脱细胞化组织组合物的制作方法

1.本发明涉及一种脱细胞化组织组合物。


背景技术：

2.在移植来自他人或不同种动物的生物体组织的移植片时，因被移植者一方的组织造成的移植片的排斥反应成为问题。作为解决该问题的方法，期待开发一种人工组织。虽然尝试了以各种高分子作为素材，但由于这些素材与生物体组织的相容性低，存在在移植片与生物体组织的接合部位发生脱落或感染症的问题。对此，为了提高与生物体组织的相容性，开发了一种将由从生物体组织中去除细胞而残留的支撑组织(细胞外基质，ecm)构成的脱细胞化组织用作移植片的技术。脱细胞化是指去除对于被移植者而言具有抗原性的核酸等细胞成分，由此能够避免免疫排斥。脱细胞化组织例如能够通过使用含有表面活性剂的处理液，对生物体组织进行脱细胞化而制造(专利文献1～3)。现有技术文献专利文献
3.专利文献1：日本特表2005-514971号公报专利文献2：日本特表2006-507851号公报专利文献3：日本特表2005-531355号公报


技术实现要素：

本发明要解决的技术问题
4.在将脱细胞化组织用于再生医疗时，除了没有排斥反应以外，能够快速进行组织再生这一点也很重要。期望一种具有适当的强度、并且表现出良好的组织再生的脱细胞化组织。因此，本发明的目的在于提供一种表现出适当的强度、及良好的组织再生的脱细胞化组织。解决技术问题的技术手段
5.本技术的发明人对具有适当的强度及良好的组织再生的脱细胞化组织进行了认真研究，结果惊讶地发现，含有特定蛋白质的脱细胞化组织组合物具有优异的强度及细胞粘附性，能够促进良好的组织再生。本发明基于上述见解而成。因此，本发明涉及下述发明：(1)一种脱细胞化组织组合物，其含有脱细胞化组织与(a)分子量为30,000～70,000且(b)等电点pi为6.00～9.00的蛋白质a；(2)根据(1)所述的脱细胞化组织组合物，其进一步含有(a)分子量为3,000～15,000且(b)等电点pi为3.00～5.50的蛋白质b；
(3)根据(1)或(2)所述的脱细胞化组织组合物，其中，相对于脱细胞化组织组合物，所述蛋白质a的含量为0.01～5.0质量％；(4)根据(1)～(3)中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，相对于脱细胞化组织组合物，所述蛋白质b的含量为0.001～3.0质量％；(5)根据(1)～(4)中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，蛋白质a与蛋白质b在组合物中的质量比为a:b＝5:1～150:1；(6)根据(1)～(5)中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，相对于脱细胞化组织组合物，每单位干燥质量的dna含量为0.0300质量％以下；(7)根据(1)～(6)中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，所述蛋白质为膜联蛋白；(8)根据(1)～(7)中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，所述蛋白质b为来自纤调蛋白聚糖的肽。发明效果
6.根据本发明的脱细胞化组织组合物，由于表现出适度的强度及优异的细胞粘附性，能够在生物体内表现出良好的组织再生能力(例如，细胞的诱引效果及分化诱导效果)。并且，由于具有优异的强度，在进行手术时，表现出优异的操作性。
附图说明
7.图1为示出实施例1及比较例1的脱细胞化组织的双向电泳中的、实施例1与比较例1之间不同的蛋白质点的图。图2为示出实施例1～13以及比较例1及3的脱细胞化组织组合物的细胞粘附性试验的结果的图表。图3为示出实施例1及11以及比较例1的脱细胞化组织组合物伸长10％时的弹性模量的图表。图4为示出实施例1及11以及比较例1的脱细胞化组织组合物的最大弹性模量的图表。图5为示出实施例1及11以及比较例1的脱细胞化组织组合物的断裂强度的图表。图6为示出实施例1及11以及比较例1的脱细胞化组织组合物的撕裂强度的图表。图7为示出实施例9及11的脱细胞化组织的双向电泳中的与比较例1不同的蛋白质点的图。
具体实施方式
8.本发明的脱细胞化组织组合物含有脱细胞化组织与(a)分子量为30,000～70,000且(b)等电点pi为6.00～9.00的蛋白质(以下，有时称之为蛋白质a)。本发明的脱细胞化组织组合物还可以含有(a)分子量为3,000～15,000且(b)等电点pi为3.00～5.50的蛋白质(以下，有时称之为蛋白质b)。
9.＜＜脱细胞化组织＞＞脱细胞化组织为从来自动物的组织中去除了细胞成分的组织，为以弹性蛋白、胶原蛋白(i型、iv型等)、层粘连蛋白等细胞外基体成分作为主要成分的组织。其在埋植于生
物体时排斥反应小，能够期待移植位置的细胞的固定及重建，发挥作为细胞立足点的功能。获得本发明的组合物中所含有的脱细胞化组织的方法能够使用以往公知的方法。在本发明中，只要能够获得本发明的效果，则脱细胞化的方法没有特别限定，例如可列举出利用高静水压处理的方法、利用冻融处理的方法、使用表面活性剂的方法、利用超声波处理进行处理的方法、使用酶的方法、或利用高渗电解质溶液进行处理的方法、利用物理搅拌的方法、高渗液低渗液法、利用蛋白分解酶或核酸分解酶等进行酶处理的方法、利用醇溶剂进行的处理等，也可以组合上述方法中的两种以上的方法，由于能够有效获得脱细胞化组织组合物，且能够发挥本技术发明的效果，优选利用高静水压处理的方法。
10.关于本发明的脱细胞化组织组合物中所使用的脱细胞化组织，只要为来自脊椎动物的生物体组织，则没有特别限定，由于排斥反应少，优选来自哺乳类或鸟类的生物体组织，由于容易获得，进一步优选来自哺乳类的家畜、鸟类的家畜或人的生物体组织。作为哺乳类的家畜，可列举出牛、马、骆驼、美洲驼、驴、牦牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、貉、鼬、狐狸、猫、兔、仓鼠、旱獭、大鼠、小鼠、松鼠、浣熊等。此外，作为鸟类的家畜，可列举出鹦哥、鹦鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠鸡、雉、鸵鸟、鹌鹑、鸸鹋等。其中，从获取稳定性出发，优选牛、猪、兔、人的生物体组织。
11.作为生物体组织的部位，能够使用在细胞外具有基体结构的部位，作为这种部位，例如可列举出肝脏、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃体、食道、胃、小肠、大肠、肛门、胰脏、心脏、血管、脾脏、肺、脑、骨、脊髓、软骨、睾丸、子宫、输卵管、卵巢、胎盘、角膜、骨骼肌、肌腱、神经、皮肤等。作为生物体组织的部位，由于组织再生的效果高，优选软骨、骨骼、肝脏、肾脏、心脏、心包、主动脉、皮肤、小肠粘膜下组织、肺、脑、乳内动脉或脊髓，更优选心包、乳内动脉、肝脏、软骨、皮肤、小肠粘膜下组织或脊髓。
12.在通过所述利用高静水压处理的方法获得所述脱细胞化组织时，在介质中对来自生物体的组织施加50～1500mpa的静水压。从能够充分进行脱细胞化的角度出发，所施加的静水压优选为50mpa以上，从不需要耐受施压的压力容器、不需要庞大的能量，以及防止当施压时使用的介质为水性介质时生成冰，进而使得组织因生成的冰受到损伤的角度出发，优选为1500mpa以下。所施加的静水压更优选为80～1300mpa，进一步优选为90～1200mpa，进一步更加优选为95～1100mpa，更加优选为95～700mpa，从发挥脱细胞化效果、杀菌效果及病毒灭活效果，且施压的容易度的角度出发，最优选为400～700mpa。
