/细胞核递送。
8.在又一方面，本文描述了一种用于修饰在真核细胞中的基因表达的方法，所述方法包括：(a)提供用于细胞内递送的非阴离子多核苷酸类似物货物，所述非阴离子多核苷酸类似物货物被设计成与所述真核细胞中的目的rna杂交；(b)提供独立于或不共价连接至所
述非阴离子多核苷酸类似物货物的合成肽穿梭剂；(c)在存在所述合成肽穿梭剂的情况下使所述真核细胞与所述非阴离子多核苷酸类似物货物接触，与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，所述合成肽穿梭剂的浓度足以增加所述电荷中性多核苷酸类似物货物的转导效率和/或胞质溶胶/细胞核递送，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物在胞质溶胶/细胞核递送后与所述目的rna杂交，从而实现基因表达修饰。
9.通用定义
10.提供标题和其他标识符(例如，(a)、(b)、(i)、(ii)等)只是为了便于阅读说明书和权利要求书。说明书或权利要求中的标题或其他标识符的使用不一定要求所述步骤或要素按字母或数字顺序或它们提供的顺序进行。
11.在权利要求书和/或说明书中，当与术语“包含(comprising)”连用时，词语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”的使用可以意指“一个/一种(one)”，但是它也与“一个/一种或多个/多种(one or more)”、“至少一个/一种(at least one)”和“一个/一种或超过一个/一种(one or more than one)”的含义一致。
12.当在本文中使用时，术语“约”指示某一数值包括为了测定所述值而采用的装置或方法的误差的标准偏差。通常，术语“约”意在指定至多10％的可能变动。因此，术语“约”包括某数值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的变化。除非另外指示，否则当在某范围之前使用术语“约”适用于所述范围的两端。
13.如本说明书和权利要求书中所用，词语“包含(comprising)”(和包含的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或是开放性的，且不排除
14.另外、未列举的要素或方法步骤。
15.如本文所用，“蛋白质”或“多肽”或“肽”意指任何肽连接的氨基酸链，其可以包含或可以不包含任何类型的修饰(例如，化学或翻译后修饰，如乙酰化、磷酸化、糖基化、硫酸化、苏素化、异戊二烯化、泛素化等)。为进一步清楚起见，设想了蛋白质/多肽/肽修饰，只要所述修饰不破坏本文所述穿梭剂的货物转导活性即可。例如，本文所述穿梭剂可以是线性或环状的，可以用一种或多种d-或l-氨基酸合成，和/或可以与脂肪酸缀合(例如，在其n末端)。本文所述穿梭剂的至少一个氨基酸还可以被相应的合成氨基酸替代，所述合成氨基酸具有生理化学特性(例如，结构、疏水性或电荷)与被替代氨基酸相似的侧链。
16.如本文所用，“结构域”或“蛋白质结构域”通常是指蛋白质的具有特定功能性或功能的部分。一些结构域在与蛋白质的其余部分分离时保留了它们的功能，因此可以以模块化方式使用。许多蛋白质结构域的模块化特征可以在其在本说明书的穿梭剂内的位置方面提供灵活性。然而，当在穿梭剂的某些位置(例如，在n末端或c末端区域，或在它们之间)进行工程化时，一些结构域可能表现更好。结构域在其内源性蛋白质中的位置有时指示了所述结构域应在穿梭剂内哪个位置进行工程化以及应使用哪种类型/长度的接头。鉴于本公开文本，技术人员可以使用标准的重组dna技术来操纵本说明书的穿梭剂内的结构域的位置和/或数量。此外，本文所公开的测定以及本领域已知的其他测定可以用于评估在穿梭剂的上下文中每个结构域的功能性(例如，其促进跨越质膜的细胞穿透、内体逃逸和/或进入
胞质溶胶的能力)。标准方法也可以用于评估穿梭剂的结构域是否影响有待于细胞内递送的货物的活性。就此而言，如本文所用的表述“可操作地连接”是指所述结构域在本说明书的穿梭剂的上下文中执行一种或多种其预期功能(例如，细胞穿透、内体逃逸和/或亚细胞靶向)的能力。为更清楚起见，表述“可操作地连接”意在定义两个或更多个结构域之间的功能连接，而不限于它们之间的特定顺序或距离。
17.如本文所用，在诸如“合成肽”、“合成肽穿梭剂”或“合成多肽”的表述中使用的术语“合成”旨在指可在体外产生(例如，化学合成和/或使用重组dna技术产生)的非天然存在的分子。各种合成制剂的纯度可以通过例如高效液相色谱分析和质谱法来评估。化学合成方法可能优于细胞表达系统(例如，酵母或细菌蛋白质表达系统)，因为它们可以排除对大量重组蛋白纯化步骤(例如，临床使用所需)的需要。相比之下，经由化学合成方法产生较长的合成多肽可能更复杂和/或成本更高，并且使用细胞表达系统可以更有利地产生此类多肽。在一些实施方案中，与由重组宿主细胞表达相对照，本说明书的肽或穿梭剂可以通过化学方法合成(例如，固相或液相肽合成)。在一些实施方案中，本说明书的肽或穿梭剂可以缺乏n末端甲硫氨酸残基。本领域技术人员可以通过使用一种或多种经修饰的氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸)或通过化学修饰本说明书的合成肽或穿梭剂来改变本说明书的合成肽或穿梭剂以适应稳定性的特殊需要或其他需要。
18.如本文所用，术语“独立”通常旨在是指这样的分子或药剂，其彼此不共价结合，或者可以经由可切割键瞬时共价连接，使得在施用后(例如，当暴露于还原性细胞环境和/或在细胞内递送之前、同时或之后不久)所述分子或药剂(例如，穿梭剂和货物)通过键的切割而彼此分离。例如，表述“独立的货物”旨在是指在跨越质膜转导时不与本说明书的穿梭剂共价结合(例如，不融合)的有待细胞内递送(转导)的货物。在一些方面，独立于(未融合至)货物的穿梭剂可能是有利的，因为它提供了增加的穿梭剂多功能性-例如，能够容易地改变穿梭剂与货物的比率(与受限于在穿梭剂与货物之间的共价键的情况下的固定比率形成对照)。在一些方面，从制造和/或管理的角度来看，经由可切割键将穿梭剂共价连接到其货物使得它们在与靶细胞接触时彼此分离可能是有利的。
19.如本文所用，表述“是或来自”或“来自”包括给定蛋白质或肽(例如，本文所述的穿梭剂)的功能变体或其结构域(例如，cpd或eld)，诸如保守氨基酸取代、缺失、修饰，以及不消除蛋白质结构域活性的变体或功能衍生物。
20.本说明书的其他目的、优点和特征将在阅读其具体实施方案的以下非限制性描述后变得更加明显，所述具体实施方案仅以举例方式参照附图而给出。
附图说明
21.在附图中：
22.图1示出了pmo-fitc货物经由第一代“基于结构域”和合理设计的合成肽穿梭剂在hela细胞中的细胞内递送，如通过流式细胞术所评估的。结果是从至少一式两份进行的实验计算出的平均值。
23.图2示出了合成肽穿梭剂fsd10将反义pmo转导到hela细胞的胞质溶胶中从而能够敲低gfp基因表达的能力，如通过流式细胞术所评估的。结果是从至少一式两份进行的实验计算出的平均值。
24.图3示出了合成肽穿梭剂fsd250转导靶向wnt1和gli1的反义pmo以敲低du145细胞中的gli1蛋白表达的能力，如通过蛋白质印迹所评估的。结果是从至少一式两份进行的实验计算出的平均值。
25.图4示出了合成肽穿梭剂fsd250转导靶向gli1的反义pmo以敲低du145细胞中的gli1蛋白表达的能力，如通过蛋白质印迹所评估的。结果是从至少一式两份进行的实验计算出的平均值。
26.图5示出了针对碘化丙啶(pi)和gfp-nls转导活性对候选肽穿梭剂的大规模筛选的结果。结果是从至少一式两份进行的实验计算出的平均值。
27.图6示出了针对碘化丙啶(pi)和/或gfp-nls转导活性对候选肽穿梭剂的进一步筛选的结果。结果是从至少一式两份进行的实验计算出的平均值。
28.图7示出了合成肽穿梭剂fsd250将反义pmo和pna转导在hela细胞中的能力。图7a示出了通过流式细胞术得到的细胞内递送的结果。图7b示出了通过流式细胞术得到的细胞活力的结果。结果是从至少一式两份进行的实验计算出的平均值。
29.图8示出了通过流式细胞术得到的裸dna(图8a)和rna(sgrna；图8b)对合成肽穿梭剂fsd250细胞内递送pmo的抑制作用的结果。
30.图9示出了与his-cm18-ptd4(第一代穿梭剂)相比，第二代合成肽穿梭剂fsd10和fsd250将反义pmo转导在rh-30细胞中的能力。图9a示出了通过流式细胞术得到的细胞内递送的结果。图9b示出了通过流式细胞术得到的细胞活力的结果。结果是从至少一式两份进行的实验计算出的平均值。
31.图10示出了与vivopmo-gli1相比，在用合成肽穿梭剂fsd250转导pmo-gli1后，rh-30细胞中gli1敲低的结果。图10a示出了针对gli1和gapdh(对照)的蛋白质印迹的结果。图10b示出了图10a的相应蛋白质印迹的密度测定术扫描分析的结果。
32.图11示出了与endoporter
tm
相比，合成肽穿梭剂fsd396将反义pmo转导在hela细胞中的能力。示出了未处理的(图11a)、pmo-fitc处理的(图11b)、pmo-fitc+fsd396(图11c)和pmo-fitc+endoporter(图11d)的代表性免疫荧光显微术图像。
33.图12示出了仅在用合成肽穿梭剂fsd250转导后，四种不同的靶向gli1的pmo在人du145细胞中敲低gli1的能力。示出了针对gli1和辅肌动蛋白(对照)的代表性蛋白质印迹和相应的密度测定术扫描分析。
34.图13示出了用合成肽穿梭剂fsd250将pmo-gli1转导到基底细胞癌型肿瘤外植体中的结果。示出了在用pmo-gli1-cy5和fsd250或仅pmo-gli1-cy5处理后，cy5(左)、cy5+dapi(细胞核染色；中)和cy5+dapi+nomarski(即，微分干涉显微术[dic])(右)的代表性荧光显微术图像。
[0035]
序列表
[0036]
本技术包含创建于2021年10月15日的呈计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过引用并入本文。
[0037]
[0038]
[0039]
具体实施方式
[0040]
在一些方面，本文描述了用于非阴离子多核苷酸类似物货物转导的组合物和方法。所述方法通常包括使靶真核细胞与包含非阴离子多核苷酸类似物货物和独立于或不共价连接至所述非阴离子多核苷酸类似物货物的合成肽穿梭剂的组合物接触，其中合成肽穿梭剂增加所述非阴离子多核苷酸类似物货物在真核细胞中的胞质溶胶/细胞核递送。
[0041]
非阴离子多核苷酸类似物货物
[0042]
在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以是电荷中性或阳离子的反义合成寡核苷酸(aso)。在一些实施方案中，所述aso可以是电荷中性或阳离子的剪接转换寡核苷酸(sso)。在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以是具有磷酸二酰胺骨架、酰胺(例如，肽)骨架、甲基膦酸酯骨架、中性磷酸三酯骨架、砜骨架或三唑骨
架的电荷中性多核苷酸类似物货物。在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以是具有氨基烷基化氨基磷酸酯骨架、胍鎓骨架、s-甲基硫脲骨架或核苷基氨基酸(naa)骨架的阳离子多核苷酸类似物货物。在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(pmo)、肽核酸(pna)、甲基膦酸酯寡聚物、或短干扰核糖核酸中性寡核苷酸(sirnn)。在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以是5至50聚体、5至75聚体、或5至100聚体。在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物不共价连接至细胞穿透肽、八胍树枝状聚合物、或其他细胞内递送部分。在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物是细胞膜不可渗透的或具有低膜渗透性(例如，由于货物的物理化学特性，阻止其自由扩散跨越细胞膜)，其中本文所述的肽穿梭剂促进或增加其细胞内递送和/或进入胞质溶胶/细胞核。在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以是细胞膜可渗透的货物，其中本文所述的肽穿梭剂仍然增加其细胞内递送和/或进入胞质溶胶。在一些实施方案中，与仅施用货物相比，本文所述的肽穿梭剂可以降低有待施用以实现其预期生物效应所需的货物的量或浓度。
[0043]
在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以是用于治疗修饰治疗相关靶rna的基因表达的任何疾病或病症的药物。在一些实施方案中，所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以是用于治疗癌症(例如，皮肤癌、基底细胞癌、痣样基底细胞癌综合征)、炎症或炎症相关疾病(例如，银屑病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、荨麻疹、干眼病、干性或湿性年龄相关性黄斑变性、指溃疡、光线性角化病、特发性肺纤维化)、疼痛(例如，慢性或急性)或影响肺的疾病(例如，囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)或特发性肺纤维化)的药物。
[0044]
在一些实施方案中，本文所述的非阴离子多核苷酸类似物货物可以是剪接转换寡核苷酸(sso)，例如用于校正或修饰治疗相关靶mrna的剪接。在一些实施方案中，所述靶mrna可以是囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cftr)，并且本文所述的组合物或方法可以用于治疗囊性纤维化(例如，通过施用于囊性纤维化受试者的肺)。就此而言，合成肽穿梭剂已显示能够将重组蛋白货物高效地递送至难治性气道上皮细胞(krishnamurthy等人,2018)。
[0045]
在一些实施方案中，本文所述的非阴离子多核苷酸类似物货物不共价连接至细胞穿透或阳离子肽、八胍树枝状聚合物、或其他细胞内递送部分。已例如用于肽缀合的磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(ppmo)和vivo-morpholino的此类常规递送策略为pmo的合成过程增加了另一层复杂性。相反，本文所述的合成肽穿梭剂可以有利地转导未经修饰或“裸”的非阴离子多核苷酸类似物货物，极大地促进了制造和配制。
[0046]
合理的设计参数和肽穿梭剂
[0047]
在一些方面，本文所述的穿梭剂可以是具有非阴离子多核苷酸类似物货物、蛋白质货物或两者在靶真核细胞中的转导活性的肽。在一些实施方案中，本文所述的穿梭剂优选地满足以下十五个合理设计参数中的一个或多个或任何组合。
[0048]
(1)在一些实施方案中，所述穿梭剂是长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的肽。例如，所述肽可以包含17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基的最小长度，以及35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个氨基酸残基的最大长度。在一些实施方案中，较短的肽(例如，在17-50或20-50个氨基
酸范围内)可能是特别有利的，因为它们可以更容易通过化学合成方法进行合成和纯化，这可能更适合于临床使用(与重组蛋白形成对照，其必须从细胞表达系统纯化)。虽然本说明书中的数字和范围通常作为5的倍数列出，但是本说明书不应受此限制。例如，在本说明书中描述的最大长度应该被理解为还包括56、57、58
……
61、62等的长度，并且本文的非列举仅仅是为了简洁起见。同样的推理适用于本文列出的同一性％。
[0049]
(2)在一些实施方案中，所述肽穿梭剂包含在中性ph下的两亲性α-螺旋基序。如本文所用，除非另有说明，否则表述“α-螺旋基序”或“α-螺旋”是指在连续氨基酸之间的旋转角为100度的右手式卷曲或螺旋构象(螺旋)和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋。如本文所用，表述“包含α-螺旋基序”或“两亲性α-螺旋基序”等是指这样的三维构象，其是当在生物环境中时基于所述肽的一级氨基酸序列预测本说明书的肽(肽的区段)所采用的构象，不论所述肽在细胞中用作穿梭剂时实际上是否采用该构象。此外，本说明书的肽可以在肽的不同位置处包含一个或多个α-螺旋基序。例如，预测wo/2018/068135中的穿梭剂fsd5在其整个长度上采用一个α-螺旋(参见wo/2018/068135的图49c)，而预测wo/2018/068135的穿梭剂fsd18包含朝向肽的n和c末端区域的两个分隔开的α-螺旋(参见wo/2018/068135的图49d)。在一些实施方案中，预测本说明书的穿梭剂不包含β-折叠基序，例如如wo/2018/068135的图49e和图49f所示。预测蛋白质和肽中α-螺旋和β-折叠存在的方法是本领域熟知的。例如，一种这样的方法基于使用pep-foldtm的3d建模，其是用于从头肽结构预测的在线资源(http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/pep-fold/)(lamiable等人,2016；shen等人,2014；th
é
venet等人,2012)。预测肽和蛋白质中α-螺旋存在的其他方法是已知的并且容易为技术人员所用。
[0050]
如本文所用，表述“两亲性”是指具有疏水性和亲水性元件的肽(例如，基于包含肽的氨基酸的侧链)。例如，表述“两亲性α-螺旋”或“两亲性α-螺旋基序”是指基于形成螺旋的氨基酸侧链的特性，预测采用具有非极性疏水性面和极性亲水性面的α-螺旋基序的肽。
