流式细胞术减弱报告物表达（FLARE）多种报告物系统及其使用方法与流程

流式细胞术减弱报告物表达(flare)多种报告物系统及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年11月19日提交的美国临时专利申请号63/116,094的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
3.序列表
4.本技术含有已以ascii格式电子提交并通过引用以其整体特此并入的序列表。2021年11月2日创建的所述ascii副本被命名为723336_sa9-271pc_st25.txt并且大小为16,727字节。
技术领域
5.本公开文本总体上涉及用于鉴定可用于产生治疗性和诊断性蛋白质的高产克隆的高通量系统和方法。


背景技术：

6.治疗性蛋白质的商业生产需要稳定、高表达的重组细胞系。现有技术方法通常依赖于二氢叶酸还原酶缺陷型(dhfr)中国仓鼠卵巢(cho)细胞系来制造可产生一种或多种所述蛋白质的克隆细胞系。在使用药剂如甲氨蝶呤(mtx)对转染的细胞池进行基于选择的重复扩增后，获得高产克隆。这个过程既费时又费力，并且无法特异性地鉴定将产生高水平蛋白质的克隆。
7.包括荧光激活细胞分选(facs)在内的流式细胞术已被用于改善高产cho细胞系的开发和选择。该技术能够从异质的转染细胞群快速鉴定和分离高产克隆，从而减少与随机克隆方法相关的劳动和时间。其可以鉴定所需的细胞，且无需对池进行重复的mtx扩增。
8.然而，经由基于facs的分选方法分离单细胞克隆后，筛选足够数量的克隆以分离稳定、高产细胞系仍然是耗时的过程。因此，在细胞系开发的这个阶段，高效且准确的筛选方法极为有利。另外，例如，在克隆开发的96孔板阶段实施筛选是可取的，因为它集中于对那些具有高生产力的克隆进一步扩增。细胞培养基收获物的分析通常用于鉴定分泌高水平的治疗性蛋白质的克隆。然而，这种方法不是最佳的，因为它没有考虑孔之间的细胞密度或培养基体积的差异。因此，它可能无法准确地预测具有高比生产力和高滴度的克隆。此外，必须经常花费精力为每种新的目的治疗性蛋白质开发和优化新的测定。
9.具有商业价值的蛋白质通常由两个或多个共价和/或非共价缔合的多肽链构成。作为异二聚体四聚体的igg抗体及其衍生物是此类蛋白质的例子。多链蛋白质的产生通常涉及单独多肽链的共表达以及完整蛋白质的分离。
10.wo 2008/036255披露了一种用于治疗性蛋白质的高通量开发的基于facs和报告蛋白的系统，其用于鉴定、选择和产生稳定且高度表达目的多肽的重组真核宿主细胞的克隆群。
11.wo 2017/062722披露了一种用于批量选择表达目标多肽的生产细胞的荧光激活
细胞分选(facs)的方法。
12.本领域仍然需要用于筛选克隆群以选择稳定产生高水平的目的多链蛋白质的重组细胞系的组合物和方法。本发明满足了这种需要并且还提供了相关的优点。


技术实现要素：

13.本文公开了可用于鉴定、选择和产生以高水平稳定表达目的多聚体多肽(“目标多肽”)的适合于开发和大规模产生所述目标多肽的重组哺乳动物宿主细胞的方法和组合物。所述方法和组合物将用于例如工程化抗体的开发和大规模产生，所述工程化抗体包括交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质。steinmetz a.等人(2016)mabs 8(5):867-878。
14.本公开文本的一个方面是一种用于以高水平表达多种目标多肽的方法，所述方法包括：
15.(a)培养多个哺乳动物宿主细胞，每个细胞包含多种重组多核苷酸，其中
16.每种重组多核苷酸包含启动子、编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列二者在同一mrna上转录，
17.其中所述培养是在允许每种独特细胞表面标记多肽在哺乳动物宿主细胞的表面上表达以及每种独特目标多肽表达的条件下进行的；
18.(b)使步骤(a)的所培养的哺乳动物宿主细胞与多种可检测药剂接触，每种可检测药剂能够独特地结合在所述哺乳动物宿主细胞的表面上表达的一种或多种所述独特细胞表面标记多肽；
19.(c)对来自步骤(b)的经接触的细胞进行至少一轮荧光激活细胞分选，从而选择被所述多种可检测药剂中的至少一种独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞；
20.(d)制备在步骤(c)中选择的哺乳动物宿主细胞的一个或多个克隆群；
21.(e)通过检测至少两种独特细胞表面标记多肽在每个所述克隆群上的表达水平来分析来自步骤(d)的一个或多个克隆群；
22.(f)选择具有所述至少两种独特细胞表面标记多肽的高表达水平的一个或多个克隆群；以及
23.(g)在允许以高水平表达所述多种目标多肽的条件下培养在步骤(f)中选择的一个或多个克隆群。
24.在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与至少第一可检测药剂和第二可检测药剂接触的细胞进行单轮荧光激活细胞分选，从而选择被至少所述第一可检测药剂和所述第二可检测药剂二者独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。
25.在某些实施方案中，步骤(c)包括
26.(c1)关于至少第一细胞表面标记多肽进行第一轮荧光激活细胞分选，从而选择被至少第一可检测药剂结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞；以及
27.(c2)对步骤(c1)中选择的细胞关于至少第二细胞表面标记多肽进行第二轮荧光激活细胞分选，从而选择被至少所述第一可检测药剂和所述第二可检测药剂二者结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。
28.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-28天进行的。
29.在某些实施方案中，步骤(e)中的分析包括流式细胞术。
30.在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的至少一种的表达水平高于步骤(e)中分析的克隆群的至少70％的相应表达水平。
31.在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的每一种的表达水平高于步骤(e)中分析的克隆群的至少70％的相应表达水平。
32.在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的至少第一种的表达水平高于步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的至少第二种的表达水平。
33.在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的第一种的表达水平高于步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的第二种的表达水平。
34.在某些实施方案中，所述方法还包括：
35.(h)从所述一个或多个选择的克隆群或从培养所述一个或多个选择的克隆群的细胞培养基分离步骤(g)中表达的至少第一独特目标多肽和第二独特目标多肽。
36.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2至8种独特目标多肽。
37.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2至4种独特目标多肽。
38.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2种独特目标多肽。
39.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含3种独特目标多肽。
40.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含4种独特目标多肽。
41.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列。
42.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸包含1至4个启动子、各自编码独特细胞表面标记多肽的1至4个核苷酸序列和各自编码独特目标多肽的1至4个核苷酸序列，其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列之一与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列之一在同一mrna上转录。
43.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸是双顺反子多核苷酸，其包含两个启动子和各自编码独特目标多肽的两个核苷酸序列，并且还包含各自编码独特细胞表面标记多肽的一个或两个核苷酸序列。
44.在某些实施方案中，每种双顺反子多核苷酸包含编码独特细胞表面标记多肽的单个核苷酸序列。
45.在某些实施方案中，每种双顺反子多核苷酸包含各自编码独特细胞表面标记多肽的两个核苷酸序列，并且其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列中的每一个与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列之一在同一mrna上转录。
46.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含1-4个启动子中的一个、编码独特细胞表面标记多肽的1-4个核苷酸序列中的一个和编码独特目标多肽的1-4个核苷酸序列中的一个。在某些实施方案中，每种重组多核苷酸包含一个启动子、一个编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和一个编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列在同一mrna上转录。
47.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
48.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含用于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。
49.在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。
50.在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自gtg和ttg。
51.在某些实施方案中，编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。
52.在某些实施方案中，至少第一重组多核苷酸从5'到3'包含第一启动子、编码第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码第一独特目标多肽的核苷酸序列；并且至少第二重组多核苷酸从5'到3'包含第二启动子、编码第二独特目标多肽的核苷酸序列和编码第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。
53.在某些实施方案中，所述第一重组多核苷酸还包含位于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
54.在某些实施方案中，所述第一重组多核苷酸还包含用于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。
55.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。
56.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子选自gtg和ttg。
57.在某些实施方案中，编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。
58.在某些实施方案中，所述第二重组多核苷酸还包含位于编码所述第二独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体入口位点(ires)。
59.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特目标多肽的核苷酸序列和编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。
60.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
61.在某些实施方案中，至少一个启动子是β-肌动蛋白启动子。
62.在某些实施方案中，每个启动子都是β-肌动蛋白启动子。
63.在某些实施方案中，至少一个启动子是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
64.在某些实施方案中，每个启动子都是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
65.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
66.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
67.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
68.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
69.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
70.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
71.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
72.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
73.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
74.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽是人cd52。
75.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽是人cd52。
76.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2是a。
77.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x4是a。
78.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:21(gqndtsx7tssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7是a。
79.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:22(gqndtsqx8ssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8是a。
80.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:23(gqndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8和x9中的每一个是a。
81.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:24(gqndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8和x
10
中的每一个是a。
82.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:25(gqndtsqx8x9x
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8、x9和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8、x9和x
10
中的每一个是a。
83.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:26(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2、x8和x9中的每一个是a。
84.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2、x8和x
10
中的每一个是a。
85.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7、x8和x9中的每一个是a。
86.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7、x8和x
10
中的每一个是a。
87.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4和x7中的每一个是独立地选自a、g、i、l和v。
88.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列组成，其中x4和x7中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
89.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列的变体人cd52。
90.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列组成。
91.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
92.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列组成。
93.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
94.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列组成。
95.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
96.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20
(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:23(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
97.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
98.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:15(gandtsqaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:17(gqndtsaaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
99.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:16(gandtsqasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:18(gqndtsaasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
100.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽包含治疗性多肽或治疗性蛋白质。
101.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。