13.作为施加静水压时使用的介质，可列举出水、生理盐水、注射用水、丙二醇或其水溶液、甘油或其水溶液、糖类水溶液等。作为缓冲液，可列举出乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液、酒石酸缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液、mes缓冲液等。这些介质也可以含有表面活性剂。
14.关于高静水压处理的温度，只要为不生成冰、不会因热对组织造成损伤的温度，则没有特别限定，从顺利进行脱细胞处理、对组织的影响少的角度出发，优选为0～45℃，进一步优选为4～37℃，最优选为15～35℃。若高静水压处理的时间过短，则无法充分破坏细胞，而当高静水压处理的时间较长时，会牵涉到能量的浪费，因此在高静水压处理中，维持目标的施加压力的时间优选为1～120分钟，更优选为5～60分钟，进一步优选为7～30分钟。
15.优选对所述经高静水压处理的组织进行核酸分解酶处理。核酸分解酶为从施加了静水压的生物体组织中去除核酸成分的物质，没有特别限定，例如可列举出来自胰脏、来自
脾脏或来自大肠菌的脱氧核糖核酸酶(dnase)(例如，脱氧核糖核酸酶i(dnasei)、脱氧核糖核酸酶ii(dnaseii))。核酸分解酶能够通过添加于用于所述高静水压处理的介质(例如，水、生理盐水、注射用液或缓冲液等)中而发挥作用。所添加的酶量根据酶的种类或单元数(u)的定义而有所不同，本领域技术人员能够适当设定。例如，若为脱氧核糖核酸酶i，则以50～200u/ml进行使用即可。处理温度也根据所使用的核酸分解酶而有所不同，但例如设定为1℃～40℃的温度即可。处理时间没有特别限定，例如可以为1～120小时(优选为1～96小时，更优选为1～48小时)，低温时可进行长时间的处理，高温时可进行短时间的处理。
16.所述经高静水压处理的组织使用洗涤液进行洗涤。洗涤液可以与高静水压处理的介质相同，也可以不同。洗涤液优选含有有机溶剂或螯合剂。有机溶剂能够提高去除脂质的效率，螯合剂能够通过使脱细胞化组织中的钙离子、镁离子失活来防止将本发明的粒子化脱细胞化组织应用于疾病部位时发生钙化。作为有机溶剂，由于去除脂质的效果高，优选水溶性的有机溶剂，优选乙醇、异丙醇、丙酮、二甲基亚砜。作为螯合剂，可列举出乙二胺四乙酸(edta)、次氮基三乙酸(nta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、羟乙基乙二胺三乙酸(hedta)、三亚乙基四胺六乙酸(ttha)、1,3-丙二胺四乙酸(pdta)、1,3-二氨基-2-羟基丙烷四乙酸(dpta-oh)、羟乙基亚氨基二乙酸(hida)、二羟乙基甘氨酸(dheg)、乙二醇醚二胺四乙酸(gedta)、二羧甲基谷氨酸(cmga)、3-羟基-2,2
’‑
亚氨基二琥珀酸(hida)、二羧甲基天冬氨酸(asda)等亚氨基羧酸类螯合剂或其盐；柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸等羟基羧酸类螯合剂或其盐，作为这些螯合剂的盐，可列举出钠盐或钾盐。关于洗涤温度，只要为不会因热对组织造成损伤的温度，则没有特别限定，由于洗涤性良好，且对组织的影响小，优选0～45℃，进一步优选1～40℃，最优选2～35℃，在进行洗涤时，可以根据需要对洗涤液进行振荡或搅拌。
17.在通过利用冻融处理的方法获得所述脱细胞化组织时，重复进行1次或2次以上(优选2～5次)的下述工序：将来自生物体的组织于-80～-20℃(优选-80～-40℃)的温度下保持1～48小时(优选10～30小时)而使其冻结之后，于20～37℃的温度下使其融化的工序。然后，优选进行核酸分解酶处理，核酸分解酶处理可以为与所述高静水压处理中的处理相同的方法。对于经冻融处理的生物体组织，其组织中的细胞被破坏，且该细胞通过洗涤液而被去除。洗涤的方法可以为与高静水压处理中的洗涤相同的方法。
18.在通过使用表面活性剂的方法获得所述脱细胞化组织时，将来自生物体的组织在表面活性剂的溶液(例如，0.25质量％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液)中于2～10℃(优选4℃)振荡1～48小时(优选12～36小时)。进一步，可以在不同的表面活性剂溶液(例如，0.5％质量％triton x(聚氧乙烯辛基苯基醚)溶液)中于2～10℃(优选4℃)振荡1～48小时(优选12～36小时)。然后，优选利用与高静水压处理中的洗涤相同的方法进行洗涤。表面活性剂没有限定，例如可列举出十二烷基硫酸钠、烷基磺酸盐、烷基硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基硫酸酯盐、α-磺基脂肪酸酯盐、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如，聚氧乙烯辛基苯基醚)、烷基(聚)糖苷。
19.在通过利用超声波处理进行处理的方法获得所述脱细胞化组织时，对来自生物体的组织例如在生理盐水中进行超声波处理(例如，强度：10w/cm2，频率：10khz，作用时间：2分钟)。然后，优选在表面活性剂溶液(例如，1％质量％triton x(聚氧乙烯辛基苯基醚)溶
液)中于2～10℃(优选4℃)振荡1～120小时(优选12～120小时)。进一步，优选进行核酸分解酶处理，核酸分解酶处理可以为与所述高静水压处理中的处理相同的方法。然后，优选利用与高静水压处理中的洗涤相同的方法进行洗涤。
20.对于所得到的脱细胞化组织，优选进行冻结干燥处理，但并不限定于此。冻结干燥能够根据生物体组织的部位而省略。此外，对于所得到的脱细胞化组织，可以通过伽马射线照射、uv照射等进行杀菌，优选通过照射伽马射线进行杀菌。
21.从发挥本发明的效果的角度出发，相对于脱细胞化组织组合物，所述脱细胞化组织的含量优选为90.0～100.0质量％，更优选为95.0～100.0质量％，进一步优选为96.0～100.0质量％，最优选为97.0～100.0质量％。
22.(脱细胞化dna比(dna含量))通常优选脱细胞化组织组合物的dna含量少，但在本发明的脱细胞化组织组合物中，相对于脱细胞化组织组合物，每单位干燥质量的dna含量优选为0.0300质量％以下。由此，能够防止在用于再生医疗时发生排斥反应。从细胞的诱引效果、分化诱导效果这一点出发，本发明的脱细胞化组织组合物的脱细胞化dna比更优选为0.0250质量％以下，进一步优选为0.0200质量％以下，更进一步优选为0.0150质量％以下，最优选为0.0120质量％以下。若脱细胞化dna比为0.0150质量％以下，则特别容易提高对脱细胞化组织组合物的细胞粘附性，故而优选。
23.脱细胞化dna比的下限没有特别限定，优选越低越好，从实现的容易度出发，优选为0.0001质量％以上，进一步优选为0.0002质量％以上。
24.dna含量能够通过picogreen法进行测定。在将脱细胞化组织组合物的干燥试验片(以下，有时称之为样本)浸渍在蛋白质分解酶溶液中而使其溶解之后，使用苯酚/氯仿进行处理来去除蛋白质，并通过乙醇沉淀法回收dna。利用picogreen(life technologies corporation)对回收的dna进行荧光染色，并测定荧光强度，由此对dna进行定量，并计算出样本的dna含量(质量)。其中，使用利用picogreen中附带的标准dna制作的标准曲线进行定量。按照下述公式，由样本的干燥质量与dna含量计算出dna比。(每单位干燥质量的dna含量(以下，有时称之为脱细胞化dna比)＝(脱细胞化组织组合物的干燥试验片的dna含量)/(脱细胞化组织组合物的干燥试验片的质量)