[0051]
(3)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂包含具有带正电荷的亲水性外面的两亲性α-螺旋基序，诸如富含r和/或k残基的外面。如本文所用，表述“带正电荷的亲水性外面”是指基于α-螺旋轮投影，存在至少三个赖氨酸(k)和/或精氨酸(r)残基聚集在两亲性α-螺旋基序的一侧(例如，参见wo/2018/068135的图49a，左图)。可以使用多种程序(诸如由don armstrong和raphael zidovetzki创造的在线螺旋轮投影工具)来准备此类螺旋轮投影。(例如，可访问：https://www.donarmstrong.com/cgi-bin/wheel.pl)或由m
ó
l等人,2018开发的在线工具(例如，可访问http://lbqp.unb.br/netwheels/)。在一些实施方案中，所述两亲性α-螺旋基序可以包含带正电荷的亲水性外面，基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋，所述带正电荷的亲水性外面包含：(a)在螺旋轮投影时至少两个、三个或四个相邻的带正电荷的k和/或r残基；和/或(b)在螺旋轮投影时包含三至五个k和/或r残基的六个相邻残基的区段。
[0052]
在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂包含两亲性α-螺旋基序，其包含疏水性外面，基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋，所述疏水性外面包含：(a)在螺旋轮投影时至少两个相邻l残基；和/或(b)在螺旋轮投影时包含选自l、i、f、v、w和m的至少五个疏水性残基的十个相邻残基的区段。
[0053]
(4)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂包含两亲性α-螺旋基序，其具有由空
间上相邻的高疏水性残基(例如l、i、f、v、w和/或m)构成的高疏水性核心。在一些实施方案中，基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示，所述高疏水性核心可以由空间上相邻的l、i、f、v、w和/或m氨基酸组成，排除任何富含组氨酸的结构域时计算出所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12％至50％(参见下文)，如wo/2018/068135的图49a的右图所示。在一些实施方案中，所述高疏水性核心可以由空间上相邻的l、i、f、v、w和/或m氨基酸组成，所述氨基酸占所述肽的氨基酸的从12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％至25％、30％、35％、40％或45％。更具体地，高疏水性核心参数可以通过首先以开放圆柱形表示排列肽的氨基酸，然后描绘连续的高疏水性残基(l、i、f、v、w、m)的区域来计算，如wo/2018/068135的图49a右图所示。然后将该描绘的高疏水性核心中包含的高疏水性残基的数量除以肽的总氨基酸长度，排除任何富含组氨酸的结构域(例如，富含n末端和/或c末端组氨酸的结构域)。例如，对于wo/2018/068135的图49a中所示的肽，在描绘的高疏水性核心中存在8个残基，并且所述肽中总共25个残基(排除末端12个组氨酸)。因此，高疏水性核心为32％(8/25)。
[0054]
(5)疏水力矩涉及螺旋、肽或其部分的两亲性的量度，其由氨基酸侧链的疏水性的矢量和计算(eisenberg等人,1982)。用于计算多肽疏水力矩的在线工具可从以下获得：http://rzlab.ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi。高疏水力矩指示强两亲性，而低疏水力矩指示弱两亲性。在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以包含疏水力矩(μ)为3.5至11的肽或α-螺旋结构域或由其组成。在一些实施方案中，所述穿梭剂可以是包含两亲性α-螺旋基序的肽，所述α-螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之间的疏水力矩。在一些实施方案中，所述穿梭剂可以是具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之间的疏水力矩的肽。在一些实施方案中，排除可能存在于所述肽中的任何富含组氨酸的结构域来计算疏水力矩。
[0055]
(6)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂在生理ph下可具有至少+3或+4的预测净电荷，其由k、r、d和e残基的侧链计算。例如，肽的净电荷在生理ph下可以是至少+5、+6、+7、至少+8、至少+9、至少+10、至少+11、至少+12、至少+13、至少+14、或至少+15。这些正电荷通常由带正电荷的赖氨酸和/或精氨酸残基的更多存在赋予，这与带负电荷的天冬氨酸和/或谷氨酸残基形成对照。
[0056]
(7)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以具有8至13，优选10至13的预测等电点(pi)。用于计算和/或测量肽的等电点的程序和方法或蛋白质是本领域已知的。例如，可以使用可访问http://web.expasy.org/protparam/的prot param软件计算pi
[0057]
(8)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以由35％至65％的疏水性残基(a、c、g、i、l、m、f、p、w、y、v)构成。在特定实施方案中，所述肽穿梭剂可以由36％至64％、37％至63％、38％至62％、39％至61％或40％至60％的以下氨基酸的任何组合构成：a、c、g、i、l、m、f、p、w、y和v。
[0058]
(9)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以由0至30％的中性亲水性残基
(n、q、s、t)构成。在特定实施方案中，所述肽穿梭剂可以由1％至29％、2％至28％、3％至27％、4％至26％、5％至25％、6％至24％、7％至23％、8％至22％、9％至21％或10％至20％的以下氨基酸的任何组合构成：n、q、s和t。
[0059]
(10)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以由35％至85％的以下氨基酸构成：a、l、k和/或r。在特定实施方案中，所述肽穿梭剂可以由36％至80％、37％至75％、38％至70％、39％至65％或40％至60％的以下氨基酸的任何组合构成：a、l、k或r。
[0060]
(11)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以由15％至45％的氨基酸a和/或l构成，条件是在所述肽中存在至少5％的l。在特定实施方案中，所述肽穿梭剂可以由15％至40％、20％至40％、20％至35％或20％至30％的以下氨基酸的任何组合构成：a和l，条件是在所述肽中存在至少5％的l。
[0061]
(12)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以由20％至45％的氨基酸k和/或r构成。在特定实施方案中，所述肽穿梭剂可以由20％至40％、20％至35％或20％至30％的以下氨基酸的任何组合构成：k和r。
[0062]
(13)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以由0至10％的氨基酸d和/或e构成。在特定实施方案中，所述肽穿梭剂可以由5％至10％的以下氨基酸的任何组合构成：d和e。
[0063]
(14)在一些实施方案中，所述肽穿梭剂中a和/或l的百分比与k和/或r的百分比之间的绝对差可以小于或等于10％。在特定实施方案中，所述肽穿梭剂中a和/或l的百分比与k和/或r的百分比之间的绝对差可以小于或等于9％、8％、7％、6％或5％。
[0064]
(15)在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以由10％至45％的以下氨基酸构成：q、y、w、p、i、s、g、v、f、e、d、c、m、n、t或h(即，不是a、l、k或r)。在特定实施方案中，所述肽穿梭剂可以由15％至40％、20％至35％或20％至30％的以下氨基酸的任何组合构成：q、y、w、p、i、s、g、v、f、e、d、c、m、n、t和h。
[0065]
在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂遵守本文所述的参数(1)至(15)中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、十三个、至少十四个或全部。在特定实施方案中，本说明书的肽穿梭剂遵守参数(1)至(3)中的全部以及本文所述的参数(4)至(15)中的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或全部。
[0066]
在一些实施方案中，当本说明书的肽穿梭剂仅包含一个富含组氨酸的结构域时，所述一个富含组氨酸的结构域的残基可以包括在本文所述的参数(1)至(15)的计算/评估中。在一些实施方案中，当本说明书的肽穿梭剂包含多于一个富含组氨酸的结构域时，仅一个富含组氨酸的结构域的残基可以包括在本文所述的参数(1)至(15)的计算/评估中。例如，当本说明书的肽穿梭剂包含两个富含组氨酸的结构域：朝向n末端的第一富含组氨酸的结构域和朝向c末端的第二富含组氨酸的结构域时，仅所述第一富含组氨酸的结构域可以包括在本文所述的参数(1)至(15)的计算/评估中。
[0067]
在一些实施方案中，可以实施机器学习或计算机辅助设计方法以产生遵守本文所述的参数(1)至(15)中的一个或多个的肽。一些参数如参数(1)和(5)-(15)可能更适合在计算机辅助设计方法中实现，而结构参数诸如参数(2)、(3)和(4)可能更适合手动设计方法。因此，在一些实施方案中，可以通过组合计算机辅助和手动设计方法来产生遵守参数(1)至
(15)中的一个或多个的肽。例如，本文所示的充当有效穿梭剂的多种肽(和其他肽)的多序列比对分析揭示了一些共有序列的存在-即通常发现的疏水性、阳离子、亲水性、丙氨酸和甘氨酸氨基酸的交替模式。这些共有序列的存在可能导致遵守结构参数(2)、(3)和(4)(即，两亲性α-螺旋形成，带正电荷的面和12％-50％的高疏水性核心)。因此，这些和其他共有序列可以用于机器学习和/或计算机辅助设计方法，以产生遵守参数(1)-(15)中的一个或多个的肽。
[0068]
因此，在一些实施方案中，本文所述的肽穿梭剂可以包含以下氨基酸序列或由其组成：
[0069]
(a)[x1]-[x2]-[接头]-[x3]-[x4](式1)；
[0070]
(b)[x1]-[x2]-[接头]-[x4]-[x3](式2)；
[0071]
(c)[x2]-[x1]-[接头]-[x3]-[x4](式3)；
[0072]
(d)[x2]-[x1]-[接头]-[x4]-[x3](式4)；
[0073]
(e)[x3]-[x4]-[接头]-[x1]-[x2](式5)；
[0074]
(f)[x3]-[x4]-[接头]-[x2]-[x1](式6)；
[0075]
(g)[x4]-[x3]-[接头]-[x1]-[x2](式7)；
[0076]
(h)[x4]-[x3]-[接头]-[x2]-[x1](式8)；
[0077]
(i)[接头]-[x1]-[x2]-[接头](式9)；
[0078]
(j)[接头]-[x2]-[x1]-[接头](式10)；
[0079]
(k)[x1]-[x2]-[接头](式11)；
[0080]
(l)[x2]-[x1]-[接头](式12)；
[0081]
(m)[接头]-[x1]-[x2](式13)；
[0082]
(n)[接头]-[x2]-[x1](式14)；
[0083]
(o)[x1]-[x2](式15)；或
[0084]
(p)[x2]-[x1](式16)，
[0085]
其中：
[0086]
[x1]选自：2[φ]-1[+]-2[φ]-1[ζ]-1[+]-；2[φ]-1[+]-2[φ]-2[+]-；1[+]-1[φ]-1[+]-2[φ]-1[ζ]-1[+]-；和1[+]-1[φ]-1[+]-2[φ]-2[+]-；
[0087]
[x2]选自：-2[φ]-1[+]-2[φ]-2[ζ]-；-2[φ]-1[+]-2[φ]-2[+]-；-2[φ]-1[+]-2[φ]-1[+]-1[ζ]-；-2[φ]-1[+]-2[φ]-1[ζ]-1[+]-；-2[φ]-2[+]-1[φ]-2[+]-；-2[φ]-2[+]-1[φ]-2[ζ]-；-2[φ]-2[+]-1[φ]-1[+]-1[ζ]-；和-2[φ]-2[+]-1[φ]-1[ζ]-1[+]-；
[0088]
[x3]选自：-4[+]-a-；-3[+]-g-a-；-3[+]-a-a-；-2[+]-1[φ]-1[+]-a-；-2[+]-1[φ]-g-a-；-2[+]-1[φ]-a-a-；或-2[+]-a-1[+]-a；-2[+]-a-g-a；-2[+]-a-a-a-；-1[φ]-3[+]-a-；-1[φ]-2[+]-g-a-；-1[φ]-2[+]-a-a-；-1[φ]-1[+]-1[φ]-1[+]-a；-1[φ]-1[+]-1[φ]-g-a；-1[φ]-1[+]-1[φ]-a-a；-1[φ]-1[+]-a-1[+]-a；-1[φ]-1[+]-a-g-a；-1[φ]-1[+]-a-a-a；-a-1[+]-a-1[+]-a；-a-1[+]-a-g-a；和-a-1[+]-a-a-a；
[0089]
[x4]选自：-1[ζ]-2a-1[+]-a；-1[ζ]-2a-2[+]；-1[+]-2a-1[+]-a；-1[ζ]-2a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[ζ]-a-1[ζ]-a-1[+]；-2[+]-a-2[+]；-2[+]-a-1[+]-a；-2[+]-a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-2[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[+]-1[ζ]-a-1[+]-a；-1[+]-1[ζ]-a-2[+]；-1[+]-1[ζ]-a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[+]-2[ζ]-a-1[+]；-1[+]-2[ζ]-2[+]；-1[+]-2[ζ]-1[+]-a；-1
[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-a-1[+]；-3[ζ]-2[+]；-3[ζ]-1[+]-a；-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[ζ]-2a-1[+]-a；-1[ζ]-2a-2[+]；-1[ζ]-2a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-2[+]-a-1[+]-a；-2[+]-1[ζ]-1[+]-a；-1[+]-1[ζ]-a-1[+]-a；-1[+]-2a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；和-1[ζ]-a-1[ζ]-a-1[+]；并且
[0090]
[接头]选自：-gn-；-sn-；-(gnsn)n-；-(gnsn)ngn-；-(gnsn)nsn-；-(gnsn)ngn(gnsn)n-；和-(gnsn)nsn(gnsn)n-；
[0091]
其中：[φ]是氨基酸，其为：leu、phe、trp、ile、met、tyr或val，优选leu、phe、trp或ile；[+]是氨基酸，其为：lys或arg；[ζ]是氨基酸，其为：gln、asn、thr或ser；a为氨基酸ala；g是氨基酸gly；s是氨基酸ser；并且n是1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至1至4或1至3的整数。
[0092]
在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以包含肽或其功能变体或由所述肽或其功能变体组成，所述肽与seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中任一个的氨基酸序列或如wo/2018/068135中披露的seq id no:104、105、107、108、110-131、133-135、138、140、142、145、148、151、152、169-242和243-10 242中任一个的氨基酸序列至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以包含wo/2018/068135的seq id no:158和/或159的氨基酸序列基序，所述氨基酸序列基序是在肽fsd5、fsd16、fsd18、fsd19、fsd20、fsd22和fsd23中的每一个中发现的。在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以包含wo/2018/068135的seq id no:159的氨基酸序列基序，其与wo/2018/068135的seq id no:158的氨基酸序列基序可操作地连接。如本文所用，“功能变体”是指具有货物转导活性的肽，其与参考肽相差一个或多个保守氨基酸取代。如本文在功能变体的上下文中所用，“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代。本领域已经明确定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸以及任选脯氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0093]
