用于抗B7H4抗体-药物缀合物疗法的评分方法与流程

用于抗b7h4抗体-药物缀合物疗法的评分方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年9月12日提交的美国临时专利申请号63/077,607的优先权。出于所有目的，以上所列的申请中的每一者通过援引以其全文并入本文。
3.以电子方式提交的材料通过援引而并入
4.通过援引以其全文并入本文的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表与此同时提交，并确定如下：名为“b7h4-400-wo-pct_seq-listing.txt”、创建于2021年9月2日的一个14,351字节的ascii(文本)文件。
技术领域
5.本发明涉及一种用于计算分数的方法，该分数指示癌症患者将对使用抗b7h4抗体-药物缀合物的疗法的反应情况。


背景技术：

6.评估癌症患者对给定治疗的反应概率是确定癌症患者治疗方案的必需步骤。这种评估常常基于对癌症患者组织样品的组织学分析，并涉及使用标准分级方案对癌症进行鉴别和分类。免疫组化(ihc)染色可用于区分表达特定蛋白质的标志物阳性细胞与不表达该蛋白质的标志物阴性细胞。ihc染色通常涉及多种染料，这些染料包括一种或多种与蛋白质特异性抗体相连的染料和另一种作为复染剂的染料。常见的复染剂是苏木精，它标记dna，从而对细胞核进行染色。
7.蛋白质特异性染剂或生物标志物可用于鉴别癌症患者组织中可能对预定疗法表现出反应的区域。例如，对上皮细胞进行染色的生物标志物可以帮助鉴别疑似肿瘤区域。然后用其他蛋白质特异性生物标志物来表征癌组织内的细胞。可以鉴别和量化受特定生物标志物染色的细胞，随后病理学家可以在视觉上估计指示阳性染色细胞和阴性染色细胞数量的分数。然后可以将该分数与已经以同样方式计算的其他癌症患者的分数进行比较。如果这些其他患者对给定癌症治疗的反应是已知的，则病理学家可以基于为该癌症患者计算的分数与其他患者的分数的比较来预测该癌症患者对给定治疗的反应可能性。然而，病理学家的视觉评估有可变性和主观性倾向。
8.一种有前景的癌症治疗涉及抗体-药物缀合物(adc)，该抗体-药物缀合物具有与抗体缀合的具有细胞毒性的药物，该抗体的抗原在癌细胞的表面上表达。adc与抗原结合并经历细胞内化，以便将药物选择性地递送至癌细胞并且使药物在那些癌细胞内积聚并杀伤癌细胞。寻求一种基于计算机的方法，用于生成指示癌症患者对涉及治疗性b7-h4抗体-药物缀合物的治疗的反应的可重复的客观分数。


技术实现要素：

9.一种用于预测癌症患者将对涉及抗体药物缀合物(adc)的疗法的反应情况的方法涉及基于每个癌细胞的单细胞adc分数计算反应分数。adc包括adc有效载荷和靶向每个癌
细胞上的蛋白质的adc抗体。使用与诊断性抗体连接的染料对组织样品进行免疫组化染色，该诊断性抗体与组织样品中癌细胞上的蛋白质结合。获取该组织样品的数字图像。对数字图像进行图像分析，以使用卷积神经网络检测癌细胞。对于每个癌细胞，单细胞adc分数是基于染料在癌细胞的膜和/或细胞质中和/或在与癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度计算的。通过使用统计运算来聚合组织样品的所有单细胞adc分数，生成预测癌症患者对adc疗法的反应分数。推荐反应分数高于预定阈值的患者接受涉及该adc的疗法。
10.在一个实施例中，一种生成指示用抗体药物缀合物(adc)治疗的癌症患者的生存概率的分数的方法涉及计算单细胞adc分数。使用与诊断性抗体连接的染料对癌症患者的组织样品进行免疫组化染色。该adc包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的b7-h4蛋白的adc抗体。诊断性抗体与组织样品中癌细胞上的b7-h4蛋白结合。获取组织样品的数字图像，并使用图像分析检测数字图像中的癌细胞。对于每个癌细胞，基于染料在膜中的染色强度计算单细胞adc分数。单细胞adc分数也可以任选地基于染料在癌细胞的细胞质中的染色强度，以及基于染料在与该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度。所得到的定量连续分数(qcs)指示癌症患者的生存概率并且是通过使用统计运算来聚合组织样品的所有单细胞adc分数而生成的。所有单细胞adc分数的聚合是通过确定平均值、确定中位数或确定具有预定义百分比的分位数来进行的。在另一个方面，所有单细胞adc分数的聚合涉及使用预定阈值的阈值运算。所有单细胞adc分数大于预定阈值的细胞都被标记为单细胞adc阳性。聚合是通过确定单细胞adc阳性细胞的数量除以所有癌症细胞的数量来进行的。
11.在一个实施例中，一种预测癌症患者对抗体药物缀合物(adc)的反应的方法涉及检测癌细胞并计算每个癌细胞的单细胞adc分数。该adc包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的蛋白质的adc抗体。该蛋白质是b7-h4。使用与诊断性抗体连接的染料对组织样品进行免疫组化染色。诊断性抗体与组织样品中癌细胞上的蛋白质结合。获取组织样品的数字图像，并检测数字图像中的癌细胞。对于每个癌细胞，基于染料在膜中的染色强度计算单细胞adc分数。单细胞adc分数也可以任选地基于染料在癌细胞的细胞质中的染色强度，以及基于染料在与癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度。每个膜的染色强度是基于膜的像素中棕色二氨基联苯胺(dab)信号的平均光密度来计算的，并且每个细胞质的染色强度是基于细胞质的像素中棕色dab信号的平均光密度来计算的。基于使用统计运算对组织样品的所有单细胞adc分数的聚合，预测癌症患者对adc的反应。
12.在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为5或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为6或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为7或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为8或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为9或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为10或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为15或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为20或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为25或更大，则患者评分阳性。
13.在一些实施例中，如果至少50％的肿瘤细胞的膜光密度为5或更大、8或更大或25或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少50％的肿瘤细胞的膜光密度为8或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少60％的肿瘤细胞的膜光密度为5或更大、8或更大或25或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少60％的肿瘤细胞的膜光密度为8或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少70％的肿瘤细胞的膜光密度为5或更大、8或更大或25或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少70％的肿瘤细胞的膜光密度为8或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少80％的肿瘤细胞的膜光密度为5或更大、8或更大或25或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少80％的肿瘤细胞的膜光密度为8或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为5或更大、8或更大或25或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少90％的肿瘤细胞的膜光密度为8或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少95％的肿瘤细胞的膜光密度为5或更大、8或更大或25或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果至少95％的肿瘤细胞的膜光密度为8或更大，则患者评分阳性。
14.在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为500个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为1000个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为1250个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为1500个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为1600个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为1670个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为1700个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为1800个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为1900个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为2000个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果膜光密度为至少8的肿瘤细胞的密度为3000个细胞/mm2或更大，则患者评分阳性。
15.在一些实施例中，如果空间接近度分数为90或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为91或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为92或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为93或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为94或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为95或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为96或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为97或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为98或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为99或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为99.5或更高，则患者评分阳性。在一些实施例中，如果空间接近度分数为99.8或更高，则患者评分阳性。在上述实施例中，空间接近度分数的计算如下：空间接近度分数＝([od》8的肿瘤细胞数]+[在od》8的至少一个肿瘤细胞25um附近的od《＝8的肿瘤细胞数])/[所有肿瘤细胞数]。
[0016]
在另一个实施例中，一种鉴别将对抗体药物缀合物(adc)表现出预定反应的癌症
患者的方法涉及生成反应分数。该adc包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的蛋白质的adc抗体。使用与诊断性抗体连接的染料对癌症患者的组织样品进行免疫组化染色，该诊断性抗体与组织样品中癌细胞上的蛋白质结合。获取组织样品的数字图像，并使用卷积神经网络检测数字图像中的癌细胞。对于每个癌细胞，基于染料在膜中的染色强度计算单细胞adc分数。单细胞adc分数也可以任选地基于染料在癌细胞的细胞质中的染色强度，并且基于染料在与计算单细胞分数的该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度。qcs分数是通过使用统计运算来聚合该组织样品的所有单细胞adc分数而生成的反应分数。基于qcs分数是否超过阈值，将癌症患者鉴别为将会对adc表现出预定反应的癌症患者。将表现出大于阈值的qcs分数的患者认为是qcs评分阳性的，而将所有其他患者认为是qcs评分阴性的。预定反应是平均肿瘤大小的减小。在另一个方面，qcs分数与阈值之差指示将癌症患者正确鉴别为将会对adc表现出预定反应的癌症患者的概率。差异小指示概率低，而差异大指示准确鉴别癌症患者的概率高。
[0017]
在一个实施例中，一种用抗体药物缀合物(adc)治疗癌症患者的方法涉及生成治疗分数形式的qcs分数。该adc包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的蛋白质的adc抗体。该蛋白质是b7-h4。使用与诊断性抗体连接的染料对癌症患者的组织样品进行免疫组化染色，该诊断性抗体与组织样品中癌细胞上的蛋白质结合。获取组织样品的数字图像，并检测数字图像中的癌细胞。对于每个癌细胞，基于染料在膜中的染色强度计算单细胞adc分数。单细胞adc分数也可以任选地基于染料在癌细胞的细胞质中的染色强度，以及基于染料在与该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度。通过使用统计运算来聚合组织样品的所有单细胞adc分数而生成治疗分数。如果该治疗分数超过预定阈值，则向该癌症患者施用涉及该adc的疗法。
[0018]
在另一个实施例中，一种用抗体药物缀合物(adc)治疗癌症患者的方法是由施用疗法的临床医生进行的。该adc包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的蛋白质的adc抗体。该蛋白质是b7-h4。如果反应分数超过预定阈值，则向该癌症患者施用涉及该adc的疗法。qcs反应分数是通过使用统计运算来聚合癌症患者的组织样品的单细胞adc分数而生成的。基于染料在膜中的染色强度，计算每个癌细胞的单细胞adc分数。单细胞adc分数也可以任选地基于染料在每个癌细胞的细胞质中的染色强度并且还基于染料在与每个癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度，单细胞adc分数是对该每个癌细胞计算的。在癌症患者的组织样品的数字图像中检测癌细胞。使用与诊断性抗体连接的染料对组织样品进行免疫组化染色，该诊断性抗体与组织样品中癌细胞上的蛋白质结合。
[0019]
其他实施例和优点将在下面的具体实施方式中进行描述。该发明内容并不旨在限定本发明。本发明由权利要求书限定。
附图说明
[0020]
附图说明了本发明的实施例，附图中相同的数字指示相同的组成部分。
[0021]
图1示出了编码人b7-h4的完整核苷酸序列(seq id no:1)。
[0022]
图2示出了人b7-h4的核苷酸编码序列(seq id no:2)。
[0023]
图3示出了人b7-h4的多肽序列(seq id no:3)。
[0024]
图4示出了抗b7h4抗体的重链hcdr1的氨基酸序列(seq idno:4)。
[0025]
图5示出了抗b7h4抗体的重链hcdr2的氨基酸序列(seq idno:5)。
[0026]
图6示出了抗b7h4抗体的重链hcdr3的氨基酸序列(seq idno:6)。
[0027]
图7示出了抗b7h4抗体的轻链lcdr1的氨基酸序列(seq idno:7)。
[0028]
图8示出了抗b7h4抗体的轻链lcdr2的氨基酸序列(seq idno:8)。
[0029]
图9示出了抗b7h4抗体的轻链lcdr3的氨基酸序列(seq idno:9)。
[0030]
图10示出了抗b7h4抗体的重链可变区(vh)的氨基酸序列(seqid no:10)。
[0031]
图11示出了抗b7h4抗体的轻链可变区(vl)的氨基酸序列(seqid no:11)。
[0032]
图12示出了抗b7h4抗体的重链的氨基酸序列(seq id no:12)。
[0033]
图13示出了抗b7h4抗体的轻链的氨基酸序列(seq id no:13)。
[0034]
图14是步骤流程图，通过这些步骤分析系统分析来自癌症患者的组织的数字图像，并预测癌症患者将可能对涉及抗b7h4抗体-药物缀合物的疗法的反应情况。
[0035]
图15示出了说明图14的步骤2的图像分析过程的数字图像。
[0036]
图16说明了图像分析步骤，其中检测癌细胞的细胞核目标。
[0037]
图17说明了图像分析步骤，其中使用细胞核目标检测膜。
[0038]
图18说明了图像分析步骤，其中检测癌细胞的膜目标。
[0039]
图19是图像分析软件环境中的图像分析步骤结果的截图。
[0040]
图20示出了用于图像分析分割的脚本和使用该脚本获得的细胞目标测量结果。
[0041]
图21示出了使用膜和细胞质像素的灰度值进行图像分析的染色强度的样品定量结果。
[0042]
图22列出了图21的图像的膜上和细胞质中的示例性定量染色量。
[0043]
图23说明了抗b7h4 adc疗法杀伤癌细胞的机制。
[0044]
图24说明了在图22所示三个细胞中的每个细胞基于细胞分离的单细胞adc分数的计算以反映adc有效载荷向相邻细胞中的摄取。
[0045]
图25示出了计算单细胞分数的公式。
[0046]
图26示出了pdx乳腺研究的15个样品的实际结果与按反应类别列出的人工h分数之间的相关性。
[0047]
图27是将人工比例分数与平均h分数进行比较的图表。
[0048]
图28是将b7h4膜染色的光密度的人工比例分数与qcs中位分数进行比较的图表。
[0049]
图29是将人工强度分数与平均h分数进行比较的图表。
[0050]
图30是将b7h4膜染色的光密度的人工强度分数与qcs中位分数进行比较的图表。
[0051]
图31示出了pdx乳腺研究中落在pd、r和sd三个反应类别中的样品的平均h分数。
[0052]
图32示出了pdx乳腺研究中落在pd、r和sd三个反应类别中的样品的中位qcs分数。
[0053]
图33示出了相对于r、sd和pd反应类别，样品的人工h分数的箱形图分布。
[0054]
图34示出了相对于r、sd和pd反应类别，如样品的中位膜光密度限定的qcs分数的箱形图分布。
[0055]
图35示出了肿瘤增长的百分比与qcs分数(样品中所有肿瘤细胞的膜光密度的中位数/50％分位数)之间的关系。
[0056]
图36示出了肿瘤增长的百分比与qcs分数之间的关系，添加了相关线。
[0057]
图37说明了如何将异种移植小鼠模型与图像分析和定量连续分数一起用于研究
抗b7h4 adc的药代动力学和药效学。
[0058]
图38a是显示在所有上皮细胞中adc-igg染色的上皮细胞的细胞比率的图表，并且展示了adc与靶细胞结合的浓度依赖性和动力学。
[0059]
图38b是显示gh2ax阳性上皮细胞百分比的图表，并且展示在adc处理后，并且在不同adc浓度下随时间增加的dna损伤。
[0060]
图38c是显示基于裂解的半胱天冬酶-3(cc-3)阳性肿瘤面积的百分比，在adc处理后dna损伤随时间增加的图表。
[0061]
图38d是显示在adc处理后，基于所有上皮细胞的细胞密度下降，肿瘤细胞死亡随时间增加的图表。
[0062]
图39a示出了通过植入小鼠中而克隆的来自28名乳腺癌患者的肿瘤组织的膜染色的中位光密度。
[0063]
图39b示出了图39a中21号样品的染色组织，其中诊断性抗体d11的膜染色远远小于诊断性抗体a57.1和cal63的染色。
[0064]
图39c示出了图39a中28号样品的染色组织，其中诊断性抗体a57.1的膜染色显著小于诊断性抗体d11和cal63的染色。
[0065]
图40a是使用诊断性抗体cal63染色的图39a中26号样品的数字图像。
[0066]
图40b是使用诊断性抗体cal63染色的图39a中4号样品的数字图像。
[0067]
图41a示出了用各种浓度的无有效载荷的adc处理前后，26号样品的每个细胞膜染色的分布。
[0068]
图41b示出了用adc e02-gl-sg3932处理前后，4号样品的每个细胞膜染色的分布。
[0069]
图42a示出了26号样品在adc处理前后结合的igg的每个细胞分布。
[0070]
图42b示出了4号样品在adc处理前后结合的igg的每个细胞分布。
[0071]
图42c是在adc e02-gl-sg3932的不同剂量水平下结合的igg的最大膜光密度图表。
[0072]
图42d示出了在adc e02-gl-sg3932的不同剂量水平下，26号样品的裂解的半胱天冬酶-3(cc-3)阳性肿瘤的百分比。
[0073]
图43a是显示26号和4号克隆样品在用不同剂量的adc处理后不同时间的igg膜光密度的图表。
[0074]
图43b示出了在用7mg/kg的adc e02-gl-sg3932处理后不同时间的26号样品的中位光密度。
[0075]
图44a示出了对于26号样品，用adc处理后不同时间的染色上皮细胞的密度，以及adc处理后基于裂解的半胱天冬酶-3(cc-3)阳性肿瘤细胞百分比，随时间增加的dna损伤。
[0076]
图44b示出了对于4号样品，adc处理后不同时间的染色上皮细胞的密度，以及adc处理后基于cc-3阳性肿瘤细胞的百分比，随时间增加的dna损伤。
[0077]
图45a示出了26号样品在adc处理后不同时间的二元空间接近度与膜光密度的关系。
[0078]
图45b示出了4号样品在adc处理后不同时间的二元空间接近度与膜光密度的关系。
[0079]
图46a示出了26号样品在adc处理后不同时间的连续空间接近度与膜光密度的关
系。
[0080]
图46b示出了4号样品在adc处理后不同时间的连续空间接近度与膜光密度的关系。
[0081]
图47a示出了26号样品在adc处理后不同时间的连续空间接近度与上皮细胞密度的关系。
[0082]
图47b示出了4号样品在adc处理后不同时间的连续空间接近度与上皮细胞密度的关系。
具体实施方式
[0083]
本发明提供了一种用于计算分数的新型方法，该分数指示癌症患者将对使用b7-h4抗体-药物缀合物的疗法的反应情况。本发明的另一个方面涉及一种用于计算癌症患者分数的方法，该分数指示用adc治疗的癌症患者的生存概率。本发明的另一个方面涉及一种用于预测癌症患者对adc的反应的方法。本发明的另一个方面涉及鉴别将会对adc表现出预定反应的癌症患者。本发明的又一个方面涉及一种治疗癌症患者的方法，该方法通过在治疗分数超过预定阈值时施用涉及adc的疗法来进行。
[0084]
i.定义.