102.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。
103.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是抗体的多肽。
104.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是抗体的多肽。
105.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。
106.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。
107.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是codv三抗体的多肽。
108.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是codv三抗体的多肽。
109.在某些实施方案中，所述重组哺乳动物宿主细胞是cho细胞。
110.本公开文本的另一方面是包含多种重组多核苷酸的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸包含启动子、编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列二者在同一mrna上转录。
111.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2至8种独特目标多肽。
112.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2至4种独特目标多肽。
113.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2种独特目标多肽。
114.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含3种独特目标多肽。
115.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含4种独特目标多肽。
116.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列。
117.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸包含1至4个启动子、各自编码独特细胞表面标记多肽的1至4个核苷酸序列和各自编码独特目标多肽的1至4个核苷酸序列，其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列之一与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列之一在同一mrna上转录。
118.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸是双顺反子多核苷酸，其包含两个启动子和各自编码独特目标多肽的两个核苷酸序列，并且还包含各自编码独特细胞表面标记多肽的一个或两个核苷酸序列。
119.在某些实施方案中，每种双顺反子多核苷酸包含编码独特细胞表面标记多肽的单个核苷酸序列。
120.在某些实施方案中，每种双顺反子多核苷酸包含各自编码独特细胞表面标记多肽的两个核苷酸序列，并且其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列中的每一个与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列之一在同一mrna上转录。
121.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含1-4个启动子中的一个、编码独特细胞表面标记多肽的1-4个核苷酸序列中的一个和编码独特目标多肽的1-4个核苷酸序列中的一个。在某些实施方案中，每种重组多核苷酸包含一个启动子、一个编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和一个编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列在同一mrna上转录。
122.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
123.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含用于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。
124.在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。
125.在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自gtg和ttg。
126.在某些实施方案中，编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。
127.在某些实施方案中，至少第一重组多核苷酸从5'到3'包含第一启动子、编码第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码第一独特目标多肽的核苷酸序列；并且至少第二重组多核苷酸从5'到3'包含第二启动子、编码第二独特目标多肽的核苷酸序列和编码第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。
128.在某些实施方案中，所述第一重组多核苷酸还包含位于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
129.在某些实施方案中，所述第一重组多核苷酸还包含用于编码所述第一独特细胞表
面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。
130.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。
131.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子选自gtg和ttg。
132.在某些实施方案中，编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。
133.在某些实施方案中，所述第二重组多核苷酸还包含位于编码所述第二独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体入口位点(ires)。
134.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特目标多肽的核苷酸序列和编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。
135.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
136.在某些实施方案中，至少一个启动子是β-肌动蛋白启动子。
137.在某些实施方案中，每个启动子都是β-肌动蛋白启动子。
138.在某些实施方案中，至少一个启动子是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
139.在某些实施方案中，每个启动子都是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
140.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
141.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
142.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
143.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
144.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
145.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
146.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
147.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
148.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
149.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽是人cd52。
150.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽是人cd52。
151.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2是a。
152.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x4是a。
153.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:21
(gqndtsx7tssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7是a。
154.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:22(gqndtsqx8ssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8是a。
155.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:23(gqndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8和x9中的每一个是a。
156.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:24(gqndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8和x
10
中的每一个是a。
157.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:25(gqndtsqx8x9x
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8、x9和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8、x9和x
10
中的每一个是a。
158.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:26(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2、x8和x9中的每一个是a。
159.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2、x8和x
10
中的每一个是a。
160.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7、x8和x9中的每一个是a。
161.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7、x8和x
10
中的每一个是a。
162.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4和x7中的每一个是独立地选自a、g、i、l和v。
163.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列组成，其中x4和x7中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
164.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列
的变体人cd52。
165.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列组成。
166.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
167.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列组成。
168.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
169.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列组成。
170.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
171.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:23(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
172.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
173.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:15(gandtsqaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:17(gqndtsaaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
174.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含
含有seq id no:16(gandtsqasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:18(gqndtsaasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
175.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽包含治疗性多肽或治疗性蛋白质。
176.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。
177.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。
178.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是抗体的多肽。
179.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是抗体的多肽。
180.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。
181.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。
182.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是codv三抗体的多肽。
183.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是codv三抗体的多肽。
184.在某些实施方案中，所述重组哺乳动物宿主细胞是cho细胞。
185.本公开文本的另一方面是包含由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。在某些在一些实施方案中，x2是a。
186.本公开文本的另一方面是包含由seq id no:20(gqnx4tsqtssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x4是a。
187.本公开文本的又另一方面是包含由seq id no:22(gqndtsqx8ssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8是a。
附图说明
188.图1是根据本公开文本的重组多核苷酸和相应的mrna转录物的示意性描绘。在该描绘中，仅显示了单个代表性重组多核苷酸。编码独特细胞表面标记多肽(报告物)的核苷酸序列具有ttg起始密码子，并且编码独特目标多肽(治疗性蛋白质)的核苷酸序列具有atg起始密码子。
189.图2a是描绘mab 4b10和7f11与表达野生型hcd52(wt)和10种hcd52单点突变体中的每一种的cho细胞的结合的图，每种突变体用丙氨酸(a)取代wt的指示氨基酸。还显示了与未转染的cho细胞(cho亲本)的结合。
190.图2b是描绘mab cf1d12、5f7、3g7、4g7、9d9和11c11与表达野生型hcd52(wt)和10种hcd52单点突变体中的每一种的cho细胞的结合的图，每种突变体用丙氨酸(a)取代wt的指示氨基酸。还显示了与未转染的cho细胞(cho亲本)的结合。
191.图2c是描绘mab campath-1h、2c3、12g6和23e6与表达野生型hcd52(wt)和10种hcd52单点突变体中的每一种的cho细胞的结合的图，每种突变体用丙氨酸(a)取代wt的指示氨基酸。还显示了与未转染的cho细胞(cho亲本)的结合。
192.图3描绘了天然(野生型)hcd52(seq id no:30)和工程化突变体hcd52(mut4；seq id no:31)的序列比对，后者包括具有最佳kozak背景的非aug(替代性)起始密码子、所有内部atg密码子的突变、消除的剪接位点以及在hcd52的氨基酸4处用丙氨酸取代天冬氨酸的
单点突变。mut4被campath-1h(c-1h)结合，但不被mab 9d9结合。所示的部分氨基酸序列对应于seq id no:4。
193.图4描绘了天然(野生型)hcd52(seq id no:30)和工程化突变体hcd52(mut8；seq id no:32)的序列比对，后者包括具有最佳kozak背景的非aug(替代性)起始密码子、所有内部atg密码子的突变、消除的剪接位点以及在hcd52的氨基酸8处用丙氨酸取代苏氨酸的单点突变。mut8被mab 9d9结合，但不被campath-1h(c-1h)结合。所示的部分氨基酸序列对应于seq id no:8。
194.图5描绘了天然(野生型)hcd52(seq id no:30)和工程化突变体hcd52(mut8/10；seq id no:33)的序列比对，后者包括具有最佳kozak背景的非aug(替代性)起始密码子、所有内部atg密码子的突变、消除的剪接位点以及在hcd52的氨基酸8处用丙氨酸取代苏氨酸和在hcd52的氨基酸10处用丙氨酸取代丝氨酸的两个点突变。mut8/10被mab9d9结合，但不被campath-1h(c-1h)结合。所示的部分氨基酸序列对应于seq id no:13。
195.图6是四个流式细胞术直方图，其描绘了campath-1h或9d9与指示的hcd52突变体的结合，其中编码每种hcd52突变体的多核苷酸具有atg起始密码子。
196.图7是四个流式细胞术直方图，其描绘了campath-1h或9d9与指示的hcd52突变体的结合，其中编码每种hcd52突变体的多核苷酸具有atg起始密码子。
197.图8是四个流式细胞术直方图，其描绘了campath-1h或9d9与指示的hcd52突变体的结合，其中编码每种hcd52突变体的多核苷酸具有指示的起始密码子(atg、ctg、gtg或ttg)。
198.图9是一对条形图，其描绘了campath-1h或9d9与mut4(左图)和mut8(右图)的相对结合，其中每种hcd52突变体由具有指示的起始密码子(atg、ctg、gtg或ttg)的多核苷酸编码。
199.图10是流式细胞术直方图，其描绘了报告物表达和目的基因(goi)表达的相对水平，这取决于报告物的起始密码子(atg/aug、ctg/cug、gtg或ttg)的选择。所描绘的部分序列对应于seq id no:35至38。