在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂不包含wo/2018/068135的seq id no:57-59、66-72或82-102中任一个的氨基酸序列中的一个或多个。在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂不包含wo/2018/068135的seq id no:104、105、107、108、110-131、133-135、138、140、142、145、148、151、152、169-242和243-10 242中任一个的氨基酸序列中的一个或多个。更确切地说，在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以涉及此类先前描述的穿梭剂肽的变体，其中所述变体被进一步工程化用于改善转导活性(即，能够更稳健地转导非阴离子多核苷酸类似物货物)。
[0094]
在一些实施方案中，如在真核细胞模型系统(例如，永生化真核细胞系)中或在模型生物体中所测量，本说明书的肽穿梭剂可以具有“替代”货物的转导效率和/或货物递送得分的最小阈值。表述“转导效率”是指目的货物被细胞内递送至其中的靶细胞群体的百分比或比例，这可以通过例如流式细胞术、免疫荧光显微术和可用于评估货物转导效率的其他合适方法(例如，如wo/2018/068135中所述)来确定。在一些实施方案中，转导效率可以表示为货物阳性细胞的百分比。在一些实施方案中，转导效率可以表示为在除了不存在货物和穿梭剂(“无处理”；nt)或不存在穿梭剂(“仅货物”)以外相同的条件下评估的相比于合适阴性对照的倍数增加(或倍数减少)。
[0095]
在一些实施方案中，本文所述穿梭剂包含以下项或由以下项组成：
[0096]
(i)seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中的任一个的氨基酸序列；
[0097]
(ii)与seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中的任一个相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如，不包括任何接头结构域)的氨基酸序列；
[0098]
(iii)与seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中的任一个至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(例如，不包括任何接头结构域计算的)的氨基酸序列；
[0099]
(iv)与seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中的任一个仅相差保守氨基酸取代(例如，相差不超过不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，优选不包括任何接头结构域)的氨基酸序列，其中每个保守氨基酸取代选自相同氨基酸类别内的氨基酸，所述氨基酸类别是：脂族的：g、a、v、l和i；含羟基或硫/硒的：s、c、u、t和m；芳族的：f、y和w；碱性的：h、k和r；酸性的及其酰胺：d、e、n和q；或
[0100]
(v)(i)至(iv)的任何组合。
[0101]
在一些实施方案中，本文所述用于递送非阴离子多核苷酸类似物货物的穿梭剂优选是缺乏细胞穿透结构域的第二代穿梭剂或缺乏与内体渗漏结构域融合的细胞穿透结构域。在一些实施方案中，本文所述的特别适用于递送非阴离子多核苷酸类似物货物的穿梭剂优选是具有相对高的递送得分的那些，这意味着穿梭剂递送更大的货物分子总数/细胞。由于本文所述的合成多核苷酸类似物在与它们的靶细胞内rna分子杂交(即，一个货物分子结合至一个细胞内rna分子)时通过空间位阻来发挥功能，因此预期具有较高递送得分的穿梭剂对于此类应用特别有利。在一些实施方案中，本文所述的穿梭剂(和/或在上一段中以上列举的seq id no)是图5中列出的那些，其递送pi和/或gfp货物的归一化平均递送得分
为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200。
[0102]
在一些实施方案中，本文所述穿梭剂包含所述合成肽穿梭剂的变体或由其组成，所述变体与如本文定义的合成肽穿梭剂相同，除了至少一个氨基酸被相应的合成氨基酸替代，所述合成氨基酸具有生理化学特性(例如，结构、疏水性或电荷)与被替代氨基酸相似的侧链，其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，所述变体增加所述非阴离子多核苷酸类似物货物在真核细胞中的胞质溶胶/细胞核递送。
[0103]
化学修饰和合成氨基酸
[0104]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以包含本文所述肽的寡聚体(例如，二聚体、三聚体等)。此类寡聚体可以通过共价结合相同或不同类型的穿梭剂单体来构建(例如，使用二硫桥连接引入单体序列中的半胱氨酸残基)。在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以包含n末端和/或c末端半胱氨酸残基。
[0105]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以包含环状肽或由其组成。在一些实施方案中，所述环状肽可以经由朝向穿梭剂的n末端定位的第一残基与朝向穿梭剂的c末端定位的第二残基之间的共价连接形成。在一些实施方案中，所述第一和第二残基是位于穿梭剂的n和c末端的侧接残基。在一些实施方案中，所述第一和第二残基可以经由酰胺键连接以形成环状肽。在一些实施方案中，所述环状肽可以由所述穿梭剂内的两个半胱氨酸残基之间的二硫键形成，其中两个半胱氨酸残基朝向穿梭剂的n和c末端定位。在一些实施方案中，所述穿梭剂可以包含或被设计为包含在n和c末端处的侧接半胱氨酸残基，其经由二硫键连接以形成环状肽。在一些实施方案中，与相应的线性肽相比，本文所述的环状穿梭剂可以更具降解(例如，被蛋白酶降解)抗性和/或可以具有更长的半衰期。
[0106]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以包含一种或多种d-氨基酸。在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以包含在穿梭剂的n和/或c末端处的d-氨基酸。在一些实施方案中，所述穿梭剂可以完全由d-氨基酸构成。在一些实施方案中，与仅由l-氨基酸构成的相应肽相比，本文所述的具有一种或多种d-氨基酸的穿梭剂可以更具降解(例如，被蛋白酶降解)抗性和/或可以具有更长的半衰期。
[0107]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以包含对一个或多个氨基酸的化学修饰，其中所述化学修饰不破坏所述合成肽穿梭剂的转导活性。如本文在此上下文中所用，术语“破坏”是指化学修饰不可逆地消除本文所述肽穿梭剂的货物转导活性。可暂时抑制、减弱或延迟本文所述肽穿梭剂的货物转导活性的化学修饰可以包括在对本说明书的穿梭剂的化学修饰中。在一些实施方案中，对本文所述的任一种穿梭剂的化学修饰可以在穿梭剂的n和/或c末端。化学修饰的例子包括添加乙酰基(例如，n末端乙酰基)、半胱酰胺基团(例如，c末端半胱酰胺基团)或脂肪酸(例如，c4-c16、c6-c14、c6-c12、c6-c8或c8脂肪酸，优选n末端)。
[0108]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂包含穿梭剂变体，所述穿梭剂变体具有对非阴离子多核苷酸类似物货物在靶真核细胞中的转导活性，所述变体与本说明书的任何穿梭剂相同，除了至少一个氨基酸被相应的合成氨基酸或氨基酸类似物替代，所述相应的合成氨基酸或氨基酸类似物具有生理化学特性(例如，结构、疏水性或电荷)与被替代氨基酸相似的侧链。在一些实施方案中，所述合成氨基酸替代：
[0109]
(a)用以下任一种替代碱性氨基酸：α-氨基甘氨酸、α,γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、α,β-二氨基丙酸、2,6-二氨基-4-己炔酸、β-(1-哌嗪基)-丙氨酸、4,5-脱氢-赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、ω,ω-二甲基精氨酸、高精氨酸、ω,ω'-二甲基精氨酸、ω-甲基精氨酸、β-(2-喹啉基)-丙氨酸、4-氨基哌啶-4-甲酸、α-甲基组氨酸、2,5-二碘组氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、菠菜素、4-氨基苯丙氨酸、3-氨基酪氨酸、β-(2-吡啶基)-丙氨酸或β-(3-吡啶基)-丙氨酸；
[0110]
(b)用以下任一种替代非极性(疏水性)氨基酸：脱氢-丙氨酸、β-氟丙氨酸、β-氯丙氨酸、β-碘丙氨酸、α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、β-环丙基丙氨酸、氮杂环丁烷-2-甲酸、α-烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、β-(2-噻唑基)-丙氨酸、硫代脯氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、叔丁基甘氨酸、β-环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、α-甲基脯氨酸、正缬氨酸、α-甲基缬氨酸、青霉胺、β,β-二环己基丙氨酸、4-氟脯氨酸、1-氨基环戊烷甲酸、哌啶甲酸、4,5-脱氢亮氨酸、别异亮氨酸、正亮氨酸、α-甲基亮氨酸、环己基甘氨酸、顺式-八氢吲哚-2-甲酸、β-(2-噻吩基)-丙氨酸、苯基甘氨酸、α-甲基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、β-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、4-叔丁基苯丙氨酸、α-甲基色氨酸、β-(2-萘基)-丙氨酸、β-(1-萘基)-丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-甲基色氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯-苯丙氨酸、2,6-二氟-苯丙氨酸、n-in-甲基色氨酸、1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-3-甲酸、β,β-二苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟-苯丙氨酸或4-苯甲酰基苯丙氨酸；
[0111]
(c)用以下任一种替代极性不带电荷的氨基酸：β-氰基丙氨酸、β-脲基丙氨酸、高半胱氨酸、别苏氨酸、焦谷氨酸、2-氧代噻唑烷-4-甲酸、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、高瓜氨酸、羟脯氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸、2-巯基组氨酸、β-(3,4-二羟基苯基)-丝氨酸、β-(2-噻吩基)-丝氨酸、4-叠氮基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-羟基甲基酪氨酸、3-碘酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,5-二硝基酪氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、5-羟基色氨酸、甲状腺原氨酸、β-(7-甲氧基香豆素-4-基)-丙氨酸或4-(7-羟基-4-香豆素基)-氨基丁酸；和/或
[0112]
(d)用以下任一种替代酸性氨基酸：γ-羟基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、γ-羧基谷氨酸、α-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、α-氨基辛二酸、4-羧基苯丙氨酸、磺基丙氨酸、4-膦酰基苯丙氨酸或4-磺甲基苯丙氨酸。
[0113]
富含组氨酸的结构域
[0114]
在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以进一步包含一个或多个富含组氨酸的结构域。在一些实施方案中，所述富含组氨酸的结构域可以是包含至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％组氨酸残基的至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个氨基酸的延伸段。在一些实施方案中，所述富含组氨酸的结构域可以包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个连续组氨酸残基。不受理论束缚，穿梭剂中的富含组氨酸的结构域可以通过在内体的酸性条件下对其咪唑基团进行质子化而在内体中充当质子海绵，提供内体膜不稳定的另一种机制，从而进一步促进内体捕获的货物进入胞质溶胶的能力。在一些实施方案中，所述富含组氨酸的结构域可以位于或朝向肽穿梭剂的n末端和/或c末端。
[0115]
接头
[0116]
在一些实施方案中，本说明书的肽穿梭剂可以包含一种或多种合适的接头(例如，柔性多肽接头)。在一些实施方案中，此类接头可以分隔开两个或更多个两亲性α-螺旋基序(例如，参见wo/2018/068135的图49d中的穿梭剂fsd18)。在一些实施方案中，接头可以用于将两个或更多个结构域(cpd、eld或富含组氨酸的结构域)彼此分隔开。在一些实施方案中，可以通过添加没有旋转潜力的小疏水性氨基酸序列(例如，甘氨酸)和赋予稳定性和柔性的极性丝氨酸残基来形成接头。接头可以是柔软的并且允许穿梭剂的区域移动。在一些实施方案中，可以避免脯氨酸，因为它们可以增加显著的构象刚性。在一些实施方案中，所述接头可以是富含丝氨酸/甘氨酸的接头(例如，gs、ggs、ggsgggs、ggsgggsgggs等)。在一些实施方案中，包含合适接头的穿梭剂的使用可以有利于将货物递送至悬浮细胞而非贴壁细胞。在一些实施方案中，所述接头可以包含以下项或由以下项组成：-gn-；-sn-；-(gnsn)n-；-(gnsn)ngn-；-(gnsn)nsn-；-(gnsn)ngn(gnsn)n-；或-(gnsn)nsn(gnsn)n-，其中g是氨基酸gly；s是氨基酸ser；并且n是1至5的整数。在一些实施方案中，柔性和/或亲水性氨基酸的短延伸段或“接头”(例如，富含甘氨酸/丝氨酸的延伸段)可以添加到本文所述穿梭剂或本文所述的c末端截短穿梭剂的n末端、c末端、或n末端和c末端两者。在一些实施方案中，此类延伸段可以促进穿梭剂，特别是较短穿梭剂(例如，具有带有强疏水性部分的两亲性α螺旋结构)的溶解，所述穿梭剂原本将在水溶液中是不溶的或仅部分可溶的。在一些实施方案中，增加穿梭剂肽的溶解度可以避免使用有机溶剂(例如，dmso)，所述有机溶剂可能遮掩货物转导结果和/或使穿梭剂与治疗应用不相容。
[0117]
基于结构域的肽穿梭剂
[0118]
在一些方面，本文所述的穿梭剂可以是如wo/2016/161516中所述的穿梭剂，其包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作地连接的内体渗漏结构域(eld)。
[0119]
内体渗漏结构域(eld)
[0120]
在一些方面，本说明书的肽穿梭剂可以包含用于促进内体逃逸和进入胞质隔室的内体渗漏结构域(eld)。如本文使用，表述“内体渗漏结构域”是指赋予内体捕获的货物进入胞质隔室的能力的氨基酸序列。不受理论束缚，内体渗漏结构域是短序列(通常源自病毒或细菌肽)，认为其诱导内体膜的不稳定化和内体内容物向细胞质中释放。如本文使用，表述“内体溶解肽”旨在指代具有内体膜不稳定特性的该普通类别的肽。因此，在一些实施方案中，本说明书的合成肽或基于多肽的穿梭剂可以包含作为内体溶解肽的eld。此类肽的活性可以例如使用wo/2016/161516的实施例2中所述的钙黄绿素内体逃逸测定来评估。
[0121]
在一些实施方案中，eld可以是在酸性ph破坏膜的肽，诸如ph依赖性膜活性肽(pmap)或ph依赖性切割肽。例如，肽gala和inf-7是当ph下降改变其中所含氨基酸的电荷时形成α螺旋的两亲性肽。更特别地，不受理论束缚，表明eld诸如gala由于ph降低导致构象改变后通过形成孔和膜脂质的翻转诱导内体渗漏(kakudo,chaki等人,2004,li,nicol等人,2004)。相比之下，表明eld诸如inf-7通过在内体膜积累并且使内体膜不稳定化诱导内体渗漏(el-sayed,futaki等人,2009)。因此，在内体成熟过程中，伴随的ph下降引起肽构象的变化，并且这使内体膜不稳定化，从而导致内体内容物的释放。认为相同的原理适用于假单胞菌的毒素a(varkouhi,scholte等人,2011)。ph下降后，毒素转位结构域的构象改变，允许其在形成孔的地方插入内体膜(london 1992,o'keefe 1992)。这最终有利于内体的不稳定化
和复合物向内体外部的转位。上述eld涵盖在本说明书的eld以及其作用机制未详尽界定的其他内体渗漏机制中。
[0122]