[0085]
为了便于理解本发明，下文定义了一些术语和短语。术语“癌症”与术语“肿瘤”的含义相同。
[0086]
在本发明中，“b7-h4”与由vtcn1基因编码的含v-set结构域的t细胞活化抑制剂1同义。b7-h4是b7共刺激蛋白家族的跨膜多肽。b7-h4被理解为在抗原呈递细胞的表面上表达，用于与免疫细胞(诸如t淋巴细胞，cd28为潜在的配体)的配体相互作用。观察到b7-h4在各种癌症类型的细胞上高度表达，表明该分子是肿瘤相关抗原。b7-h4的表达不限于特定的癌症类型，而是代表了用于治疗广谱癌症类型的靶抗原。b7-h4蛋白的表达可以使用本领域技术人员熟知的方法检测，诸如免疫组化(ihc)。
[0087]
b7-h4的rna、dna、和氨基酸序列是本领域技术人员已知的，并且可以在许多数据库中(例如，在美国国家生物技术信息中心(ncbi)和uniprot的数据库中)发现。在uniprot找到的这些序列的实例是人b7-h4的q7z7d3(vtcn1_human)；和小鼠b7-h4的q7tsp5(vtcn1_mouse)。编码人b7-h4的核苷酸序列可以是seq id no:1(图1)，或更优选地是seq id no:2(图2)。人b7-h4的多肽序列优选地是seq id no:3(图3)。
[0088]
在本发明中，“抗b7h4抗体”意指与b7-h4特异性结合的抗体，该抗体优选地具有与b7-h4结合的活性，从而被内化到表达b7-h4的细胞中。换言之，“抗b7h4抗体”意指具有与b7-h4结合并且在之后移动到表达b7-h4的细胞中的活性的抗体。
[0089]
抗b7h4抗体包含具有seq id no:4的氨基酸序列的重链hcdr1(图4)，具有seq id no:5的氨基酸序列的重链hcdr2(图5)，具有seq id no:6的氨基酸序列的重链hcdr3(图6)，具有seq id no:7的氨基酸序列的轻链lcdr1(图7)，具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链lcdr2(图8)，和具有seq id no:9的氨基酸序列的轻链lcdr3(图9)。该抗b7h4抗体包含含有seq id no:10的氨基酸序列(图10)的可变重链和含有seq id no:11的氨基酸序列(图11)的可变轻链。该抗b7h4抗体包含含有seq id no:12的氨基酸序列(图12)的重链(例如，包含vh和恒定重链)以及含有seq id no:13的氨基酸序列(图13)的轻链(例如，包含vl和恒定轻
链)。
[0090]
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指哺乳动物受试者。在一个实施例中，该“受试者”是人、家畜、农场动物、竞赛动物和动物园动物，例如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛等。在一个实施例中，该受试者是食蟹猴(cynomolgus monkey/macaca fascicularis)。在一个优选的实施例中，该受试者是人。在本发明的方法中，该患者可能先前尚未被诊断为患有癌症。替代性地，该患者可能先前已被诊断为患有癌症。该患者也可以是表现出疾病风险因素的人，或没有癌症症状的人。该患者也可以是患有癌症或有患癌症的风险的人。因此，在一个实施例中，本发明的方法可用于确认患者中癌症的存在。例如，该患者可能先前已通过替代性方式被诊断出患有癌症。在一个实施例中，该患者先前已经施用癌症疗法。
[0091]
在本发明中，术语“qcs阳性”是指可能对抗b7h4 adc疗法显示出反应的癌症。术语“qcs阴性”是指不太可能对抗b7h4 adc疗法显示出反应的癌症。首字母qcs缩写代表定量连续分数。本发明的新型预测方法的结果通常称为定量连续分数并且可以是反应分数或预测生存时间的指示。
[0092]
ii.抗b7h4抗体-药物缀合物。
[0093]
本发明中使用的抗b7h4抗体-药物缀合物包含缀合至一种或多种细胞毒素的抗b7h4抗体或抗原结合片段，该一种或多种细胞毒素选自拓扑异构酶i抑制剂、微管溶素(tubulysin)衍生物、吡咯并苯并二氮杂或它们的组合。例如，该抗体或其抗原结合片段缀合至一种或多种细胞毒素，该一种或多种细胞毒素选自由以下组成的组：拓扑异构酶i抑制剂sg3932、sg4010、sg4057或sg4052(其结构如下提供)；微管溶素az1508；吡咯并苯并二氮杂sg3315；吡咯并苯并二氮杂sg3249；或它们的组合。
[0094]
优选的是，该抗体或其抗原结合片段缀合至拓扑异构酶i抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是阻断拓扑异构酶(拓扑异构酶i和ii)作用的化学化合物，拓扑异构酶是在正常细胞周期中通过催化dna链的磷酸二酯骨架的断裂和重新连接来控制dna结构变化的一种类型的酶。
[0095]
合适的拓扑异构酶i抑制剂的一般实例由以下化合物表示：
[0096]
[式1]
[0097][0098]
以上所示化合物表示为a*，并且可以在本文中称为“药物单元”。该化合物a*优选提供有用于连接(优选缀合)至本文所述的抗体或抗原结合片段(其可称为“配体单元”)的
接头。合适地，该接头以可裂解的方式附接(例如，缀合)至氨基残基，例如，本文所述的抗体或抗原结合片段的氨基酸。
[0099]
更特别地，合适的拓扑异构酶i抑制剂的实例由表示为“i”的以下化合物表示：
[0100]
[式2]
[0101][0102]
化合物i包括其盐和溶剂化物，其中r
l
是用于连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头，其中所述接头“ia”优选地选自：
[0103]
[式3]
[0104][0105]
其中q为：
[0106]
[式4]
[0107][0108]
其中q
x
使得q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基，并且式3中的x为：
[0109]
[式5]
[0110][0111]
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0(即b1和b2中只有一个可以不是0)并且至少c1或c2＝0(即c1和c2中只有一个可以不是0)。式3中的g
l
是用于连接至如本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头。替代性地，式3中的g
l
是表示为“ib”的化合物：
[0112]
[式6]
[0113][0114]
其中r
l1
和r
l2
独立地选自h和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团。在式6中，e是0或1。
[0115]
本领域技术人员将理解，所述药剂(例如，拓扑异构酶i抑制剂)中的多于一种可以缀合至该抗体或其抗原结合片段。例如，本发明的缀合物(例如，抗体-药物缀合物)可以是通式l-(d
l
)
p
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中l是本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)，p是1至20的整数，并且d
l
是具有由下式表示的接头(例如，药物接头单元)的拓扑异构酶i抑制剂：
[0116]
[式7]
[0117][0118]
在式7中，r
ll
是连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头，其中该接头优选地选自“ia”或“ib”：
[0119]
[式8]
[0120][0121]
其中q和x如上文所定义，并且g
ll
是连接至如本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头。ib'由下式表示：
[0122]
[式9]
[0123][0124]
其中r
l1
和r
l2
如上文所定义。抗体-药物缀合物的式l-(d
l
)
p
中的“p”表示载药量并且是每个抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的拓扑异构酶i抑制剂(例如，药物单元)的数量。载药量在1至20个药物单元(d)/配体单元的范围内。每个药物接头单元都缀合至抗b7h4抗体。对于组合物，“p”表示组合物中缀合物的平均载药量，并且“p”的范围为1至20。“p”的含义与所谓的缀合药物分子的平均数(药物与抗体比率dar)的含义相同，并指示每个抗体分子所缀合的药物接头的平均单元数。
[0125]
因此，本文所述的抗体-药物缀合物包括包含共价连接至至少一种拓扑异构酶i抑制剂(例如，药物单元，如以上说明的a*)的本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的缀合物。所述抑制剂优选通过接头(例如，接头单元)，诸如以上描述为r
l
和/或r
ll
的接头连接至该抗体或其抗原结合片段。换言之，本文所述的抗体-药物缀合物包括附接有(优选经由接头(例如，药物接头单元))一种或多种拓扑异构酶i抑制剂的本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)。以上更全面描述的抗体或其抗原结合片段(代表配体单元)是结合靶标部分的靶向剂。更特别地，该配体单元可以例如特异性结合靶细胞上的b7-h4蛋白，由此将药物单元递送至该靶细胞。因此，本发明还提供了用adc治疗例如各种癌症和其他障碍(例如，与表达b7-h4的细胞、优选癌细胞的存在相关的癌症/障碍)的方法。
[0126]
本发明所用的抗b7h4抗体-药物缀合物在经历了细胞内化进入癌细胞之后，在接头单元处裂解并将药物单元释放到癌细胞中。本发明所用的抗b7h4抗体-药物缀合物还具有旁观者效应，其中抗b7h4抗体-药物缀合物被内化到表达靶蛋白b7-h4的癌细胞中，然后药物单元还对不表达靶蛋白b7-h4的相邻癌细胞发挥抗肿瘤作用。
[0127]
iii.优选实施例的其他偏好。
[0128]
以下偏好可以应用于如上所述的本发明的所有方面，或者可以涉及单个方面。这些偏好能以任何组合被组合在一起。在下文列出的标题“其他化学定义”下提供了涉及本节中的某些术语的各种定义。
[0129]
上述拓扑异构酶i抑制剂的某些特征是特别优选的并且在下文更详细地定义。举例来说，概述式4的接头的特征q
x
的优选实施例。在一个实施例中，q是氨基酸残基。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。例如，q可以选自：phe、lys、val、ala、cit、leu、ile、arg、和trp，其中cit是瓜氨酸。在一个实施例中，q包含二肽残基。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施例中，二肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，二肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，二肽是组织蛋白酶的识别位点。
[0130]
在一个实施例中，q选自：
[0131]
nh-phe-lys-c＝o
、
[0132]
nh-val-ala-c＝o
、
[0133]
nh-val-lys-c＝o
、
[0134]
nh-ala-lys-c＝o
、
[0135]
nh-val-cit-c＝o
、
[0136]
nh-phe-cit-c＝o
、
[0137]
nh-leu-cit-c＝o
、
[0138]
nh-ile-cit-c＝o
、
[0139]
nh-phe-arg-c＝o
、
[0140]
nh-trp-cit-c＝o
、和
[0141]
nh-gly-val-c＝o
；
[0142]
其中cit是瓜氨酸。优选地，q选自：
[0143]
nh-phe-lys-c＝o
、
[0144]
nh-val-ala-c＝o
、
[0145]
nh-val-lys-c＝o
、
[0146]
nh-ala-lys-c＝o
、和
[0147]
nh-val-cit-c＝o
。
[0148]
更优选地，q选自
nh-phe-lys-c＝o
、
nh-val-cit-c＝o
或
nh-val-ala-c＝o
。其他合适的二肽组合包括：
[0149]
nh-gly-gly-c＝o
、
[0150]
nh-gly-val-c＝o
、
[0151]
nh-pro-pro-c＝o
、和
[0152]
nh-val-glu-c＝o
。
[0153]
可以使用其他二肽组合，包括由dubowchik等人,bioconjugatechemistry[生物缀合化学],2002,13,855-869描述的那些，将其通过援引并入本文。
[0154]
在一些实施例中，q是三肽残基。三肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施例中，三肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，三肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，三肽是组织蛋白酶的识别位点。特别感兴趣的三肽接头是：
[0155]
nh-glu-val-ala-c＝o
、
[0156]
nh-glu-val-cit-c＝o
、
[0157]
nh-αglu-val-ala-c＝o
，以及
[0158]
nh-αglu-val-cit-c＝o
。
[0159]
在一些实施例中，q是四肽残基。四肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施例中，四肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，四肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，四肽是组织蛋白酶的识别位点。特别感兴趣的四肽接头是：
[0160]
nh-gly-gly-phe-gly
c＝o
和
[0161]
nh-gly-phe-gly-gly
c＝o
。
[0162]
在一些实施例中，四肽是：
[0163]
nh-gly-gly-phe-gly
c＝o
。
[0164]
在上述肽残基的表示中，
nh-表示残基的n末端，并且-c＝o
表示残基的c末端。c端与式1所示化合物a*的nh结合。glu表示谷氨酸的残基，即：
[0165]
[式10]
[0166]
[0167]
αglu表示当经由α链结合时的谷氨酸的残基，即：
[0168]
[式11]
[0169][0170]
在一个实施例中，在适当的情况下，氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基团可以是如上所讨论的基团。被保护的氨基酸序列可被酶切割。例如，包含boc侧链保护的lys残基的二肽序列可被组织蛋白酶切割。
[0171]
氨基酸侧链的保护基团是本领域熟知的，并且描述于novabiochem公司目录中以及如上所述。
[0172]
式3的接头的g
l
可以选自：
[0173]
[0174][0175]
其中ar表示c
5-6
亚芳基基团，例如亚苯基，并且x表示c
1-4
烷基。
[0176]
在一些实施例中，g
l
选自g
l1-1
和g
l1-2
。在这些实施例的一些中，g
l
是g
l1-1
。g
ll
可以选
自：
[0177]
[0178][0179]
其中ar表示c
5-6
亚芳基基团，例如亚苯基，且x表示c
1-4
烷基。在一些实施例中，g
ll
选自g
ll1-1
和g
ll1-2
。在这些实施例的一些中，g
ll
是g
ll1-1
。
[0180]
x优选为：
[0181]
[式12]
[0182][0183]
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0并且至少c1或c2＝0。
[0184]“a”可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，a是0至3。在这些实施例的一些中，a是0或1。在另外的实施例中，a是0。
[0185]“b1”可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，“b1”是0至12。在这些实施例的一些中，“b1”是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。
[0186]“b2”可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，“b2”是0至12。在这些实施例的一些中，“b2”是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。优选地，b1和b2中只有一个可以不是0。
[0187]“c1”可以是0或1。“c2”可以是0或1。优选地，“c1”或“c2”中只有一个可以不是0。
[0188]“d”可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，“d”是0至3。在这些实施例的一些中，“d”是1或2。在另外的实施例中，“d”是2。在另外的实施例中，“d”是5。
[0189]
在x的一些实施例中，a是0，b1是0，c1是1，c2是0并且d是2，并且b2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。在x的一些实施例中，a是1，b2是0，c1是0，c2是0并且d是0，并且b1可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b1是0、2、3、4、5或8。在x的一些实施例中，a是0，b1是0，c1是0，c2是0并且d是1，并且b2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。在x的一些实施例中，b1是0，b2是0，c1是0，c2是0并且a和d之一是0。a和d中另一个是从1至5。在这些实施例的一些中，a和d中另一个是1。在另一些这些实施例中，a和d中另一个是5。在x的一些实施例中，a是1，b2是0，c1是0，c2是1，d是2，并且b1可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。
[0190]
在一些实施例中，r
l
是式6的ib。在一些实施例中，r
ll
是式9的基团ib'。r
l1
和r
l2
可以独立地选自h和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团。