25.＜＜蛋白质＞＞本发明的脱细胞化组织组合物含有(a)分子量为30,000～70,000且(b)等电点pi为6.00～9.00的蛋白质a。本发明的脱细胞化组织组合物可以进一步含有(a)分子量为3,000～15,000且(b)等电点pi为3.00～5.50的蛋白质。由此能够进一步发挥本发明的效果。关于所述蛋白质的分子量及等电点(pi)，例如对蛋白质进行双向电泳，蛋白质的鉴定能够通过质量分析而进行。在双向电泳法中，可以先进行等电点分离及分子量分离中的任意一者(作为第一向)，但从提高测定精度的角度出发，优选在第一向进行等电点分离，在第二向进行分子量分离。双向电泳法能够按照常规方法而进行，能够使用市售的试剂盒及装置。例如，能够将毛细管凝胶或胶条凝胶(strip gel)等作为分离介质进行等电点电泳，并使用平面状的凝胶(例如，sds-聚丙烯酰胺凝胶)，在相对于等电点电泳的展开方向为直角的方向上对完成了电泳的凝胶进行电泳，从而进行分子量分离。能够通过按照常规方法对进行了双向电泳
的凝胶进行染色，确认蛋白质的有无、分子量、等电点。
26.从发挥本发明的效果的角度出发，所述蛋白质a的分子量优选为30,000～70,000，更优选为30,000～50,000，进一步优选为30,000～40,000。所述蛋白质a的等电点(pi)优选为6.00～9.00，更优选为6.00～8.50，进一步优选为6.50～8.50。
27.作为所述蛋白质a，可优选列举出膜联蛋白。膜联蛋白为具有由4个或8个α-螺旋结构的所谓膜联蛋白重复序列(约70个氨基酸残基)构成的弯曲的中心结构域的蛋白质。氨基末端侧结构域在各自的膜联蛋白中为固有序列(11～196个残基)，而羧基末端侧的结构域可在膜联蛋白之间良好地保存。钙结合部位或磷脂质结合部位存在于羧基末端侧的结构域上。具有8个膜联蛋白重复序列的膜联蛋白vi的分子量约为66k。
28.关于脱细胞化组织组合物中含有的膜联蛋白的来源，只要是来自真核生物则没有特别限定，但优选来自哺乳类或鸟类的膜联蛋白。作为哺乳类，可列举出牛、马、骆驼、美洲驼、驴、牦牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、貉、鼬、狐狸、猫、兔、仓鼠、旱獭、大鼠、小鼠、松鼠或浣熊等。此外，作为鸟类，可列举出鹦哥、鹦鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠鸡、雉、鸵鸟、鹌鹑或鸸鹋等。
29.在脊椎动物中，存在膜联蛋白a1～a11、a13这12种膜联蛋白，其具有与ca
2+
和磷脂质的结合部位。例如，在膜联蛋白a2的凹面的n末端结构域上结合具有c末端赖氨酸的s100a10，为与组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tpa)和纤溶酶原的结合部位。所述膜联蛋白包括不同修饰的膜联蛋白。即，包括经磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化或乙酰基化的膜联蛋白、或者未进行这些修饰的膜联蛋白。例如，实施例中记载的膜联蛋白a2为磷酸化的3种不同的膜联蛋白a2，其均能够显示出本发明的效果。
30.进一步，关于本发明的脱细胞化组织组合物，只要可以获得本发明的效果，则能够包含膜联蛋白的改性体，但并不限定于此。作为膜联蛋白的改性体，例如可列举出以下多肽：(1)包含在膜联蛋白的氨基酸序列(例如，seq id no：1所表示的氨基酸序列)的一个或多个位置上，作为整体经过缺失、取代、插入和/或添加一个或多个(优选1～10个，更优选1～7个，进一步优选1～5个)氨基酸而成的氨基酸序列，例如作为整体经过缺失、取代、插入和/或添加一个～几个氨基酸而成的氨基酸序列，且具有膜联蛋白的活性的多肽；或(2)具有与膜联蛋白的氨基酸序列(例如，seq id no：1所表示的氨基酸序列)的同源性为90％以上的氨基酸序列，且具有膜联蛋白的活性的多肽。作为膜联蛋白的活性，例如可列举出与“ca
2+
和磷脂质”的结合能力。或者，可列举出：与作为本发明的脱细胞化组织组合物的不含改性体的组合物相比，提高了细胞的粘附性这一点。
31.(经过缺失、取代、插入和/或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列)所述改性体可以为由在膜联蛋白(例如，seq id no：1)的氨基酸序列中经过缺失、取代、插入和/或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽。并且，所述改性体的多肽具有与ca
2+
和磷脂质的结合能力。即，所述改性体的多肽中不包括不表现出与ca
2+
和磷脂质的结合能力的多肽。在本说明书中，“经过缺失、取代、插入和/或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列”是指，通过氨基酸的取代等而进行了改性。氨基酸的改性个数例如能够为1～30个、1～20个、1～15个、1～10个，优选为1～8个，更优选为1～6个，进一步优选
为1～5个，最优选为1～2个。作为能够用于本发明的改性体的氨基酸序列的例子，能够优选为该氨基酸具有一个或几个(优选1、2、3或4个)保守性取代的氨基酸序列。
32.(与氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列)所述改性体可以为由相对于膜联蛋白(例如，seq id no：1)的氨基酸序列而言与氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列构成的多肽。并且，所述改性体的多肽具有与ca
2+
和磷脂质的结合能力。即，所述改性体的多肽中不包括不表现出与ca
2+
和磷脂质的结合能力的多肽。更优选由该同源性为95％以上的氨基酸序列构成且表现出与ca
2+
和磷脂质的结合能力的多肽；更优选由该同源性为96％以上的氨基酸序列构成且表现出与ca
2+
和磷脂质的结合能力的多肽；更优选由该同源性为97％以上的氨基酸序列构成且表现出与ca
2+
和磷脂质的结合能力的多肽；更优选由该同源性为98％以上的氨基酸序列构成且表现出与ca
2+
和磷脂质的结合能力的多肽；更优选由该同源性为99％以上的氨基酸序列构成且表现出与ca
2+
和磷脂质的结合能力的多肽。
33.在所述膜联蛋白(例如，seq id no：1)的氨基酸序列中，“经过缺失、取代、插入和/或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列”或“同源性为90％以上的氨基酸序列”虽为膜联蛋白(例如，seq id no：1)的氨基酸序列经取代而成的氨基酸序列，但该氨基酸序列的取代为维持本发明中使用的膜联蛋白的功能的保守性取代。换言之，“保守性取代”是指不丧失膜联蛋白的优异效果的取代。即，其为即使在经所述插入、取代、或缺失或者添加时，也能够维持膜联蛋白的与ca
2+
和磷脂质的结合能力的取代。具体而言，是指使用其他化学上类似的氨基酸残基对氨基酸残基进行取代。例如，可列举出通过其他疏水性残基取代某些疏水性残基的情况、通过具有相同电荷的其他极性残基取代某些极性残基的情况等。对于能够进行这种取代的功能上类似的氨基酸，每个氨基酸在该技术领域中为公知的氨基酸。作为非极性(疏水性)氨基酸，例如可列举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，例如可列举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷的(碱性)氨基酸，可列举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。此外，作为具有负电荷的(酸性)氨基酸，可列举出天冬氨酸、谷氨酸等。