在一些实施方案中，eld可以是抗微生物肽(amp)诸如线性阳离子α螺旋抗微生物肽(amp)。由于其与细菌膜强相互作用的能力，这些肽在天然免疫反应中起关键作用。不受理论束缚，认为这些肽在水溶液中呈现无序状态，但在疏水性环境中采取α-螺旋二级结构。认为后者的构象有助于其典型的浓度依赖性膜破坏特性。当以特定浓度在内体中积累时，一些抗微生物肽可能诱导内体渗漏。
[0123]
在一些实施方案中，eld可以是抗微生物肽(amp)诸如天蚕杀菌肽-a/蜂毒肽杂合(cm)肽。认为此类肽在具有膜破坏能力的最小和最有效的amp-衍生肽中。天蚕杀菌肽是针对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具有膜扰动能力的抗微生物肽家族。作为第一种鉴定的抗细菌肽的天蚕杀菌肽a(ca)由具有线性结构的37个氨基酸构成。作为一种26个氨基酸的肽的蜂毒肽(m)是在蜜蜂毒液中发现的细胞膜裂解因子。天蚕杀菌肽-蜂毒肽杂合肽已显示产生短的高效抗生素肽而对真核细胞没有细胞毒性(即，非溶血性)，一种在任何抗细菌剂中都是希望的特性。这些嵌合肽构建自天蚕杀菌肽a的亲水性n末端结构域与蜂毒肽的疏水性n末端结构域的多种组合，并且已对细菌模型系统进行了测试。两种26聚体，ca(1-13)m(1-13)和ca(1-8)m(1-18)(boman等人,1989)已显示证明了广谱且改善的天然天蚕杀菌肽a效力而没有蜂毒肽的细胞毒性效应。
[0124]
在产生较短cm系列肽的工作中，andreu等人,1992的作者构建了杂交肽诸如26聚体(ca(1-8)m(1-18))，并且将其与20聚体(ca(1-8)m(1-12))、18聚体(ca(1-8)m(1-10))和六种15聚体((ca(1-7)m(1-8)、ca(1-7)m(2-9)、ca(1-7)m(3-10)、ca(1-7)m(4-11)、ca(1-7)m(5-12)和ca(1-7)m(6-13))进行了比较。20和18聚体维持与ca(1-8)m(1-18)可比较的相似活性。在六种15聚体中，ca(1-7)m(1-8)显示出低抗细菌活性，而其他五种相比于26聚体显示出相似的抗生素效力并且无溶血作用。因此，在一些实施方案中，本说明书的合成肽或基于多肽的穿梭剂可以包含作为或来自cm系列肽变体(诸如上文所述的那些)的eld。
[0125]
在一些实施方案中，eld可以是由与蜂毒肽的残基2-12(ygrkkrrqrrr)融合的天蚕杀菌肽-a(kwklfkkigavlkvlttg)的残基1-7构成的cm系列肽cm18，[c(1-7)m(2-12)]。当与细胞穿透肽tat融合时，cm18显示独立地穿过质膜并且使内体膜不稳定化，允许一些内体捕获的货物释放至胞质溶胶(salomone等人,2012)。然而，在作者的一些实验中，与荧光团(atto-633)融合的cm18-tat11肽的使用引起了对于肽相比于荧光团的贡献的不确定性，这是由于荧光团本身已显示出对内体溶解的贡献-例如，经由内体膜的光化学破坏(erazo-oliveras等人,2014)。
[0126]
在一些实施方案中，eld可以是具有wo/2016/161516的seq id no:1的氨基酸序列的cm18，或与wo/2016/161516的seq id no:1具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性并且具有内体溶解活性的其变体。
[0127]
在一些实施方案中，eld可以是源自流感血凝素(ha)的ha2亚基的n末端的肽，所述肽当在内体中积累时还可能引起内体膜的不稳定化。
[0128]
在一些实施方案中，本说明书的合成肽或基于多肽的穿梭剂可以包含作为或来自表i中阐述的eld的eld，或具有内体逃逸活性和/或ph依赖性膜破坏活性的其变体。
[0129]
表i：内体渗漏结构域的例子
[0130][0131][0132]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以包含一个或多个eld或一种或多种类型的eld。更特别地，它们可以包含至少2、至少3、至少4、至少5个或更多个eld。在一些实施方案中，所述穿梭剂可以包含1与10个之间的eld、1与9个之间的eld、1与8个之间的eld、1与7个之间的eld、1与6个之间的eld、1与5个之间的eld、1与4个之间的eld、1与3个之间的eld等。
[0133]
在一些实施方案中，eld相对于本说明书的穿梭剂内其他结构域(cpd、富含组氨酸的结构域)的顺序或位置可以变化，只要保持穿梭剂的穿梭能力即可。
[0134]
在一些实施方案中，eld可以是表i中列出并且具有内体溶解活性的那些中的任一种的变体或片段。在一些实施方案中，eld可以包含wo/2016/161516的seq id no:1-15、63或64中任一个的氨基酸序列，或与wo/2016/161516的seq id no:1-15、63或64中任一个至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％相同并且具有内体溶解活性的序列，或由其组成。
[0135]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂不包含wo/2016/161516的seq id no:1-15、63或64中任一个的氨基酸序列中的一个或多个。
[0136]
细胞穿透结构域(cpd)
[0137]
在一些方面，本说明书的穿梭剂可以包含细胞穿透结构域(cpd)。如本文使用，表述“细胞穿透结构域”是指赋予含有cpd的大分子(例如，肽或蛋白质)转导到细胞中的能力的氨基酸序列。
[0138]
在一些实施方案中，cpd可以是(或可以来自)细胞穿透肽或细胞穿透肽的蛋白质转导结构域。细胞穿透肽可以作为载体用于成功地细胞内递送多种货物(例如，多核苷酸、
多肽、小分子化合物或以其他方式膜不可渗透的其他大分子/化合物)。细胞穿透肽通常包括富含碱性氨基酸的短肽，其与大分子融合(或以其他方式可操作地连接)后介导其内化至细胞中(shaw,catchpole等人,2008)。通过分析hiv-1转录顺式激活因子(tat)蛋白的细胞穿透能力来鉴定第一种细胞穿透肽(green和loewenstein 1988,vives,brodin等人,1997)。这种蛋白质包含称为“tat”的短亲水性氨基酸序列，其促进其插入质膜内并且形成孔。自该发现起，已描述了多种其他细胞穿透肽。就此而言，在一些实施方案中，cpd可以是如表ii中列出的细胞穿透肽或具有细胞穿透肽活性的其变体。
[0139]
表ii：细胞穿透肽的例子
[0140][0140][0141]
不受理论束缚，认为细胞穿透肽与细胞质膜相互作用，然后通过胞饮作用或内吞作用跨过。在tat肽的情况下，认为其亲水性质和电荷促进其插入质膜内并且形成孔(herce和garcia 2007)。还认为疏水性肽(诸如sp)内的α螺旋基序在质膜内形成孔(veach,liu等人,2004)。
[0142]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以包含一个或多个cpd或一种或多种类型的cpd。更特别地，其可以包含至少2、至少3、至少4或至少5个或更多个cpd。在一些实施方案中，所述穿梭剂可以包含在1与10个之间的cpd、在1与6个之间的cpd、在1与5个之间的cpd、在1与4个之间的cpd、在1与3个之间的cpd等。
[0143]
在一些实施方案中，cpd可以是具有wo/2016/161516的seq id no:17的氨基酸序列的tat，或与wo/2016/161516的seq id no:17具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性并且具有细胞穿透活性的其变体；或具有wo/2016/161516的seq id no:18的氨基酸序列的穿膜肽，或与wo/2016/161516的seq id no:18具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性并且具有细胞穿透活性的其变体。
[0144]
在一些实施方案中，cpd可以是具有wo/2016/161516的seq id no:65的氨基酸序
列的ptd4，或与wo/2016/161516的seq id no:65具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性的其变体。
[0145]
在一些实施方案中，cpd相对于本说明书的穿梭剂内其他结构域(eld、富含组氨酸的结构域)的顺序或位置可以变化，只要保持穿梭剂的转导能力即可。
[0146]
在一些实施方案中，cpd可以是表ii中列出并且具有细胞穿透活性的那些中任一种的变体或片段。在一些实施方案中，cpd可以包含wo/2016/161516的seq id no:16-27或65中任一个的氨基酸序列，或与wo/2016/161516的seq id no:16-27或65中任一个至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％相同并且具有细胞穿透活性的序列，或由其组成。
[0147]
在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂不包含wo/2016/161516的seq id no:16-27或65的氨基酸序列中的任一个。
[0148]
方法、试剂盒、用途、组合物和细胞
[0149]
在一些实施方案中，本说明书涉及用于将非阴离子多核苷酸类似物货物从细胞外空间递送至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核的方法。所述方法包括在存在一定浓度的穿梭剂的情况下使靶真核细胞与货物接触，与不存在所述穿梭剂的情况相比，所述浓度的穿梭剂足以增加货物的转导效率。在一些实施方案中，与不存在所述穿梭剂的情况相比，在存在所述穿梭剂的情况下使靶真核细胞与货物接触导致所述非阴离子多核苷酸类似物货物的转导效率增加至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍。
[0150]
在一些实施方案中，本说明书涉及用于增加非阴离子多核苷酸类似物货物向靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核中的转导效率的方法。如本文所用，表述“增加转导效率”是指本说明书的穿梭剂改善目的货物(例如，非阴离子多核苷酸类似物货物)被细胞内递送到的靶细胞群体的百分比或比例的能力。免疫荧光显微术、流式细胞术和其他合适方法可以用于评估货物转导效率。在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以实现至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的转导效率，例如，如通过免疫荧光显微术、流式细胞术、facs和其他合适方法所测量。在一些实施方案中，本说明书的穿梭剂可以实现上述转导效率之一以及至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞活力，例如，如通过wo/2018/068135的实施例3.3a中所述的测定或通过本领域中已知的另一种合适的测定所测量。
[0151]
除了增加靶细胞转导效率之外，本说明书的穿梭剂还可以促进目的货物(例如，非阴离子多核苷酸类似物货物)向靶细胞的胞质溶胶和/或细胞核中的递送。就此而言，使用肽高效地将细胞外货物递送至靶细胞的胞质溶胶和/或细胞核可能具有挑战性，因为货物在跨过质膜后往往被捕获在细胞内的内体中，这可能限制其细胞内可用性并且可能导致其最终的代谢降解。例如，已经报道使用来自hiv-1tat蛋白的蛋白质转导结构域导致货物被大量隔离至细胞内的囊泡中。在一些方面，本说明书的穿梭剂可以促进内体捕获的货物从内体逃逸并且进入胞质隔室的能力。就此而言，例如在短语“增加非阴离子多核苷酸类似物货物向胞质溶胶中的转导效率”中“向胞质溶胶”的表述旨在指本说明书的穿梭剂允许细胞内递送目的货物以逃避内体捕获并且进入胞质溶胶和/或细胞核隔室。在目的货物进入胞
质溶胶后，它可以自由结合其细胞内靶标(例如，在胞质溶胶、细胞核、核仁、线粒体、过氧化物酶体中)。在一些实施方案中，因此，表述“向胞质溶胶”旨在不仅涵盖胞质溶胶递送，而且还涵盖递送至首先需要货物进入胞质隔室的其他亚细胞隔室。
[0152]
在一些实施方案中，本说明书的方法是体外方法(例如，诸如用于治疗和/或诊断目的)。在其他实施方案中，本说明书的方法是体内方法(例如，诸如用于治疗和/或诊断目的)。在一些实施方案中，本说明书的方法包括非阴离子多核苷酸类似物货物和合成肽穿梭剂的局部、肠内/胃肠道(例如，口服)或肠胃外施用。在一些实施方案中，本文描述了被配制用于局部、肠内/胃肠道(例如，口服)或肠胃外施用非阴离子多核苷酸类似物货物和合成肽穿梭剂的组合物。
[0153]
在一些实施方案中，本说明书的方法可以包括使靶真核细胞与如本文定义的穿梭剂或组合物以及非阴离子多核苷酸类似物货物接触。在一些实施方案中，所述穿梭剂或组合物可以与货物预孵育以形成混合物，然后将靶真核细胞暴露于该混合物。在一些实施方案中，可以基于有待于细胞内递送的货物的特征和/或物理化学特性来选择穿梭剂的类型。在其他实施方案中，可以选择穿梭剂的类型以考虑有待于细胞内递送的货物的特征和/或物理化学特性、细胞类型、组织类型等。
[0154]
在一些实施方案中，所述方法可以包括用所述穿梭剂或组合物多次处理靶细胞(例如，每天1、2、3、4次或更多次，和/或按预定时间表)。在这种情况下，较低浓度的穿梭剂或组合物可能是可取的(例如，为了降低毒性)。在一些实施方案中，所述细胞可以是悬浮细胞或贴壁细胞。在一些实施方案中，本领域技术人员将能够使用穿梭剂、结构域、用途和方法的不同组合来调整本说明书的教导，以适应将非阴离子多核苷酸类似物货物递送至具有所希望活力的特定细胞的特定需求。
[0155]
在一些实施方案中，本说明书的方法可以应用于在体内将非阴离子多核苷酸类似物货物细胞内递送至细胞的方法。此类方法可以通过肠胃外施用或直接注射至组织、器官或系统中来实现。
[0156]
在一些方面，本说明书的组合物或合成肽穿梭剂可以用于增加非阴离子多核苷酸类似物货物(例如，靶向治疗或生物学相关rna分子)向靶真核细胞中的转导效率的体外或体内方法中，其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体在一定浓度下使用或被配制为在一定浓度下使用，与不存在所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体的情况相比，所述浓度足以增加货物向靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
[0157]
在一些实施方案中，本说明书的组合物或合成肽穿梭剂可以用于疗法中，其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体将治疗相关非阴离子多核苷酸类似物货物转导到靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核中，其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体在一定浓度下使用(或被配制为在一定浓度下使用)，与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，所述浓度足以增加货物向靶真核细胞中的转导效率。
[0158]
在一些方面，本文描述了用于将非阴离子多核苷酸类似物货物转导到靶真核细胞中的组合物，所述组合物包含用药学上合适的赋形剂配制的合成肽穿梭剂，其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，所述组合物中合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加货物向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含货物。在一些实施方案中，所述组合物可以在施用或治疗用途之前与货物
混合。
[0159]
在一些方面，本文描述了用于疗法的组合物，所述组合物包含与有待于通过合成肽穿梭剂转导到靶真核细胞中的非阴离子多核苷酸类似物货物一起配制的合成肽穿梭剂，其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，所述组合物中合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加货物向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
[0160]
在一些方面，本文描述了组合物，所述组合物包含用于细胞内递送的非阴离子多核苷酸类似物货物和独立于或不共价连接至所述非阴离子多核苷酸类似物货物的合成肽穿梭剂，所述合成肽穿梭剂是包含具有带正电荷的亲水性外面和疏水性外面两者的两亲性α-螺旋基序的肽，其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，合成肽穿梭剂增加所述非阴离子多核苷酸类似物货物在真核细胞中的胞质溶胶/细胞核递送。在一些实施方案中，本文所述的组合物和/或穿梭剂不包含有机溶剂(例如，dmso)或不包含不适于治疗或人类用途的浓度的有机溶剂。在一些实施方案中，本文所述穿梭剂是在考虑水溶性的情况下有利设计的，从而排除了使用有机溶剂的必要。
[0161]
在一些实施方案中，所述穿梭剂或组合物和所述非阴离子多核苷酸类似物货物可以在存在或不存在血清的情况下暴露于靶细胞。在一些实施方案中，所述方法可以适合于临床或治疗用途。
[0162]
在一些实施方案中，本说明书涉及用于将非阴离子多核苷酸类似物货物从细胞外空间递送至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核的试剂盒。在一些实施方案中，本说明书涉及用于增加非阴离子多核苷酸类似物货物向靶真核细胞的胞质溶胶中的转导效率的试剂盒。所述试剂盒可以包含如本文定义的穿梭剂或组合物以及合适的容器。