[0191]
在一些实施例中，r
l1
和r
l2
两者均为h。在一些实施例中，r
l1
是h并且r
l2
是甲基。在一些实施例中，r
l1
和r
l2
两者均为甲基。
[0192]
在一些实施例中，r
l1
和r
l2
与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯基团。在一些实施例中，r
l1
和r
l2
与它们所结合的碳原子一起形成环丁烯基团。
[0193]
在式6的基团ib中，在一些实施例中，e是0。在其他实施例中，e是1并且硝基基团可以在环的任何可用位置上。在这些实施例的一些中，它位于邻位。在这些实施例的另一些中，它位于对位。
[0194]
在其中以单一对映异构体或以对映异构体富集的形式提供本文所述的化合物的一些实施例中，对映异构体富集形式具有大于60:40、70:30、80:20或90:10的对映异构体比率。在另外的实施例中，对映异构体比率大于95:5、97:3或99:1。
[0195]
在一些实施例中，式2的r
l
选自：
[0196]
[0197][0198]
在一些实施例中，r
ll
是衍生自上述r
l
基团的基团。
[0199]
已经概述了上述偏好，现在描述某些优选的拓扑异构酶i接头式(例如，药物接头单元的)。在一些实施例中，式2的化合物i是化合物i
p
：
[0200]
[式13]
[0201][0202]
及其盐和溶剂化物。r
lp
是用于连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段的接头，其中所述接头选自基团ia或基团ib。基团ia由下式表示：
[0203]
[式14]
[0204][0205]
其中q
p
为：
[0206][0207]
其中q
xp
使得q
p
为氨基酸残基、二肽残基或三肽残基。式14中的x
p
为：
[0208]
[式15]
[0209][0210]
其中ap＝0至5，bp＝0至16，cp＝0或1，并且dp＝0至5。式14中的g
l
是用于连接至抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头。ap可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，ap是0至3。在这些实施例的一些中，ap是0或1。在另外的实施例中，ap是0。bp可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，b是0至12。在这些实施例的一些中，bp是0至8，并且可以是0、2、4或8。cp可以是0或1。dp可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，dp是0至3。在这些实施例的一些中，dp是1或2。在另外的实施例中，dp是2。
[0211]
基团ib由下式表示：
[0212]
[式16]
[0213][0214]rl1
和r
l2
独立地选自h和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯基团或环丁烯基团。式16中的“e”是0或1。
[0215]
在式14的x
p
的一些实施例中，ap是0，cp是1并且dp是2，并且bp可以是从0至8。在这些实施例的一些中，bp是0、4或8。
[0216]
对于化合物i的式4的q
x
的偏好可以适用于式14的q
xp
。上述对于式2的化合物i的g
l
、r
l1
、r
l2
和e的偏好可以适用于式13的化合物i
p
。
[0217]
在一些实施例中，抗体-药物缀合物l-(d
l
)
p
的缀合物是化合物l
–
(d
lp
)
p
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中l是抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)，d
lp
是拓扑异构酶i抑制剂(例如，药物接头单元)，其是化合物iii
p
：
[0218]
[式17]
[0219][0220]rllp
是连接至该抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头，其中所述接头选自基团ia’或基团ib’。基团ia’由下式表示：
[0221]
[式18]
[0222][0223]
其中q
p
和x
p
如上文所定义，并且g
ll
是连接至抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头。基团ib’由下式表示：
[0224]
[式19]
[0225][0226]
其中r
l1
和r
l2
如上文所定义；并且p是1至20的整数。
[0227]
在一些实施例中，式2的化合物i是化合物i
p2
：
[0228]
[式20]
[0229][0230]
及其盐和溶剂化物。r
lp2
是用于连接至抗体或其抗原结合片段的接头，其中所述接头选自基团ia或基团ib。基团ia由下式表示：
[0231]
[式21]
[0232][0233]
q是：
[0234][0235]
其中q
x
使得q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基。x
p2
是：
[0236][0237]
其中ap2＝0至5，b1p2＝0至16，b2p2＝0至16，cp2＝0或1，dp2＝0至5，其中至少b1p2或b2p2＝0(即，b1和b2中只有一个可以不是0)。式21的g
l
是用于连接至抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头。
[0238]
ap2可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，ap2是0至3。在这些实施例的一些中，ap2是0或1。在另外的实施例中，ap2是0。b1p2可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，b1p2是0至12。在这些实施例的一些中，b1p2是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。b2p2可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，b2p2是0至12。在这些实施例的一些中，b2p2是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。优选地，b1p2和b2p2中只有一个可以不是0。cp2可以是0或1。dp2可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，dp2是0至3。在这些实施例的一些中，dp2是1或2。在另外的实施例中，dp2是2。在另外的实施例中，dp2是5。
[0239]
基团ib由下式表示：
[0240]
[式22]
[0241][0242]
其中r
l1
和r
l2
独立地选自h和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团；并且e是0或1。
[0243]
在式21的x
p2
的一些实施例中，ap2是0，b1p2是0，cp2是1并且dp2是2，并且b2p2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2p2是0、2、3、4、5或8。在x
p2
的一些实施例中，ap2是1，b2p2是0，cp2是0并且dp2是0，并且b1p2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b1p2是0、2、3、4、5或8。在x
p2
的一些实施例中，ap2是0，b1p2是0，cp2是0并且dp2是1，并且b2p2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2p2是0、2、3、4、5或8。在x
p2
的一些实施例中，b1p2是0，b2p2是0，cp2是0并且ap2和dp2之一是0。ap2和d中另一个是从1至5。在这些实施例的一些中，ap2和
d中另一个是1。在这些实施例的另一些中，ap2和dp2中另一个是5。
[0244]
上述对于式2的化合物i的q
x
的偏好可以适用于式21的基团ia
p2
中的q
x
。上述对于式2的化合物i的g
l
、r
l1
、r
l2
和e的偏好可以适用于式21的基团ia
p2
。
[0245]
在一些实施例中，缀合物l
–
(d
l
)
p
的缀合物是化合物l
–
(d
lp2
)
p
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中l是抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)，并且d
lp2
是拓扑异构酶i抑制剂(例如，药物接头单元)，其是化合物iii
p2
：
[0246]
[式23]
[0247][0248]rllp2
是连接至该抗体或其抗原结合片段(例如配体单元)的接头，其中所述接头选自基团ia’或基团ib’。基团ia’由下式表示：
[0249]
[式24]
[0250][0251]
其中q和x
p2
如上文所定义，并且g
ll
是连接至该抗体或其抗原结合片段的接头。
[0252]
基团ib’由下式表示：
[0253]
[式25]
[0254][0255]
其中r
l1
和r
l2
如上文所定义；并且p是1至20的整数。
[0256]
特别合适的拓扑异构酶i抑制剂包括具有以下式的那些：
[0257]
[式26]
[0258][0259]
[式27]
[0260][0261]
[式28]
[0262][0263]
[式29]
[0264]
和/或
[0265]
[式30]
[0266][0267]
抑制剂sg3932是特别优选的。因此，在优选的实施例中，抗体或其抗原结合片段缀合至具有sg3932下式的拓扑异构酶i抑制剂：
[0268]
[式26]
[0269][0270]
为了避免疑问，式26中的数字“8”指定，方括号内的结构重复八次。因此，sg3932的另一种表示是：
[0271]
[式31]
[0272][0273]
sg4010的另一种表示是：
[0274]
[式32]
[0275][0276]
sg4057的另一种表示是：
[0277]
[式33]
[0278][0279]
sg4052的另一种表示是：
[0280]
[式34]
[0281][0282]
本文所述的任何抗体或其抗原结合片段可以缀合至所述拓扑异构酶i抑制剂中的一种或多种。
[0283]
iv.其他化学定义。
[0284]
以下定义特别涉及对以上拓扑异构酶i抑制剂的描述，并且甚至可能更特别地涉及标题为“优选实施例的其他偏好”的部分。
[0285]c5-6
亚芳基：如本文所使用的，术语“c
5-6
亚芳基”涉及通过从芳香族化合物的芳香族环原子上除去两个氢原子而获得的二价部分。
[0286]
在本文中，前缀(例如，c
5-6
)表示环原子的数量或环原子数量的范围，无论是碳原子还是杂原子。环原子可以都是碳原子，如“碳亚芳基基团”中那样，在这种情况下，该基团是亚苯基(c6)。替代性地，环原子可以包括一个或多个杂原子，如“杂亚芳基基团”中那样。杂亚芳基基团的实例包括但不限于衍生自如下的那些：
[0287]
n1：吡咯(氮杂茂(azole))(c5)、吡啶(吖嗪(azine))(c6)；
[0288]
o1：呋喃(氧杂环戊二烯(oxole))(c5)；
[0289]
s1：噻吩(硫杂环戊二烯(thiole))(c5)；
[0290]
n1o1：噁唑(c5)、异噁唑(c5)、异噁嗪(isoxazine)(c6)；
[0291]
n2o1：噁二唑(呋咱)(c5)；
[0292]
n3o1：噁三唑(c5)；
[0293]
n1s1：噻唑(c5)、异噻唑(c5)；
[0294]
n2：咪唑(1,3-二唑)(c5)、吡唑(1,2-二唑)(c5)、哒嗪(1,2-二嗪)(c6)、嘧啶(1,3-二嗪)(c6)(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(c6)；以及
[0295]
n3：三唑(c5)、三嗪(c6)。
[0296]c1-4
烷基：如本文所使用的，术语“c
1-4
烷基”涉及通过从具有从1至4个碳原子的烃基化合物的碳原子上除去氢原子而获得的单价部分，该烃基化合物可以是脂肪族或脂环族，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和、完全不饱和)。如本文所使用的，术语“c
1-n
烷基”涉及通过从具有从1至n个碳原子的烃基化合物的碳原子上除去氢原子而获得的单价部分，该烃基化合物可以是脂肪族或脂环族，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和、完全不饱和)。因此，术语“烷基”包括以下讨论的亚类：烯基、炔基、环烷基等。
[0297]
饱和烷基基团的实例包括但不限于甲基(c1)、乙基(c2)、丙基(c3)和丁基(c4)。饱和直链烷基基团的实例包括但不限于甲基(c1)、乙基(c2)、正丙基(c3)和正丁基(c4)。饱和支链烷基基团的实例包括异丙基(c3)、异丁基(c4)、仲丁基(c4)和叔丁基(c4)。
[0298]c2-4
烯基：如本文所使用的，术语“c
2-4
烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基基团。不饱和烯基基团的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl、vinyl)(-ch＝ch2)、1-丙烯基(-ch＝ch-ch3)、2-丙烯基(烯丙基，-ch-ch＝ch2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-c(ch3)＝ch2)和丁烯基(c4)。
[0299]c2-4
炔基：如本文所使用的，术语“c
2-4
炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基基团。不饱和炔基基团的实例包括但不限于乙炔基(-c≡ch)和2-丙炔基(炔丙基，-ch
2-c≡ch)。
[0300]c3-4
环烷基：如本文所使用的，术语“c
3-4
环烷基”涉及还是环基基团的烷基基团；即，通过从环状烃基(碳环)化合物的脂环族环原子上除去氢原子而获得的一价部分，该部分具有从3至7个碳原子，包括从3至7个环原子。环烷基基团的实例包括但不限于衍生自如下的那些：饱和单环烃类化合物，诸如环丙烷(c3)和环丁烷(c4)；以及不饱和单环烃类化合物，诸如环丙烯(c3)和环丁烯(c4)。
[0301]
连接标签：在下式35中，上标
c(＝o)
和
nh
指示原子所结合的基团。
[0302]
[式35]
[0303][0304]
例如，nh基团显示与羰基(其不是所示部分的一部分)结合，并且羰基显示与nh基团(其不是所示部分的一部分)结合。
[0305]
v.拓扑异构酶i抑制剂的合成。
[0306]
具有式2的化合物i(其中r
l
是具有式3的基团ia)可以从具有式36的化合物：
[0307]
[式36]
[0308][0309]
(其中r
l*
是
–
qh)通过连接具有式37的化合物：
[0310]
[式37]
[0311][0312]
或其活化形式来合成。这样的反应可以在酰胺偶联条件下进行。具有式36的化合物可以通过具有式38的化合物：
[0313]
[式38]
[0314][0315]
(其中r
l*prot
是-q-protn，并且其中protn是胺保护基团)的脱保护合成。具有式38的化合物可以通过具有式39的化合物：
[0316]
[式39]
[0317][0318]
与化合物a3的偶联，使用弗里德兰德反应(friedlander reaction)合成。化合物a3是(s)-4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮。具有式39的化合物可以从具有式40的化合物：
[0319]
[式40]
[0320][0321]
通过除去三氟乙酰胺保护基团来合成。具有式40的化合物可以通过以下偶联合成：r
l*prot-oh至化合物i7。化合物i7是n-(4-氨基-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)-2,2,2-三氟乙酰胺。具有式2的化合物i(其中r
l
是具有式3的ia基团或具有式6的ib基团)可由化合物i11通过化合物r
l-oh或其活化形式的偶联合成。化合物i11是(s)-4-氨基-9-乙基-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10h,13h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮。
[0322]
胺保护基团是本领域技术人员熟知的。特别参考以下文献中的合适的保护基团的披露：greene’s protecting groups in organic synthesis[有机合成中的格林氏保护基团],第四版,约翰威利父子公司(johnwiley&sons),2007(isbn 978-0-471-69754-1),第696-871页。
[0323]
vi.抗b7h4抗体。
[0324]
术语“抗体”涵盖单克隆抗体及其片段(例如，表现出所需的生物活性的片段)。在一个优选的实施例中，本文所述的抗体是单克隆抗体。在一个更优选的实施例中，该抗体是完全人单克隆抗体。在一个实施例中，本发明的方法可以使用多克隆抗体。
[0325]
特别地，抗体是包含至少一个或两个重(h)链可变区(本文缩写为vhc)以及至少一个或两个轻(l)链可变区(本文缩写为vlc)的蛋白质。vhc和vlc区可以进一步细分为被称为“互补决定区”(“cdr”)的高变区，其间插有被称为“框架区”(fr)的更保守的区域。框架区和cdr的范围已经被精确确定(参见，kabat,e.a.等人sequences ofproteins ofimmunological interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列],第五版,u.s.department of health and human services[美国卫生与公众服务部],nih公开号91-3242,1991，以及chothia,c等人,j.moi.biol.[分子生物学杂志]196:901-917,1987)。
[0326]