34.相对于脱细胞化组织组合物，所述蛋白质a的含量优选为0.01～5.0质量％，更优选为0.03～4.5质量％，进一步优选为0.05～4.0质量％，进一步更优选为0.1～3.5质量％，更优选为0.2～3.3质量％，最优选为0.3～3.0质量％。由此，能够发挥本发明的效果。
35.从发挥本发明的效果的角度出发，所述蛋白质b的分子量优选为3,000～15,000，更优选为5,000～14,000，进一步优选为7,000～13,000。所述蛋白质的等电点(pi)优选为3.00～5.50，更优选为3.40～5.30，进一步优选为3.80～5.20。
36.相对于脱细胞化组织组合物，所述蛋白质b的含量优选为0.001～3.0质量％，更优选为0.003～2.0质量％，进一步优选为0.005～1.5质量％，进一步更加优选为0.008～1.0质量％，更优选为0.009～0.5质量％，最优选为0.01～0.1质量％。由此，能够发挥本发明的效果。
37.对于本发明的脱细胞化组织组合物，优选在蛋白质a与蛋白质b的质量比a:b＝5:1～150:1的范围内含有该蛋白质a与蛋白质b，更优选在a:b＝8:1～110:1的范围内含有该蛋白质a与蛋白质b，进一步优选在a:b＝10:1～50:1的范围内含有该蛋白质a与蛋白质b。由
此，能够有效发挥本发明的效果。
38.作为所述蛋白质b，可优选列举出纤调蛋白聚糖的片段。纤调蛋白聚糖主要为与纤维性胶原蛋白结合的蛋白质，认为其具有使胶原纤维彼此结合的作用。已知若纤调蛋白聚糖的表达上调，则胶原纤维的密度增加。纤调蛋白聚糖为由375个氨基酸构成的蛋白质(seq id no：2)，其分子量为43,000，pi为5.6。蛋白质b为纤调蛋白聚糖的片段，若根据分子量进行推定，则其为由c末端的90个氨基酸构成的片段(seq id no：3)，但并不限定于此。纤调蛋白聚糖片段的分子量为10,000，pi为4.65。
39.脱细胞化组织组合物中可含有的纤调蛋白聚糖片段的来源只要与膜联蛋白同样来自真核生物，则没有特别限定，可列举出与膜联蛋白相同的来源。
40.关于本发明的脱细胞化组织组合物，只要能够获得本发明的效果，则能够包含纤调蛋白聚糖片段的改性体，但并不限定于此。作为纤调蛋白聚糖片段的改性体，例如可列举出以下多肽：(1)包含在纤调蛋白聚糖片段的氨基酸序列(例如，seq id no：3所表示的氨基酸序列)的一个或多个位置上，作为整体经过缺失、取代、插入和/或添加一个或多个(优选1～10个，更优选1～7个，进一步优选1～5个)氨基酸而成的氨基酸序列，例如作为整体经过缺失、取代、插入和/或添加一个～几个氨基酸而成的氨基酸序列，且具有纤调蛋白聚糖片段的活性的多肽；或(2)具有与纤调蛋白聚糖片段的氨基酸序列(例如，seq id no：3所表示的氨基酸序列)的同源性为90％以上的氨基酸序列，且具有纤调蛋白聚糖片段的活性的多肽。作为纤调蛋白聚糖片段的活性，可列举出：与作为本发明的脱细胞化组织组合物的不含改性体的组合物相比，提高了细胞的粘附性这一点。纤调蛋白聚糖片段的改性体为表现与所述膜联蛋白改性体同样的氨基酸变异、同源性及保守性取代等的改性体。
41.认为所述纤调蛋白聚糖片段通过对脱细胞化组织组合物照射伽马射线而由纤调蛋白聚糖生成。关于伽马射线照射的强度，只要能够获得本发明的效果，则没有特别限定，为10～50kgy，优选为15～35kgy，更优选为20～30kgy。通过使其在所述范围内，能够生成纤调蛋白聚糖片段。
42.＜＜作用＞＞本发明的脱细胞化组织组合物表现出优异的强度及优异的细胞粘附性的理由虽然尚未完全解明，但可推论如下。然而，本发明并不限定于以下的说明。本发明的脱细胞化组织组合物中所含有的蛋白质a(例如，膜联蛋白)具有4个或8个α-螺旋结构(膜联蛋白重复序列)，且与ca
2+
和磷脂质进行结合。虽不限定于此，但认为与ca
2+
和磷脂质的结合能力与细胞粘附能力相关。并且，认为膜联蛋白对于脱细胞化组织的强度而言发挥了有效的作用。此外，认为本发明的脱细胞化组织组合物中所含有的蛋白质b(例如，纤调蛋白聚糖片段)通过对纤调蛋白聚糖照射伽马射线而将其切断从而生成。纤调蛋白聚糖具有稳定胶原纤维的作用，认为若纤调蛋白聚糖充分存在，则会抑制细胞新产生胶原蛋白。另一方面，推测若纤调蛋白聚糖被破坏，则与该片段接触的细胞的胶原蛋白的新生的抑制消失。推
测因此引发细胞的胶原蛋白新生，细胞的功能得以活化，与脱细胞化组织组合物粘附的细胞增加。
43.本发明的脱细胞化组织组合物能够通过获得脱细胞化组织的方法而制备。此时，为了有效获得脱细胞化组织组合物，并且为了显著发挥本技术发明的效果，优选采用利用高静水压处理的方法。此外，能够对以任意方法获得的脱细胞化组织自外部添加所述蛋白质，从而获得本发明的脱细胞化组织组合物。实施例
44.以下，利用实施例对发明进行具体说明，但本发明的范围并不受限于这些实施例。
45.＜＜实施例1＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用高静水压处理制备脱细胞化组织组合物。将牛心包切成片状，将脂肪整体去除(以下，将该片状的牛心包称为“心包片”)。在聚乙烯制袋中，将在注射用水中添加磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)而成的液体作为介质，使用研究开发用高压处理装置(kobe steel,ltd.：dr.chef)，以600mpa对心包片进行10分钟的高静水压处理。使用核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经高静水压处理的心包片进行处理，于4℃振荡18小时5分钟以上，接着在80％乙醇中于4℃处理1小时以上，最后于4℃使用4l的注射用水进行洗涤。进行冻结干燥处理，得到实施例1的脱细胞化组织组合物。
46.＜＜实施例2＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用表面活性剂处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。在将心包片在以含有4％乙醇的方式而制备的0.1％(v/v)过乙酸溶液中于4℃浸渍2小时，从而进行杀菌之后，使用注射用水于4℃洗涤1小时。然后，在0.25质量％的十二烷基硫酸钠(以下，称之为sds)溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡24小时，接着，在0.5质量％triton-x(聚氧乙烯辛基苯基醚：以下，称之为tx)溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡24小时。然后，使用10l的注射用水于4℃进行洗涤之后，在磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)中于4℃振荡1小时。进行冻结干燥处理，以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化组织组合物为0.3质量％的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例2的脱细胞化组织组合物。
47.＜＜实施例3＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用冻融处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。使用干冰冻结心包片，并在放有干冰的保冷箱中(约为-78℃)中保存20小时之后，于25℃使其溶解。对重复了4次该冻融的心包片使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)进行处理，于4℃振荡96小时。进一步，在80％乙醇中于4℃振荡96小时之后，在注射用水中于4℃振荡2小时。进行冻结干燥处理，以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化组织组合物为0.3质量％的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例3的脱细胞化组织组合物。