[0163]
在一些实施方案中，所述靶真核细胞可以是动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施方案中，所述靶真核细胞可以是干细胞(例如胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、外周血干细胞)、原代细胞(例如，成肌细胞、成纤维细胞)、免疫细胞(例如，nk细胞、t细胞、树突细胞、抗原呈递细胞)、上皮细胞、皮肤细胞、胃肠道细胞、粘膜细胞或肺部(肺)细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞包括具有用于内吞作用(即，产生内体)的细胞机制的那些细胞。
[0164]
在一些实施方案中，本说明书涉及包含如本文定义的合成肽穿梭剂的分离的细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是多能干细胞。应当理解，通常对dna转染具有抗性或不适合dna转染的细胞可能是本说明书的合成肽穿梭剂的关注候选物。
[0165]
在一些实施方案中，本说明书涉及本文所述的组合物或方法，所述非阴离子多核苷酸类似物货物是靶向刺猬通路的基因的非阴离子反义寡核苷酸。在一些实施方案中，所述非阴离子反义寡核苷酸靶向gli1进行敲低。在一些实施方案中，所述非阴离子反义寡核苷酸与seq id no:365-368中的任一个的多核苷酸序列杂交(例如，当在胞质溶胶中或在胞质溶胶条件下时)。在一些实施方案中，本文所述非阴离子反义寡核苷酸包含与seq id no:365-368中的任一个杂交的序列。在一些实施方案中，本说明书涉及本文所述的组合物或方法，其中所述组合物或方法用于治疗戈林综合征(gorlin’s syndrome)和/或基底细胞癌。
[0166]
实施例
[0167]
实施例1：材料与方法
[0168]
本文未描述或指定的所有材料和方法一般如wo/2018/068135、ca 3,040,645和/
或wo/2020/210916中进行。
[0169]
材料与试剂
[0170][0171]
细胞系和培养条件
[0172]
按照制造商的说明书培养细胞。
[0173][0174]
磷酸二酰胺吗啉代寡聚物转导方案
[0175]
在无菌水中制备1mm的用荧光团fitc(pmo-fitc)标记的磷酸二酰胺吗啉代寡聚物。
[0176]
实验前一天将hela细胞铺板在96孔培养皿中(20 000个细胞/孔)。制备包含合成肽穿梭剂(7.5、10或20μm)和pmo-fitc(6μm)的每种递送混合物，并且用rpmi-1640培养基补全至50μl。将细胞用pbs洗涤一次，并且在细胞上仅添加穿梭剂/pmo-fitc或pmo-fitc持续5分钟。然后将100μl含有10％ fbs的dmem添加到混合物中并且去除。将细胞用pbs洗涤一次
并且在含有10％ fbs的dmem中孵育。孵育2小时后通过流式细胞术分析细胞。
[0177]
在gfpd报告hela细胞中的反义gfp-pmo转导方案
[0178]
如下制备货物的储备溶液：pmo储备液(在水中1mm)；sirna储备液(在60mm kcl、6mm hepes-ph 7.5和0.2mm mgcl2中100μm)。
[0179]
递送。实验前一天将hela-plex-teto-gfpd细胞铺板在96孔培养皿中(20 000个细胞/孔)。制备包含合成肽穿梭剂(7.5μm)和pmo(0.1或10μm)的每种递送混合物，并且用rpmi-1640培养基补全至50μl。将细胞用pbs洗涤一次，并且在细胞上仅添加穿梭剂/pmo或pmo持续5分钟。然后将100μl含有10％ fbs的dmem添加到混合物中并且去除。将细胞用pbs洗涤一次并且在含有10％ fbs的dmem中孵育。孵育5小时后通过流式细胞术分析细胞。
[0180]
转染。实验前一天将hela-plex-teto-gfpd细胞铺板在96孔培养皿中(20 000个细胞/孔)。按照制造商的说明书使用lipofectamine
tm rnaimax试剂转染sirna(2.5pmol)。将lipofectamine
tm rnaimax稀释在opti-mem中(在25μl中0.3μl)。首先在不含rna酶的水中以10μm稀释sirna储备液，然后将2.5pmol(0.25μl)添加到25μl opti-mem中。将稀释的lipofectamine
tm rnaimax与稀释的sirna(50nm终浓度)混合，并且在室温下孵育5分钟。将细胞用pbs洗涤一次并且在细胞上添加100μl含有10％ fbs的dmem。将在lipofectamine
tm rnaimax中稀释的sirna添加到细胞中。24h后，将培养基更换为100μl含有10％ fbs的新鲜dmem。在转染后48小时通过流式细胞术分析细胞。
[0181]
在du145细胞中敲低gli1表达的反义pmo转导方案
[0182]
实验前一天，将du145细胞进行胰蛋白酶消化并且铺板在24孔培养皿中(500 000个细胞/孔)。制备包含仅合成肽穿梭剂(5μm)和pmo-fitc(6μm)或与设计用于敲低靶蛋白表达的反义pmo(6μm)一起的每种递送混合物，并且用普通rpmi-1640培养基补全至1ml。将细胞用pbs洗涤一次，并且在细胞上添加递送混合物持续5分钟。然后将2ml含有10％ fbs的rpmi-1640添加到混合物中并且去除。将未处理细胞仅与rpmi-1640一起孵育。将细胞在含有10％ fbs的新鲜rpmi-1640中孵育。48小时后，去除培养基，并且在胰蛋白酶消化之前将细胞用pbs洗涤一次。收获细胞，通过离心收集，洗涤，并且用pbs重悬。然后，借助facs(bd facs aria fusion)分选和收集pmo-fitc阳性和pmo-fitc阴性细胞。通过离心收集fitc阳性和fitc阴性细胞样品，并且将其重悬于50μl蛋白质提取ripa缓冲液(150mm nacl、1％ nonidet
tm p-40、0.1％ sds、0.5％脱氧胆酸钠、25mm tris)中。用bca蛋白质测定试剂盒测量总蛋白质浓度。对于所有条件，用4x laemmeli和ripa缓冲液以40μl终体积制备10μg蛋白质。然后将蛋白质样品在90℃下加热，并且通过8％ sds-page凝胶进行分离。然后将蛋白质过夜(25伏)转移到0.2μm pvdf膜上。使用5％牛血清白蛋白、tris缓冲液盐水、0.1％20溶液(5％ bsa/tbs-t)将膜封闭1小时。封闭后，将膜与含有1:1000的抗α-辅肌动蛋白(d6f6)一抗的5％ bsa/tbs-t溶液孵育1小时。存在于细胞裂解物中的α-辅肌动蛋白用作负载对照。随后，将膜与含有以1:500稀释的抗gli1一抗的5％ bsa/tbs-t溶液一起孵育过夜。然后使膜在hrp缀合的山羊抗兔二抗5％ bsa/tbs-t溶液的1:5000稀释度下经受1小时孵育。使用clarity
tm western ecl底物和chemidoc
tm xrs仪器进行化学发光检测。使用imagej
tm
软件评估gli1和α-辅肌动蛋白密度测定术。
[0183]
碘化丙啶或gfp-nls转导方案
[0184]
实验前一天将hela细胞铺板在96孔培养皿中(20 000个细胞/孔)。制备包含合成
肽穿梭剂(10μm)和碘化丙啶(pi)(10μg/ml)或gfp-nls(10μm)的每种递送混合物，并且针对pi用磷酸盐缓冲盐水(pbs)或针对gfp-nls用rpmi-1640培养基补全至50μl。将细胞洗涤一次，并且将穿梭剂/pi或穿梭剂/gfp-nls添加到细胞上持续1分钟(pi)或5分钟(gfp-nls)。然后将100μl含有10％ fbs的dmem添加到混合物中并且去除。将细胞用pbs洗涤一次并且在含有10％ fbs的dmem中孵育。孵育2小时后通过流式细胞术分析细胞。在pi或gfp-nls处理后1小时分析细胞。
[0185]
实施例2：合成肽穿梭剂：一类新的细胞内递送肽
[0186]
被称为穿梭剂的合成肽代表了一类新的细胞内递送肽，其具有将多肽货物快速转导到真核细胞的胞质溶胶/细胞核隔室中的能力。与传统的基于细胞穿透肽的细胞内递送策略相反，合成肽穿梭剂不共价连接至其多肽货物。事实上，以不可切割方式将穿梭剂共价连接至其货物通常对它们的转导活性有负面影响。
[0187]
wo/2016/161516中描述了第一代合成肽穿梭剂，并且其由基于多结构域的肽组成，所述肽具有可操作地连接到细胞穿透结构域(cpd)的内体渗漏结构域(eld)，并且任选地进一步包含一个或多个富含组氨酸的结构域。尽管最初据信穿梭剂介导的货物转导是通过类似于常规细胞穿透肽的机制发生的，货物递送到胞质溶胶/细胞核隔室中的速度和效率表明了在不需要完全内体形成的情况下来自跨越质膜的更直接递送机制的强大贡献(del’guidice等人,2018)。因此，使用第一代穿梭剂作为起点，进行了大规模迭代设计和筛选项目，以优化穿梭剂以快速且高效地转导多肽货物，同时降低细胞毒性。所述项目涉及几乎11,000种合成肽的手动和计算机辅助设计/建模，以及合成和测试数百种不同肽以得到它们快速且高效地将多种多肽货物转导在多种细胞和组织中的能力。与其将穿梭剂视为来源于文献的已知细胞穿透肽(cpd)和内体溶解肽(eld)的融合体，不如基于其预测的三维结构和物理化学特性对每种肽进行全面考虑。设计和筛选程序最终产生了第二代合成肽穿梭剂，所述第二代肽穿梭剂由wo/2018/068135中描述的控制穿梭剂的合理设计的一组15个参数定义，所述穿梭剂相比于第一代穿梭剂具有改善的多肽货物的转导/毒性特征。这些第二代合成肽穿梭剂被设计并且根据经验筛选用于多肽货物的快速转导(即，典型地在5分钟内)，并且因此主要被设计为缺乏原型cpd。
[0188]
实施例3：合成肽穿梭剂将裸dna/rna货物低效递送到胞质溶胶/细胞核隔室中
[0189]
几十年来，细胞穿透肽(cpp)一直被用于细胞内递送dna/rna的转染策略。使用cpp递送多核苷酸可以分为两类，其中cpp与它们的多核苷酸货物共价结合或静电结合。前者的合成的复杂性增加是一个显著障碍，而鉴于cpp的阳离子性质和dna/rna的带负电荷的磷酸骨架，后者相对简单。因此，在第一代合成肽穿梭剂的筛选过程中，进行了实验以确定穿梭剂是否能够高效地将质粒dna货物转导到细胞核中用于基因表达。wo/2016/161516的实施例7.2报道了这些转染实验的结果，其中第一代穿梭剂cm18-tat-cys确实能够细胞内递送荧光标记的编码gfp的质粒dna。然而，仅在0.1％的细胞中检测到gfp表达(参见wo/2016/161516的表7.1)，这强烈表明内化的质粒dna仍被捕获在内体中，而无法进入胞质溶胶/细胞核隔室。wo/2018/068135的实施例7.3重新考察了多种第一代和第二代合成肽穿梭剂用gfp编码质粒成功转染细胞的能力。结果相似-对于所有穿梭剂，在少于1％的细胞中检测到gfp表达(参见wo/2018/068135的表7.2)。这些结果表明，合成肽穿梭剂不适用于将dna/rna转导到真核细胞的胞质溶胶/细胞核中。
[0190]
进行了几种策略以试图将dna/rna货物递送到胞质溶胶/细胞核隔室中，但没有成功。有趣的是，在试图同时共转导gfp和多核苷酸货物两者的实验中，观察到多核苷酸的存在以浓度依赖的方式减低了gfp货物的转导效率。假设多核苷酸的抑制作用可能是由于带负电荷的磷酸骨架，我们试图在转导前用带正电荷的小分子包被多核苷酸来中和负电荷。尝试的带正电荷的小分子包括1,3-二氨基胍单盐酸盐；3,5-二氨基-1,2,4-三唑；胍盐酸盐；和l-精氨酸酰胺二盐酸盐，浓度范围为100nm至10mm。然而，这些策略未能显著改善dna/rna货物的胞质溶胶/细胞核递送，其中内体捕获仍然是有问题的，这潜在地表明穿梭剂介导的转导需要的不仅仅是电荷中和。
[0191]
实施例4：合成肽穿梭剂能够细胞内递送fitc标记的电荷中性多核苷酸类似物
[0192]
磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(pmo)是一种短单链多核苷酸类似物，可用作通过空间位阻修饰基因表达的反义寡核苷酸。它们的分子结构含有dna/rna核碱基，其附接至经由磷酸二酰胺基团连接的亚甲基吗啉环的骨架。由于其电荷中性结构，许多针对dna/rna开发的细胞内递送系统(例如，阳离子脂质；与阳离子细胞穿透肽的静电偶联)不适用于pmo的细胞内传递。因此，已经开发了用于细胞内递送的修饰形式的pmo，包括将pmo共价连接到八个胍鎓头基团(vivo-morpholino)或细胞穿透肽(ppmo)。然而，除了直接注射策略外，很少有报道表明能够修饰基因表达的未经修饰的pmo的胞质溶胶递送成功。
[0193]
为了探索合成肽穿梭剂是否能够细胞内递送pmo，在7.5、10或20μm第一代和第二代合成肽穿梭剂的代表性成员的存在下，将hela细胞暴露于含有6μm用荧光团共价标记的25聚体pmo分子(“pmo-fitc”；seq id no:348)的普通rpmi培养基中5分钟。结果在图1中示出，其中通过流式细胞术评价平均细胞活力(“平均活力”)和“pmo+细胞的平均％”(pmo-fitc货物阳性的活细胞的数量)，如wo/2018/068135所述。“平均递送得分”提供了所有货物阳性细胞中，递送的货物(pmo-fitc)总量/细胞的进一步指示，并且通过以下方式计算：将针对活pmo-fitc+细胞测量的平均荧光强度(至少一式两份样品的)乘以活pmo-fitc+细胞的平均百分比，除以100,000。最后，每种肽的“递送-活力得分”计算为平均活力乘以平均递送得分乘以10，从而能够根据其转导活性和毒性对穿梭剂进行排名。图1中的行根据其递送-活力得分从最低到最高进行排名。
[0194]
作为阴性对照，包括“仅货物”(在不存在肽的情况下与pmo-fitc孵育的细胞)和“fsd10乱序物”(具有与穿梭剂fsd10相同的氨基酸组成的对照肽，除了初级氨基酸序列被“搅乱”以破坏所有穿梭剂共有的阳离子两亲性结构)。图1中的结果显示，被设计用于转导蛋白质货物的第二代穿梭剂-既在转导效率(pmo+细胞的平均％)方面也在递送到每个细胞的货物的平均量(递送得分)方面-总体上优于第一代穿梭剂。鉴于pmo和其他反义寡核苷酸类似物的作用取决于细胞内浓度，后者对于基因表达修饰目的是特别有利的。实验中包括的第一代穿梭剂cm18-穿透蛋白-cys、cm18-tat和his-cm18-ptd4在测试的最低浓度(7.5μm)下展现出更高的毒性(即，平均活力低于50％)，并且因此从图1排除。此结果是出乎意料的，因为此类第一代穿梭剂已经以更高的浓度用于在相同hela细胞中递送gfp-nls，而对活力没有可比较的负面影响。毒性的增加不能仅仅归因于pmo-fitc货物毒性，因为在没有相同毒性水平的情况下，测试的许多其他穿梭剂显示出高得多的pmo+细胞的平均％和平均pmo递送得分。这些结果表明，毒性可能是由于每种穿梭剂与pmo-fitc货物之间的相互作用，并且出于毒性和转导活性的目的，可以考虑穿梭剂/货物的“匹配”。
[0195]
总之，图1中的结果显示合成肽穿梭剂能够细胞内递送pmo-fitc货物，并且第二代穿梭剂在转导效率、递送的货物量/细胞、和毒性方面总体上优于第一代穿梭剂。
[0196]
实施例5：合成肽穿梭剂fsd10将反义pmo转导到胞质溶胶中，从而能够在hela细胞中敲低gfp基因表达
[0197]
发现对于穿梭剂介导的裸dna/rna货物的转导而言，内体捕获是有问题的(实施例3)。实施例4和图1中呈现的流式细胞术结果认为，无论货物是胞质溶胶/细胞核还是内体捕获的，细胞对pmo-fitc货物呈阳性。此外，来自其他团队的最新报告显示，疏水性荧光团(例如，四甲基罗丹明)可能与脂质双层相互作用，并且增强膜的不稳定性(brock等人,2018)。因此，进行了实验以证实穿梭剂可以以生物活性形式将未标记的pmo货物递送到胞质溶胶/细胞核隔室中，以敲低靶基因的表达。
[0198]
创造了“hela plex teto gfpd”细胞系，其由稳定表达被工程化为具有约2小时的较短半衰期的gfp变体(“gfpd”)的hela细胞组成。将hela plex teto gfpd细胞暴露于含有不同浓度的被设计为敲低gfpd表达的反义pmo分子(“pmo-gfp”；seq id no:345)或靶向gli1表达的脱靶反义pmo分子(“pmo-gli1”；seq id no:346)以及有或没有合成肽穿梭剂的普通rpmi培养基中5分钟。作为进一步的对照，包括具有与反义(“sirna-gfp”；seq id no:349)和非特异性(“sirna-gli1”；seq id no:350)pmo分子相同序列的sirna，并且通过商业的基于阳离子脂质的递送系统(lipofectamine
tm rnaimax)递送。转导/转染后，将细胞洗涤，在生长培养基中培养，并且然后通过流式细胞术分析，以在适当的时间评价对gfpd表达的影响，以观察敲低作用(对于pmo处理为5小时或对于sirna处理为48小时)。
[0199]
如图2所示，未处理的hela plex teto gfpd细胞的基线为65％平均gfp+细胞，并且将细胞暴露于仅pmo货物(没有穿梭剂)导致在这方面没有变化。有趣的是，在7.5μm穿梭剂fsd10的存在下，将细胞暴露于10μm pmo-gfp货物中导致gfp+细胞的百分比降低至34％。所述作用对pmo-gfp货物是特异性的，因为在阴性对照的pmo非特异性货物中没有观察到对gfpd表达的影响。最后，所述作用是剂量依赖性的，因为通过将pmo-gfp货物浓度降低到0.1μm而丧失gfpd表达的敲低。
[0200]
实施例6：合成肽穿梭剂fsd250将反义pmo转导到胞质溶胶中，从而能够在du145细胞中敲低gli1表达
[0201]
在5μm合成肽穿梭剂fsd250的存在下，将人du145细胞暴露于含有6μm被设计用于敲低gli1蛋白表达的反义pmo分子(“pmo-gli1”；seq id no:346)或被设计用于敲降低wnt1蛋白表达的反义pmo分子(“pmo-wnt1”；seq id no:347)的普通rpmi培养基中5分钟。在两种条件下还包括示踪剂pmo-fitc分子(6μm)，以能够从同一细胞群体中的未转导细胞进行转导细胞的荧光活化细胞分选(facs)。在转导后48小时，通过流式细胞术分析细胞，并且然后通过facs将细胞分离为fitc阳性群体和fitc阴性群体。