200.图11是一组条形图，其描绘了使用指示的hcd52突变体(mut4、mut2/8/9和mut7/8/9)和指示的抗体(7f11、9d9和campath-1h)的三报告物系统的方案。
201.图12是一组条形图，其描绘了使用指示的hcd52突变体(mut4、mut2/8/10和mut7/8/10)和指示的抗体(7f11、9d9和campath-1h)的三报告物系统的方案。
202.图13a是描绘编码codv三抗体的四个载体的示意图。在该系统中存在两种报告物。
203.图13b是描绘编码codv三抗体的两个双顺反子载体的示意图。在该系统中存在两种报告物。
具体实施方式
204.贯穿本公开文本，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过识别引用来引用。特此将这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用结合到本公开文本中，以更全面地描述本发明所属领域的现有技术。
205.如本文所用，特定术语具有以下定义的含义。
206.i.定义
207.除非另有指示，否则本发明的实践将采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见例如，sambrook,fritsch和maniatis,molecular cloning:a laboratory manual,第2版(1989)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel等人编辑,(1987))；系列丛书：methods in enzymology(academic press,inc.):pcr 2:a practical approach(m.j.macpherson.b.d.hames和g.r.taylor编辑(1995))、harlow和lane编辑(1988)antibodies,a laboratory manual以及animal cell culture(r.i.freshney编辑(1987))。
208.除非上下文另有明确指示，否则如说明书和权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
209.如本文所用，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
……
组成”应意指排除对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，如本文所定义的基本上由元素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体(如磷酸盐缓冲盐水)、防腐剂等。“由
……
组成”将意指排除超过微量的其他成分的元素以及用于施用本发明的组合物的实质方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
210.如本文所用，术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”意指任何长度的核苷酸聚合形式，其例子包括但不限于基因或基因片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、互补dna(cdna)、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离dna、任何序列的经分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。
211.如本文所用，术语“多肽”是指具有任何长度的氨基酸或氨基酸类似物的聚合体形式，其例子实包括全长单链多肽、全长单链蛋白质、全长单链多肽的片段、全长单链蛋白质的片段；全长多链多肽、全长多链蛋白质、全长多链多肽的片段、全长多链蛋白质的片段；以及多链多肽的全长单链、多链蛋白质的全长单链、全长多链多肽的单链的片段和全长多链蛋白质的单链的片段。
212.如本文所用，“多链多肽”或“多链蛋白质”是指由两个或更多个单链多肽构成的任何多肽或蛋白质。所述两个或更多个单链多肽可以通过共价键(例如，二硫键)和/或非共价键(例如，离子键或氢键)的任何组合缔合。例如，常规igg抗体由通过铰链区中的一个或多个二硫键连接的两条重链以及两条轻链构成，每条轻链与单个重链通过在其各自的可变轻链(vl)与可变重链(vh)结构域之间的一个或多个二硫键连接。作为另一个例子，codv三抗体由两条不同的重链(codv重链和fab重链，具有相互的杵和臼)和两条不同的轻链(codv轻链和fab轻链)构成。
213.多链蛋白质(也称为多聚体蛋白)的另外的例子包括同聚和异聚多聚体蛋白，包括但不限于某些酶、离子通道、受体、细胞粘附分子、电压门控钾通道和治疗性蛋白质(例如，胰岛素和α-半乳糖苷酶)。许多可溶性蛋白质和膜蛋白在细胞中形成同多聚体复合物，并且蛋白质数据库中的大多数蛋白质都是同多聚体。原核生物中约65％的蛋白质以及真核生物中55％的蛋白质以二聚体或更高阶复合物的形式(不包括非常高阶的结构，如细胞骨架、核
糖体等)存在。在复合物中，同聚体在单细胞物种中的频率是异聚体的约4倍，而这两种类型在脊椎动物中的频率相同。因此，异聚体在单细胞物种中构成约10％的蛋白质，而在脊椎动物中构成近30％的蛋白质。lynch m,mol biol evol.29(5):1353-1366(2012)。同寡聚体负责许多途径的多样性和特异性，并且它们可能介导和调节基因表达、酶活性、离子通道、受体和细胞粘附过程。神经元的质膜中的电压门控钾通道是异多聚体蛋白，其由四十个已知的α亚基中的四个构成。
214.如本文所用，术语“ires”或“具有ires生物活性的多核苷酸”旨在包括能够启动与ires可操作地连接的多核苷酸的翻译而没有真核细胞中帽位点的益处的任何分子，如多核苷酸或其逆转录物。ires或具有ires生物活性的多核苷酸可以与自然界中发现的序列相同，如小核糖核酸病毒ires，或者它们可以是当其被引入合适的宿主细胞中时执行相同功能的非天然存在的或非天然的序列。
215.如本文所用，术语“替代性起始密码子”旨在包括任何非atg多核苷酸(通常为三联体)，其用作翻译起始的起始位点，且具有相对于atg起始密码子的效率降低的效率。天然存在的替代性起始密码子使用是本领域已知的并且描述于例如kozak(1991)j cell biol.115(4):887-903；mehdi等人(1990)gene 91:173-178；kozak(1989)mol cell biol.9(11):5073-5080。一般来说，与atg的翻译效率相比，替代性起始密码子具有降低的翻译效率；例如，与atg的翻译效率(100％)相比，替代性起始密码子gtg可能具有3％-5％的翻译效率。替代性起始密码子的翻译效率也可能受其序列背景的影响：例如，据报道，最佳kozak共有序列对替代性起始密码子的翻译起始具有积极影响。mehdi等人(1990)gene91:173-178；kozak(1989)mol cell biol.9(11):5073-5080。完整的kozak共有序列是gccrccatgg(seq id no:34)，其中起始密码子atg为粗体，atg起始密码子的a指定为+1位置，并且位置-3处的“r”为嘌呤(a或g)。这两个最高度保守位置是嘌呤，优选地是位于-3处的a和位于+4处的g(kozak(1991)j cell biol.115(4):887-903)。用于选择标记物的减弱表达的替代性起始密码子使用描述于美国专利公开2006/0172382和美国专利公开2006/0141577。本领域技术人员将认识到本文描述为dna的序列将具有作为rna分子的相关序列，例如，dna序列atg将对应于rna序列aug。
216.如本文所用，“高表达水平”是指这样的表达水平，其高于所分析的总细胞的至少50％、70％、80％、90％、95％或99％的表达水平。
217.如本文所用，“cd20”是指在b细胞的表面上表达的四次跨膜蛋白，从前b细胞阶段开始并且也在骨髓和外周中的成熟b细胞上表达。cd20呈现三个表面可用的抗原区域。人和小鼠cd20的cdna和氨基酸序列可从genbank获得，例如登录号nm_152866、nm_021950和nm_152867(人)；nm_007641(小鼠)；np_068769、np_690605和np_690606(人)；以及np_031667(小鼠)。全长人cd20的长度为297个氨基酸，并且全长小鼠cd20的长度为291个氨基酸。
218.cd52(也称为campath-1h抗原)是指在成熟淋巴细胞上表达的短糖蛋白；虽然其功能尚不清楚，但认为其抑制细胞粘附。人和小鼠cd52的cdna和氨基酸序列可从genbank获得，例如登录号bc000644(人)；nm_013706(小鼠)；aah00644(人)；以及edl30035(小鼠)。全长人cd52的长度为61个氨基酸，包括42个氨基酸的信号序列，并且全长小鼠cd52的长度为74个氨基酸，包括23个氨基酸的信号序列。
219.cd59(也称为膜攻击复合物(mac)抑制蛋白和保护素)是一种细胞表面糖蛋白，其
抑制补体组分c9聚合以及形成膜攻击复合物。人和小鼠cd59的cdna和氨基酸序列可从genbank获得，例如登录号nm_203331、nm_0006111、nm_001127223、nm_001127225和nm_001127226(人)；nm_181858和nm_001368215(小鼠)；np_000602、np_001120695、np_001120697、np_001120698和np_001120699(人)；以及np_862906和np_001355144(小鼠)。全长人cd59的长度为128个氨基酸，包括25个氨基酸的信号序列，并且全长小鼠cd59的长度为129个氨基酸，包括23个氨基酸的信号序列。
220.如本文所用，“治疗性多肽”或“治疗性蛋白质”是指可在宿主细胞中和在本文例示的方面中产生的任何蛋白质或多肽，其由于作为治疗剂或药物的潜力而被选择，例如，抗体、抗体片段、抗体样分子(例如，交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质)或酶。
221.ii.方法
222.本公开文本的一个方面是一种用于以高水平表达多种目标多肽的方法，所述方法包括：
223.(a)培养多个哺乳动物宿主细胞，每个细胞包含多种重组多核苷酸，其中
224.每种重组多核苷酸包含启动子、编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列二者在同一mrna上转录，
225.其中所述培养是在允许每种独特细胞表面标记多肽在哺乳动物宿主细胞的表面上表达以及每种独特目标多肽表达的条件下进行的；
226.(b)使步骤(a)的所培养的哺乳动物宿主细胞与多种可检测药剂接触，每种可检测药剂能够独特地结合在所述哺乳动物宿主细胞的表面上表达的一种或多种所述独特细胞表面标记多肽；
227.(c)对来自步骤(b)的经接触的细胞进行至少一轮荧光激活细胞分选，从而选择被所述多种可检测药剂中的至少一种独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞；
228.(d)制备在步骤(c)中选择的哺乳动物宿主细胞的一个或多个克隆群；
229.(e)通过检测至少两种独特细胞表面标记多肽在每个所述克隆群上的表达水平来分析来自步骤(d)的一个或多个克隆群；
230.(f)选择具有所述至少两种独特细胞表面标记多肽的高表达水平的一个或多个克隆群；以及
231.(g)在允许以高水平表达所述多种目标多肽的条件下培养在步骤(f)中选择的一个或多个克隆群。
232.所述多个哺乳动物宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞群，例如哺乳动物细胞的细胞系的细胞群。在步骤(a)中，所述多个细胞或细胞群通常包括100个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、10,000个或更多个、50,000个或更多个、100,000个或更多个、500,000个或更多个、或106个或更多个细胞。所述细胞通常全部为一种类型，例如，cho细胞、hek-293细胞、bhk-21细胞、hepg2细胞、bae-1细胞、sh-sy5y细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、hela细胞、vero细胞、nih3t3细胞、wehi231细胞、yac细胞、jurkat细胞及其衍生物，例如cho-k1细胞和cho/dhfr-细胞。
233.在允许每种独特细胞表面标记多肽在哺乳动物宿主细胞的表面上表达以及每种独特目标多肽表达的条件下的培养可以包括例如对于哺乳动物细胞在组织培养中的典型
条件，例如，37℃下在补充有5％co2的加湿空气中在合适的培养基(如dmem、ham's f12或无血清培养基)中，所述培养基任选地补充有牛胎儿血清(fcs)或胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺和青霉素/链霉素)。所述培养可以以任何合适的形式进行，例如多孔板培养、培养皿培养、大批培养或生物反应器培养。所述培养可以为细胞表面标记多肽的表达留出时间，以及为细胞群扩增留出时间。
234.所述多种重组多核苷酸包括两种或更多种不同的重组多核苷酸。在某些实施方案中，所述多种重组多核苷酸包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种或更多种不同的重组多核苷酸。在某些实施方案中，所述多种重组多核苷酸包括2种不同的重组多核苷酸。在某些实施方案中，所述多种重组多核苷酸包括3种不同的重组多核苷酸。在某些实施方案中，所述多种重组多核苷酸包括4种不同的重组多核苷酸。在某些实施方案中，所述多种重组多核苷酸包括5种不同的重组多核苷酸。在某些实施方案中，所述多种重组多核苷酸包括6种不同的重组多核苷酸。在某些实施方案中，所述多种重组多核苷酸包括7种不同的重组多核苷酸。在某些实施方案中，所述多种重组多核苷酸包括8种不同的重组多核苷酸。
235.当然，每个哺乳动物宿主细胞可以含有每种重组多核苷酸的多于单个拷贝。例如，每个哺乳动物宿主细胞可以含有每种重组多核苷酸的约101至约106个拷贝。
236.另外，每个哺乳动物宿主细胞可以含有每种重组多核苷酸的大约相同数量或不同数量的拷贝。在某些实施方案中，优选每个哺乳动物宿主细胞含有至少两种不同的重组多核苷酸的大约相同数量的拷贝。在某些实施方案中，优选每个哺乳动物宿主细胞含有每种重组多核苷酸的大约相同数量的拷贝。在某些其他实施方案中，优选每个哺乳动物宿主细胞含有至少两种不同的重组多核苷酸的不同数量的拷贝。在某些其他实施方案中，优选每个哺乳动物宿主细胞含有每种重组多核苷酸的不同数量的拷贝。每种不同的重组多核苷酸的拷贝数量可以基于用于将所述不同的重组多核苷酸引入宿主哺乳动物细胞中的条件而变化和选择。
237.每种重组多核苷酸包含启动子、编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列二者在同一mrna上转录。
238.因为每种重组多核苷酸包含编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列，并且因为编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列二者均在同一mrna上转录，所以每个哺乳动物宿主细胞可以表达与存在的不同重组多核苷酸一样多的独特即不同的细胞表面标记多肽。例如，用两种不同的重组多核苷酸转染的哺乳动物宿主细胞可以表达两种独特即不同的细胞表面标记多肽。类似地，用三种不同的重组多核苷酸转染的哺乳动物宿主细胞可以表达三种独特即不同的细胞表面标记多肽，以此类推。无论编码独特即不同的细胞表面标记多肽的核苷酸序列的数量是多少，每种这样的细胞表面标记多肽的表达将与相应的独特即不同的目标多肽的表达相关联。
239.类似地，因为每种重组多核苷酸包含编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列，并且因为编码独特目标多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列二者均在同一mrna上转录，所以每个哺乳动物宿主细胞可以表达与存在的不同重组多核苷酸一样多的独特即不同的目标多肽。例如，用两种不同的重组多核苷酸转染的哺乳动物宿主细胞可以表达两种独特即不同的目标多肽。类似地，用三种不同的重组多核苷酸转染的哺乳动物宿
主细胞可以表达三种独特即不同的目标多肽，以此类推。无论编码独特即不同的目标多肽的核苷酸序列的数量是多少，每种这样的目标多肽的表达将与相应的独特即不同的细胞表面标记多肽的表达相关联。
240.步骤(b)涉及使步骤(a)的所培养的哺乳动物宿主细胞与多种可检测药剂接触，每种可检测药剂能够独特地结合在所述哺乳动物宿主细胞的表面上表达的一种或多种所述独特细胞表面标记多肽。在某些实施方案中，至少一种独特可检测药剂能够仅结合一种独特细胞表面标记多肽。在某些实施方案中，每种独特可检测药剂能够仅结合一种独特细胞表面标记多肽。在某些实施方案中，至少一种独特可检测药剂能够结合多于一种独特细胞表面标记多肽；例如，这种独特可检测药剂可以能够结合两种不同的即独特细胞表面标记多肽。
241.步骤(c)涉及对来自步骤(b)的经接触的细胞进行至少一轮荧光激活细胞分选(facs)，从而选择被所述多种可检测药剂中的至少一种独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与至少第一可检测药剂和第二可检测药剂接触的细胞进行单轮facs，从而选择被至少所述第一可检测药剂和所述第二可检测药剂二者独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与3种或更多种可检测药剂接触的细胞进行单轮facs，从而选择被所述3种或更多种可检测药剂独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与3种可检测药剂接触的细胞进行单轮facs，从而选择与所述3种可检测药剂独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。
242.在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与4种可检测药剂接触的细胞进行单轮facs，从而选择与所述4种可检测药剂独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与5种可检测药剂接触的细胞进行单轮facs，从而选择与所述5种可检测药剂独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与6种可检测药剂接触的细胞进行单轮facs，从而选择与所述6种可检测药剂独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与7种可检测药剂接触的细胞进行单轮facs，从而选择与所述7种可检测药剂独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。在某些实施方案中，步骤(c)包括对来自步骤(b)的与8种可检测药剂接触的细胞进行单轮facs，从而选择与所述8种可检测药剂独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。
243.在某些实施方案中，步骤(c)包括
244.(c1)关于至少第一细胞表面标记多肽进行第一轮荧光激活细胞分选，从而选择被至少第一可检测药剂结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞；以及
245.(c2)对步骤(c1)中选择的细胞关于至少第二细胞表面标记多肽进行第二轮荧光激活细胞分选，从而选择被至少所述第一可检测药剂和所述第二可检测药剂二者结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。
246.当然，在某些实施方案中，还进行了另外几轮facs，从而选择被任何数量的特定可检测药剂结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。例如，在某些实施方案中，步骤(c)还包括
247.(c3)对步骤(c2)中选择的细胞关于至少第三细胞表面标记多肽进行第三轮facs，从而选择被至少所述第一、第二和第三可检测药剂结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。
248.类似地，在某些实施方案中，步骤(c)还包括