48.＜＜实施例4＞＞
在本实施例中，使用牛的心包，利用超声波处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。在生理盐水中对心包片进行超声波处理(强度：10w/cm2，频率：10khz，作用时间：2分钟)。对于经超声波处理的牛心包，在1质量％的tx溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡96小时。使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经tx处理的心包片进行处理，并于4℃振荡96小时。进一步，在80％乙醇中于4℃振荡72小时之后，在生理盐水中于4℃振荡2小时。进行冻结干燥处理，以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化组织组合物为0.3质量％的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例4的脱细胞化组织组合物。
49.＜＜实施例5＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用高静水压处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。将牛心包切成片状，将脂肪整体去除，得到心包片。在聚乙烯制袋中，将在注射用水中添加磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)而成的液体作为介质，使用研究开发用高压处理装置(kobe steel,ltd.：dr.chef)，以600mpa对心包片进行10分钟的高静水压处理。使用核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经高静水压处理的心包片进行处理，并于4℃振荡18小时5分钟以上，接着在80％乙醇中于4℃处理1小时以上，最后于4℃使用4l的注射用水进行洗涤。进行冻结干燥处理，得到脱细胞化牛心包膜。以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化组织组合物为1.0质量％(总含量)的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例5的脱细胞化组织组合物。
50.＜＜实施例6＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用表面活性剂处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。在将心包片在以含有4％乙醇的方式而制备的0.1％(v/v)过乙酸溶液中于4℃浸渍2小时，从而进行杀菌之后，使用注射用水于4℃洗涤1小时。然后，在0.25质量％的sds溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡24小时，接着，在0.5质量％tx溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡24小时。然后，于4℃使用10l的注射用水进行洗涤之后，在磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)中于4℃振荡1小时。进行冻结干燥处理，以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化组织组合物为1.0质量％的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例6的脱细胞化组织组合物。
51.＜＜实施例7＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用冻融处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。使用干冰冻结心包片，并在放有干冰的保冷箱中(约为-78℃)中保存20小时之后，于25℃使其溶解。对重复了4次该冻融的心包片使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)进行处理，并于4℃振荡96小时。进一步，在80％乙醇中于4℃振荡96小时之后，在注射用水中于4℃振荡2小时。进行冻结干燥处理，以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化组织组合物为1.0质量％的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例7的脱细胞化组织组合物。
52.＜＜实施例8＞＞
在本实施例中，使用牛的心包，利用超声波处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。在生理盐水中对心包片进行超声波处理(强度：10w/cm2，频率：10khz，作用时间：2分钟)。对于经超声波处理的牛心包，在1质量％的tx溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡96小时。使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经tx处理的心包片进行处理，于4℃振荡96小时。进一步，在80％乙醇中于4℃振荡72小时之后，在生理盐水中于4℃振荡2小时。进行冻结干燥处理，以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化组织组合物为1.0质量％的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例8的脱细胞化组织组合物。
53.＜＜比较例1＞＞在本比较例中，使用牛的心包，利用表面活性剂处理制造脱细胞化材料。在将心包片在以含有4％乙醇的方式而制备的0.1％(v/v)过乙酸溶液中于4℃浸渍2小时，从而进行杀菌之后，使用注射用水于4℃洗涤1小时。然后，在0.25质量％的sds溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡24小时，接着，在0.5质量％tx溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡24小时。然后，于4℃使用10l的注射用水进行洗涤之后，在磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)中于4℃振荡1小时。进行冻结干燥处理，得到比较例1的脱细胞化牛心包膜(脱细胞化材料)。
54.＜＜比较例2＞＞在本比较例中，使用牛的心包，利用冻融处理制造脱细胞化材料。使用干冰冻结心包片，并在放有干冰的保冷箱中(约为-78℃)中保存20小时之后，于25℃使其溶解。对重复了4次该冻融的心包片使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)进行处理，并于4℃振荡96小时。进一步，在80％乙醇中于4℃振荡96小时之后，在注射用水中于4℃振荡2小时。进行冻结干燥处理，得到比较例2的脱细胞化牛心包膜(脱细胞化材料)。