[0202]
对于pmo-gli/pmo-fitc的转导，pmo-fitc+细胞的平均％是37％，并且活力是95.8％。对于pmo-wnt1/pmo-fitc的转导，pmo-fitc+细胞的平均％是36.8％，并且活力是75.7％。对于未处理细胞，pmo-fitc+细胞的平均％是0.6％，并且活力是91.3％。
[0203]
然后裂解fitc+和fitc-细胞群体，通过sds-page分辨，并且使用抗gli1多克隆抗体、抗辅肌动蛋白多克隆抗体作为负载对照以及适当的酶缀合的二抗进行蛋白质印迹分析。结果在图3中示出，包括每个带的密度测定术扫描值。图3清楚地示出了与未转导的细胞
(“fitc-细胞”)相比，转导细胞(“fitc+细胞”)中通过穿梭剂介导的细胞内递送反义pmo-wnt1和反义pmo-gli1，敲低了gli1蛋白的表达。如预期的那样，与通过敲低wnt1 mrna间接敲低gli1(其为相同信号传导通路的一部分)相比，用pmo-gli1直接敲低gli1 mrna的gli1敲低作用更强。
[0204]
实施例7：合成肽穿梭剂fsd250将反义pmo转导到胞质溶胶中，从而能够在du145细胞中敲低gli1表达
[0205]
在3.75μm合成肽穿梭剂fsd250的存在下，将人du145细胞暴露于含有6μm pmo-gli1(seq id no:346)或pmo-gfp(seq id no:345)的普通rpmi培养基中5分钟。在两种条件下(以及单独地作为另外的阴性对照)还包括示踪剂pmo-fitc分子，以使得能够通过facs将转导细胞与未转导细胞分离。在转导后48小时，通过facs将细胞分离为fitc阳性群体和fitc阴性群体。
[0206]
对于仅pmo-fitc的转导，pmo-fitc+细胞的平均％是44.1％，并且活力是77.7％。对于pmo-gli1/pmo-fitc的转导，pmo-fitc+细胞的平均％是36.0％，并且活力是61.1％。对于pmo-gfp/pmo-fitc的转导，pmo-fitc+细胞的平均％是48.9％，并且活力是77.0％。对于未处理细胞，pmo-fitc+细胞的平均％是0.1％，并且活力是84.5％。
[0207]
然后裂解fitc+和fitc-细胞群体，通过sds-page分辨，并且使用抗gli1多克隆抗体、抗辅肌动蛋白多克隆抗体作为负载对照以及适当的酶缀合的二抗进行蛋白质印迹分析。结果在图4中示出，包括每个带的相对密度测定术扫描值，每个带相对于其相应辅肌动蛋白负载对照带被归一化。图4清楚地示出了通过穿梭剂介导的细胞内递送反义pmo-gli1敲低了gli1蛋白表达，而用仅示踪剂pmo-fitc或用pmo-gfp转导的细胞则没有。
[0208]
实施例8：针对碘化丙啶(pi)和gfp-nls转导活性对候选肽穿梭剂的大规模筛选
[0209]
使用如实施例1中一般所述的流式细胞术，针对在hela细胞中的碘化丙啶(pi；小分子货物)和gfp-nls转导活性两者平行筛选超过300种候选肽穿梭剂的专有文库。将pi用作货物，因为仅在与基因组dna结合后，它才展现出20至30倍增强的荧光和最大激发/发射光谱的可检测偏移-此特性使其特别适用于区分内体捕获货物与可进入胞质溶胶/细胞核隔室的内体逃逸货物。因此，细胞内递送和内体逃逸两者均可以通过流式细胞术测量，因为任何保持被捕获在内体中的pi都不会到达细胞核，并且既不展现出增强的荧光，也不展现出光谱偏移。
[0210]
由于筛选了大量的肽，因此每个实验批次都并行地进行阴性对照，并且阴性对照包括其中细胞不暴露于穿梭肽或货物的“无处理”(nt)对照以及其中在不存在穿梭剂的情况下将细胞暴露于货物的“仅货物”对照。结果在图5中示出，其中“转导效率”是指对货物(pi或gfp-nls)呈阳性的所有活细胞的百分比。“平均递送得分”提供了在所有货物阳性细胞中，递送的货物总量/细胞的进一步指示。平均pi或gfp-nls递送得分通过以下方式来计算：所测量的对于活pi+或gfp+细胞的(至少一式两份样品的)平均荧光强度乘以活pi+或gfp+细胞的平均百分比，除以100,000(对于gfp递送)或除以10,000(对于pi递送)。然后将每种候选穿梭剂的pi和gfp-nls的平均递送得分通过除以对于每个实验批次并行进行的“仅货物”阴性对照的平均递送得分进行归一化。因此，图5中的“归一化平均递送得分”表示平均递送得分相对于“仅货物”阴性对照的增加倍数。
[0211]
观察到的对于阴性对照的批次间变化对于gfp-nls相对较小，但在pi作为货物时
明显较高。例如，“仅货物”阴性对照的转导效率的变化范围对于gfp-nls为0.4％至1.3％并且对于pi为0.9％至6.3％。此外，并行测试的若干种阴性对照肽(即，已知具有低或无gfp转导活性的肽)的转导效率(例如，fsd174乱序物；数据未示出)有时比“仅货物”阴性对照得到更低的对于pi的转导效率(但对于gfp-nls并非如此)，在一些情况下多达5％的更低转导效率，这可能是由于pi与肽之间的非特异性相互作用。对于gfp-nls转导实验未观察到这种现象。前述内容表明至少对于pi的穿梭剂转导效率可能更适合于与阴性对照肽的转导效率比较，而不适合与“仅货物”条件比较。
[0212]
在图5中具有至少20％的平均pi转导效率的候选肽穿梭剂中包括具有小于20个残基长度的肽：fsd390(17aa)、fsd367(19aa)和fsd366(18aa)。具有至少20％的平均pi转导效率的候选肽穿梭剂中还包括包含非生理氨基酸类似物(例如，fsd435，其对应于fsd395，不同的是赖氨酸残基(k)被l-2,4-二氨基丁酸残基替代)或化学修饰(例如，fsd438，其对应于fsd10，不同的是具有n末端辛酸修饰；fsd436，其对应于fsd222，不同的是苯丙氨酸残基(f)被(2-萘基)-l-丙氨酸残基替代；fsd171，其对应于fsd168，不同的是具有n末端乙酰基和c末端半胱酰胺基团)的肽。这些结果证实了肽穿梭剂平台技术耐受使用非生理氨基酸或其类似物代替生理氨基酸和/或使用化学修饰的稳健性。
[0213]
使用进一步的穿梭剂进行另外的筛选测定，如图6所示。在这些结果中，有几种活性穿梭剂是先前显示具有转导活性的较长穿梭剂的截短物：fsd10-15(15aa)和fsd418-12-2(12aa)、fsd418(15aa)、cm18(18aa)和穿透蛋白(16aa)。
[0214]
实施例9：合成肽穿梭剂将pmo和pna高效转导在hela细胞中
[0215]
将hela细胞用10μm pmo-fitc或荧光标记的肽核酸(pna)(pna telc-alexa 488；目录号f1004；pna bio inc.)转导，如实施例1所述转导方案中一般描述并且进行了一些修改。使用的穿梭肽是fsd250(5μm)，并且使细胞与货物和穿梭剂接触两分钟，并且在孵育1小时后通过流式细胞术分析细胞。此外，将pna在水而不是在制造商推荐的二甲基甲酰胺(dmf)中再溶解，因为在培养基中包含dmf导致细胞活力低于50％。图7a中的货物转导结果证明，与不存在穿梭剂(“仅pmo”和“仅pna”；“nt”＝未处理细胞)相比，fsd250大大增加了pmo(“fsd250+pmo”递送)和pna(“fsd250+pna”)货物两者的细胞内递送。细胞活力在所有测试条件下都保持很高，如图7b所示。使用fsd250试图转导作为货物的荧光标记的sirna的平行实验导致仅5％的细胞内递送(数据未示出)。这些结果表明，除了pmo，合成肽穿梭剂还可以快速且高效地转导其他非阴离子多核苷酸类似物，诸如pna。
[0216]
实施例10：裸dna/rna对穿梭剂介导的pmo货物转导的影响
[0217]
尽管显示裸dna/rna货物本身是合成肽穿梭剂的不良货物(实施例3和9)，但本实施例评价了它们以反式对穿梭剂介导的pmo货物转导的潜在显性负面影响。简而言之，在培养基中存在递增量的dna寡核苷酸或加标sgrna的情况下，使rh-30细胞(24孔培养皿中的150,000个细胞/孔)与6μm pmo-fitc和5μm合成肽穿梭剂fsd250的递送混合物在rpmi中接触2分钟。然后将细胞洗涤，在生长培养基中孵育，并且然后在1h后收集用于流式细胞术分析。图8中的结果显示在1.5μg dna寡核苷酸(3μg/ml)(图8a)和2μgsgrna(4μg/ml)(图8b)的存在下，观察到降低的pmo-fitc转导效率。在所有测试条件下，细胞活力保持高于75％。
[0218]
实施例11：第一代和第二代合成肽穿梭剂转导pmo货物的比较
[0219]
一般来说，第二代合成肽穿梭剂展现出比第一代穿梭剂更高的货物转导效率。本
实施例比较了包含原型cpd的第一代穿梭剂与两种合理设计的第二代合成肽穿梭剂的pmo转导活性。简而言之，使rh-30细胞(在96孔培养皿中20,000个细胞/孔)与6μm pmo-fitc和递增浓度的第一代穿梭剂his-cm18-ptd4或两种缺乏cpd的第二代合成肽穿梭剂的cpd(fsd250和fsd10)的递送混合物在rpmi中接触2分钟。将细胞洗涤，在完全培养基中孵育，并且然后在1h后收集细胞用于流式细胞术分析。pmo-fitc转导效率在图9a中示出，并且细胞活力在图9b中示出。图9a中的结果显示与his-cm18-ptd4相比，fsd250和fsd10对pmo-fitc货物产生更高的转导效率。
[0220]
实施例12：合成肽穿梭剂介导的pmo转导与自内化vivopmo的比较
[0221]
一般如实施例6中所述进行gli1敲低实验，以比较穿梭剂介导的未经修饰的pmo的转导与可商购自内化vivo-morpholino(vivopmo)，所述自内化vivo-morpholino是一种用末端八胍鎓树枝状聚合物化学修饰以促进进入细胞中的pmo。简而言之，在存在或不存在5μm合成肽穿梭剂fsd250的情况下，使rh-30细胞与6μm货物(pmo-gli1或vivopmo-gli1)的递送混合物在rpmi中接触2分钟。然后将细胞洗涤，在完全培养基中孵育，并且然后在24h后收集以使用抗gli1多克隆ab(abcam ab273018，150kda)、抗gapdh ab(abcam ab181602，37kda)和抗兔hrp二级ab通过蛋白质印迹收集分析gli1蛋白表达。蛋白质印迹结果在图10a中示出，并且相应的密度测定术扫描分析在图10b中示出。仅在用fsd250和pmo-gli1货物处理的细胞中观察到gli1蛋白的敲低。在暴露于仅vivopmo-gli1的细胞中观察到的gli1敲低的缺乏表明图10中的2分钟孵育时间不足以使vivopmo自内化。事实上，这与制造商推荐的对于vivopmo通过内吞作用实现足够的自内化的2-4小时孵育时间一致。无论如何，图10中的结果突出了vivopmo的缓慢内吞依赖性细胞内递送与使用合成肽穿梭剂观察到的快速且高效的pmo转导之间内化动力学的巨大差异。
[0222]
实施例13：合成肽穿梭剂介导的pmo转导与endoporter介导的细胞内pmo递送的比较
[0223]
在hela细胞中进行pmo货物递送实验，以直接比较合成肽穿梭剂介导的pmo转导与endoporter介导的细胞内pmo递送。对于穿梭剂介导的转导，在2.5、5、7.5或10μm第二代穿梭剂fsd396的存在下，将hela细胞在rpmi中暴露于10μm pmo-fitc持续5分钟。对于endoporter介导的递送，在生长培养基中在2.5、5、7.5或10μm可商购endoporter
tm
肽(genetools,llc)的存在下，将hela细胞暴露于10μm pmo-fitc中持续制造商推荐的至少24小时的最短孵育时间。洗涤步骤后，通过免疫荧光显微术观察细胞内pmo-fitc荧光，比较递送结果，并且结果在图11中示出。与未处理细胞(图11a)相比，暴露于仅pmo-fitc货物的hela细胞(图11b)在48h后仅展现出轻微的细胞内递送。虽然fsd396在孵育5分钟后诱导了pmo-fitc的稳健细胞内递送(图11c)，但只有用endoporter肽在孵育48小时后，才可达到可比较水平的细胞内pmo-fitc(图11d)。此外，endoporter处理的细胞展现出不希望的形态变化，所述变化在未处理细胞中(图11a)、在用仅货物处理的细胞中(图11b)或在穿梭剂处理的细胞中(图11c)没有观察到。在endoporter处理的细胞中也可观察到大的pmo-fitc聚集体，所述聚集体不能通过洗涤步骤从细胞中去除。
[0224]
实施例14：gli1敲低在bcc细胞系中触发增加的细胞凋亡，但在正常人皮肤细胞系中不会
[0225]
戈林综合征，也称为痣样基底细胞癌综合征或基底细胞癌痣样综合征(bccns)，是
一种与异常刺猬(hh)通路信号传导相关的遗传疾病，导致面部、手部、背部和颈部上基底细胞癌(bcc)频繁生长。患有戈林综合征的患者每年可能发生多达30种病变，所述病变起源于位于表皮与真皮之间的皮肤基底细胞层。戈林病患者具有导致hh通路组成型激活的基因突变。
[0226]
gli1是负责表达hh通路的决定簇的转录因子，并且因此可以被认为是hh信号传导的主要调节因子。评价了gli1敲低对两种人类皮肤细胞系的影响：源自正常人类皮肤的皮肤上皮样细胞系(nctc-2544)和人类基底细胞癌细胞系(uw-bcc1)。将正常来源的nctc-2544细胞和bcc来源的uw-bcc1细胞在完全细胞培养基中暴露于自内化vivopmo-gli1(15μm)24或48h。48h后，通过蛋白质印迹观察到gli1蛋白表达大约60％的敲低。平行地，用荧光标记的膜联蛋白-v通过流式细胞术测量细胞凋亡的百分比。有趣的是，与用阴性对照vivopmo处理的仅有11％的凋亡细胞相比，用vivopmo-gli1处理导致在48h后68％-72％的凋亡uw-bcc1细胞。相比之下，用vivopmo-gli1处理导致在48h后仅3％-6％的凋亡nctc-2544细胞，并且在用阴性对照vivopmo处理的细胞中导致仅2％的细胞凋亡。这些结果支持通过细胞内递送gli1特异性pmo来敲低gli1，以治疗基底细胞癌。
[0227]
实施例15：用于gli1敲低的pmo的设计、合成和穿梭介导的转导
[0228]
设计并且合成四种不同的pmo，靶向在人gli1基因的5’非翻译区或起始密码子近侧的不同区域。按照它们与gli1起始密码子的距离的升序，合成的四种pmo是：pmo-gli1_opt(结合至seq id no:365并且横跨gli1起始密码子)；pmo-gli1_opt1(结合至seq id no:366)；pmo-gli1_opt2(结合至seq id no:367)；和pmo-gli1_opt3(结合至seq id no:368)。如实施例12中所述，用四种pmo货物中的每一种(6μm)或用带有穿梭剂fsd250的阴性对照pmo-fitc(6μm)转导rh-30细胞。如通过用pmo-fitc对照货物转导的细胞的流式细胞术估计，转导实验中的总转导效率是大约80％。在递送后24小时收获细胞，并且通过蛋白质印迹评价gli1蛋白表达的敲低(图12)。当用穿梭剂转导时，所有四种pmo都敲低gli1蛋白的表达，但在不存在穿梭剂的情况下观察到最小的敲低。gli1和对照辅肌动蛋白带的密度测定术分析揭示了四种pmo将gli1的表达敲低到未处理细胞的27％-45％(图12)。用递增浓度的pmo-gli1_opt重复转导实验，并且发现gli1敲低是剂量依赖性的：0.325、0.75、1.5、3和6μm pmo-gli1_opt将gli1水平分别敲低至未处理细胞的48％、43％、34％、33％和22％。
[0229]
实施例16：在患者来源的肿瘤外植体的基底细胞中穿梭介导的用于gli1敲低的pmo的转导
[0230]
在mohs型手术后新鲜获得的基底细胞癌型肿瘤在表面暴露于空气的丝网上的完全dmem培养基中孵育。为了允许将货物递送到表皮和真皮，将肿瘤用pbs 1x洗涤，并且用pantec please
tm
激光器根据以下参数使外植体的角质层透化：孔密度2.5％，1个脉冲/孔，阵列尺寸14mm，孔深20μm(4.9j/cm2，0.8w)。然后将外植体分为两半，一半用含有25μm pmo-gli1-cy5和40μm fsd250的pbs 1x-2％羟乙基纤维素溶液处理，而另一半用含有仅pmo-gli1-cy5的相同溶液处理(不含穿梭剂；对照)。处理后，将肿瘤在37℃下孵育4小时并且用4％多聚甲醛(pfa)固定，然后用30％蔗糖处理，并且在oct(最佳切割温度)下冷冻。将10μm切片转移到盖玻片上，并且用prolong
tm diamond处理用于荧光显微术分析。如图13所示，与用仅pmo-gli1-cy5处理的另一半肿瘤相比，观察到在用pmo-gli1-cy5和穿梭剂组合处理的一半肿瘤中增加的荧光水平，特别是在表皮水平。此外，在肿瘤孵育后，通过用嗜热菌蛋白
酶和胰蛋白酶进行酶处理来分离真皮和表皮细胞，并且在37℃下在5％ co2中进一步培养。在用抗gli1-alexa 647抗体固定和标记分离的真皮和表皮细胞后，在不同的培养时间通过细胞荧光测定术测量gli1蛋白的水平。在肿瘤处理后孵育24与48小时之间，通过流式细胞术测量，在用pmo-gli1和穿梭剂组合处理的培养细胞中，gli1蛋白的水平显著降低(50％)(数据未示出)。
[0231]
参考文献
[0232]
andreu et al.,(1992)“shortened cecropin a-melittin hybrids.significant size reduction retains potent antibiotic activity”.febs letters 296,190-194
[0233]
amand et al.,(2012)."functionalization with c-terminal cysteine enhances transfection efficiency of cell-penetrating peptides through dimer formation."biochem biophys res commun 418(3):469-474.