优选地，每个vhc和vlc由三个cdr和四个fr构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：frl、cdrl、fr2、dr2、fr3、cdr3、fr4。抗体的vhc或vlc链可以进一步包含所有的或部分的重链或轻链恒定区。在一个实施例中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻免疫球蛋白链由例如二硫键相互连接。重链恒定区包含三个结构域，即ch1、ch2和ch3。轻链恒定区由一个结构域cl构成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
[0327]
术语“抗体”包括类型iga、igg、ige、igd、igm(及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ类型。如本文所使用的，术语抗体还指与上述标记物之一结合的抗体的一部分，例如，其中一个或多个免疫球蛋白链不是全长但与标记物结合的分子。涵盖在术语抗体中的“结合部分”的实例包括(i)fab片段：由vlc、vhc、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段：包含两个在绞链区由二硫桥连接的fab片段的二价片段；
(iii)由vhc和ch1结构域组成的fc片段；(iv)由抗体单臂的vlc和vhc结构域组成的fv片段；(v)由vhc结构域组成的dab片段(ward等人,nature[自然]341:544-546,1989)；以及(vi)具有足以发生结合的框架的分离的互补决定区(cdr)，例如，可变区的抗原结合部分。轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分(例如fv片段的两个结构域vlc和vhc)可以使用重组方法通过合成接头连接，该合成接头允许它们成为单个蛋白链，其中vlc和vhc区配对形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等人(1988)science[科学]lal-ati-alβ；以及huston等人(1988)proc.proc.natl.acad.scl usa[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。此类单链抗体也涵盖在术语抗体内。这些部分可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式针对实用性来筛选这些部分。
[0328]
在一个实施例中，该抗体或抗原结合片段是选自以下中的一种或多种：鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体、或其组合。
[0329]
在一个实施例中，该抗原结合片段是选自以下中的一种或多种：fv片段、fab片段、f(ab')2片段、fab'片段、dsfv片段、scfv片段、sc(fv)2片段、或其组合。
[0330]
在一个优选的实施例中，该抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体(mab)。在一个实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段(例如mab)是scfv。
[0331]
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段可以跨物种结合b7-h4分子，例如，该抗体或片段可以结合小鼠b7-h4、大鼠b7-h4、兔、人b7-h4和/或食蟹猴b7-h4。在一个实施例中，该抗体或片段可以结合人b7-h4和食蟹猴b7-h4。在一个实施例中，该抗体或抗原结合片段还可以结合小鼠b7-h4。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段可以特异性结合b7-h4，例如人b7-h4和食蟹猴b7-h4，但不特异性结合人b7-h1、b7-h2和/或b7-h3。
[0332]
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段除了vh和vl之外还可以包含重链恒定区或其片段。在一个实施例中，该重链恒定区是人重链恒定区，例如人igg恒定区，例如人igg1恒定区。在一个实施例(特别是在该抗体或其抗原结合片段缀合至药剂(如细胞毒性剂)的情况下)中，将半胱氨酸残基插入到igg1的ch2区中的氨基酸s239和v240之间。该半胱氨酸被称为“239插入”或“239i”。
[0333]
vii.抗b7h4抗体的制备。
[0334]
本文所述的抗体可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且它们的效用通过常规结合研究来证实。举例来说，简单的结合测定是用抗体孵育表达抗原的细胞。如果将抗体用荧光团标记，则可以通过facs分析来检测抗体与抗原的结合。
[0335]
本文所述的抗体可以在多种动物中产生，包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猴或马。可以在用单独荚膜多糖或用多种荚膜多糖进行免疫后产生抗体。从这些动物中分离出的血液含有多克隆抗体—与相同抗原结合的多种抗体。也可以将抗原注射至鸡中以在蛋黄中产生多克隆抗体。为了获得对抗原的单一表位具有特异性的单克隆抗体，从动物中分离出分泌抗体的淋巴细胞，并且通过将它们与癌细胞系融合而使其永生化。融合的细胞被称为杂交瘤，并且在培养中会不断生长并分泌抗体。通过稀释克隆法分离单一杂交瘤细胞以生成均产生相同抗体的细胞克隆；这些抗体被称为单克隆抗体。用于产生单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的常规技术(参见例如，making andusing antibodies:a practical handbook.[制备和使用抗体：实用手册]gc howard.crc books[crc书籍].2006.isbn 0849335280)。通常使用蛋白a/g或抗原亲和色谱法纯化多克隆和单克隆抗体。
[0336]
本文所述的抗体或其抗原结合片段可以制备为单克隆抗b7h4抗体，该抗体可以使用杂交瘤方法制备，诸如kohler和milstein,nature[自然]256:495(1975)描述的那些方法。使用杂交瘤方法，如上所述对小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞产生会特异性结合免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外被免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并且利用例如聚乙二醇与适合骨髓瘤细胞系融合，以形成然后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择出的杂交瘤细胞。然后可以在体外培养物中使用标准方法(goding,monoclonalantibodies:principles and practice[单克隆抗体：原理和实践],academic press[学术出版社],1986)或在体内作为动物的腹水肿瘤繁殖杂交瘤，这些杂交瘤产生特异性针对选定的抗原的单克隆抗体，如通过免疫沉淀、免疫印迹、或体外结合测定(例如，放射免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa))所确定的。然后可以使用已知的方法从培养基或腹水中纯化单克隆抗体。
[0337]
替代性地，该抗体或其抗原结合片段(例如，单克隆抗体)还可以使用如在美国专利号4,816,567中所述的重组dna方法制备。从成熟b细胞或杂交瘤细胞，诸如通过使用寡核苷酸引物(其特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因)的rt-pcr分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并且使用常规程序测定它们的序列。
[0338]
然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到适合的表达载体中，这些表达载体在转染到不产生免疫球蛋白的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、或骨髓瘤细胞)中时，由这些宿主细胞生产单克隆抗体。此外，所希望物种的重组单克隆抗体或其抗原结合片段可以从表达所希望物种的cdr的噬菌体展示文库中分离，如以下文献所述：mccafferty等人,nature[自然]348:552-554(1990)；clackson等人,nature[自然],352:624-628(1991)；以及marks等人,j.mol.biol.[分子生物学杂志]222:581-597(1991)。
[0339]
编码本发明的抗体或其抗原结合片段的一种或多种多核苷酸可进一步使用重组dna技术以多种不同的方式被修饰以产生替代性抗体。在一些实施例中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被(1)例如人抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体，或被(2)非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些实施例中，将恒定区截短或去除以产生所希望的单克隆抗体的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
[0340]
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段。可以使用本领域已知的不同技术来直接制备人抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人b淋巴细胞。参见例如，cole等人,monoclonal antibodies andcancer therapy[单克隆抗体和癌症疗法],alan r.liss[奥兰李斯公司],第77页(1985)；boemer等人,j.immunol.[免疫学杂志]147(1):86-95(1991)；美国专利5,750,373。
[0341]
在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体，如例如在以下文献中所述的：vaughan等人,nat.biotech.[自然生物技术]14:309-314(1996)；sheets等人,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊],95:6157-6162(1998)；hoogenboom和winter,j.mol.biol.[分子生物学杂志]227:381(1991)；以及marks等人,j.mol.biol.[分子生物学杂志]222:581(1991)。用于产生和使用抗体噬菌
体文库的技术还描述在美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963；以及rothe等人，j.molec.biol.[分子生物学杂志]376:1182-1200(2008)中，将这些文献中的每一篇通过援引以其全文并入。
[0342]
亲和力成熟策略和链改组策略是本领域已知的，并且可用于产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段。参见marks等人,biotechnology[生物技术]10:779-783(1992)，将其通过援引以其全文并入。
[0343]
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段(例如，单克隆抗体)可以是人源化抗体。用于工程化、人源化或表面重修非人抗体或人抗体的方法也可以使用并且是本领域熟知的。人源化、表面重修或类似工程化的抗体可以具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基，该来源例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他哺乳动物。这些非人氨基酸残基被通常称为“输入”残基的残基替换，这些残基典型地取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。此类输入序列可以用于降低免疫原性或减小、增强或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他合适的特征。合适地，cdr残基可直接且最实质性地参与影响b7-h4结合。因此，优选地保持非人或人cdr序列的一部分或全部，同时可变区和恒定区的非人序列可以被人氨基酸或其他氨基酸替换。
[0344]
抗体还可以任选地被人源化、表面重修、工程化或人抗体工程化，其中保留针对抗原b7-h4的高亲和力以及其他有利生物性质。为实现这个目标，人源化(或人)或工程化抗b7h4抗体以及表面重修的抗体可任选地通过使用亲本、工程化和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化和工程化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。说明并展示所选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原如b7-h4的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入的序列中选择并且组合fw残基，这样使得所希望的抗体特征(诸如增加对一种或多种靶抗原的亲和力)得以实现。
[0345]
本发明抗b7h4抗体或其抗原结合片段的人源化、表面重修或工程化可以使用任何已知方法进行，该已知方法诸如但不限于以下文献中所述的那些：jones等人,nature[自然]321:522(1986)；riechmann等人,nature[自然]332:323(1988)；verhoeyen等人,science[科学]239:1534(1988)；sims等人,j.immunol.[免疫学杂志]151:2296(1993)；chothia和lesk,j.mol.biol.[分子生物学杂志]196:901(1987)；carter等人,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89:4285(1992)；presta等人,j.immunol.[免疫学杂志]151:2623(1993)；美国专利号5,639,641、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567、7,557,189、7,538,195和7,342,110；国际申请号pct/us98/16280、pct/us96/18978、pct/us91/09630、pct/us91/05939、pct/us94/01234、pct/gb89/01334、pct/gb91/01134、pct/gb92/01755；国际专利申请公开号wo 90/14443、wo 90/14424、wo 90/14430；以及欧洲专利公开号ep 229246；将这些文献中的每一篇通过援引整个并入本文，包括其中引用的参考文献。
[0346]
抗b7h4人源化抗体及其抗原结合片段也可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，这些基因座在免疫时能够在内源性免疫球蛋白产生不存在时产生全套人抗体。这种方法描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中。
[0347]
在一个实施例中，提供了抗体(例如，抗b7h4抗体)的片段(例如抗体片段)。已知各种用于产生抗体片段的技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解衍生，例如由morimoto等人,j.biochem.biophys.meth.[生物化学和生物物理方法杂志]24:107-117(1993)以及brennan等人,science[科学]229:81(1985)所描述的。在一个实施例中，重组产生抗b7h4抗体片段。所有fab、fv和scfv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并且从其分泌，因而允许产生大量的这些片段。此类抗b7-h4抗体片段也可以从以上论述的抗体噬菌体文库分离。这些抗b7-h4抗体片段还可以是如美国专利号5,641,870中所述的线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业人员将是清楚的。
[0348]
根据本发明，技术可经改编以产生对b7-h4具有特异性的单链抗体。参见例如，美国专利号4,946,778)。此外，方法可经改编以构建fab表达文库，以允许快速且有效地鉴别针对b7-h4或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所希望特异性的单克隆fab片段。参见例如，huse等人,science[科学]246:1275-1281(1989)。通过本领域已知的技术可以生产抗体片段，包括但不限于：由抗体分子的胃蛋白酶消化产生的f(ab')2片段；通过还原f(ab')2片段的二硫键产生的fab片段；通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的fab片段；或fv片段。
[0349]
在一个实施例中，可以对本文所述的抗体或其抗原结合片段进行修饰以增加其血清半衰期。这可以例如通过将补救受体结合表位掺入抗体或抗体片段中，通过使抗体或抗体片段中的适当的区域突变，或通过将表位并入随后融合在抗体或抗体片段的末端或中部的肽标签(例如，通过dna或肽合成)，或通过yte突变来实现。本领域中已知其他增加抗体或其抗原结合片段的血清半衰期的方法，例如，缀合至异源分子如peg。
[0350]
如本文所提供的经修饰的抗体或其抗原结合片段可以包含任何类型的提供该抗体或多肽与b7-h4的缔合的可变区。在这点上，可变区可构成或衍生自可诱导增加体液应答并生成针对所希望抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。正因如此，抗b7h4抗体或其抗原结合片段的可变区可以是例如人、鼠、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、猕猴等)或狼来源的。在一个实施例中，经修饰的抗体或其抗原结合片段的可变区和恒定区二者均是人的。在一个实施例中，相容性抗体的可变区(通常衍生自非人来源)可经工程化或专门定制来改进结合性质或减少分子的免疫原性。在这点上，在本发明中有用的可变区可经人源化或另外通过纳入输入的氨基酸序列改变。