249.(c4)对步骤(c3)中选择的细胞关于至少第四细胞表面标记多肽进行第四轮facs，从而选择被至少所述第一、第二、第三和第四可检测药剂结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。
250.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-14天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-13天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-12天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-11天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-10天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-9天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-8天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7-9天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后7天进行的。
251.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8-14天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8-13天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8-12天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8-11天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8-10天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8-9天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后8天进行的。
252.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后9-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后9-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后9-14天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后9-13天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后9-12天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后9-11天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后9-10天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后9天进行的。
253.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后10-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后10-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后10-14天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后10-13天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后10-12天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后10-11天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后10天进行的。
254.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后11-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后11-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后11-14天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后11-13天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后11-12天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后11天进行的。
255.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后12-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后12-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后12-14天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后12-13天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后12天进行的。
256.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后13-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后13-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后13-14天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后13天进行的。
257.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后14-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后14-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后14天进行的。
258.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后15-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后15-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后15天进行的。
259.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后16-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后16-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后16天进行的。
260.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后17-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后17-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后17天进行的。
261.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后18-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后18-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后18天进行的。
262.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后19-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后19-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后19天进行的。
263.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后20-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后20-21天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后20天进行的。
264.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后21-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后21天进行的。
265.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后22-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后22天进行的。
266.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后23-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后23天进行的。
267.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后24-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后24天进行的。
268.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后25-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后25天进行的。
269.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后26-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后26天进行的。
270.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后27-28天进行的。在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后27天进行的。
271.在某些实施方案中，步骤(e)是在步骤(d)之后28天进行的。
272.在某些实施方案中，步骤(e)中的分析包括流式细胞术。在某些实施方案中，步骤(e)中的流式细胞术分析包括细胞分选。在某些其他实施方案中，步骤(e)中的流式细胞术分析不包括细胞分选。
273.在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的至少一种的表达水平高于步骤(e)中分析的克隆群的至少70％的相应表达水平。例如，如果所述多种独特细胞表面标记多肽之一是cd52，则步骤(f)中cd52的表达水平可以高于步骤(e)中所分析的克隆群的至少70％的cd52表达水平。在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的至少一种是一种独特细胞表面标记物。在某些其他实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的至少一种是两种独特细胞表面标记多肽。在某些其他实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的至少一种是三种独特细胞表面标记多肽、四种独特细胞表面标记多肽等。相同的原则加以必要的修正适用于任何数量的独特细胞表面标记多肽。
274.在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的每一种的表达水平高于步骤(e)中分析的克隆群的至少70％的相应表达水平。
275.在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的至少第一种的表达水平高于步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的至少第二种的表达水平。例如，如果所述多种独特细胞表面标记多肽中的一种是第一cd52变体且所述多种独特细胞表面标记多肽中的另一种是第二cd52变体，则步骤(f)中至少所述第一cd52变体的表达水平可以高于步骤(f)中至少所述第二cd52变体的表达水平。类似地，如果所述多种独特细胞表面标记多肽中的一种是第一cd52变体，所述多种独特细胞表面标记多肽中的另一种是第二cd52变体，并且所述多种独特细胞表面标记多肽中的又另一种是第三cd52变体，则步骤(f)中至少所述第一cd52变体的表达水平可以高于步骤(f)中所述第二cd52变体和所述第三cd52变体二者的表达水平。作为另一个例子，如果所述多种独特细胞表面标记多肽中的一种是第一cd52变体，所述多种独特细胞表面标记多肽中的另一种是第二cd52变体，并且所述多种独特细胞表面标记多肽中的又另一种是第三cd52变体，则步骤(f)中至少所述第一cd52变体的表达水平和所述第二cd52变体的表达水平可以高于步骤(f)中所述第三cd52变体的表达水平。相同的原则适加以必要的修正适用于任何数量的独特细胞表面标记多肽。
276.在某些实施方案中，步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的第一种的表达水平高于步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的第二种的表达水平。
277.在某些实施方案中，所述方法还包括：
278.(h)从所述一个或多个选择的克隆群或从培养所述一个或多个选择的克隆群的细胞培养基分离步骤(g)中表达的至少第一独特目标多肽和第二独特目标多肽。可以使用用于分离或纯化所需的表达的目标多肽的任何合适的方法。例如，在某些实施方案中，所述分离可以涉及亲和色谱、凝胶过滤/尺寸排阻、疏水相互作用色谱、免疫沉淀、离子交换色谱或其任何组合。对于分泌的目标多肽，可以直接从细胞培养基或从透析液和/或从其浓缩液进行所述分离或纯化。对于其他目标多肽，所述分离或纯化可以包括细胞裂解步骤或膜破坏步骤。此类一般的分离和纯化方法是本领域技术人员熟知的。
279.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2至8种独特目标多肽。
280.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2至4种独特目标多肽。
281.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2种独特目标多肽。
282.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含3种独特目标多肽。
283.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含4种独特目标多肽。
284.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含5种独特目标多肽。
285.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含6种独特目标多肽。
286.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含7种独特目标多肽。
287.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含8种独特目标多肽。
288.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含8种或更多种独特目标多肽。
289.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列。
290.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
291.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含用于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。
292.在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。也就是说，替代性(非atg)起始密码子可以相同或不同；可以部分或全部相同，或者可以部分或全部不同。
293.在某些实施方案中，至少一个替代性起始密码子是ctg。
294.在某些实施方案中，至少一个替代性起始密码子是gtg。
295.在某些实施方案中，至少一个替代性起始密码子是ttg。
296.在某些实施方案中，至少一个替代性起始密码子是att。
297.在某些实施方案中，至少一个替代性起始密码子是ata。
298.在某些实施方案中，至少一个替代性起始密码子是acg。
299.在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自gtg和ttg。在某些实施方案中，至少一个替代性起始密码子是gtg。在某些实施方案中，至少一个替代性起始密码子是ttg。在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子是gtg。在某些其他实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子是ttg。
300.在某些实施方案中，编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。
301.在某些实施方案中，至少第一重组多核苷酸从5'到3'包含第一启动子、编码第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码第一独特目标多肽的核苷酸序列；并且至少第二重组多核苷酸从5'到3'包含第二启动子、编码第二独特目标多肽的核苷酸序列和编码第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。如上所述，本公开文本还考虑了如下实施方案，所述实施方案还可以包括但不限于具有相应元件的至少第三重组多核苷酸、具有相应元件的至少第四重组多核苷酸、具有相应元件的至少第五重组多核苷酸、具有相应元件的至少第六重组多核苷酸、具有相应元件的至少第七重组多核苷酸以及具有相应元件的至少第八重组多核苷酸。
302.在某些实施方案中，所述第一重组多核苷酸还包含位于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
303.在某些实施方案中，所述第一重组多核苷酸还包含用于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。
304.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。
305.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子选自gtg和ttg。
306.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子是ctg。
307.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子是gtg。
308.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子是ttg。