55.＜＜比较例3＞＞在本比较例中，使用牛的心包，利用超声波处理制备脱细胞化材料。在生理盐水中对心包片进行超声波处理(强度：10w/cm2，频率：10khz，作用时间：2分钟)。对于经超声波处理的牛心包，在1质量％的tx溶液(10mm tris，ph8.0)中于4℃振荡96小时。使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经tx处理的心包片进行处理，并于4℃振荡96小时。进一步，在80％乙醇中于4℃振荡72小时之后，在生理盐水中于4℃振荡2小时。进行冻结干燥处理，得到比较例3的脱细胞化牛心包膜(脱细胞化材料)。
56.＜＜细胞粘附性试验＞＞使用经高压灭菌的剪刀与镊子，将实施例及比较例中得到的脱细胞化组织组合物或脱细胞化材料剪切成直径为4mm的圆盘状作为试验片，并将其设置在96孔板用的细胞池(cell inserts)中。在细胞池的下侧添加175μl的dmem培养基，并在细胞池的上侧添加15μl的dmem培养基，于37℃静置24小时以上，从而驯化脱细胞化组织组合物或脱细胞化材料。在去除dmem培养基之后，接种人皮肤成纤维细胞(nhdf)(7.0
×
104细胞/cm2)，于37℃培养3小时。在使用dpbs(dulbecco’s phosphate-buffered saline(杜氏磷酸缓冲盐溶液))从试验片上洗涤并去除未附着的细胞之后，使用wst-8(dojindo laboratories制造)对试验片进行染色，测定450nm处的吸光度。另外，预先由使用wst-8进行了染色的nhdf与吸光度制成标
准曲线，根据试验片的吸光度与标准曲线计算出附着在试验片上的nhdf数量。将细胞粘附性试验的结果示于图2。比较例2为与比较例1相同程度的结果。可知与比较例1相比，实施例1～8的细胞粘附数多，细胞的诱引效果良好。特别是实施例1、5的细胞的诱引效果良好。
57.＜＜实施例9＞＞在本实施例中，使用猪的肝脏，利用高静水压处理制备脱细胞化组织组合物。将猪肝脏切成片状，将脂肪整体去除(以下，将该片状的猪肝脏称为“肝脏片”)。在聚乙烯制袋中，将在注射用水中添加磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)而成的液体作为介质，使用研究开发用高压处理装置(kobe steel,ltd.：dr.chef)，以600mpa对肝脏片进行10分钟的高静水压处理。使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经高静水压处理的肝脏片进行处理，并于4℃振荡18小时5分钟以上，接着在80％乙醇中于4℃处理1小时以上，最后于4℃使用4l的注射用水进行洗涤。进行冻结干燥处理，得到实施例9的脱细胞化组织组合物。
58.＜＜实施例10＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用高静水压处理制备脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。将牛心包切成片状，将脂肪整体去除，得到心包片。在聚乙烯制袋中，将在注射用水中添加磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)而成的液体作为介质，使用研究开发用高压处理装置(kobe steel,ltd.：dr.chef)，以600mpa对心包片进行10分钟的高静水压处理。使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经高静水压处理的心包片进行处理，并于4℃振荡18小时5分钟以上，接着在80％乙醇中于4℃处理1小时以上，最后于4℃使用4l的注射用水进行洗涤。进行冻结干燥处理，得到脱细胞化牛心包膜。以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化组织组合物为3.0质量％(总含量)的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例10的脱细胞化组织组合物。
59.＜＜实施例11＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用高静水压处理制备脱细胞化组织组合物。将牛心包切成片状，将脂肪整体去除(以下，将该片状的牛心包称为“心包片”)。在聚乙烯制袋中，将在注射用水中添加磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)而成的液体作为介质，使用研究开发用高压处理装置(kobe steel,ltd.：dr.chef)，以600mpa对心包片进行10分钟的高静水压处理。使用作为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经高静水压处理的心包片进行处理，并于4℃振荡18小时5分钟以上，接着在80％乙醇中于4℃处理1小时以上，最后于4℃使用4l的注射用水进行洗涤。在进行冻结干燥处理之后，照射伽马射线(25kgy)，由此得到实施例11的脱细胞化组织组合物。
60.＜＜实施例12＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用高静水压处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。将牛心包切成片状，将脂肪整体去除，得到心包片。在聚乙烯制袋中，将在注射用水中添加磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)而成的液体作为介质，使用研究开发用高压处理装置(kobe steel,ltd.：dr.chef)，以600mpa对心包片进行10分钟的高静水压处理。使用作
为核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经高静水压处理的心包片进行处理，于4℃振荡18小时5分钟以上，接着在80％乙醇中于4℃处理1小时以上，最后于4℃使用4l的注射用水进行洗涤。在进行冻结干燥处理之后，照射伽马射线(25kgy)，由此得到脱细胞化牛心包膜。以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化牛心包膜为1.0质量％(总含量)的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例12的脱细胞化组织组合物。
61.＜＜实施例13＞＞在本实施例中，使用牛的心包，利用高静水压处理制造脱细胞化材料，并添加膜联蛋白a2，得到脱细胞化组织组合物。将牛心包切成片状，将脂肪整体去除，得到心包片。在聚乙烯制袋中，将在注射用水中添加磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)而成的液体作为介质，使用研究开发用高压处理装置(kobe steel,ltd.：dr.chef)，以600mpa对心包片进行10分钟的高静水压处理。使用核酸分解酶的脱氧核糖核酸酶i(125u/ml)对经高静水压处理的心包片进行处理，于4℃振荡18小时5分钟以上，接着在80％乙醇中于4℃处理1小时以上，最后于4℃使用4l的注射用水进行洗涤。在进行冻结干燥处理之后，通过照射伽马射线(25kgy)，得到脱细胞化牛心包膜。以使膜联蛋白a2相对于每单位重量的脱细胞化牛心包膜为3.0质量％(总含量)的方式添加膜联蛋白a2，得到实施例13的脱细胞化组织组合物。