[0351]
在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段的重链和轻链二者中的可变结构域通过至少部分替换一个或多个cdr和/或通过部分框架区替换和序列改变而被改变。虽然cdr可以衍生自与框架区所衍生自的抗体相同的类别或甚至亚类的抗体，但是设想cdr将衍生自不同类别的抗体并且在某些实施例中衍生自不同物种的抗体。不必用来自供体可变区的完整cdr来替换所有cdr以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个。而是，只需要转移维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到在美国专利号5,585,089、5,693,761、和5,693,762中所阐明的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验获得具
有减少的免疫原性的功能抗体。
[0352]
尽管对可变区进行改变，本领域技术人员将理解，本文所述的经修饰的抗体或其抗原结合片段将包含抗体(例如，全长抗体或其抗原结合片段)，其中至少一个或多个恒定区结构域的一部分已被缺失或以其他方式改变，以便提供所希望的生物化学特征，如当与包含天然或未改变的恒定区的具有大约相同免疫原性的抗体相比时增加的肿瘤定位或减少的血清半衰期。在一个实施例中，经修饰的抗体的恒定区将包含人恒定区。对与本发明相容的恒定区的修饰包括在一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文所披露的修饰的抗体可以包含对三个重链恒定结构域(ch1、ch2或ch3)中的一个或多个和/或对轻链恒定结构域(cl)的改变或修饰。在一个实施例中，考虑了经修饰的恒定区，其中一个或多个结构域部分或全部缺失。在一个实施例中，经修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个ch2结构域被去除(δch2构建体)。在一个实施例中，省略的恒定区结构域可被短氨基酸间隔区(例如，10个残基)替换，该间隔区提供通常由不存在的恒定区所赋予的一定分子柔性。
[0353]
除它们的构型以外，本领域中已知恒定区介导几种效应子功能。例如，抗体通过fc区与细胞结合，抗体fc区上的fc受体位点与细胞上的fc受体(fcr)结合。有许多fc受体对不同类别的抗体具有特异性，包括igg(γ受体)、ige(η受体)、iga(α受体)和igm(μ受体)。抗体与细胞表面上的fc受体的结合触发许多重要并且多样的生物应答，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破环、免疫复合物的清除、杀灭细胞溶解抗体包覆的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或adcc)、炎症介体的释放、胎盘转移、以及对免疫球蛋白产生的控制。
[0354]
在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段提供改变的效应子功能，进而影响施用的抗体或其抗原结合片段的生物学特性。例如，恒定区结构域的缺失或失活(经由点突变或其他手段)可以减少循环的经修饰的抗体的fc受体结合。在其他情况下，与本发明一致的，恒定区修饰可以缓和补体结合并且因而减少缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。恒定区的其他修饰可以用于消除二硫键或寡糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体灵活性增加而增强定位。类似地，根据本发明对恒定区的修饰可以容易地使用技术人员认知范围内的熟知的生物化学或分子工程技术进行。
[0355]
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段不具有一种或更多种效应子功能。例如，在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段不具有抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性和/或不具有补体依赖性细胞毒性(cdc)活性。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段不结合fc受体和/或补体因子。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段不具有效应子功能。
[0356]
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段可以被工程化以将ch3结构域直接融合到相应的经修饰的抗体或其片段的铰链区。在其他构建体中，可以将肽间隔区插在铰链区与经修饰的ch2和/或ch3结构域之间。例如，可表达相容性构建体，其中ch2结构域已经缺失，且剩余的ch3结构域(经修饰的或未修饰的)与具有5-20个氨基酸的间隔区的铰链区结合。可添加此间隔区，例如以确保恒定结构域的调节元件保持游离且可接触，或者铰链区保持柔性。在一些情况中，氨基酸间隔区可被证明具有免疫原性，并引发针对构建体的非所需免疫应答。在一个实施例中，添加至构建体的任何间隔区都可以是相对无免疫原性的，或甚至被完全省略，以便维持经修饰的抗体的所希望的生物化学性质。
[0357]
除了缺失整个恒定区结构域之外，本文提供的抗体或其抗原结合片段可通过恒定
区中的几个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来修饰。例如，ch2结构域中的选定区域中的单个氨基酸的突变可足以实质性地减少fc结合，并且从而增加肿瘤定位。类似地，控制效应子功能(例如，补体c1q结合)的一个或多个恒定区结构域可以完全或部分缺失。恒定区的这类部分缺失可以改进该抗体或其抗原结合片段的选定特征(例如，血清半衰期)，同时使与受试者恒定区结构域相关的其他所希望的功能保持完整。此外，该抗体及其抗原结合片段的恒定区可通过增强所得构建体特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰。在这个方面，可以干扰保守结合位点所提供的活性(例如，fc结合)，同时基本上维持经修饰的抗体或其抗原结合片段的构型和免疫原性特性。在一个实施例中，可以向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强期望特征，如减少或增加效应子功能，或提供更多细胞毒素或碳水化合物附接。在一个实施例中，可以希望插入或复制衍生自选定的恒定区结构域的特定序列。
[0358]
本文所述的抗体和抗体结合片段进一步包括与本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，鼠、嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段)基本同源的变体和等效物。这些可以含有例如保守取代突变，即通过相似的氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指用相同通用类别内的另一个氨基酸取代一个氨基酸，例如像，用另一个酸性氨基酸取代一个酸性氨基酸、用另一个碱性氨基酸取代一个碱性氨基酸或用另一个中性氨基酸取代一个中性氨基酸。保守氨基酸取代所指的内容在本领域是熟知的。
[0359]
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段可以被进一步修饰为含有通常不是蛋白质的一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可以改进蛋白质的溶解性、生物半衰期、或吸收。这些部分还可以减少或消除蛋白质的任何所希望的副作用等。对那些部分的综述可以在remington's pharmaceutical sciences[雷明顿药物科学],第22版,lloyd v.allen,jr.编辑,(2012)中发现。
[0360]
viii.抗b7h4抗体-药物缀合物的用途。
[0361]
优选地，缀合物可用于治疗增殖性疾病。术语“增殖性疾病”涉及过量或异常细胞的不想要的或不受控制的细胞增殖，无论是体外还是体内，其都是不希望的，例如赘生性或增生性生长。术语“增殖性疾病”可以替代性地称为“癌症”。
[0362]
合适的增殖性疾病(例如癌症)将优选地通过表达b7-h4的癌细胞的存在来表征。
[0363]
增殖性病症的实例包括但不限于良性、癌前和恶性细胞增殖，包括但不限于赘生物和肿瘤(例如组织细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波济氏肉瘤、黑色素瘤)、白血病、银屑病、骨骼疾病、纤维增殖性障碍(例如结缔组织的障碍)和动脉粥样硬化。其他所关注的癌症包括但不限于血液恶性肿瘤，如白血病和淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤及亚型(如dlbcl、边缘区淋巴瘤、套区淋巴瘤和滤泡淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、aml以及其他b或t细胞来源的癌症。可以治疗任何类型的细胞，这些细胞包括但不限于肺、胃肠道(例如包括肠、结肠)、乳腺(breast或mammary)、卵巢、前列腺、肝(liver或hepatic)、肾(kidney或renal)、膀胱、胰腺、脑和皮肤。
[0364]
在一些实施例中，本文所述的抗体-药物缀合物用于治疗选自包括以下的列表的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌和胃癌。在一些实施例中，本文所述的抗体-药物缀合物用于治疗选自包括以下的列表的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌。在一些实施例中，乳腺癌是激素受体阳性(hr+)乳腺癌。在一些实施例中，乳腺癌
是人表皮生长因子受体2阳性(her2+)乳腺癌。在其他实施例中，乳腺癌是三阴性乳腺癌(tnbc)。在一些实施例中，肺癌是非小细胞肺癌(nsclc)。在一些实施例中，nsclc是鳞状细胞癌。在其他实施例中，nsclc是腺癌。
[0365]
本发明的抗体-药物缀合物可以延迟癌细胞生长，抑制其增殖，并进一步破坏癌细胞。这些作用可以实现癌症引起的症状的缓解，癌症患者的生活质量(qol)的改善，并保持癌症患者的生命，从而达到治疗作用。即使未能导致癌细胞的破坏，抑制或控制癌细胞增殖也可以在癌症患者中获得更长期的生存以及实现更高的qol。
[0366]
可以预期本发明的抗h7b4 adc通过作为全身疗法应用于患者以及另外通过局部应用于癌组织来发挥治疗作用。
[0367]
抗h7b4 adc可以作为含有一种或多种药学上相容的组分的药物组合物施用。鉴于抗h7b4 adc的剂量、施用浓度等，药学上相容的组分可以适当地选自本领域通常使用的配制添加剂等。例如，本发明中使用的抗h7b4 adc可以作为药物组合物施用，该药物组合物含有缓冲剂诸如组氨酸缓冲剂、赋形剂诸如蔗糖和表面活性剂诸如聚山梨醇酯80。本发明中使用的含有抗h7b4 adc的药物组合物可以用作注射剂，用作含水注射剂或冻干注射剂，或者甚至可以用作冻干注射剂。
[0368]
如果本发明中使用的含有抗h7b4 adc的药物组合物是含水注射剂，则该含水注射剂可以用合适的稀释剂稀释，然后作为静脉输注施用。稀释剂的实例可以包括葡萄糖溶液和生理盐水。
[0369]
如果本发明中使用的含有抗h7b4抗体-药物缀合物的药物组合物是冻干注射剂，该冻干注射剂可以用注射级水溶解，然后用合适的稀释剂稀释到必要的量，然后作为静脉输注施用。稀释剂的实例包括葡萄糖溶液和生理盐水。
[0370]
可能用于施用本文所述的药物组合物的施用途径的实例可以包括静脉途径、皮内途径、皮下途径、肌内途径和腹膜内途径。
[0371]
ix.预测患者对抗b7h4抗体-药物缀合物的反应的方法。
[0372]
图14是方法7的步骤1-6的流程图，通过这些步骤分析系统分析来自癌症患者的组织的数字图像，并预测癌症患者将可能对涉及抗b7h4抗体-药物缀合物(adc)的疗法的反应情况。在一个实施例中，该方法预测患有选自由乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌和胃癌组成的组的癌症的患者对adc的反应。在一个实施例中，该方法预测患有选自由乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌组成的组的癌症的患者对adc的反应。在一个实施例中，该方法预测患有乳腺癌的患者对adc的反应。在一个实施例中，该方法预测患有卵巢癌的患者对adc的反应。在一个实施例中，该方法预测患有子宫内膜癌的患者的adc反应。
[0373]
在第一步骤1中，获取来自癌症患者的组织切片的高分辨率数字图像，该组织切片已经使用一种或多种生物标志物或染剂进行染色。
[0374]
为了预测adc疗法的功效，使用附接有染料的诊断性生物标志物，其靶向与adc疗法所靶向的相同蛋白质。在一个实施例中，评分所针对的抗b7h4 adc疗法是缀合至拓扑异构酶i抑制剂的抗b7h4抗体。在一个实施例中，抗b7h4 adc包含缀合至选自以下的拓扑异构酶i抑制剂的抗b7h4抗体：
[0375][0376][0377]
在一个实施例中，抗b7h4 adc包含缀合至拓扑异构酶抑制剂sg3932的抗b7h4抗体，该拓扑异构酶抑制剂由以下结构表示：
[0378][0379]
因此，在实施例中，诊断性生物标志物也靶向b7-h4蛋白。
[0380]
在步骤2中，预训练卷积神经网络处理癌症患者的组织的数字图像，该组织已经用与染料诸如3,3'-二氨基联苯胺(dab)连接的诊断性抗体染色。染料在癌细胞膜中的染色强度是基于与相应的分割膜目标相关的所有像素的染料的平均染色强度来确定的。此外，单个像素中染料的染色强度是基于该像素的红、绿、蓝颜色组分计算的。图像分析处理的结果是两个后部图像层，对于数字图像中的每个像素，表示该像素属于细胞核的概率和该像素属于细胞膜的概率。
[0381]
在步骤2的另一个实施例中，两个预训练卷积网络处理组织的数字图像。第一网络的处理结果是后部图像层，对于数字图像中的每个像素，表示该像素属于细胞核的可能性。第二网络的处理结果是后部图像层，对于数字图像中的每个像素，表示该像素属于细胞膜的可能性。
[0382]
在步骤3中，基于对细胞核和膜后部层的启发式图像分析，检测单个癌细胞。生成包括细胞膜目标和任选还包括细胞质目标的癌细胞目标。
[0383]
在步骤4中，为每个癌细胞确定单细胞adc分数。单细胞adc分数是基于(1)细胞膜中dab的量，和(2)adc有效载荷的摄取量。基于膜的像素中棕色二氨基联苯胺(dab)信号的平均光密度，通过每个膜的染色强度来确定dab的量。adc有效载荷的摄取量是基于细胞膜中和任选还有细胞质中dab的量，并且进一步任选地还基于对其确定分数的细胞的相邻细胞的膜和细胞质中dab的量来估计的。细胞质中的dab量是通过每个细胞质的染色强度确定的，染色强度是基于细胞质的像素中棕色dab信号的平均光密度计算的。对于那些在对其确定分数的细胞的预定义距离内的癌细胞，确定相邻细胞中dab的量。
[0384]
在步骤5中，对于组织的数字图像而言基于对数字图像中所有癌细胞的单细胞adc分数的统计运算，计算患者分数。患者分数指示癌症患者将对涉及抗b7h4 adc的疗法的反应情况。使用已知对adc疗法有反应的患者训练队列来优化步骤4中单细胞adc分数的参数和步骤5中统计运算的类型。优化目的是在对训练队列中评分阳性与评分阴性的患者组进行kaplan meier分析中获得低p值。
[0385]
在步骤6中，如果分数大于预定阈值，则向评分阳性的患者推荐涉及抗b7h4 adc的疗法。
[0386]
x.预测和评分方法的实例。
[0387]
a.染色组织的图像分析。
[0388]
现在结合染色的癌症组织的特定图像来描述图14的方法。
[0389]
在步骤1中，使用与诊断性抗体连接的染料对组织样品进行免疫组化染色，该诊断性抗体与组织样品中癌细胞上的相关蛋白质结合。图15(左上方图像)是在步骤1中获取的一部分染色组织的数字图像8。图像8示出了癌症患者的组织，该组织已经用与染料连接的抗b7h4诊断性抗体进行了免疫组化染色。在这个实例中，诊断性抗体是抗b7h4生成的克隆(表示为b7h4 ihc工具ab)，重新格式化为小鼠抗人b7h4 igg1克隆。igg1指示抗b7h4抗体的同种型。染色方案是使用dako自动染色机平台开发的。抗b7h4抗体与膜蛋白b7-h4结合，使得3,3'-二氨基联苯胺(dab)染色指示组织样品中b7-h4蛋白的位置。
[0390]
在步骤2中，对数字图像8进行图像分析，以使用卷积神经网络生成癌细胞核和膜的后部图像层。使用图像分析检测癌细胞及其组分，诸如细胞核、膜和细胞质。图15说明了步骤2的图像分析过程。卷积神经网络生成后部层(灰度图像)，对于数字图像8的每个像素，后部层指示每个像素属于细胞核(图15的右上方图像)或细胞膜(图15的左下方图像)的概率。高概率示为黑色，低概率示为白色。
[0391]
在一个实施例中，卷积神经网络包括来自输入图像8朝向具有非常低的空间尺寸(1至16个像素)的瓶颈层的一系列卷积层，以及朝向具有与输入图像8相同尺寸的后部层的一系列去卷积层。这种网络结构被称为u-net。卷积神经网络权重的训练是通过以下方式进行的：在多个训练图像中生成细胞核和膜的人工注释层，然后通过优化算法调整网络权重，使得生成的后部层与人工生成的注释层最为相似。
[0392]
在另一个实施例中，细胞核和膜的注释层是自动生成的，并在多个训练图像中进行人工校正。上皮细胞区域和细胞核中心分别被人工注释为区域和点。对于每张训练图像，膜的分割是通过应用类似于区域增长的算法(例如，分水岭分割)自动生成的，该算法由带注释的细胞核中心作为种子并受到带注释的上皮区域的范围限制。考虑到训练图像，通过应用斑点(blob)检测算法(例如，通过最大稳定极值区域mser算法)和通过仅选择检测到的含有带注释的细胞核中心的斑点作为细胞核，自动生成细胞核的分割。对自动生成的细胞膜和细胞核的分割进行视觉审查并在必要时进行人工校正。校正步骤涉及以下方法之一：拒绝不正确分割的细胞膜或细胞核，明确接受正确注释的细胞膜或细胞核，或细化细胞膜或细胞核的形状。对于每张具有带注释的细胞膜或细胞核的图像，创建注释层。在一个实施例中，如果注释层的每个像素属于注释目标(细胞膜或细胞核)，则对其分配“1”，否则对其分配“0”。在另一个实施例中，注释层的像素表示与最近的注释目标的距离。通过优化算法来调整网络权重，使得生成的后部层与自动生成的细胞膜和细胞核注释层最为相似。