309.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子是att。
310.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子是ata。
311.在某些实施方案中，所述替代性的(非atg)起始密码子是acg。
312.在某些实施方案中，编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。
313.在某些实施方案中，所述第二重组多核苷酸还包含位于编码所述第二独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体入口位点(ires)。
314.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特目标多肽的核苷酸序列和编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。
315.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
316.每个启动子的选择独立于任何其他启动子。在某些实施方案中，没有两个启动子是相同的。在某些实施方案中，至少两个启动子是相同的。在某些实施方案中，所有启动子都是相同的。
317.在某些实施方案中，至少一个启动子是β-肌动蛋白启动子。
318.在某些实施方案中，每个启动子都是β-肌动蛋白启动子。
319.在某些实施方案中，至少一个启动子是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
320.在某些实施方案中，每个启动子都是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
321.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
322.如本文所用，除非另有说明，否则cd20、cd52和cd59包括cd20、cd52和cd59的人和非人形式。在某些实施方案中，cd20是人cd20(hcd20)。在某些实施方案中，cd52是人cd52(hcd52)。在某些实施方案中，cd59是人cd59(hcd59)。cd20、cd52和cd59的非人形式包括但不限于cd20、cd52和cd59的小鼠、大鼠和非人灵长类形式。
323.如本文所用，“变体”是指指定分子的突变形式，其中至少一个氨基酸残基与野生
型分子不同。例如，与野生型多肽相比，“变体”可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个点突变，前提是所述变体能够在宿主哺乳动物细胞的表面上表达。对于具有两个或更多个点突变的变体，所述突变可以彼此相邻或不相邻。在一些实施方案中，至少两个点突变彼此相邻。在某些其他实施方案中，没有两个点突变彼此相邻。在一些实施方案中，一些点突变彼此相邻，并且其他点突变彼此不相邻。
324.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是cd20或其变体。
325.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是cd20。
326.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是变体cd20。
327.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是cd52或其变体。
328.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是cd52。
329.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是变体cd52。
330.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是cd59或其变体。
331.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是cd59。
332.在某些实施方案中，所述第一独特细胞表面标记多肽是变体cd59。
333.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。在此类实施方案中，所述第一和第二独特细胞表面标记多肽彼此不同。例如，所述第一独特细胞表面标记多肽可以是野生型cd52，并且第二独特细胞表面标记多肽可以是变体cd52。作为另一个例子，所述第一独特细胞表面标记多肽可以是第一变体cd52，并且所述第二独特细胞表面标记多肽可以是第二变体cd52，其中所述第一和第二变体cd52分子是不同的。
334.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
335.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
336.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。在此类实施方案中，所述第一和第二独特细胞表面标记多肽彼此不同。例如，所述第一独特细胞表面标记多肽可以是野生型人cd52，并且第二独特细胞表面标记多肽可以是变体人cd52。作为另一个例子，所述第一独特细胞表面标记多肽可以是第一变体人cd52，并且所述第二独特细胞表面标记多肽可以是第二变体人cd52，其中所述第一和第二变体人cd52分子不同。
337.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
338.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
339.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
340.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
341.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽是人cd52。
342.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽是人cd52。
343.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2是a。
344.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。在某些实施
方案中，x4是a。
345.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:21(gqndtsx7tssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7是a。
346.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:22(gqndtsqx8ssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8是a。
347.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:23(gqndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8和x9中的每一个是a。
348.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:24(gqndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8和x
10
中的每一个是a。
349.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:25(gqndtsqx8x9x
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8、x9和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8、x9和x
10
中的每一个是a。
350.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:26(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2、x8和x9中的每一个是a。
351.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2、x8和x
10
中的每一个是a。
352.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7、x8和x9中的每一个是a。
353.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7、x8和x
10
中的每一个是a。
354.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4和x7中的每一个是独立地选自a、g、i、l和v。
355.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列组成，其中x4和x7中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
356.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2
(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列的变体人cd52。
357.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列组成。
358.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
359.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列组成。
360.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
361.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列组成。
362.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
363.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:23(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
364.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
365.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:15(gandtsqaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:17(gqndtsaaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
366.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:16(gandtsqasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:18(gqndtsaasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
367.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽包含治疗性多肽或治疗性蛋白质。
368.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。
369.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。
370.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是抗体的多肽。
371.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是抗体的多肽。
372.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质三抗体的多肽。
373.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。在某些实施方案中，每种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质三抗体的多肽。
374.所述重组哺乳动物宿主细胞可以是能够根据本文公开的方法和/或组合物表达一种或多种所述目标多肽的任何哺乳动物细胞或细胞系。在某些实施方案中，所述重组哺乳动物宿主细胞选自cho细胞、hek-293细胞、bhk-21细胞、hepg2细胞、bae-1细胞、sh-sy5y细胞、骨髓瘤细胞(例如，sp2/0-ag14)、杂交瘤细胞、hela细胞、vero细胞、nih3t3细胞、wehi231细胞、yac细胞、jurkat细胞及其衍生物，例如cho-k1细胞和cho/dhfr-细胞。在某些实施方案中，所述重组哺乳动物宿主细胞是cho细胞。
375.iii.组合物
376.本公开文本的另一方面是包含多种重组多核苷酸的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸包含启动子、编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列二者在同一mrna上转录。
377.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2至8种独特目标多肽。
378.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2至4种独特目标多肽。
379.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含2种独特目标多肽。
380.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含3种独特目标多肽。
381.在某些实施方案中，所述多种独特目标多肽包含4种独特目标多肽。
382.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列。
383.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
384.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含用于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述独特目标多肽的
核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。
385.在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。
386.在某些实施方案中，每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自gtg和ttg。
387.在某些实施方案中，编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。
388.在某些实施方案中，至少第一重组多核苷酸从5'到3'包含第一启动子、编码第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码第一独特目标多肽的核苷酸序列；并且至少第二重组多核苷酸从5'到3'包含第二启动子、编码第二独特目标多肽的核苷酸序列和编码第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。
389.在某些实施方案中，所述第一重组多核苷酸还包含位于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
390.在某些实施方案中，所述第一重组多核苷酸还包含用于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。
391.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。
392.在某些实施方案中，所述替代性(非atg)起始密码子选自gtg和ttg。
393.在某些实施方案中，编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。
394.在某些实施方案中，所述第二重组多核苷酸还包含位于编码所述第二独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体入口位点(ires)。
395.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特目标多肽的核苷酸序列和编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。
396.在某些实施方案中，每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。
397.在某些实施方案中，至少一个启动子是β-肌动蛋白启动子。
398.在某些实施方案中，每个启动子都是β-肌动蛋白启动子。
399.在某些实施方案中，至少一个启动子是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
400.在某些实施方案中，每个启动子都是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
401.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
402.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
403.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。
404.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
405.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
406.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。
407.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
408.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
409.在某些实施方案中，每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。
410.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽是人cd52。
411.在某些实施方案中，至少第二独特细胞表面标记多肽是人cd52。
412.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2是a。
413.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x4是a。
414.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:21(gqndtsx7tssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7是a。