[0234]
boman et al.,(1989)antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids.febs letters 259,103-106.
[0235]
brock et al.,(2018)“efficient cell delivery mediated by lipid-specific endosomal escape of supercharged branched peptides”.traffic 19(6):421-435.doi:10.1111/tra.12566.
[0236]
del’guidice et al.,(2018)“membrane permeabilizing amphiphilic peptide delivers recombinant transcription factor and crispr-cas9/cpf1 ribonucleoproteins in hard-to-modify cells”.plos one 13(4):e0195558.
[0237]
drin et al.,(2003)."studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides."j biol chem 278(33):31192-31201.
[0238]
eisenberg et al.,(1982).“the helical hydrophobic moment:a measure of the amphiphilicity of a helix”.nature 299,371
–
374.
[0239]
el-andaloussi et al.,(2007)."a novel cell-penetrating peptide,m918,for efficient delivery of proteins and peptide nucleic acids."mol ther 15(10):1820-1826.
[0240]
el-sayed et al.,(2009)."delivery of macromolecules using arginine-rich cell-penetrating peptides:ways to overcome endosomal entrapment."aaps j 11(1):13-22.
[0241]
elmquist et al.,(2001)."ve-cadherin-derived cell-penetrating peptide,pvec,with carrier functions."exp cell res 269(2):237-244.
[0242]
erazo-oliveras et al.,(2014)“protein delivery into live cells by incubation with anendosomolytic agent.”nat methods.(8):861-7.
[0243]
fawell et al.,(1994)."tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells."proc natlacad sci u s a 91(2):664-668.
[0244]
fominaya et al.,(1998)."a chimeric fusion protein containing transforming growthfactor-alpha mediates gene transfer via binding to the egf receptor."gene ther 5(4):521-530.
[0245]
fominaya,j.and w.wels(1996)."target cell-specific dna transfer mediated by achimeric multidomain protein.novel non-viral gene delivery system."j biol chem 271(18):10560-10568.
[0246]
glover et al.,(2009)."multifunctional protein nanocarriers for targeted nuclear genedelivery in nondividing cells."faseb j 23(9):2996-3006.
[0247]
gottschalk et al.,(1996)."a novel dna-peptide complex for efficient gene transfer andexpression in mammalian cells."gene ther 3(5):448-457.
[0248]
green,m.and p.m.loewenstein(1988)."autonomous functional domains of chemicallysynthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein."cell 55(6):1179-1188.
[0249]
hallbrink et al.,(2001)."cargo delivery kinetics of cell-penetrating peptides."biochimbiophys acta 1515(2):101-109.
[0250]
herce,h.d.and a.e.garcia(2007)."molecular dynamics simulations suggest amechanism for translocation of the hiv-1 tat peptide across lipid membranes."proc natlacad sci u s a 104(52):20805-20810.
[0251]
ho et al.,(2001).“synthetic protein transduction domains:enhanced transduction potentialin vivo.”cancer research 61:474-477.
[0252]
ilfeld and yaksh(2009).“the end of postoperative pain
–
a fast-approaching possibility？and,if so,will we be ready？”regional anesthesia and pain medicine 34(2):85-87.
[0253]
kakudo et al.,(2004)."transferrin-modified liposomes equipped with a ph-sensitivefusogenic peptide:an artificial viral-like delivery system."biochemistry 43(19):5618-5628.
[0254]
kichler et al.,(2006)."cationic amphipathic histidine-rich peptides for gene delivery."biochim biophys acta 1758(3):301-307.
[0255]
kichler et al.,(2003).“histidine-rich amphipathic peptide antibiotics promote efficientdelivery of dna into mammalian cells”.proc natl acad sci u s a.2003 feb 18；100(4):1564
–
1568.
[0256]
krishnamurthy et al.,(2019).“engineered amphiphilic peptides enable delivery of proteinsand crispr-associated nucleases to airway epithelia”.nature communications.10(1):4906.doi:10.1038/s41467-019-12922-y.
[0257]
kwon,et al.,(2010).“a truncated hgp peptide sequence that retains endosomolyticactivity and improves gene delivery efficiencies”.mol.pharmaceutics,7:1260
–
65.
[0258]
lamiable et al.,(2016).“pep-fold3:faster de novo structure prediction for linear peptidesin solution and in complex”nucleic acids res.44(w1):w449-54.
[0259]
li et al.,(2004)."gala:a designed synthetic ph-responsive amphipathic peptide withapplications in drug and gene delivery."adv drug deliv rev 56(7):
mice."bioconjug chem 10(6):1075-1083.
[0274]
shaw et al.,(2008)."comparison of protein transduction domains in mediating cell deliveryof a secreted cre protein."biochemistry 47(4):1157-1166.
[0275]
shen et al.,(2014)“improved pep-fold approach for peptide and miniprotein structureprediction”.j.chem.theor.comput.10:4745-4758.
[0276]
tan et al.,(2012)."truncated peptides from melittin and its analog with high lytic activity atendosomal ph enhance branched polyethylenimine-mediated gene transfection."j gene med14(4):241-250.
[0277]
th
é
riault et al.,“differential modulation of nav1.7 and nav1.8 channels by antidepressantdrugs.”european journal of pharmacology(2015)764:395-403.
[0278]
th
é
venet et al.,“pep-fold:an updated de novo structure prediction server for both linearand disulfide bonded cyclic peptides.”nucleic acids res.2012.40,w288-293.
[0279]
uherek et al.,(1998)."a modular dna carrier protein based on the structure of diphtheriatoxin mediates target cell-specific gene delivery."j biol chem 273(15):8835-8841.
[0280]
varkouhi et al.,"endosomal escape pathways for delivery of biologicals."j control release151(3):220-228.
[0281]
veach et al.,(2004)."receptor/transporter-independent targeting of functional peptidesacross the plasma membrane."j biol chem 279(12):11425-11431.
[0282]
vives et al.,(1997)."a truncated hiv-1 tat protein basic domain rapidly translocatesthrough the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus."j biol chem 272(25):16010-16017.《
[0283]
wyman et al.,(1997)."design,synthesis,and characterization of a cationic peptide thatbinds to nucleic acids and permeabilizes bilayers."biochemistry 36(10):3008-3017.
[0284]
zhou et al.,(2009)."generation of induced pluripotent stem cells using recombinantproteins."cell stem cell 4(5):381-384.

技术特征：
1.一种组合物，所述组合物包含用于细胞内递送的非阴离子多核苷酸类似物货物和独立于或不共价连接至所述非阴离子多核苷酸类似物货物的合成肽穿梭剂，所述合成肽穿梭剂是包含具有带正电荷的亲水性外面和疏水性外面两者的两亲性α-螺旋基序的肽，其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，合成肽穿梭剂增加所述非阴离子多核苷酸类似物货物在真核细胞中的胞质溶胶/细胞核递送。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物是电荷中性或阳离子的反义合成寡核苷酸(aso)。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物是：(a)具有磷酸二酰胺骨架、酰胺(例如，肽)骨架、甲基膦酸酯骨架、中性磷酸三酯骨架、砜骨架或三唑骨架的电荷中性多核苷酸类似物货物；或(b)具有氨基烷基化氨基磷酸酯骨架、胍鎓骨架、s-甲基硫脲骨架或核苷基氨基酸(naa)骨架的阳离子多核苷酸类似物货物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(pmo)、肽核酸(pna)、甲基膦酸酯寡聚物、或短干扰核糖核酸中性寡核苷酸(sirnn)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物是5至50聚体、5至75聚体、或5至100聚体。6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物不共价连接至细胞穿透肽、八胍树枝状聚合物、或其他细胞内递送部分。7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂是：(1)长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的肽，所述肽包含(2)两亲性α-螺旋基序，其具有(3)带正电荷的亲水性外面和疏水性外面，其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个：(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示，所述疏水性外面包含由空间上相邻的l、i、f、v、w和/或m氨基酸组成的高疏水性核心，所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12％至50％；(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ)；(6)所述肽在生理ph下具有至少+3或+4的预测净电荷；(7)所述肽具有8至13的等电点(pi)；(8)所述肽由35％至65％的以下氨基酸的任何组合构成：a、c、g、i、l、m、f、p、w、y和v；(9)所述肽由0％至30％的以下氨基酸的任何组合构成：n、q、s和t；(10)所述肽由35％至85％的以下氨基酸的任何组合构成：a、l、k或r；(11)所述肽由15％至45％的以下氨基酸的任何组合构成：a和l，前提是所述肽中存在至少5％的l；(12)所述肽由20％至45％的以下氨基酸的任何组合构成：k和r；(13)所述肽由0％至10％的以下氨基酸的任何组合构成：d和e；(14)所述肽中a和l残基的百分比(a+l％)与所述肽中k和r残基的百分比(k+r)之间的差小于或等于10％；以及
(15)所述肽由10％至45％的以下氨基酸的任何组合构成：q、y、w、p、i、s、g、v、f、e、d、c、m、n、t和h。8.根据权利要求7所述的组合物，其中：(a)所述穿梭剂遵守参数(4)至(15)中的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个，或遵守其全部；(b)所述穿梭剂是具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的最小长度和40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的最大长度的肽；(c)所述两亲性α-螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之间的疏水力矩(μ)；(d)所述两亲性α-螺旋基序包含带正电荷的亲水性外面，基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋，所述带正电荷的亲水性外面包含：(i)在螺旋轮投影时至少两个、三个或四个相邻的带正电荷的k和/或r残基；和/或(ii)在螺旋轮投影时包含三至五个k和/或r残基的六个相邻残基的区段；(e)所述两亲性α-螺旋基序包含疏水性外面，基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋，所述疏水性外面包含：(i)在螺旋轮投影时至少两个相邻l残基；和/或(ii)在螺旋轮投影时包含选自l、i、f、v、w和m的至少五个疏水性残基的十个相邻残基的区段；(f)所述疏水性外面包含高疏水性核心，所述高疏水性核心由空间上相邻的l、i、f、v、w和/或m氨基酸组成，所述氨基酸占所述穿梭剂的氨基酸的从12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％至25％、30％、35％、40％或45％；(g)所述穿梭剂具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之间的疏水力矩(μ)；(h)所述穿梭剂具有在+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9至+10、+11、+12、+13、+14或+15之间的预测净电荷；(i)所述穿梭剂具有10至13的预测pi；或(j)(a)至(i)的任何组合。9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述穿梭剂遵守以下参数中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或全部：(8)所述穿梭剂由36％至64％、37％至63％、38％至62％、39％至61％或40％至60％的以下氨基酸的任何组合构成：a、c、g、i、l、m、f、p、w、y和v；(9)所述穿梭剂由1％至29％、2％至28％、3％至27％、4％至26％、5％至25％、6％至24％、7％至23％、8％至22％、9％至21％或10％至20％的以下氨基酸的任何组合构成：n、q、s和t；(10)所述穿梭剂由36％至80％、37％至75％、38％至70％、39％至65％或40％至60％的