[0393]
图16说明了步骤3，其中检测到各自包括细胞膜和细胞质的单个癌细胞目标。启发式图像分析过程使用分水岭分割法，以使用由卷积神经网络生成的细胞核后部层来分割细胞核。分割生成细胞核目标。对每个细胞核目标分配唯一标识符(uid)。在图16(右下方图像)中，单独鉴别的细胞核示为深色目标。检测到的细胞核也在输入图像8(左上方图像)以及细胞核(右上方图像)和细胞膜(左下方图像)的后部层中作为覆盖图展示。
[0394]
在一个实施例中，分水岭分割涉及用预定义的第一尺寸阈值对核后部层进行阈值化。所有高于第一尺寸阈值的单一连接像素都被认为属于细胞核目标。弃去面积小于16um^2的细胞核目标。对每个细胞核目标分配uid。在后续步骤中，细胞核目标朝向更小的细胞核后部增长，其中增加的细胞核后部像素必须大于第二预定阈值。
[0395]
图17说明了进一步的分割步骤，其中使用细胞核目标来检测和改善细胞膜的分
割。区域增长算法使用检测到的细胞核目标作为种子以增长到膜后部层的膜脊(接近细胞边界)。检测到的细胞膜(右下方图像)在输入图像8(左上方图像)以及细胞核(右上方图像)和细胞膜(左下方图像)的后部层中作为覆盖图示出。
[0396]
图18说明了膜目标的检测和分割，这些膜目标是通过使检测到的细胞的边界像素区域向外增长到膜概率层和预定义膜层后部阈值来分割的。较厚的边界区域成为膜目标。对每个膜目标分配与相关细胞核目标相同的uid。
[0397]
使用细胞核的uid将膜与细胞核之间的空间分配给细胞质。对于每个膜(图18见左上方图像)和细胞质(图18见左上方图像)，将dab染色的平均光密度与uid一起输出到硬盘驱动器上的文件中。对于每个细胞(定义为包括细胞核、细胞质和细胞膜)，还输出了载玻片内细胞的重心位置(x,y)。该文件可以留在硬盘、固态盘或计算机系统中的一部分专用ram上。
[0398]
图19说明了图像分析软件环境中图像分析的结果。图19(左上方图像)作为染色组织的数字图像的叠加图示出了细胞核目标和细胞膜目标的分割。图19(左下图)作为数字图像的光密度表示的叠加图示出了细胞核目标的分割。暗光密度像素与dab量大相关，而亮光密度像素与dab量小相关。每个图像像素的dab光密度是由图像像素的红-绿-蓝表示通过以下方式计算的：对红-绿-蓝色彩空间进行转换，使得棕色dab分量变成独立色彩，并对该棕色色彩分量取对数。图19(右上方图像)和图20(上图)示出了用于在definiens developerxd平台内生成分割图像的图像分析脚本。图19(右下方图像)和图20(下图)示出了图像8中所有细胞膜目标和细胞质目标的输出测量结果。
[0399]
b.预测性adc分数的计算。
[0400]
基于细胞膜目标和任选细胞质目标内dab染色的光密度，为数字图像8中的每个癌细胞计算单细胞adc分数。单细胞adc分数也任选地基于dab染料在相邻癌细胞的细胞膜目标和细胞质目标中的染色强度，这些相邻癌细胞与正在对其计算单细胞adc分数的癌细胞相距比预定义距离更近。单细胞adc分数的聚合预测癌症患者对抗b7h4 adc疗法的反应。
[0401]
图21在示意图中使用细胞膜和细胞质像素的灰度值说明了步骤2-3的图像分析的染色光密度的示例性定量结果。图15-图20中说明的启发式图像分析步骤用于获得图21的向细胞核、细胞膜和细胞质的示例分割。图21中的亮灰度值与高dab光密度相关，因此与大量被诊断性抗体靶向的蛋白质相关。暗灰度值与低dab光密度相关。较亮的像素对应于较高的dab光密度。
[0402]
图22列出了图21的图像的膜上和细胞质中的示例性定量染色量，其在图22中部分重现。来自第一细胞、第二细胞和第三细胞的膜的棕色dab信号的光密度分别为0.949、0.369和0.498。来自第一细胞、第二细胞和第三细胞的细胞质的棕色dab信号的光密度分别为0.796、0.533和0.369。在图22的示意图中，第一癌细胞9表达大量靶蛋白b7-h4并且非常有可能会被进入细胞的与adc抗体连接的adc有效载荷杀伤(图23中的作用1)。第二癌细胞10和第三癌细胞11不表达足够量的靶蛋白b7-h4，无法被抗b7h4 adc直接杀伤。然而，由于第二癌细胞10与第一癌细胞9相邻，从第一癌细胞释放的毒性有效载荷也会杀伤第二癌细胞10(图23中的作用3)。第三癌细胞11将保持活性并且可以成为耐药机制的起源，最终可导致患者死亡。
[0403]
图23说明了抗b7h4 adc疗法杀伤癌细胞的机制。在第一步骤中，adc抗体与靶蛋白
b7-h4结合并抑制靶蛋白的自然功能，这可导致细胞死亡。在第二步骤中，有效载荷(例如，i型拓扑异构酶抑制剂)内化到细胞中并通过有效载荷的毒性杀伤细胞。有效载荷的这种摄取取决于细胞膜上靶蛋白的量，以及细胞膜上和细胞质中靶蛋白量的差异。摄取后，有效载荷可以从细胞中释放到周围组织中。在第三步骤中，有效载荷可以进入附近的细胞并且也可能杀伤它们。有效载荷在组织中的空间分布是通过被动扩散传播的。
[0404]
传统的ihc评分既反映了adc结合引起的靶蛋白的抑制效果，也反映了细胞毒性有效载荷与adc抗体一起进入癌细胞的效果。因此，传统的adc疗法评分没有反映出靶蛋白在细胞质中存在的重要性以及细胞毒性有效载荷从杀伤的第一癌细胞中释放后扩散到组织中的效果。相比之下，新型预测性adc分数衡量了细胞毒性有效载荷释放对相邻癌细胞的影响。
[0405]
在图14的方法的步骤4中，为每个癌细胞确定单细胞adc分数。图24说明了图22中所示三个细胞中每个细胞的单细胞adc分数的计算并且并入了基于细胞分离的指数加权因子，以反映adc有效载荷向相邻细胞中的摄取。单细胞分数可以基于图25中所示的公式或权利要求4中叙述的公式计算。将图22中列出的来自细胞膜(0.949、0.369和0.498)和来自细胞质(0.796、0.533和0.369)的dab信号的光密度输入到图24中说明的计算中。第一细胞、第二细胞和第三细胞9-11的单细胞分数分别为0.145、0.012和0.064。
[0406]
因此，单细胞adc分数并入了使用dab光密度对细胞膜上靶蛋白的量的测量，以及任选对adc有效载荷摄取量的估计。如图23所示，第一细胞对adc有效载荷的摄取既取决于其细胞膜和细胞质中染料的量，也取决于第一细胞附近的第二细胞的细胞膜和细胞质中染料的量。更具体地说，附近可以是在第一癌细胞周围预定义半径的圆盘。在一个实施例中，第一癌细胞的单细胞adc分数是由细胞膜和细胞质目标的dab光密度的几个幂的距离加权总和确定的，这些目标的相关癌细胞中心与第一癌细胞中心相距比预定义距离更近。在一个实施例中，预定义距离是50um，如图24的计算中使用的。在另一个实施例中，该距离是20um。在又一个实施例中，距离加权涉及计算总和中从第一癌细胞中心到其他癌细胞中心按比例的负欧氏距离的指数。在另一个实施例中，总和中的幂限制为0、1和2(常数、线性项、平方)。
[0407]
图25示出了计算单细胞adc分数的公式的一个实施例。公式中的函数a
kl
取决于细胞j到细胞i的距离|r
j-ri|。odmj是细胞j的膜的dab光密度，并且odcj是细胞j的细胞质的dab光密度。常数a_jj、r_norm和d对于所有类型的癌症而言是相同的。然而，确定患者是否有资格接受adc疗法的分数阈值对于不同类型的癌症而言是不同的。
[0408]
在用于指示特定癌症患者将对adc疗法的反应情况的方法的步骤5中，基于靶蛋白b7-h4的染色，为癌症患者的组织的数字图像8计算反应分数，使得该分数指示癌症患者将对抗b7h4 adc疗法的反应情况。反应分数是通过使用统计运算来聚合该组织样品的所有单细胞adc分数而生成的。因此，该分数是基于数字图像中检测到的所有癌细胞的单细胞adc分数的统计量来计算的。在一个实施例中，该统计量是图像8中所有癌细胞的adc有效载荷摄取估计值的预定义分位数。
[0409]
在另一个实施例中，用于计算单细胞adc分数的公式只考虑每个癌细胞的染色膜的光密度，而不考虑细胞质的染色或其他癌细胞是否位于正在对其计算单细胞adc分数的癌细胞的预定义距离内。
[0410]
在该方法的步骤6中，如果分数大于预定阈值，则向患者推荐抗b7h4 adc疗法。步骤6中的预定阈值和步骤5中的分位数是通过使用具有已知单细胞adc分数和治疗反应参数的患者队列优化阳性预测值、阴性预测值和阳性推荐的普遍率而确定的。
[0411]
在步骤5中对反应分数的计算的另一个实例中，获取癌症患者组织样品的数字图像s，并用诊断性抗体(dab)染色。对数字图像s进行图像分析，以检测n个癌细胞(ci)
0≤i＜n
。细胞ci的分割膜中的光密度表示为并且分割细胞质中的光密度表示为与数字图像s相关的反应分数ss指示癌症患者将对抗b7h4 adc疗法有反应的可能性。该adc与诊断性抗体特异性结合相同的b7-h4蛋白。反应分数ss可以表示为：
[0412]
[公式41]
[0413]ss
＝∧
0≤i＜n
[p(ci)]
[0414]
其中∧是对数字图像s中检测到的一组细胞的聚合算子。聚合运算是代表与检测到的细胞相关的阳性值p(ci)的单一数字。在一个实例中，聚合运算是算术平均值。在另一个实例中，聚合运算是几种平均数中的一种，诸如调和平均值或几何平均值。在另一个实例中，聚合运算是检测到的细胞的亚组的频率。在另一个实例中，聚合运算是总和。在一个实施例中，聚合运算是细胞子集的几种平均数中的一种。在又一个实例中，聚合运算是分位数。
[0415]
p()项表示阳性函数，该阳性函数表示每个细胞对抗b7h4 adc疗法有反应的概率。细胞的阳性函数对于与该细胞的相邻细胞相关的dab阳性值的聚合为正。与细胞ci相关的阳性值p(ci)表示为：
[0416]
[公式42]
[0417][0418]
其中πi是靠近细胞ci的相邻癌细胞的集合，该集合包括细胞ci，定义为与细胞ci的距离小于预定义常数的癌细胞。在一个实例中，ci与cj之间的距离是两个细胞中心之间的欧氏距离。在另一个实例中，该距离是ci和cj的细胞膜之间的最小距离。在公式42中，p
dab
(cj)是与细胞cj相关的基于其在细胞膜中的光密度及其在细胞质中的光密度的阳性值。在一个实例中，p
dab
(cj)定义为函数，该函数将1与细胞相关联，对于这些细胞
[0419]
[公式43]
[0420][0421]
否则将0与细胞相关联。在公式43中，α1、α2、α3、γ1、γ2、γ3和t
p
是预定义常数，而h()是衡量与之差的函数。这些预定义常数是通过对抗b7h4 adc疗法具有已知治疗反应的癌症患者的队列的统计分析确定的。在另一个实例中，p
dab
(cj)表示为：
[0422]
[公式44]
[0423][0424]
在一个实例中，函数h()等于与之差，表示为在另一个实例中，函数h()只考虑了与之间的正差，表示为
在又一个实例中，函数h()等于与之间的反差，表示为
[0425]
在公式42中，∨是对相邻癌细胞集合的聚合算子。聚合运算是代表与相邻细胞相关的dab阳性值的单一数字。在一个实例中，聚合运算是dab阳性率的加权算术平均值，表示为：
[0426]
[公式45]
[0427][0428]
其中表示计算细胞ci受到相邻细胞cj影响的可能性的加权函数。在另一个实例中，聚合运算在细胞ci的相邻细胞的dab阳性值的总和高于任意的实常数tn时将1与该细胞相关联，否则将0与该细胞相关联。在另一个实例中，聚合运算是分位数、频率测量值、或几种平均数(诸如调和平均值或几何平均值)中的一种。在一个实例中，该加权函数是细胞ci与细胞cj之间的空间距离d(ci，cj)的高斯函数，表示为：
[0429]
[公式46]
[0430][0431]
其中σ和α是预定义常数。在另一个实例中，该加权函数是空间距离的s型函数(sigmoid)：
[0432]
[公式47]
[0433][0434]
其中σ、α和β是预定义常数。在另一个实例中，该加权函数是细胞ci与细胞cj之间的欧氏距离的递减函数。在又一个实例中，该加权函数是细胞ci与细胞cj之间距离的赫维赛德函数(heaviside function)，如果该距离小于预定义常数td，则该函数关联1，否则关联0。
[0435]
阳性函数p(ci)的一个特定实例将1与细胞ci相关联，对该细胞而言
[0436]
[公式48]
[0437][0438]
否则将0与该细胞相关联。
[0439]
c.预测方法的验证。
[0440]
根据图14的方法生成的新型预测性adc评分的准确性基于对15名具有不同b7-h4表达水平的患者的患者源性异种移植(pdx)研究进行验证，如人工“h分数”所示。简言之，将肿瘤组织碎片皮下植入6至8周龄的雌性无胸腺裸小鼠体内。当肿瘤达到适当的肿瘤体积范
围(通常为150-300mm)时，将动物随机分为治疗组和对照组并开始b7h4-sg3932 adc给药。通过静脉内注射向荷瘤小鼠施用单剂量的b7h4-sg3932 adc。每天观察动物，每周测量并记录肿瘤尺寸和体重两次。通过数显卡尺测量肿瘤体积且使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长(mm)x宽(mm)2x0.52，其中长和宽分别为肿瘤的最长和最短直径。
[0441]
图26示出了pdx乳腺研究中15名患者的实际结果与按反应类别列出的人工h分数之间的相关性。反应类别是pd(进行性疾病)、sd(稳定疾病)和r(反应)。图26中分析的组织是携带来自15名人类癌症患者的肿瘤细胞的小鼠的组织。
[0442]
图27-图28示出了人工评估的h分数与qcs分数之间的比例分数结果的相关性。图27将人工比例分数与平均h分数进行比较。图28将b7h4膜染色的光密度的人工比例分数与qcs中位分数(q50)进行比较。对于比例分数，qcs分数(q50)与人工评估的h分数之间存在强相关性。
[0443]
图29-图30示出了人工评估的h分数与qcs分数之间的强度分数结果的相关性。图29将人工强度分数与平均h分数进行比较。图30将b7h4膜染色的光密度的人工强度分数与qcs中位分数进行比较。对于强度分数，qcs分数与人工评估的h分数之间存在弱相关性。
[0444]
图31-图32说明了每名患者随平均h分数变化的实际反应类别相比该患者随qcs中位分数(q50)变化的实际反应类别的相关性。图31示出了三个反应类别pd(进行性疾病)、r(反应)和sd(稳定疾病)中每个类别的患者的平均h分数。图32示出了三个反应类别pd、r和sd中每个类别的患者的qcs中位分数(q50)。虽然平均h分数是pd和r反应类别中患者的不太理想的区分指标，但是较低的qcs分数与进行性疾病相关，而较高的qcs分数往往与抗h7b4adc的反应相关。
[0445]
图33-图34显示使用qcs分数和h分数，pd与r反应类别之间基线时的b7-h4水平差异是显著的。图33显示使用h分数，pd(进行性疾病)与r(反应)组患者样品之间t检验的p值为0.019。图34显示使用qcs分数，pd组与r组患者样品之间t检验的p值为0.011。
[0446]
图35示出了肿瘤增长的百分比与qcs分数(样品中所有肿瘤细胞的膜光密度的中位数/50％分位数)之间的关系。x轴的值大于0表示观察期间肿瘤大小增大，值小于0表示观察期间肿瘤大小缩小。
[0447]
每个患者样品的qcs q50分数是通过确定从患者样品获取的b7h4染色的组织数字图像中所有肿瘤细胞的中位膜光密度来计算的。
[0448]
图36示出了qcs分数与肿瘤生长之间的相关性。使用qcs分数评估的基线b7-h4光密度染色水平与治疗后肿瘤大小的变化之间存在负相关。在图36的图表中，斯皮尔曼等级相关系数ρ为-0.65，并且p等于0.011。因此，与b7-h4染色的较高光密度相关的肿瘤大小有较大的下降。
[0449]
d.显示来自诊断性抗体染色的较高qcs分数与adc处理后肿瘤细胞密度下降有相关性的实例。
[0450]
显示定量连续分数(qcs)应用的实例涉及使用该分数和相关的图像分析来评价抗h7b4 adc e02-gl-sg3932的药代动力学(pk)和药效学(pd)。图37说明了如何进行pk和pd研究。使用异种移植小鼠模型研究adc如何减少人乳腺癌组织的肿瘤生长。将来自28名乳腺癌患者的人类肿瘤细胞植入小鼠体内并克隆。使用图像分析和与adc e02-gl-sg3932的抗体缔合的染色的诊断性抗体来跟踪植入的肿瘤细胞随时间的生长。
[0451]
图38a-图38d是聚合pk和pd结果的图表。在用单剂量adc处理后的不同时间收获肿瘤样品，然后通过免疫组化法进行染色。使用基于深度学习的qcs算法来量化adc，并且定制的halo解决方案确定肿瘤细胞中gh2ax和裂解的半胱天冬酶3的普遍率。
[0452]
图38a示出了adc在上皮细胞中的结合和摄取情况，基于对adc-igg(人免疫球蛋白g1)进行膜染色的上皮细胞与所有上皮细胞的细胞比率。只有当细胞表现出的染色超过在对照中观察到的最大值时，才将这些细胞作为染色细胞进行计数。图38a显示，adc摄取在adc处理后长达96小时随时间增加，并且随着较高的adc剂量而增加。
[0453]
图38b说明了adc处理后，dna损伤(gh2ax)随时间增加。dna损伤用在gh2ax测定中对于病灶发现呈阳性的上皮细胞的分率表示。用市售的图像分析系统halo(indica labs,albuquerque,usa[美国阿尔伯克基的印迪卡实验室])对载玻片进行分析，以确定γh2ax的普遍率。图38b显示，dna损伤在adc处理后约168小时达到峰值。
[0454]
图38c说明基于裂解的半胱天冬酶-3阳性肿瘤细胞的百分比，在adc处理后dna损伤随时间增加。使用halo图像分析系统对载玻片进行分析。
[0455]
图38d显示在adc处理后，基于所有上皮细胞的细胞密度下降，肿瘤细胞死亡随时间增加。与用同种型adc处理相比，用e02-gl-sg3932处理导致细胞数量减少，指示细胞死亡。
[0456]
在对染色组织进行图像分析之前，首先选择与adce02-gl-sg3932的抗体密切相关的诊断性抗体。然后将该诊断性抗体用于染色。首先，使用异种移植模型来证实，在三者之间，与d11、a57.1和cal63三种诊断性抗体连接的染料对肿瘤细胞膜染色有高度相关性。图39a示出了通过植入小鼠中而克隆的来自28名乳腺癌患者的肿瘤组织的膜染色的中位光密度。由三种诊断性抗体对28个不同肿瘤样品产生的染色程度高度相关，证明诊断性抗体对肿瘤进展程度的测量是一致的。在28个肿瘤样品中的仅两个肿瘤样品中，这些诊断性抗体中的一种诊断性抗体产生的染色水平与其他两种诊断性抗体的染色水平显著不同。
[0457]
图39b显示对于21号肿瘤克隆样品，诊断性抗体d11的膜染色远远低于诊断性抗体a57.1和cal63的染色。图39c显示对于28号肿瘤样品，诊断性抗体a57.1的膜染色显著大于诊断性抗体d11和cal63的染色。因此，诊断性抗体cal63提供了对肿瘤样品最一致的膜染色，并用于pk和pd研究。