415.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:22(gqndtsqx8ssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8是a。
416.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:23(gqndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8和x9中的每一个是a。
417.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:24(gqndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8和x
10
中的每一个是a。
418.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:25(gqndtsqx8x9x
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8、x9和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8、x9和x
10
中的每一个是a。
419.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:26(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2、x8和x9中的每一个是a。
420.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x2、x8和x
10
中的每一个是a。
421.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7、x8和x9中的每一个是a。
422.在某些实施方案中，至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x
10
中的每一个独立地
选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x7、x8和x
10
中的每一个是a。
423.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4和x7中的每一个是独立地选自a、g、i、l和v。
424.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列组成，其中x4和x7中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
425.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列的变体人cd52。
426.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列组成。
427.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
428.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列组成。
429.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
430.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列组成。
431.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
432.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:23(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三
独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
433.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
434.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:15(gandtsqaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:17(gqndtsaaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
435.在某些实施方案中，至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:16(gandtsqasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:18(gqndtsaasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。
436.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽包含治疗性多肽或治疗性蛋白质。
437.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。
438.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。
439.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是抗体的多肽。
440.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是抗体的多肽。
441.在某些实施方案中，至少一种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。
442.在某些实施方案中，每种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。
443.在某些实施方案中，所述重组哺乳动物宿主细胞是cho细胞。
444.本公开文本的另一方面是包含由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。在某些在一些实施方案中，x2是a。
445.本公开文本的又另一方面是包含由seq id no:20(gqnx4tsqtssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x4是a。
446.本公开文本的又另一方面是包含由seq id no:21(gqndtsqx8ssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。在某些实施方案中，x8是a。
447.实施例
448.实施例1.新型抗hcd52单克隆抗体的产生和表征
449.用人cd52(hcd52)免疫小鼠，然后使用常规方法从结合抗体制备表达鼠单克隆抗hcd52抗体的11种克隆。然后再次使用常规方法将这11种单克隆抗体转化为具有小鼠可变区和人恒定区的嵌合单克隆抗体。进行了11种克隆对hcd52肽模拟表位(mimetope)的亲和力。这11种克隆示于表1。
450.表1：抗hcd52表达克隆
[0451][0452][0453]
nd，未进行
[0454]
*campath-1h具有68nm的测量kd。
[0455]
接下来，根据对hcd52肽模拟表位的截短的和丙氨酸扫描系列的基于elisa的结合谱来表征克隆。与campath-1h(c-1h)进行了比较。结果示于表2和表3。表2显示c-1h主要与hcd52的c末端区域结合，而9d9、11c11、3g7和cf1d12主要与hcd52的n末端区域结合。这些结果与表3中所示的数据大体一致，即hcd52的c末端区域中的丙氨酸扫描消除了与c-1h的结合，而hcd52的n末端区域中的丙氨酸扫描消除了与9d9、11c11和3g7的结合。
[0456]
这些克隆(抗体)中的某些克隆还根据其基于facs的结合谱进行了表征。简而言之，hcd52和对应于表3中肽模拟表位的hcd52的单独丙氨酸扫描变体单独地由cho细胞表达，然后使用本实施例中描述的所选择的抗体(4b10、7f11、cf1d12、5f7、3g7、4g7、9d9、11c11、campath-1h、2c3、12g8和23e6)通过facs进行分析。测试抗原的氨基酸序列如下：
[0457]
mut1 aqndtsqtssps seq id no:1
[0458]
mut2 gandtsqtssps seq id no:2
[0459]
mut3 gqadtsqtssps seq id no:3
[0460]
mut4 gqnatsqtssps seq id no:4
[0461]
mut5 gqndasqtssps seq id no:5
[0462]
mut6 gqndtaqtssps seq id no:6
[0463]
mut7 gqndtsatssps seq id no:7
[0464]
mut8 gqndtsqassps seq id no:8
[0465]
mut9 gqndtsqtasps seq id no:9
[0466]
mut10 gqndtsqtsaps seq id no:10
[0467]
wt gqndtsqtssps seq id no:11
[0468]
结果示于图2a-图2c，其显示在细胞表面呈现的hcd52丙氨酸突变体4
[0469]
(gqnatsqtssps；seq id no:4)与8(gqndtsqassps；seq id no:8)之间，campath-1h和克隆9d9有明显区别。
[0470]
这些研究的结果为开发如下系统的可能性提供了原理验证，所述系统用于通过评估相应独特细胞表面标记多肽的表达来监测单独细胞中多种不同目标多肽的共表达。
[0471]
[0472][0473]
实施例2.编码可用作独特细胞表面标记多肽的示例性hcd52突变体的多核苷酸构建体制备了编码hcd52的各种突变体形式的多核苷酸，包括具有最佳kozak背景的非aug(替
代性)起始密码子、所有内部atg密码子的突变、消除的剪接位点以及用丙氨酸取代hcd52的所选择的氨基酸的单点突变。
[0474]
图3描绘了天然(野生型)hcd52(seq id no:30)和工程化突变体hcd52(mut4；seq id no:31)的序列比对，后者包括具有最佳kozak背景的非aug(替代性)起始密码子、所有内部atg密码子的突变、消除的剪接位点以及在hcd52的氨基酸4处用丙氨酸取代天冬氨酸的单点突变。mut4被campath-1h(c-1h)结合，但不被mab 9d9结合。
[0475]
图4描绘了天然(野生型)hcd52(seq id no:30)和工程化突变体hcd52(mut8；seq id no:32)的序列比对，后者包括具有最佳kozak背景的非aug(替代性)起始密码子、所有内部atg密码子的突变、消除的剪接位点以及在hcd52的氨基酸8处用丙氨酸取代苏氨酸的单点突变。mut8被mab 9d9结合，但不被campath-1h(c-1h)结合。
[0476]
图5描绘了天然(野生型)hcd52(seq id no:30)和工程化双突变体hcd52(mut8/10；seq id no:33)的序列比对，后者包括具有最佳kozak背景的非aug(替代性)起始密码子、所有内部atg密码子的突变、消除的剪接位点以及在hcd52的氨基酸8处用丙氨酸取代苏氨酸和在hcd52的氨基酸10处用丙氨酸取代丝氨酸的两个点突变。与mut8类似，mut8/10被mab 9d9结合，但不被campath-1h(c-1h)结合。
[0477]
实施例3.编码可用作独特细胞表面标记多肽的示例性hcd52突变体的另外的多核苷酸构建体
[0478]
将cho细胞用编码以下hcd52突变体的多核苷酸转染：mut4、mut8、mut8/9、mut8/10和mut8/9/10。所有突变体都具有atg起始密码子。使用荧光团标记的campath-1h和9d9抗体通过facs分析细胞。结果示于图6和图7。
[0479]
图6是四个流式细胞术直方图，其描绘了campath-1h或9d9与表达hcd52的mut4(seq id no:4)或mut8/10(seq id no:13)的细胞的结合，其中编码每种hcd52突变体的多核苷酸具有atg起始密码子。所述图表明使用campath-1h和9d9可以容易地区分mut4突变体与mut8/10突变体。
[0480]
图7是四个流式细胞术直方图，其描绘了campath-1h或9d9与表达hcd52的mut4(seq id no:4)、mut8(seq id no:8)、mut8/9(seq id no:12)、mut8/10(seq id no:13)或mut8/9/10(seq id no:14)的结合，其中编码每种hcd52突变体的多核苷酸具有atg起始密码子。所述图表明使用campath-1h和9d9可以容易地区分mut4突变体与所有四个含有mut8的突变体。
[0481]
实施例4.非atg起始密码子使用的影响
[0482]
将cho细胞用编码hcd52突变体mut4和mut8的多核苷酸转染，每种多核苷酸具有atg、ctg、gtg或ttg起始密码子。使用荧光团标记的campath-1h和9d9抗体通过facs分析细胞。结果示于图8和图9。
[0483]
图8是四个流式细胞术直方图，其单独根据起始密码子描绘了campath-1h或9d9与表达mut4(seq id no:4)或mut8(seq id no:8)的细胞的结合。所述图显示mut4和mut8中的每一个的表达遵循模式atg》ctg》gtg》ttg》模拟物。
[0484]
图9是来自图8的数据的条形图表示，其显示使用campath-1h和9d9可以容易地区分mut4和mut8突变体，尤其是具有atg、ctg或gtg起始密码子的突变体。
[0485]
实施例5.细胞表面标记物起始密码子对目标多肽表达的影响
[0486]
使用流式细胞术方法分析了共表达替代性起始报告物和可溶性受体-fc融合蛋白的稳定转染的cho池。使用uug、gug、cug或aug作为起始密码子表达每种报告物。直方图叠加显示出cd52或cd59的细胞表面表达水平，其中起始密码子的3'端的所有aug都发生了突变。cairns等人(2011)biotechnol.bioeng.108:2611-22。代表性结果示于图10。所述图显示报告物(细胞表面标记物)表达与目的基因(goi；目标多肽)表达之间存在相反关系，其根据编码报告物的多核苷酸中的起始密码子而变化。结果表明，ttg显示出最低的可检测的cd52表达水平，这将允许核糖体更大地通读至goi。由于最终重要的是目标蛋白的表达，而不是报告物的表达，因此所述图显示选择次优的非atg起始密码子如ttg是足够的并且是优选的。
[0487]
实施例6.可以启用三种报告物的hcd52丙氨酸突变体组合
[0488]
作为概念的进一步证据，图11示出了某些hcd52丙氨酸突变体的特定组合可以如何启用三种独特报告物。如图11所示，使用campath-1h(c-1h)而不是9d9或7f11鉴定出hcd52突变体4(gqnatsqtssps；seq id no:4)。hcd52突变体mut2/8/9(gandtsqaasps；seq id no:15)通过与9d9结合但不与c1h或7f11结合而被鉴定出。hcd52突变体mut7/8/9(gqndtsaaasps；seq id no:17)通过与7f11结合但不与c1h或9d9结合而被鉴定出。
[0489]
实施例7.可以启用三种报告物的另外的hcd52丙氨酸突变体组合
[0490]
作为概念的又进一步证据，图12示出了某些hcd52丙氨酸突变体的特定组合可以如何启用三种独特报告物。如图12所示，使用campath-1h(c-1h)而不是9d9或7f11鉴定出hcd52突变体4(gqnatsqtssps；seq id no:4)。hcd52突变体mut2/8/10(gandtsqasaps；seq id no:16)通过与9d9结合但不与c1h或7f11结合而被鉴定出。hcd52突变体mut7/8/9(gqndtsaasaps；seq id no:18)通过与7f11结合但不与c1h或9d9结合而被鉴定出。
[0491]
实施例8.用于codv三抗体表达的双报告物系统
[0492]
虽然已经描述了codv三抗体，但它们的生产极具挑战性。这些构建体具有四条不同的多肽链：两条不同的重链(codv重链和fab重链，具有相互的杵和臼)和两条不同的轻链(codv轻链和fab轻链)。平衡这四条单独的多肽链的表达是困难的，并且过多的游离重链可能对表达它们的细胞有毒。
[0493]
在一个实施方案中，每条重链与在单个mrna上编码的独特细胞表面标记多肽一起由其自身单独的表达载体表达，并且每条轻链在没有任何独特细胞表面标记多肽的情况下由其自身单独的表达载体表达。相应的重链和轻链(codv重链和轻链，以及fab重链和轻链)自缔合形成所需的codv三抗体。参见图13a。
[0494]
值得注意的是，该方法提供了独立地分离和筛选每个臂的克隆的能力，并且其可以提供对于产品质量(即，均质三特异性表达)的理想筛选。
[0495]
在另一个实施方案中，可以采用类似的方法，不同之处在于相应的重链和轻链在单个双顺反子载体上编码。参见图13b。

技术特征：
1.一种用于以高水平表达多种目标多肽的方法，所述方法包括：(a)培养多个哺乳动物宿主细胞，每个细胞包含多种重组多核苷酸，其中每种重组多核苷酸包含启动子、编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列二者在同一mrna上转录，其中所述培养是在允许每种独特细胞表面标记多肽在所述哺乳动物宿主细胞的表面上表达以及每种独特目标多肽表达的条件下进行的；(b)使步骤(a)的所培养的哺乳动物宿主细胞与多种可检测药剂接触，每种可检测药剂能够独特地结合在所述哺乳动物宿主细胞的表面上表达的一种或多种所述独特细胞表面标记多肽；(c)对来自步骤(b)的经接触的细胞进行至少一轮荧光激活细胞分选，从而选择被所述多种可检测药剂中的至少一种独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞；(d)制备在步骤(c)中选择的所述哺乳动物宿主细胞的一个或多个克隆群；(e)通过检测至少两种独特细胞表面标记多肽在每个所述克隆群上的表达水平来分析来自步骤(d)的一个或多个克隆群；(f)选择具有所述至少两种独特细胞表面标记多肽的高表达水平的一个或多个克隆群；以及(g)在允许以高水平表达所述多种目标多肽的条件下培养在步骤(f)中选择的一个或多个克隆群。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括对来自步骤(b)的与至少第一可检测药剂和第二可检测药剂接触的细胞进行单轮荧光激活细胞分选，从而选择被至少所述第一可检测药剂和所述第二可检测药剂二者独特地结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括(c1)关于至少第一细胞表面标记多肽进行第一轮荧光激活细胞分选，从而选择被至少第一可检测药剂结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞；以及(c2)对步骤(c1)中选择的细胞关于至少第二细胞表面标记多肽进行第二轮荧光激活细胞分选，从而选择被至少所述第一可检测药剂和所述第二可检测药剂二者结合的一个或多个哺乳动物宿主细胞。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤(e)是在步骤(d)之后7-28天进行的。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的所述分析包括流式细胞术。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的至少一种的表达水平高于步骤(e)中分析的克隆群的至少70％的相应表达水平。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(f)中的多种独特细胞表面标记多肽中的每一种的表达水平高于步骤(e)中分析的克隆群的至少70％的相应表达水平。8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的至少第一种的表达水平高于步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的至少第二种的表达水平。