62.对实施例9～13进行上述细胞粘附性试验。并将结果示于图2。可知与比较例1相比，实施例9～13的细胞粘附数多，细胞的诱引效果良好。特别是实施例11的细胞的诱引效果良好。可知在实施例9中，即使使用了猪肝脏，仍得到了良好的结果。
63.＜＜强度试验＞＞(拉伸试验)通过以下方式进行实施例1及11以及比较例1中得到的脱细胞化组织组合物或脱细胞化材料的拉伸试验。(1)试验片的采取
·
制造将冻结干燥状态的脱细胞化组织组合物或脱细胞化材料在生理盐水中浸渍15分钟以上。从溶胀的脱细胞化组织组合物或脱细胞化材料中采取iso37中记载的哑铃形状8号形状试验片。(2)试验片的测定使用3d轮廓测量仪(vr-3200，keyence corporation)测定哑铃试验片的平行部分的厚度。试验片的宽度(mm)直接使用平行部分的冲切刀模具的切断面管的长度(40mm)。通过下述公式，由试验片的厚度与宽度计算出试验片的截面面积a(mm2)。a＝t
×
w(a：试验片截面面积(mm2)，t：试验片厚度(mm)，w：试验片宽度(mm))(3)试验步骤以iso37为基准，按照以下方式实施拉伸试验。为了使拉伸力均匀地分布在截面上，以试验片两端保持对称的方式将试验片安装在力学试验机(mct2150，and inc.制造)上。测定使试验机启动的标距lb(mm)。将夹具的速度设为200mm/分钟。舍弃在标线间的外侧发生断裂的试验片数据，使用追加的试验片重复进行试验。对试验片进行测定直至正确测定3次为止。通过下述计算公式，由测定值计算出断裂强度[mpa]、弹性模量[mpa](伸长10％
时及最大时)。(4)结果的计算＜断裂强度＞断裂强度(mpa(n/mm2))通过以下公式计算。断裂强度(mpa)＝最大负载(n)/试验片截面(mm2)＜弹性模量＞弹性模量(应力/伸长应变))通过以下公式计算。弹性模量(mpa)＝负载(mpa(n/mm2))/伸长应变((l-l0)/l0)
[0064]
(撕裂强度试验)通过以下方式进行实施例及比较例中得到的脱细胞化组织组合物或脱细胞化材料的撕裂强度试验。(1)试验片的采取
·
制造将冻结干燥状态的脱细胞化组织组合物或脱细胞化材料在生理盐水中浸渍15分钟以上。从溶胀的脱细胞化组织组合物或脱细胞化材料中采取20mm
×
15mm。在距离长边上方2mm的位置开出6mm直径的孔穴。将丝线通过孔穴，制造试验片。(2)试验步骤将试验片的一端安装在力学试验机上(mct2150，and inc.制造)的夹具上，并将丝线设置在钩式的固定工具上。将夹具的速度设为200mm/分钟。对试验片进行测定直至正确测定3次为止。将测定值作为断裂时的最大负载[n]而进行计算。
[0065]
将伸长10％时的弹性模量、最大弹性模量、断裂强度及撕裂强度的试验结果分别示于图3～6。可知与比较例1相比，实施例1及11在伸长10％时所需的力小，即柔软，操作性良好。此外，与比较例1相比，实施例1及11的最大弹性模量大，显示出与人心包的弹性模量49.62
±
3.22(mpa，参照interactive cardiovascular and thoracic surgery22(2016)72-84)相近的值。由此，在移植于患者时，容易与患者组织亲和，对于脉搏
·
搏动等而言能够维持结构的稳定性。特别是实施例1显示出了53.9mpa的最大弹性模量。此外，可知与比较例1相比，实施例1及11的断裂强度高，即强度高且坚固。此外，可知与比较例1相比，实施例1及11的撕裂强度高，即在用于手术时，耐丝线拉扯性高，缝合强度高。由此可知，与比较例1相比，实施例1及11的操作性良好，并且坚固。
[0066]
＜＜蛋白质的分析＞＞利用双向电泳，对所述实施例1的脱细胞化组织组合物及比较例1的脱细胞化材料的组成的差异进行分析。分别在2根微管中秤量20mg实施例1的脱细胞化组织组合物或比较例1的脱细胞化材料(1根10mg)。在一根微管中添加蛋白质提取缓冲液1(含有尿素)，而在另一根微管中添加蛋白质提取缓冲液2(含有尿素及表面活性剂)，并在室温下进行振荡之后，进行离心，回收上清。在利用超滤单元(amicon ultra-4，ultracel 3k，millipore)进行缓冲液取代之后，加入含尿素的缓冲液，通过离心进行浓缩，纯化蛋白质。分别对使用蛋白质提取缓冲液1及2所提取的溶液进行蛋白质的定量(pierce 660nm protein assay，thermo scientific)。将使用蛋白质提取缓冲液1及2所提取的蛋白质进行混合。分别由20mg实施例的脱细胞化组织组合物或比较例的脱细胞化材料回收了4.91mg及6.06mg的蛋白质。从实施
例或比较例的样本溶液中分取出200μg的蛋白质，作为用于双向电泳的样本。
[0067]
在样本中加入缓冲液之后，加入蛋白质溶解溶液(含有尿素及表面活性剂)，从而将总量制成0.34ml(蛋白质为200μg)，并将此作为试样溶液。在溶胀用皿中加入试样溶液，将第一向电泳预制胶覆盖在溶液上。进一步覆盖干胶条覆盖液，静置过夜。将溶胀的预制胶设置在电泳装置上，进行电泳(在500v下1分钟，在3500v下7.5小时，20℃)。使用具有10～20％的浓度梯度的丙烯酰胺凝胶。在制备后静置24小时，使丙烯酰胺完全聚合。将经平衡化的第一向电泳预制胶载置在丙烯酰胺凝胶上，使用加入了0.125％溴酚蓝的1％琼脂糖溶液进行固定。在凝胶左端施加分子量标记，作为分子量的标准，以80v进行17小时的电泳，直至在凝胶下端能够看到溴酚蓝的条带。
[0068]
使用全蛋白质检测用荧光染色剂(sypro ruby protein gel stain,s21900，thermo fisher scientific inc.)对电泳之后的凝胶进行染色，使用荧光扫描仪保存图像。使用扫描仪获得的图像的获取在激发波长：488nm、荧光滤光片：640nm bandpass(带通滤光片)、分辨率：100micrometer(微米)下进行。在获取荧光染色图像之后，使用硝酸银(195-09382，fujifilm wako pure chemical corporation)进行银染色。使用平台式扫描仪获取显影之后的银染色图像。将双向电泳的结果示于图1。实施例1在等电点pi为6～9、分子量为30,000～40,000处检测到3个点(1～3)。然而，比较例1并未检测到实施例1中检测到的3个点。比较例2、3中也未检测到实施例1中检测到的3个点。可知实施例1含有比较例1～3中没有的特定蛋白质。
[0069]
(点的鉴定)切取通过银染色而可视化的点，在切断为1mm见方大小的凝胶片上加入15mm铁氰化钾、50mm硫代硫酸钠100μl，并振荡10分钟。废弃溶液，加入milli-q水并进行振荡，洗涤至凝胶片脱色。对凝胶片加入乙腈，从而进行脱水。加入100mm碳酸氢铵、0.01μg/μl胰蛋白酶的酶溶液10μl，使凝胶片溶胀，并于37℃放置16小时。加入50μl的0.1％tfa、50％乙腈，并振荡20分钟，提取肽。进行2次提取。使用真空离心机将肽提取液浓缩至约10μl。使样本吸附在ziptip c18(millipore(微孔过滤器)，ztc18s960)上，并使用60％乙腈、0.1％tfa溶液2.5μl，使肽溶出。将1μl的样本溶液与1μl的chca基质溶液混合，滴加在靶板上并使其干燥之后，使用质谱仪(ultraflextreme)进行测定。基于得到的质量值，进行登录于数据库(ncbi refseq)中的蛋白质的鉴定。分析装置ultraflextreme(bruker daltonics)靶板mtp anchorchip 600/384(209513,bruker daltonics)极性positive mode(阳性模式)检测模式reflector mode(反射模式)(300-6,000m/z)chca基质溶液0.3g/l chca、33％丙酮、66％乙醇ms/ms ion search检索条件鉴定软件mascot(matrix science)数据库ncbi refseq检索生物种类bos taurus(家牛)酶胰蛋白酶