[0458]
图40a-图40b示出了使用与染料连接的诊断性抗体cal63染色的26号和4号克隆样品的数字图像。使用图像分析和qcs方法，为数字图像中的每个肿瘤细胞确定基于膜染色的单细胞分数。然后确定类似染色的细胞的分布。使用qcs分数来研究adc e02-gl-sg3932的药代动力学(pk)和药效学(pd)。
[0459]
图41a-图41b示出了在用不同剂量的e02-gl-sg3932或没有细胞毒性有效载荷的adc处理后，使用抗b7h4诊断性抗体cal63染色的样品的膜光密度分布。图41a-图41b的图表显示，adc处理增加靶标表达水平，并且在测试水平上与adc浓度无关。
[0460]
图41a示出了用各种浓度的无有效载荷的adc处理前后，26号克隆样品的每个细胞膜染色(膜光密度)的分布。上图是在时间零处，下图是在处理后168小时。在时间零处同种型对照的染色分布与未处理的样品大致相同。在处理后168小时，膜染色水平较高的细胞的数量增加。染色的增加与adc浓度相对无关。adc处理后染色的增加证明，adc触发了上皮细胞膜中b7h4-抗体的靶标水平升高。
[0461]
图41b示出了用adc e02-gl-sg3932处理前后，4号克隆样品的每个细胞膜染色的分布。上图是在时间零处，下图是在处理后168小时。上图显示，图41a中4号克隆样品在时间零处的膜染色的中位光密度是26号克隆样品的中位光密度的约60％。在处理后168小时，膜染色水平较高的细胞的数量增加。即使从这种较低的肿瘤细胞膜染色普遍率开始，adc处理也触发靶标水平升高。
[0462]
图42a-图42b示出了26号和4号克隆样品在adc处理前后结合的igg的每个细胞分布。图42a-图42b的上图显示，26号样品具有比4号样品更高的结合igg基线分布。图42a-图42b的下图示出了adc处理后结合的igg的分布并且证明与4号样品相比，26号样品较高的基线靶标水平引起较高的adc结合。因此，adc与靶细胞的结合取决于靶标表达。
[0463]
图42c是在e02-gl-sg3932的不同剂量水平下结合的igg的最大膜光密度图表。图42c显示，随着无有效载荷的adc剂量水平的增加，结合的igg的膜光密度分布的平均值增加。
[0464]
图42d示出了在1至7mg/kg的adc e02-gl-sg3932剂量水平下，26号克隆样品的裂解的半胱天冬酶-3阳性肿瘤的百分比。图42d显示，在7mg/kg的剂量水平下，26号克隆的阳性肿瘤百分比值比4号克隆更高。
[0465]
图43a-图43b是示出在不同剂量下靶标表达对e02-gl-sg3932的药代动力学(pk)和药效学(pd)的影响的图表。
[0466]
图43a说明了e02-gl-sg3932的膜结合动力学。图43a对26号和4号克隆在用不同剂量的无有效载荷的adc处理后不同时间的igg中位膜光密度制图。中位膜光密度随着自治疗后经过的时间而增加，并且在治疗后约96小时后达到最大值。
[0467]
图43b说明在细胞膜与细胞溶质中adc的存在性的动力学。图43b的图表示出了在用7mg/kg的e02-gl-sg3932处理后不同时间的26号克隆的中位光密度。光密度是对靶标表达的指示。图43b的图表示出了细胞膜和细胞溶质中的光密度。在从处理开始约24小时后，细胞膜中的靶标表达以比细胞溶质中的靶标表达更快的速率增加。因此，adc的结合取决于剂量和靶标表达。
[0468]
图44a-图44b是示出在不同剂量下靶标表达对e02-gl-sg3932的pk和pd的影响的图表。图44a-图44b显示，该adc对较低靶标表达的细胞系也有效。图44a涉及26号克隆，图44b涉及4号克隆。
[0469]
图44a-图44b的上图示出了用无有效载荷的adc处理后不同时间的染色上皮细胞的密度。图44a的上图显示与用同种型对照处理相比，用7mg/kg的无有效载荷的adc处理26号克隆后，上皮细胞密度到288小时下降51.2％。图44b的上图显示与用同种型对照处理相比，用7mg/kg的无有效载荷的adc处理4号克隆后，上皮细胞密度到288小时下降44.7％。
[0470]
图44a-图44b的下图说明基于裂解的半胱天冬酶-3(cc-3)阳性肿瘤细胞的百分比，在adc处理后dna损伤随时间增加。使用定制的halo解决方案对载玻片进行图像分析。图44a的下图显示，26号克隆的受损肿瘤细胞的cc-3阳性面积在从处理开始96小时后显著增加。无有效载荷的adc剂量越高，cc-3阳性组织的面积越大。图44b的下图显示，4号克隆的受损肿瘤细胞的cc-3阳性面积大约在从处理开始48小时后开始仅适度增加，即使是无有效载荷的adc在7mg/kg的较高剂量下。并且cc-3阳性组织的增加与同种型adc的增加几乎相同。
[0471]
图45a-图45b、图46a-图46b和图47a-图47b说明染色上皮细胞的空间接近度对
e02-gl-sg3932的药代动力学(pk)的影响。随着染色的肿瘤细胞的空间接近度更近，与有靶蛋白表达的癌细胞结合的adc的毒性有效载荷也能杀伤附近不表达靶蛋白的细胞。因此，在与染色的上皮细胞更接近的区域中存在更高的细胞死亡率并且因此存在更高的靶蛋白表达。
[0472]
图45a-图45b示出了在用adc处理后至312小时的不同时间，二元空间接近度(sps为25um)与膜光密度的关系。对于26号克隆样品，图45a显示，二元sps与中位膜光密度之间的关系存在很大的线性相关性，因为这种关系随时间而变化。对于图45a的散点图，相关系数r等于0.914。图45b显示，对于4号克隆在二元sps与膜光密度之间的关系中存在甚至更大的线性相关性，因为这种关系随时间而变化。对于图45b的散点图，相关系数r等于0.925。
[0473]
图46a-图46b示出了在用adc处理后的不同时间，连续空间接近度(连续sps为25um)与膜光密度的关系。对于26号克隆样品，图46a显示，连续sps与中位膜光密度之间的关系存在较差的线性相关性，因为这种关系随时间而变化。图46a实际上显示，对于具有高的染色膜光密度的26号克隆，在处理后约168小时后，随着连续空间接近度降低，光密度增加。这样将散点图分成两个不同的组。因此，对于靶标表达水平较高的26号克隆，处理后在连续空间接近度较低的肿瘤区域中，靶标表达随时间而增加。
[0474]
然而，对于靶标表达水平较低的4号克隆，图46b并没有显示在处理后经过较长一段时间后，散点图中形成第二个不同的组。相反，在连续sps与膜光密度之间的关系中，仍然有中等线性相关性，因为这种关系随时间变化。对于图46b的散点图，相关系数r等于0.617。
[0475]
图47a-图47b示出了在用adc处理后至312小时的不同时间，连续空间接近度(连续sps为25um)与上皮细胞密度的关系。对于26号克隆样品，图47a显示，连续sps与上皮密度之间的关系存在中等线性相关性，因为这种关系随时间而变化。对于图47a的散点图，相关系数r等于0.798。图47b显示，对于4号克隆在连续sps与上皮细胞密度之间的关系中存在较差的线性相关性，因为这种关系随时间而变化。对于图47b的散点图，相关系数r等于0.686。图47a-图47b显示，随着adc处理后时间的推移，在染色的肿瘤细胞之间连续空间接近度更近的区域中，细胞死亡率更高(因此细胞密度更低)。在与染色的上皮细胞更接近的区域中观察到的更高的细胞死亡率，以及因此更高的靶蛋白表达支持图23中说明的拟议的第三作用，通过这种作用在adc所靶向的细胞附近的非表达癌细胞也被adc的毒性有效载荷杀伤。此外，这也支持在图24-图25所示的单细胞adc分数的公式中纳入指数加权因子，该指数加权因子考虑了细胞分离，以反映adc有效载荷向相邻细胞中的摄取。
[0476]
尽管为了说明的目的，本发明已经结合某些具体的实施例进行了描述，但本发明并不限于此。在不脱离权利要求书中规定的本发明范围的情况下，可以对所描述的实施例的各种特征进行各种修改、改编和组合。

技术特征：
1.一种生成反应分数以预测癌症患者对抗体药物缀合物(adc)的反应的方法，该抗体药物缀合物包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的蛋白质的adc抗体，其中该蛋白质是b7-h4，该方法包括：使用与诊断性抗体连接的染料对组织样品进行免疫组化染色，其中该诊断性抗体与该组织样品中癌细胞上的该蛋白质结合；获取该组织样品的数字图像；检测该数字图像中的癌细胞；基于该染料在该癌细胞的膜和细胞质中的染色强度，并且基于该染料在与该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度，计算每个癌细胞的单细胞adc分数；以及通过使用统计运算来聚合该组织样品的所有单细胞adc分数，生成该反应分数。2.如权利要求1所述的方法，其中癌细胞的该检测涉及针对每个癌细胞检测属于该膜的像素和属于该细胞质的像素。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中每个膜的染色强度是基于该膜的像素中棕色二氨基联苯胺(dab)信号的平均光密度计算的，并且其中每个细胞质的染色强度是基于该细胞质的像素中该棕色dab信号的平均光密度计算的。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中细胞i的该单细胞adc分数计算如下：所有细胞j的总和，其中|r
j-r
i
|<d{a
20
(|r
j-r
i
|)x odm
j2
+a
11
(|r
j-r
i
|)x odm
j
x odc
j
+a
02
(|r
j-r
i
|)x odc
j2
+a
00
(|r
j-r
i
|)}，其中函数a
kl
取决于每个细胞j与每个细胞i的距离|r
j-r
i
|，其中odm
j
是细胞j的膜中该棕色dab信号的光密度，并且其中odc
j
是细胞j的细胞质中该棕色dab信号的光密度。5.如权利要求4所述的方法，其中该函数a
kl
按以下关系式取决于该细胞j与该细胞i的距离|r
j-r
i
|：a
kl
(|r
j-r
i
|)＝a
kl
x exp(-|r
j-r
i
|/r
norm
)，其中预定义常数系数为a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
。6.如权利要求5所述的方法，其中这些系数a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
、d和r
norm
是通过优化该反应分数与训练患者队列的治疗反应之间的相关性来确定的。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所有单细胞adc分数的该聚合取自于由以下组成的组：确定平均值，确定中位数，以及确定具有预定百分比的分位数。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，或其功能变体。9.如权利要求8所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:10和seq id no:11的氨基酸序列的vh链和vl链，或其功能变体。10.如权利要求9所述的方法，其中该adc抗体包含：含有seq id no:12的氨基酸序列的重链；以及含有seq id no:13的氨基酸序列的轻链。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中推荐反应分数高于预定阈值的患者接受涉及该adc的疗法。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该adc抗体是人源化igg1单克隆抗体。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该adc有效载荷是拓扑异构酶i抑制剂。14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该染料是3,3'-二氨基联苯胺(dab)。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌和胃癌。16.如权利要求15所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌。17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该adc是与药物接头缀合的抗b7h4抗体，其中该药物接头由下式表示：并且其中r
ll
表示与该抗b7h4抗体连接的接头。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：和/或
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂是：20.一种生成指示用抗体药物缀合物(adc)治疗的癌症患者的生存概率的分数的方法，该方法包括：使用与诊断性抗体连接的染料对该癌症患者的组织样品进行免疫组化染色，其中该adc包括adc有效载荷和adc抗体，该抗体靶向癌细胞上的b7-h4蛋白，并且其中该诊断性抗体与该组织样品中癌细胞上的该b7-h4蛋白结合；获取该组织样品的数字图像；检测该数字图像中的癌细胞；基于该染料在该癌细胞的膜和细胞质中的染色强度，并且基于该染料在与该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度，计算每个癌细胞的单细胞adc分数；以及通过使用统计运算来聚合该组织样品的所有单细胞adc分数，生成指示该癌症患者的生存概率的分数。21.如权利要求20所述的方法，其中癌细胞的该检测涉及针对每个癌细胞检测属于该膜的像素和属于该细胞质的像素。22.如权利要求20或权利要求21所述的方法，其中每个膜的染色强度是基于该膜的像素中棕色二氨基联苯胺(dab)信号的平均光密度计算的，并且其中每个细胞质的染色强度是基于该细胞质的像素中该棕色dab信号的平均光密度计算的。23.如权利要求22所述的方法，其中细胞i的该单细胞adc分数计算如下：所有细胞j的总和，其中|r
j-r
i
|<d{a
20
(|r
j-r
i
|)x odm
j2
+a
11
(|r
j-r
i
|)x odm
j x odc
j
+a
02
(|r
j-r
i
|)x odc
j2
+a
00
(|r
j-r
i
|)}，其中函数a
kl
取决于每个细胞j与每个细胞i的距离|r
j-r
i
|，其中odm
j
是细胞j的膜中该棕色dab信号的光密度，并且其中odc
j
是细胞j的细胞质中该棕色dab信号的光密度。
24.如权利要求23所述的方法，其中该函数a
kl
按以下关系式取决于该细胞j与该细胞i的距离|r
j-r
i
|：a
kl
(|r
j-r
i
|)＝a
kl x exp(-|r
j-r
i
|/r
norm
)，其中预定义常数系数为a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
。25.如权利要求24所述的方法，其中这些系数a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
、d和r
norm
是通过优化该反应分数与训练患者队列的治疗反应之间的相关性来确定的。26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所有单细胞adc分数的该聚合取自于由以下组成的组：确定平均值，确定中位数，以及确定具有预定百分比的分位数。27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中如果该分数指示该癌症患者的生存概率超过预定阈值，则推荐该癌症患者接受涉及该adc的疗法。28.如权利要求20-27中任一项所述的方法，其中该adc抗体是人源化igg1单克隆抗体。29.如权利要求20-28中任一项所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，或其功能变体。30.如权利要求29所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:10和seq id no:11的氨基酸序列的vh链和vl链，或其功能变体。31.如权利要求30所述的方法，其中该adc抗体包含：含有seq id no:12的氨基酸序列的重链；以及含有seq id no:13的氨基酸序列的轻链。32.如权利要求20-31中任一项所述的方法，其中该adc有效载荷是拓扑异构酶i抑制剂。33.如权利要求20-32中任一项所述的方法，其中该染料是3,3'-二氨基联苯胺(dab)。34.如权利要求20-33中任一项所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌和胃癌。35.如权利要求34所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌。36.如权利要求20-35中任一项所述的方法，其中该adc是与药物接头缀合的抗b7h4抗体，其中该药物接头由下式表示：并且其中r
ll
表示与该抗b7h4抗体连接的接头。37.如权利要求20-36中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：
和/或38.如权利要求20-36中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂是：39.一种预测癌症患者对抗体药物缀合物(adc)的反应的方法，该抗体药物缀合物包括adc抗体和adc有效载荷，其adc抗体靶向癌细胞上的蛋白质，该方法包括：使用与诊断性抗体连接的染料对组织样品进行免疫组化染色，其中该诊断性抗体与该组织样品中癌细胞上的该蛋白质结合，并且其中该蛋白质是b7-h4；
获取该组织样品的数字图像；检测该数字图像中的癌细胞；基于该染料在该膜中的染色强度，计算每个癌细胞的单细胞adc分数；以及基于使用统计运算对该组织样品的所有单细胞adc分数的聚合，预测该癌症患者对该adc的反应。40.如权利要求39所述的方法，其中每个癌细胞的该单细胞adc分数也是基于该染料在该细胞质中的染色强度并且基于该染料在与该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度计算的。41.如权利要求39或权利要求40所述的方法，其中癌细胞的该检测涉及针对每个癌细胞检测属于该膜的像素和属于该细胞质的像素。42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中每个膜的染色强度是基于该膜的像素中棕色二氨基联苯胺(dab)信号的平均光密度计算的，并且其中每个细胞质的染色强度是基于该细胞质的像素中该棕色dab信号的平均光密度计算的。43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中细胞i的该单细胞adc分数计算如下：所有细胞j的总和，其中|r