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的第一种的表达水平高于步骤(f)中的多种独特细胞表面多肽中的第二种的表达水平。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法还包括：(h)从所述一个或多个选择的克隆群或从培养所述一个或多个选择的克隆群的细胞培养基分离步骤(g)中表达的至少第一独特目标多肽和第二独特目标多肽。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述多种独特目标多肽包含2至8种独特目标多肽。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多种独特目标多肽包含2至4种独特目标多肽。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多种独特目标多肽包含2种独特目标多肽。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述多种独特目标多肽包含3种独特目标多肽。15.根据权利要求12所述的方法，其中所述多种独特目标多肽包含4种独特目标多肽。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列。17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中每种重组多核苷酸包含1至4个启动子、各自编码独特细胞表面标记多肽的1至4个核苷酸序列和各自编码独特目标多肽的1至4个核苷酸序列，其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列之一与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列之一在同一mrna上转录。18.根据权利要求17所述的方法，其中每种重组多核苷酸是双顺反子多核苷酸，其包含两个启动子和各自编码独特目标多肽的两个核苷酸序列，并且还包含各自编码独特细胞表面标记多肽的一个或两个核苷酸序列。19.根据权利要求18所述的方法，其中每种双顺反子多核苷酸包含编码独特细胞表面标记多肽的单个核苷酸序列。20.根据权利要求18所述的方法，其中每种双顺反子多核苷酸包含各自编码独特细胞表面标记多肽的两个核苷酸序列，并且其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列中的每一个与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列之一在同一mrna上转录。21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中每种重组多核苷酸从5'到3'包含1-4个启动子中的一个、编码独特细胞表面标记多肽的1-4个核苷酸序列中的一个和编码独特目标多肽的1-4个核苷酸序列中的一个。22.根据权利要求17所述的方法，其中每种重组多核苷酸包含一个启动子、一个编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和一个编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列在同一mrna上转录。23.根据权利要求16或21所述的方法，其中每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中每种重组多核苷酸还包含用于编码
所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。25.根据权利要求24所述的方法，其中每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。26.根据权利要求24所述的方法，其中每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自gtg和ttg。27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。28.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中至少第一重组多核苷酸从5'到3'包含第一启动子、编码第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码第一独特目标多肽的核苷酸序列；并且至少第二重组多核苷酸从5'到3'包含第二启动子、编码第二独特目标多肽的核苷酸序列和编码第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一重组多核苷酸还包含位于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。30.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一重组多核苷酸还包含用于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述替代性(非atg)起始密码子选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述替代性(非atg)起始密码子选自gtg和ttg。33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。34.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二重组多核苷酸还包含位于编码所述第二独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体入口位点(ires)。35.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特目标多肽的核苷酸序列和编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。36.根据权利要求35所述的方法，其中每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中至少一个启动子是β-肌动蛋白启动子。38.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中每个启动子都是β-肌动蛋白启动子。39.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中至少一个启动子是仓鼠β-肌动蛋白启动子。
40.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中每个启动子都是仓鼠β-肌动蛋白启动子。41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。44.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。45.根据权利要求1至40和44中任一项所述的方法，其中至少第二独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。46.根据权利要求45所述的方法，其中每种独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。47.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。48.根据权利要求1至40和47中任一项所述的方法，其中至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。49.根据权利要求48所述的方法，其中每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。50.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽是人cd52。51.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第二独特细胞表面标记多肽是人cd52。52.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。53.根据权利要求52所述的方法，其中x2是a。54.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。55.根据权利要求54所述的方法，其中x4是a。56.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:21(gqndtsx7tssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7选自a、g、i、l和v。57.根据权利要求56所述的方法，其中x7是a。58.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:22(gqndtsqx8ssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。
59.根据权利要求58所述的方法，其中x8是a。60.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:23(gqndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。61.根据权利要求60所述的方法，其中x8和x9中的每一个是a。62.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:24(gqndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。63.根据权利要求62所述的方法，其中x8和x
10
中的每一个是a。64.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:25(gqndtsqx8x9x
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8、x9和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。65.根据权利要求64所述的方法，其中x8、x9和x
10
中的每一个是a。66.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:26(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。67.根据权利要求66所述的方法，其中x2、x8和x9中的每一个是a。68.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。69.根据权利要求68所述的方法，其中x2、x8和x
10
中的每一个是a。70.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。71.根据权利要求70所述的方法，其中x7、x8和x9中的每一个是a。72.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。73.根据权利要求72所述的方法，其中x7、x8和x
10
中的每一个是a。74.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4和x7中的每一个是独立地选自a、g、i、l和v。75.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列组成，其中x4和x7中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。
76.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列的变体人cd52。77.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列组成。78.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。79.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列组成。80.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。81.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列组成。82.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。83.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:23(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。84.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。85.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包
含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:15(gandtsqaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:17(gqndtsaaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。86.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:16(gandtsqasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:18(gqndtsaasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。87.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中至少一种独特目标多肽包含治疗性多肽或治疗性蛋白质。88.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中至少一种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。89.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中每种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。90.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中至少一种独特目标多肽是抗体的多肽。91.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中每种独特目标多肽是抗体的多肽。92.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中至少一种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。93.根据权利要求92所述的方法，其中每种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。94.根据权利要求92所述的方法，其中至少一种独特目标多肽是codv三抗体的多肽。95.根据权利要求92所述的方法，其中每种独特目标多肽是codv三抗体的多肽。96.根据权利要求1至95中任一项所述的方法，其中所述重组哺乳动物宿主细胞是cho细胞。97.一种包含多种重组多核苷酸的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸包含启动子、编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列二者在同一mrna上转录。98.根据权利要求97所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述多种独特目标多肽包含2至8种独特目标多肽。99.根据权利要求98所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述多种独特目标多肽包含2至4种独特目标多肽。100.根据权利要求99所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述多种独特目标多肽包含2种独特目标多肽。101.根据权利要求99所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述多种独特目标多肽包含3种独特目标多肽。102.根据权利要求99所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述多种独特目标多肽包
含4种独特目标多肽。103.根据权利要求97至102中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸从5'到3'包含启动子、编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列。104.根据权利要求97至102中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸包含1至4个启动子、各自编码独特细胞表面标记多肽的1至4个核苷酸序列和各自编码独特目标多肽的1至4个核苷酸序列，其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列之一与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列之一在同一mrna上转录。105.根据权利要求104所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸是双顺反子多核苷酸，其包含两个启动子和各自编码独特目标多肽的两个核苷酸序列，并且还包含各自编码独特细胞表面标记多肽的一个或两个核苷酸序列。106.根据权利要求105所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种双顺反子多核苷酸包含编码独特细胞表面标记多肽的单个核苷酸序列。107.根据权利要求105所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种双顺反子多核苷酸包含各自编码独特细胞表面标记多肽的两个核苷酸序列，并且其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列中的每一个与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列之一在同一mrna上转录。108.根据权利要求104-107中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸从5'到3'包含1-4个启动子中的一个、编码独特细胞表面标记多肽的1-4个核苷酸序列中的一个和编码独特目标多肽的1-4个核苷酸序列中的一个。109.根据权利要求104所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸包含一个启动子、一个编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和一个编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码独特细胞表面标记多肽的所述核苷酸序列与编码独特目标多肽的所述核苷酸序列在同一mrna上转录。110.根据权利要求103或108所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。111.根据权利要求97-110中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸还包含用于编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。112.根据权利要求111所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。113.根据权利要求111所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每个替代性(非atg)起始密码子独立地选自gtg和ttg。114.根据权利要求111至112中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。115.根据权利要求97至103中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中