以下氨基酸的任何组合构成：a、l、k或r；(11)所述穿梭剂由15％至40％、20％至40％、20％至35％或20％至30％的以下氨基酸的任何组合构成：a和l；(12)所述穿梭剂由20％至40％、20％至35％或20％至30％的以下氨基酸的任何组合构成：k和r；(13)所述穿梭剂由5％至10％的以下氨基酸的任何组合构成：d和e；(14)所述穿梭剂中a和l残基的百分比(a+l％)与所述穿梭剂中k和r残基的百分比(k+r)之间的差小于或等于9％、8％、7％、6％或5％；以及(15)所述穿梭剂由15％至40％、20％至35％或20％至30％的以下氨基酸的任何组合构成：q、y、w、p、i、s、g、v、f、e、d、c、m、n、t和h。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂包含富含组氨酸的结构域，任选地其中所述富含组氨酸的结构域：(i)朝向所述穿梭剂的n末端和/或c末端定位；(ii)是包含至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％组氨酸残基的至少3、至少4、至少5或至少6个氨基酸的延伸段；和/或包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9个连续组氨酸残基；或(iii)(i)和(ii)两者。11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂包含富含丝氨酸和/或甘氨酸残基的柔性接头结构域(例如，分隔所述穿梭剂的n末端和c末端区段；或定位在中心两亲性阳离子α螺旋结构域的n末端和/或c末端)。12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成：(a)[x1]-[x2]-[接头]-[x3]-[x4](式1)；(b)[x1]-[x2]-[接头]-[x4]-[x3](式2)；(c)[x2]-[x1]-[接头]-[x3]-[x4](式3)；(d)[x2]-[x1]-[接头]-[x4]-[x3](式4)；(e)[x3]-[x4]-[接头]-[x1]-[x2](式5)；(f)[x3]-[x4]-[接头]-[x2]-[x1](式6)；(g)[x4]-[x3]-[接头]-[x1]-[x2](式7)；或(h)[x4]-[x3]-[接头]-[x2]-[x1](式8)，(i)[接头]-[x1]-[x2]-[接头](式9)；(j)[接头]-[x2]-[x1]-[接头](式10)；(k)[x1]-[x2]-[接头](式11)；(l)[x2]-[x1]-[接头](式12)；(m)[接头]-[x1]-[x2](式13)；(n)[接头]-[x2]-[x1](式14)；(o)[x1]-[x2](式15)；或(p)[x2]-[x1](式16)，其中：
[x1]选自：2[φ]-1[+]-2[φ]-1[ζ]-1[+]-；2[φ]-1[+]-2[φ]-2[+]-；1[+]-1[φ]-1[+]-2[φ]-1[ζ]-1[+]-；和1[+]-1[φ]-1[+]-2[φ]-2[+]-；[x2]选自：-2[φ]-1[+]-2[φ]-2[ζ]-；-2[φ]-1[+]-2[φ]-2[+]-；-2[φ]-1[+]-2[φ]-1[+]-1[ζ]-；-2[φ]-1[+]-2[φ]-1[ζ]-1[+]-；-2[φ]-2[+]-1[φ]-2[+]-；-2[φ]-2[+]-1[φ]-2[ζ]-；-2[φ]-2[+]-1[φ]-1[+]-1[ζ]-；和-2[φ]-2[+]-1[φ]-1[ζ]-1[+]-；[x3]选自：-4[+]-a-；-3[+]-g-a-；-3[+]-a-a-；-2[+]-1[φ]-1[+]-a-；-2[+]-1[φ]-g-a-；-2[+]-1[φ]-a-a-；或-2[+]-a-1[+]-a；-2[+]-a-g-a；-2[+]-a-a-a-；-1[φ]-3[+]-a-；-1[φ]-2[+]-g-a-；-1[φ]-2[+]-a-a-；-1[φ]-1[+]-1[φ]-1[+]-a；-1[φ]-1[+]-1[φ]-g-a；-1[φ]-1[+]-1[φ]-a-a；-1[φ]-1[+]-a-1[+]-a；-1[φ]-1[+]-a-g-a；-1[φ]-1[+]-a-a-a；-a-1[+]-a-1[+]-a；-a-1[+]-a-g-a；和-a-1[+]-a-a-a；[x4]选自：-1[ζ]-2a-1[+]-a；-1[ζ]-2a-2[+]；-1[+]-2a-1[+]-a；-1[ζ]-2a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[ζ]-a-1[ζ]-a-1[+]；-2[+]-a-2[+]；-2[+]-a-1[+]-a；-2[+]-a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-2[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[+]-1[ζ]-a-1[+]-a；-1[+]-1[ζ]-a-2[+]；-1[+]-1[ζ]-a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[+]-2[ζ]-a-1[+]；-1[+]-2[ζ]-2[+]；-1[+]-2[ζ]-1[+]-a；-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-a-1[+]；-3[ζ]-2[+]；-3[ζ]-1[+]-a；-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-1[ζ]-2a-1[+]-a；-1[ζ]-2a-2[+]；-1[ζ]-2a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；-2[+]-a-1[+]-a；-2[+]-1[ζ]-1[+]-a；-1[+]-1[ζ]-a-1[+]-a；-1[+]-2a-1[+]-1[ζ]-a-1[+]；和-1[ζ]-a-1[ζ]-a-1[+]；并且[接头]选自：-gn-；-sn-；-(gnsn)n-；-(gnsn)ngn-；-(gnsn)nsn-；-(gnsn)ngn(gnsn)n-；和-(gnsn)nsn(gnsn)n-；其中：[φ]是氨基酸，其为：leu、phe、trp、ile、met、tyr或val，优选leu、phe、trp或ile；[+]是氨基酸，其为：lys或arg；[ζ]是氨基酸，其为：gln、asn、thr或ser；a是氨基酸ala；g是氨基酸gly；s是氨基酸ser；并且n是从1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至1至4或1至3的整数。13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂包含以下项或由以下项组成：(i)seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中的任一个的氨基酸序列；(ii)与seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中的任一个相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如，不包括任何接头结构域)的氨基酸序列；(iii)与seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至
169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中的任一个至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(例如，不包括任何接头结构域计算的)的氨基酸序列；(iv)与seq id no:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、或353至364中的任一个仅相差保守氨基酸取代(例如，相差不超过不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，优选不包括任何接头结构域)的氨基酸序列，其中每个保守氨基酸取代选自相同氨基酸类别内的氨基酸，所述氨基酸类别是：脂族的：g、a、v、l和i；含羟基或硫/硒的：s、c、u、t和m；芳族的：f、y和w；碱性的：h、k和r；酸性的及其酰胺：d、e、n和q；或(v)(i)至(iv)的任何组合。14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂包含所述合成肽穿梭剂的变体或由其组成，所述变体与如权利要求1或7至13中任一项中定义的合成肽穿梭剂相同，不同的是至少一个氨基酸被相应的合成氨基酸替代，所述合成氨基酸具有生理化学特性(例如，结构、疏水性或电荷)与被替代氨基酸相似的侧链，其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，所述变体增加所述非阴离子多核苷酸类似物货物在真核细胞中的胞质溶胶/细胞核递送，优选地其中所述合成氨基酸替代：(a)用以下任一种替代碱性氨基酸：α-氨基甘氨酸、α,γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、α,β-二氨基丙酸、2,6-二氨基-4-己炔酸、β-(1-哌嗪基)-丙氨酸、4,5-脱氢-赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、ω,ω-二甲基精氨酸、高精氨酸、ω,ω'-二甲基精氨酸、ω-甲基精氨酸、β-(2-喹啉基)-丙氨酸、4-氨基哌啶-4-甲酸、α-甲基组氨酸、2,5-二碘组氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、菠菜素、4-氨基苯丙氨酸、3-氨基酪氨酸、β-(2-吡啶基)-丙氨酸或β-(3-吡啶基)-丙氨酸；(b)用以下任一种替代非极性(疏水性)氨基酸：脱氢-丙氨酸、β-氟丙氨酸、β-氯丙氨酸、β-碘丙氨酸、α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、β-环丙基丙氨酸、氮杂环丁烷-2-甲酸、α-烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、β-(2-噻唑基)-丙氨酸、硫代脯氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、叔丁基甘氨酸、β-环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、α-甲基脯氨酸、正缬氨酸、α-甲基缬氨酸、青霉胺、β,β-二环己基丙氨酸、4-氟脯氨酸、1-氨基环戊烷甲酸、哌啶甲酸、4,5-脱氢亮氨酸、别异亮氨酸、正亮氨酸、α-甲基亮氨酸、环己基甘氨酸、顺式-八氢吲哚-2-甲酸、β-(2-噻吩基)-丙氨酸、苯基甘氨酸、α-甲基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、β-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、4-叔丁基苯丙氨酸、α-甲基色氨酸、β-(2-萘基)-丙氨酸、β-(1-萘基)-丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-甲基色氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯-苯丙氨酸、2,6-二氟-苯丙氨酸、n-in-甲基色氨酸、1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-3-甲酸、β,β-二苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟-苯丙氨酸或4-苯甲酰基苯丙氨酸；(c)用以下任一种替代极性不带电荷的氨基酸：β-氰基丙氨酸、β-脲基丙氨酸、高半胱
氨酸、别苏氨酸、焦谷氨酸、2-氧代噻唑烷-4-甲酸、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、高瓜氨酸、羟脯氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸、2-巯基组氨酸、β-(3,4-二羟基苯基)-丝氨酸、β-(2-噻吩基)-丝氨酸、4-叠氮基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-羟基甲基酪氨酸、3-碘酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,5-二硝基酪氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、5-羟基色氨酸、甲状腺原氨酸、β-(7-甲氧基香豆素-4-基)-丙氨酸或4-(7-羟基-4-香豆素基)-氨基丁酸；和/或(d)用以下任一种替代酸性氨基酸：γ-羟基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、γ-羧基谷氨酸、α-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、α-氨基辛二酸、4-羧基苯丙氨酸、磺基丙氨酸、4-膦酰基苯丙氨酸或4-磺甲基苯丙氨酸。15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂不包含细胞穿透结构域(cpd)、细胞穿透肽(cpp)或蛋白质转导结构域(ptd)。16.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂不包含融合至内体渗漏结构域(eld)的cpd。17.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂包含内体渗漏结构域(eld)和/或细胞穿透结构域(cpd)。18.根据权利要求15至17中任一项所述的组合物，其中：(i)所述eld是或来自：内体溶解肽；抗微生物肽(amp)；线性阳离子α-螺旋抗微生物肽；天蚕杀菌肽-a/蜂毒肽杂合(cm)肽；ph依赖性膜活性肽(pamp)；肽两亲物；源自流感血凝素(ha)的ha2亚基的n末端的肽；cm18；白喉毒素t结构域(dt)；gala；pea；inf-7；lah4；hgp；h5wyg；ha2；eb1；vsvg；假单胞菌毒素；蜂毒肽；kala；jst-1；c(llkk)3c；g(llkk)3g；或其任何组合；(ii)所述cpd是或来自：细胞穿透肽或来自细胞穿透肽的蛋白质转导结构域；tat；ptd4；穿透蛋白；pvec；m918；pep-1；pep-2；xentry；精氨酸延伸段；转运素；synb1；synb3；或其任何组合；或(iii)(i)和(ii)两者。19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂是环状肽和/或包含一个或多个d-氨基酸。20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中相对于缺少所述穿梭剂的相应阴性对照，所述穿梭剂使细胞内递送在所述真核细胞中的非阴离子多核苷酸类似物货物的转导效率和/或总量增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍。21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述穿梭剂进一步包含对一个或多个氨基酸的化学修饰，其中所述化学修饰不破坏所述合成肽穿梭剂的转导活性。22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述化学修饰在所述穿梭剂的n和/或c末端。23.根据权利要求21或22所述的组合物，其中所述化学修饰是添加乙酰基(例如，n末端乙酰基)、半胱酰胺基团(例如，c末端半胱酰胺基团)或脂肪酸(例如，c4-c16脂肪酸，优选n末端)。24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述非阴离子多核苷酸类似物货物和/或所述合成肽穿梭剂的浓度是至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40μm。25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物：(i)用于调节在所述真核细胞中的基因表达(例如，基因表达敲低、经修饰的剪接(例如，外显子跳跃)、mirna活性和/或成熟的修饰、翻译移码诱导、rna编辑干扰、或聚a加尾的修饰)；(ii)用于疗法，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物调节治疗相关靶rna在所述真核细胞中的基因表达；(iii)用作抗病毒剂，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物调节毒力和/或致病性所需的病毒基因的基因表达；(iv)用于递送作为诊断剂的非治疗性非阴离子多核苷酸类似物货物；(v)用于制造药剂或诊断剂(例如，被配制用于局部、肠/胃肠(例如，口服)或肠胃外施用)；(vi)用于治疗癌症(例如，皮肤癌、基底细胞癌、痣样基底细胞癌综合征)、炎症或炎症相关疾病(例如，银屑病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、荨麻疹、干眼病、干性或湿性年龄相关性黄斑变性、指溃疡、光线性角化病、特发性肺纤维化)、疼痛(例如，慢性或急性)或影响肺的疾病(例如，囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)或特发性肺纤维化)；或(vii)(i)至(vi)的任何组合。26.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物或根据权利要求25所述的用于所述用途的组合物，其中所述真核细胞是动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、干细胞、原代细胞、免疫细胞、t细胞、nk细胞、树突细胞、上皮细胞、皮肤细胞、胃肠道细胞、肺细胞、或眼部细胞。27.一种用于修饰在真核细胞中的基因表达的方法，所述方法包括：(a)提供用于细胞内递送的非阴离子多核苷酸类似物货物，所述非阴离子多核苷酸类似物货物被设计成与所述真核细胞中的目的rna杂交；(b)提供独立于或不共价连接至所述非阴离子多核苷酸类似物货物的合成肽穿梭剂；(c)在存在所述合成肽穿梭剂的情况下使所述真核细胞与所述非阴离子多核苷酸类似物货物接触，与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比，所述合成肽穿梭剂的浓度足以增加所述非阴离子多核苷酸类似物货物的转导效率和/或胞质溶胶/细胞核递送，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物在胞质溶胶/细胞核递送后与所述目的rna杂交，从而实现基因表达修饰。28.根据权利要求27所述的方法，所述方法是体外方法(例如，用于治疗和/或诊断目的)。29.根据权利要求27所述的方法，所述方法是体内方法(例如，用于治疗和/或诊断目的)。30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中：(i)所述非阴离子多核苷酸类似物货物如权利要求1至6中任一项中所定义；(ii)所述合成肽穿梭剂如权利要求1或7至23中任一项中所定义；(iii)使所述真核细胞与一定浓度的如权利要求24中定义的非阴离子多核苷酸类似物货物和/或合成肽穿梭剂接触；(iv)所述方法用于如权利要求25中定义的用途；
(v)所述真核细胞如权利要求26中所定义；或(vi)(i)至(v)的任何组合。31.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物或根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述非阴离子多核苷酸类似物货物是靶向刺猬通路的基因的非阴离子反义寡核苷酸。32.根据权利要求31所述的组合物或根据权利要求31所述的方法，其中所述非阴离子反义寡核苷酸靶向gli1进行敲低。33.根据权利要求32所述的组合物或根据权利要求32所述的方法，其中所述其中所述非阴离子反义寡核苷酸与seq id no:365-368中的任一个的多核苷酸序列杂交。34.根据权利要求31至33中任一项所述的组合物或根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述组合物或方法用于治疗戈林综合征和/或基底细胞癌。

技术总结
本文描述了用于经由合成肽穿梭剂将非阴离子多核苷酸类似物货物递送至真核细胞的胞质溶胶/细胞核隔室的组合物和方法。所述非阴离子多核苷酸类似物货物能够是电荷中性或阳离子的，并且所述合成肽穿梭剂是包含具有带正电荷的亲水性外面和疏水性外面两者的两亲性α-螺旋基序的肽，其中合成肽穿梭剂不共价连接至或以在生理条件下可切割的方式连接至所述非阴离子多核苷酸类似物货物。所述非阴离子多核苷酸类似物货物能够是电荷中性或阳离子的反义合成寡核苷酸(ASO)，所述反义合成寡核苷酸与细胞内靶RNA杂交用于基因表达修饰。苷酸与细胞内靶RNA杂交用于基因表达修饰。苷酸与细胞内靶RNA杂交用于基因表达修饰。


技术研发人员：J-P
受保护的技术使用者：费尔丹生物公司
技术研发日：2021.10.18
技术公布日：2023/8/21