j-r
i
|<d{a
20
(|r
j-r
i
|)x odm
j2
+a
11
(|r
j-r
i
|)x odm
j x odc
j
+a
02
(|r
j-r
i
|)x odc
j2
+a
00
(|r
j-r
i
|)}，其中函数a
kl
取决于每个细胞j与每个细胞i的距离|r
j-r
i
|，其中odm
j
是细胞j的膜中该棕色dab信号的光密度，并且其中odc
j
是细胞j的细胞质中该棕色dab信号的光密度。44.如权利要求43所述的方法，其中该函数a
kl
按以下关系式取决于该细胞j与该细胞i的距离|r
j-r
i
|：a
kl
(|r
j-r
i
|)＝a
kl x exp(-|r
j-r
i
|/r
norm
)，其中预定义常数系数为a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
。45.如权利要求44所述的方法，其中这些系数a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
、d和r
norm
是通过优化该反应分数与训练患者队列的治疗反应之间的相关性来确定的。46.如权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所有单细胞adc分数的该聚合是通过取自于由以下组成的组的运算进行的：确定平均值，确定中位数，以及确定具有预定百分比的分位数。47.如权利要求39-46中任一项所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，或其功能变体。48.如权利要求47所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:10和seq id no:11的氨基酸序列的vh链和vl链，或其功能变体。49.如权利要求48所述的方法，其中该adc抗体包含：含有seq id no:12的氨基酸序列的重链；以及含有seq id no:13的氨基酸序列的轻链。50.如权利要求39-49中任一项所述的方法，其中如果该分数指示该癌症患者的生存概率超过预定阈值，则推荐该癌症患者接受涉及该adc的疗法。51.如权利要求39-50中任一项所述的方法，其中该adc抗体是人源化igg1单克隆抗体。52.如权利要求39-51中任一项所述的方法，其中该adc有效载荷是拓扑异构酶i抑制剂。
53.如权利要求39-52中任一项所述的方法，其中该染料是3,3'-二氨基联苯胺(dab)。54.如权利要求39-53中任一项所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌和胃癌。55.如权利要求54所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌。56.如权利要求39-55中任一项所述的方法，其中该adc是与药物接头缀合的抗b7h4抗体，其中该药物接头由下式表示：并且其中r
ll
表示与该抗b7h4抗体连接的接头。57.如权利要求39-56中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：和/或
58.如权利要求39-56中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂是：59.一种鉴别癌症患者以用抗b7h4抗体药物缀合物(adc)进行治疗的方法，该抗体药物缀合物包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的蛋白质的adc抗体，该方法包括：使用与诊断性抗体连接的染料对该癌症患者的组织样品进行免疫组化染色，其中该诊断性抗体与该组织样品中癌细胞上的该蛋白质结合，并且其中该蛋白质是b7-h4；获取该组织样品的数字图像；检测该数字图像中的癌细胞；基于该染料在该膜中的染色强度，计算每个癌细胞的单细胞adc分数；通过使用统计运算来聚合该组织样品的所有单细胞adc分数，生成反应分数；以及如果该反应分数超过阈值，则将该癌症患者鉴别为可能会从施用该adc中获益的癌症患者。60.如权利要求59所述的方法，其中该可能的益处是平均肿瘤大小的减小。61.如权利要求59或权利要求60所述的方法，其中每个癌细胞的该单细胞adc分数也是基于该染料在该细胞质中的染色强度并且基于该染料在与该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度计算的。62.如权利要求59-61中任一项所述的方法，其中癌细胞的该检测涉及针对每个癌细胞检测属于该膜的像素和属于该细胞质的像素。63.如权利要求59-62中任一项所述的方法，其中每个膜的染色强度是基于该膜的像素中棕色二氨基联苯胺(dab)信号的平均光密度计算的，并且其中每个细胞质的染色强度是基于该细胞质的像素中该棕色dab信号的平均光密度计算的。64.如权利要求59-63中任一项所述的方法，其中细胞i的该单细胞adc分数计算如下：所有细胞j的总和，其中|r
j-r
i
|<d{a
20
(|r
j-r
i
|)x odm
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11
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|)x odm
j x odc
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|)x odc
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i
|)}，其中函数a
kl
取决于每个细胞j与每个细胞i的距离|r
j-r
i
|，其中odm
j
是细胞j的膜中该
棕色dab信号的光密度，并且其中odc
j
是细胞j的细胞质中该棕色dab信号的光密度。65.如权利要求64所述的方法，其中该函数a
kl
按以下关系式取决于该细胞j与该细胞i的距离|r
j-r
i
|：a
kl
(|r
j-r
i
|)＝a
kl x exp(-|r
j-r
i
|/r
norm
)，其中预定义常数系数为a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
。66.如权利要求65所述的方法，其中这些系数a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
、d和r
norm
是通过优化该反应分数与训练患者队列的治疗反应之间的相关性来确定的。67.如权利要求59-66中任一项所述的方法，其中所有单细胞adc分数的该聚合取自于由以下组成的组：确定平均值，确定中位数，以及确定具有预定百分比的分位数。68.如权利要求59-67中任一项所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，或其功能变体。69.如权利要求68所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:10和seq id no:11的氨基酸序列的vh链和vl链，或其功能变体。70.如权利要求69所述的方法，其中该adc抗体包含：含有seq id no:12的氨基酸序列的重链；以及含有seq id no:13的氨基酸序列的轻链。71.如权利要求59-70中任一项所述的方法，其中推荐反应分数高于预定阈值的患者接受涉及该adc的疗法。72.如权利要求59-71中任一项所述的方法，其中该adc抗体是人源化igg1单克隆抗体。73.如权利要求59-72中任一项所述的方法，其中该adc有效载荷是拓扑异构酶i抑制剂。74.如权利要求59-73中任一项所述的方法，其中该染料是3,3'-二氨基联苯胺(dab)。75.如权利要求59-74中任一项所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌和胃癌。76.如权利要求75所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌。77.如权利要求59-76中任一项所述的方法，其中该adc是与药物接头缀合的抗b7h4抗体，其中该药物接头由下式表示：并且其中r
ll
表示与该抗b7h4抗体连接的接头。78.如权利要求59-77中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：
和/或79.如权利要求59-77中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂是：80.一种治疗癌症的方法，该方法涉及向癌症患者施用抗体药物缀合物(adc)，该抗体药物缀合物包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的蛋白质的adc抗体，其中该蛋白质是b7-h4，该方法包括：使用与诊断性抗体连接的染料对该癌症患者的组织样品进行免疫组化染色，其中该诊
断性抗体与该组织样品中癌细胞上的该蛋白质结合；获取该组织样品的数字图像；检测该数字图像中的癌细胞；基于该染料在该膜中的染色强度，计算每个癌细胞的单细胞adc分数；通过使用统计运算来聚合该组织样品的所有单细胞adc分数，生成治疗分数；以及如果该治疗分数超过预定阈值，则向该癌症患者施用涉及该adc的疗法。81.如权利要求80所述的方法，其中每个癌细胞的该单细胞adc分数也是基于该染料在该细胞质中的染色强度并且基于该染料在与该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度计算的。82.如权利要求80或权利要求81所述的方法，其中癌细胞的该检测涉及针对每个癌细胞检测属于该膜的像素和属于该细胞质的像素。83.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中每个膜的染色强度是基于该膜的像素中棕色二氨基联苯胺(dab)信号的平均光密度计算的，并且其中每个细胞质的染色强度是基于该细胞质的像素中该棕色dab信号的平均光密度计算的。84.如权利要求80-83中任一项所述的方法，其中细胞i的该单细胞adc分数计算如下：所有细胞j的总和，其中|r
j-r
i
|<d{a
20
(|r
j-r
i
|)x odm
j2
+a
11
(|r
j-r
i
|)x odm
j x odc
j
+a
02
(|r
j-r
i
|)x odc
j2
+a
00
(|r
j-r
i
|)}，其中函数a
kl
取决于每个细胞j与每个细胞i的距离|r
j-r
i
|，其中odm
j
是细胞j的膜中该棕色dab信号的光密度，并且其中odc
j
是细胞j的细胞质中该棕色dab信号的光密度。85.如权利要求84所述的方法，其中该函数a
kl
按以下关系式取决于该细胞j与该细胞i的距离|r
j-r
i
|：a
kl
(|r
j-r
i
|)＝a
kl x exp(-|r
j-r
i
|/r
norm
)，其中预定义常数系数为a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
。86.如权利要求85所述的方法，其中这些系数a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
、d和r
norm
是通过优化该反应分数与训练患者队列的治疗反应之间的相关性来确定的。87.如权利要求80-86中任一项所述的方法，其中所有单细胞adc分数的该聚合取自于由以下组成的组：确定平均值，确定中位数，以及确定具有预定百分比的分位数。88.如权利要求80-87中任一项所述的方法，其中该adc抗体是人源化igg1单克隆抗体。89.如权利要求80-88中任一项所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，或其功能变体。90.如权利要求89所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:10和seq id no:11的氨基酸序列的vh链和vl链，或其功能变体。91.如权利要求90所述的方法，其中该adc抗体包含：含有seq id no:12的氨基酸序列的重链；以及含有seq id no:13的氨基酸序列的轻链。92.如权利要求80-91中任一项所述的方法，其中该adc有效载荷是拓扑异构酶i抑制剂。93.如权利要求80-92中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：
和/或94.如权利要求80-92中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂是：95.如权利要求80-94中任一项所述的方法，其中该染料是3,3'-二氨基联苯胺(dab)。96.如权利要求80-95中任一项所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌和胃癌。97.如权利要求96所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺
癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌。98.一种治疗癌症的方法，该方法涉及向癌症患者施用抗体药物缀合物(adc)，该抗体药物缀合物包括adc有效载荷和靶向癌细胞上的蛋白质的adc抗体，其中该蛋白质是b7h4，该方法包括：如果反应分数超过预定阈值，则向该癌症患者施用涉及该adc的疗法，其中该反应分数是通过使用统计运算来聚合该癌症患者的组织样品的单细胞adc分数而生成的，其中每个单细胞adc分数是针对每个癌细胞基于染料在该膜中的染色强度计算的，其中在该癌症患者的该组织样品的数字图像中检测这些癌症细胞，其中该组织样品使用与诊断性抗体连接的该染料进行免疫组化染色，并且其中该诊断性抗体与该组织样品中癌细胞上的该蛋白质结合。99.如权利要求98所述的方法，其中每个癌细胞的该单细胞adc分数也是基于该染料在该细胞质中的染色强度并且基于该染料在与该癌细胞相距比预定义距离更近的其他癌细胞的膜和细胞质中的染色强度计算的。100.如权利要求98或权利要求99所述的方法，其中癌细胞的该检测涉及针对每个癌细胞检测属于该膜的像素和属于该细胞质的像素。101.如权利要求98-100中任一项所述的方法，其中每个膜的染色强度是基于该膜的像素中棕色二氨基联苯胺(dab)信号的平均光密度计算的，并且其中每个细胞质的染色强度是基于该细胞质的像素中该棕色dab信号的平均光密度计算的。102.如权利要求98-101中任一项所述的方法，其中细胞i的该单细胞adc分数计算如下：所有细胞j的总和，其中|r
j-r
i
|<d{a
20
(|r
j-r
i
|)x odm
j2
+a
11
(|r
j-r
i
|)x odm
j x odc
j
+a
02
(|r
j-r
i
|)x odc
j2
+a
00
(|r
j-r
i
|)}，其中函数a
kl
取决于每个细胞j与每个细胞i的距离|r
j-r
i
|，其中odm
j
是细胞j的膜中该棕色dab信号的光密度，并且其中odc
j
是细胞j的细胞质中该棕色dab信号的光密度。103.如权利要求102所述的方法，其中该函数a
kl
按以下关系式取决于该细胞j与该细胞i的距离|r
j-r
i
|：a
kl
(|r
j-r
i
|)＝a
kl x exp(-|r
j-r
i
|/r
norm
)，其中预定义常数系数为a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
。104.如权利要求103所述的方法，其中这些系数a
oo
、a
1o
、a
o1
、a
11
、a
20
、a
o2
、d和r
norm
是通过优化该反应分数与训练患者队列的治疗反应之间的相关性来确定的。105.如权利要求98-104中任一项所述的方法，其中所有单细胞adc分数的该聚合取自于由以下组成的组：确定平均值，确定中位数，以及确定具有预定百分比的分位数。106.如权利要求98-105中任一项所述的方法，其中该adc抗体是人源化igg1单克隆抗体。107.如权利要求98-106中任一项所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，或其功能变体。108.如权利要求107所述的方法，其中该adc抗体包含：分别含有seq id no:10和seq id no:11的氨基酸序列的vh链和vl链，或其功能变体。109.如权利要求108所述的方法，其中该adc抗体包含：
含有seq id no:12的氨基酸序列的重链；以及含有seq id no:13的氨基酸序列的轻链。110.如权利要求98-109中任一项所述的方法，其中该adc有效载荷是拓扑异构酶i抑制剂。111.如权利要求98-110中任一项所述的方法，其中该染料是3,3'-二氨基联苯胺(dab)。112.如权利要求98-111中任一项所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌和胃癌。113.如权利要求112所述的方法，其中该癌症患者患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌。114.如权利要求98-113中任一项所述的方法，其中该adc是与药物接头缀合的抗b7h4抗体，其中该药物接头由下式表示：并且其中r
ll
表示与该抗b7h4抗体连接的接头。115.如权利要求98-114中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂选自：
和/或116.如权利要求98-114中任一项所述的方法，其中该adc是与拓扑异构酶抑制剂缀合的抗b7h4抗体，其中该拓扑异构酶抑制剂是：

技术总结
本发明涉及一种用于预测癌症患者将如何对抗体药物缀合物(ADC)疗法作出反应的方法，该方法涉及基于每个癌细胞的单细胞ADC分数来计算预测反应分数。对于每个癌细胞，单细胞ADC分数是基于染料在该癌细胞的膜和细胞质中以及在相邻癌细胞的膜和细胞质中的染色强度计算的。本发明还涉及通过使用统计运算来聚合组织样品的所有单细胞ADC分数而预测癌症患者对ADC疗法的反应，以及随后用相关抗体-药物缀合物治疗癌症。物治疗癌症。物治疗癌症。


技术研发人员：G
受保护的技术使用者：免疫医疗有限公司
技术研发日：2021.09.13
技术公布日：2023/8/21