固定修饰脲甲基化
[0070]
将使用质谱仪对实施例1的3个点进行鉴定的结果示于表1。表1及后述表2的点编号对应于图1的3个点编号。3个点鉴定为膜联蛋白a2。
[0071]
[表1]点编号蛋白质名称分子量等电点
①
膜联蛋白a2388737.15
②
膜联蛋白a2388737.58
③
膜联蛋白a2388738.07
[0072]
(点信号浓度的计算：电泳数值分析)将得到的荧光染色像的tiff图像文件导入image master platinum(ge)中，进行数值化分析。在数值化分析中，首先，通过手册对各凝胶的共同点标定标记(landmark)。在对各凝胶进行300点的标定标记操作之后，进行凝胶的比对(matching)。通过该操作，对在两个被检体的凝胶上展开的点赋予共同的点id。然后，进行凝胶的点检测，计算出点信号浓度(％volume(％体积))。点信号浓度根据点的信号相对于凝胶内所有点的信号的总和所占的比例进行计算。将％volume值设为以百分率表示，将最小表示设为0.001％。
[0073]
(点重量的计算)根据经双向电泳的蛋白质的重量200μg、与各点信号相对于点信号的总和(点信号浓度)的比率，计算出各个点的蛋白质重量。对将200μg的蛋白质供于双向电泳时的各个点的蛋白质重量进行计算，其结果，在实施例1中，由点1计算出0.7μg的蛋白质重量，由点2计算出2.0μg的蛋白质重量，由点3计算出0.8μg的蛋白质重量，由3个点计算出合计3.5μg的蛋白质重量。
[0074]
(脱细胞化组织组合物中含有的3个点的蛋白质重量的计算)根据经纯化并回收的蛋白质的重量与经双向电泳的蛋白质的重量的关系，计算出各20mg脱细胞化组织组合物的3个点的蛋白质重量。将结果示于表2。在实施例1中，由3个点计算出蛋白质重量。实施例1含有0.43质量％的蛋白质a。然而，在比较例1中，未能计算出相当于该3个点的蛋白质重量。在比较例2、3中也未能计算出相当于该3个点的蛋白质重量。
[0075]
[表2]
[0076]
对实施例9及11～13的脱细胞化组织组合物同样进行蛋白质的分析。将实施例9的双向电泳的结果示于图7的a。与实施例1相同，在等电点pi为6～9、分子量为30,000～40,000处检测到3个点(4～6)。将实施例11的双向电泳的结果示于图7的b。在等电点pi为6～9、
分子量为30,000～40,000处检测到3个点(7～9)。且在等电点pi为4～5、分子量为8,000～12,000处检测到点(10)。点10仅能够在实施例11～13中检测到。
[0077]
对实施例9及11的点进行所述点的鉴定。将实施例9的结果示于表3。表3及后述表5的点编号对应于图7的a的点编号。实施例9的点4～6与实施例1相同(参照表1点编号1～3)，鉴定为膜联蛋白a2。
[0078]
[表3]点编号蛋白质名称分子量等电点
④
膜联蛋白a2388737.15
⑤
膜联蛋白a2388737.58
⑥
膜联蛋白a2388738.07
[0079]
将实施例11的结果示于表4。表4及后述表6的点编号对应于图7的b的点编号。实施例11的点7～9与实施例1相同，鉴定为膜联蛋白a2，点10鉴定为来自纤调蛋白聚糖的肽。
[0080]
[表4]点编号蛋白质名称分子量等电点
⑦
膜联蛋白a2388737.15
⑧
膜联蛋白a2388737.58
⑨
膜联蛋白a2388738.07
⑩
纤调蛋白聚糖的片段100004.65
[0081]
对实施例9及11进行所述点信号浓度的计算、点重量的计算。对将200μg的蛋白质供于双向电泳时的各个点的蛋白质重量进行计算，其结果，在实施例9中，由点4计算出0.14μg的蛋白质重量，由点5计算出0.27μg的蛋白质重量，由点6计算出0.03μg的蛋白质重量，由3个点计算出合计0.44μg的蛋白质重量。此外，在实施例11中，由点7计算出0.7μg的蛋白质重量，由点8计算出1.6μg的蛋白质重量，由点9计算出0.4μg的蛋白质重量，由3个点计算出合计2.7μg的蛋白质重量，且由点10计算出0.24μg的蛋白质重量。
[0082]
对实施例9、11进行各20mg上述脱细胞化组织组合物的点的蛋白质重量的计算。将结果示于表5、6。实施例9含有0.05质量％的蛋白质a。实施例11含有0.33质量％的蛋白质a、0.03质量％的蛋白质b。
[0083]
[表5]
[0084]
[表6]
[0085]
＜＜脱细胞化dna比的计算＞＞测定实施例1、9、及11的脱细胞化组织组合物及比较例1～3的脱细胞化材料的质量，将其作为样本，并浸渍在蛋白质分解酶溶液中进行溶解之后，使用苯酚/氯仿进行处理来去除蛋白质，并通过乙醇沉淀法回收dna。利用picogreen(life technologies corporation)对回收的dna进行荧光染色，并测定荧光强度，由此对dna进行定量，并由样本的质量与dna的量计算出样本的dna含量。其中，使用利用picogreen中附带的标准dna制作的标准曲线进行dna的定量。使用另外的样本，由样本的质量(水分量70％)与干燥的样本(在60℃的恒温槽中保存了12小时的样本)的质量求出干燥减量比，并由样本的dna含量与干燥减量比计算出样本的每单位干燥质量的dna含量。将结果示于表7。(脱细胞化dna比)＝(样本的干燥试验片的dna含量)/(样本的质量)
×
100
[0086]
[表7]
[0087]
可知与比较例相比，高静水压处理的实施例1、9、及11良好地进行了脱细胞化。工业实用性
[0088]
本发明的脱细胞化组织组合物能够用作表现出良好的组织再生的移植用组织。

技术特征：
1.一种脱细胞化组织组合物，其含有脱细胞化组织与(a)分子量为30,000～70,000且(b)等电点pi为6.00～9.00的蛋白质a。2.根据权利要求1所述的脱细胞化组织组合物，其进一步含有(a)分子量为3,000～15,000且(b)等电点pi为3.00～5.50的蛋白质b。3.根据权利要求1或2所述的脱细胞化组织组合物，其中，相对于脱细胞化组织组合物，所述蛋白质a的含量为0.01～5.0质量％。4.根据权利要求1～3中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，相对于脱细胞化组织组合物，所述蛋白质b的含量为0.001～3.0质量％。5.根据权利要求1～4中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，蛋白质a与蛋白质b在组合物中的质量比为a:b＝5:1～150:1。6.根据权利要求1～5中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，相对于脱细胞化组织组合物，每单位干燥质量的dna含量为0.0300质量％以下。7.根据权利要求1～6中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，所述蛋白质a为膜联蛋白。8.根据权利要求1～7中任一项所述的脱细胞化组织组合物，其中，所述蛋白质b为来自纤调蛋白聚糖的肽。

技术总结
本发明的目的在于提供一种表现出适当的强度及良好的组织再生的脱细胞化组织。所述技术问题能够通过含有本发明的脱细胞化组织、(a)分子量为30,000～70,00且(b)等电点pI为6.00～9.00的蛋白质A的脱细胞化组织组合物而解决。解决。


技术研发人员：本间光将 日渡谦一郎 小原春树 木村拓矢 木下敬太
受保护的技术使用者：株式会社ADEKA
技术研发日：2021.11.12
技术公布日：2023/8/21