至少第一重组多核苷酸从5'到3'包含第一启动子、编码第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码第一独特目标多肽的核苷酸序列；并且至少第二重组多核苷酸从5'到3'包含第二启动子、编码第二独特目标多肽的核苷酸序列和编码第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。116.根据权利要求115所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述第一重组多核苷酸还包含位于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。117.根据权利要求115所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述第一重组多核苷酸还包含用于编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的翻译起始的替代性(非atg)起始密码子和用于编码所述第一独特目标多肽的核苷酸序列的翻译起始的atg起始密码子。118.根据权利要求117所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述替代性(非atg)起始密码子选自ctg、gtg、ttg、att、ata和acg。119.根据权利要求118所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述替代性(非atg)起始密码子选自gtg和ttg。120.根据权利要求115至119中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中编码所述第一独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列缺乏任何atg三联体。121.根据权利要求115所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述第二重组多核苷酸还包含位于编码所述第二独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述第二独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体入口位点(ires)。122.根据权利要求97至102中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸从5'到3'包含所述启动子、编码所述独特目标多肽的核苷酸序列和编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列。123.根据权利要求122所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种重组多核苷酸还包含位于编码所述独特目标多肽的核苷酸序列的3'端且编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列的5'端的内部核糖体进入位点(ires)。124.根据权利要求97至123中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一个启动子是β-肌动蛋白启动子。125.根据权利要求97至123中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每个启动子都是β-肌动蛋白启动子。126.根据权利要求97至123中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一个启动子是仓鼠β-肌动蛋白启动子。127.根据权利要求97至123中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每个启动子都是仓鼠β-肌动蛋白启动子。128.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。129.根据权利要求97至128中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。130.根据权利要求97至129中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种独特
细胞表面标记多肽选自cd20、cd52、cd59及其变体。131.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。132.根据权利要求97至127和131中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第二独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。133.根据权利要求132所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种独特细胞表面标记多肽选自人cd52及其变体。134.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。135.根据权利要求97至127和124中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第二独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。136.根据权利要求135所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种独特细胞表面标记多肽选自cd20、cd52和cd59。137.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽是人cd52。138.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第二独特细胞表面标记多肽是人cd52。139.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。140.根据权利要求139所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x2是a。141.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。142.根据权利要求141所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x4是a。143.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:21(gqndtsx7tssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7选自a、g、i、l和v。144.根据权利要求143所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x7是a。145.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:22(gqndtsqx8ssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。146.根据权利要求145所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x8是a。147.根据权利要求77-102中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:23(gqndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。148.根据权利要求147所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x8和x9中的每一个是a。149.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:24(gqndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变
体人cd52，其中x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。150.根据权利要求149所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x8和x
10
中的每一个是a。151.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:25(gqndtsqx8x9x
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x8、x9和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。152.根据权利要求151所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x8、x9和x
10
中的每一个是a。153.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:26(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。154.根据权利要求153所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x2、x8和x9中的每一个是a。155.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。156.根据权利要求155所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x2、x8和x
10
中的每一个是a。157.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。158.根据权利要求157所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x7、x8和x9中的每一个是a。159.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特细胞表面标记多肽是包含seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x7、x8和x
10
中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。160.根据权利要求159所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中x7、x8和x
10
中的每一个是a。161.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4和x7中的每一个是独立地选自a、g、i、l和v。162.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成，其中x2选自a、g、i、l和v；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:20(gqnx4tsqtssps)和seq id no:21(gqndtsx7tssps)的氨基酸序列组成，其中x4和x7中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。163.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一
独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列的变体人cd52。164.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由选自seq id no:4(gqnatsqtssps)和seq id no:7(gqndtsatssps)的氨基酸序列组成。165.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。166.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列组成。167.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。168.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:2(gandtsqtssps)中所示的氨基酸序列组成；并且至少第二独特细胞表面标记多肽由变体人cd52组成，所述变体人cd52由seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列组成。169.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有如seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:7(gqndtsatssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。170.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:23(gx2ndtsqx8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:28(gqndtsx7x8x9sps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x9中的每一个独立地选自a、g、i、l和v。171.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:20(gqnx4tsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:27(gx2ndtsqx8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:29(gqndtsx7x8sx
10
ps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52，其中x4、x7、x8和x
10
中的每一
个独立地选自a、g、i、l和v。172.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:15(gandtsqaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:17(gqndtsaaasps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。173.根据权利要求97至127中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少第一独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:4(gqnatsqtssps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；至少第二独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:16(gandtsqasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52；并且至少第三独特细胞表面标记多肽包含含有seq id no:18(gqndtsaasaps)中所示的氨基酸序列的变体人cd52。174.根据权利要求97至173中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特目标多肽包含治疗性多肽或治疗性蛋白质。175.根据权利要求97至173中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。176.根据权利要求97至173中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种独特目标多肽是多链蛋白质的多肽。177.根据权利要求97至173中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特目标多肽是抗体的多肽。178.根据权利要求97至173中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种独特目标多肽是抗体的多肽。179.根据权利要求97至173中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。180.根据权利要求179所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种独特目标多肽是交叉双可变结构域(codv)ig样蛋白质的多肽。181.根据权利要求97至173中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中至少一种独特目标多肽是codv三抗体的多肽。182.根据权利要求97至173中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中每种独特目标多肽是codv三抗体的多肽。183.根据权利要求97至182中任一项所述的工程化哺乳动物宿主细胞，其中所述重组哺乳动物宿主细胞是cho细胞。184.一种包含由seq id no:19(gx2ndtsqtssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x2选自a、g、i、l和v。185.根据权利要求184所述的分离的变体人cd52，其中x2是a。186.一种包含由seq id no:20(gqnx4tsqtssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x4选自a、g、i、l和v。187.根据权利要求186所述的分离的变体人cd52，其中x4是a。188.一种包含由seq id no:22(gqndtsqx8ssps)组成的氨基酸序列的分离的变体人cd52，其中x8选自a、g、i、l和v。
189.根据权利要求188所述的分离的变体人cd52，其中x8是a。

技术总结
提供了用于在哺乳动物宿主细胞中以高水平表达多种目标多肽的组合物和方法。每种目标多肽在如下多核苷酸上编码，所述多核苷酸包含编码独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码独特目标多肽的核苷酸序列，其中编码所述独特细胞表面标记多肽的核苷酸序列和编码所述独特目标多肽的核苷酸序列二者在同一mRNA上转录。每个哺乳动物宿主细胞包含多种不同的多核苷酸，使得所述细胞能够表达多种独特目标多肽和多种独特细胞表面标记多肽。在某些实施方案中，所述多种独特细胞表面标记多肽是CD52的变体。所述组合物和方法可用于表达多聚体目标蛋白质，例如，交叉双可变结构域(CODV)三抗体。交叉双可变结构域(CODV)三抗体。


技术研发人员：R
受保护的技术使用者：建新公司
技术研发日：2021.11.18
技术公布日：2023/8/21