筛选赤霉病抗侵染小麦的KASP引物组及其应用的制作方法

筛选赤霉病抗侵染小麦的kasp引物组及其应用
技术领域
1.本发明属于小麦分子育种方法技术领域，涉及筛选赤霉病抗侵染小麦的ka sp引物组及其应用。


背景技术：

2.赤霉病(fusarium head blight)是严重危害小麦产量和食用安全的世界性病害，主要由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)等引起。小麦抗赤霉病的表现形式可分为5类：第一类为抗侵染、第二类为抗扩展；第三类为籽粒抗感染、第四类为耐病性、第五类为抗毒素积累。其中第一类和第二类是国内外学者长期以来致力研究的类型小麦。赤霉病抗侵染是宿主抵抗赤霉病菌的第一道屏障，对于赤霉病抗性育种更为重要。除品种本身的抗性外，小麦的农艺性状对赤霉病也具有一定的影响。株高较高，穗部与蕴藏病原菌的土壤表面相距较远，受侵染能力弱。小麦的矮秆基因rht-b1、rht-d1和rht8与赤霉病的抗性的关系报道较多，已有研究表明这3个位点的矮秆等位变异具有显著的提高赤霉病严重度的效应，其他矮秆基因与小麦赤霉病抗性的关系并未被充分研究。在生育期和小麦赤霉病的关系研究上，学者们在一定遗传背景下研究发现小麦生育期相关的基因或者位点对赤霉病抗性有显著性影响(zhu等，2021)。目前关于小麦抗侵染位点(quantitative traits loci，qtl)的报道较少，仅有分别是来自望水白4b染色体上的fhb4(xue等，2010)和5a染色体上的fhb5(xue等，2011)。望水白是一个小麦地方品种，株高偏高、易倒伏，生育期较长，作为抗赤霉病种质使用起来较困难。因此，从农艺性状较好的品种中挖掘出优良的赤霉病抗侵染位点对于抗赤霉病与高产的综合育种十分重要。扬麦4号与扬麦5号曾经是长江中下游麦区的主导品种，产量潜力高，农艺性状优异，赤霉病抗侵染性也很好，偃展1号是黄淮南部小麦品种，弱春性，矮杆大穗，产量高，农艺性状优异，易受赤霉病侵染，因此，利用扬麦4号/偃展1号和扬麦5号/偃展1号两个ril(recombinant inbred lines)群体可以挖掘扬麦4号和扬麦5号的赤霉病抗侵染位点，为小麦抗赤霉病育种提供基因资源。
3.kasp技术基于引物末端碱基的特异匹配和通用荧光探针对snp进行分型检测，荧光定量pcr仪或普通pcr仪结合酶标仪即可完成分型。kasp技术与taqman(检测寡核苷酸的荧光探针法)类似，都是基于终端荧光信号的读取判断，每孔反应都是采用双色荧光检测个snp位点的两种基因型，不同的snp对应着不同的荧光信号。但它不需要每个snp位点都合成特异的荧光引物，所有的位点检测最终都可以使用通用荧光引物进行扩增，这就降低了kasp技术的试剂成本，使其更具实用性。现代小麦中很多农艺性状或者抗病抗逆的相关基因/位点被挖掘或者精细定位后，研究者都会根据位点两侧的紧密连锁标记侧翼序列开发成kasp标记，方便育种家利用(su等，2018；zhang等，2020；胡文静等，2022)。kasp技术具有高通量、检测方便等优势(rasheed等，2019)。用snp芯片进行基因分型，通过qtl定位或gwas分析获得的与目标性状连锁的snp，可被转化成kasp标记，以方便应用于育种。(rasheed等，2019)开发了70个小麦功能基因kasp标记，已得到广泛应用。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中存在的缺陷，提供一种可供分子标记辅助选择赤霉病抗侵染基因型的小麦育种使用的连锁分子标记。本发明利用wheat 55ksnp小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于小麦品种扬麦4号和扬麦5号的与赤霉病抗侵染显著相关的qtl区域qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a，进一步通过筛选附近snp序列的有效性、可靠性，在这两个qtl峰值附近开发了2个kasp标记引物组，用以对赤霉病抗侵染基因型的小麦种质进行高效筛选。
5.第一方面，本发明提供了一种筛选赤霉病抗侵染小麦的kasp引物组，所述kasp引物组为用于检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是tt、还是gg、还是t和g的成套引物x1，和用于检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是tt、还是cc、还是t和c的成套引物x2的组合。
6.进一步地，所述成套引物x1中含有两条上游引物和一条下游引物；
7.所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为t，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为g；
8.所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计，。
9.进一步地，所述成套引物x2中含有两条上游引物和一条下游引物；
10.所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为t，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为c；
11.所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。
12.进一步地，所述成套引物x1由所述上游引物序列seq id no.1、seq id no.2及所述下游引物的序列seq id no.3组成；所述成套引物x2由所述上游引物序列seq id no.5、seq id no.6及所述下游引物的序列seq id no.7组成。
13.本发明第二方面提供了上述的kasp引物组在如下任一中的应用：
14.(a)鉴定或辅助鉴定小麦的赤霉病抗侵染性状；
15.(b)比较待测小麦赤霉病抗侵染能力的强弱；
16.(c)选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
17.(d)选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种；
18.(e)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的赤霉病抗侵染性状的产品；
19.(f)制备用于选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
20.(g)制备用于选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
21.本发明第三方面提供了如下任一方法：
22.方法a：一种比较待测小麦赤霉病抗侵染能力强弱的方法，包括如下步骤(a1)或
(a2)：
23.(a1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；
24.(a2)按照如下确定所述待测小麦赤霉病抗侵染能力强弱：基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是gg且基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是cc的纯合体，所述待测小麦具有赤霉病抗侵染能力强；
25.方法b：一种选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
26.(b1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；
27.(b2)选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c的纯合体的小麦，最终获得赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
28.方法c：一种选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
29.(c1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；
30.(c2)选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体的小麦，最终获得赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种。
31.进一步地，所述(a1)(b1)(c1)
32.具体操作为，
33.采用本发明第一方面所述的kasp引物组对待测小麦基因组dna进行pcr扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体6b上seq id no.4所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类和所述待测小麦基因中染色体3a上seq id no.8所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类；
34.若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g的纯合体，或所述待测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c
的纯合体；
35.若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为红色，则所述待测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体，或所述待测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体。
36.本发明相对于现有技术而言，利用wheat 55ksnp小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于小麦品种扬麦4号和扬麦5号的与赤霉病抗侵染显著相关的qtl区域qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a，进一步通过筛选附近附近snp序列的有效性、可靠性，在这两个qtl峰值附近分别开发了2个kasp标记引物组，用以对赤霉病抗侵染基因型的小麦种质进行高效筛选。本发明为两个赤霉病抗侵染位点qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a在抗赤霉病育种中的有效利用提供了良好工具，这两个kasp标记可快速对小麦赤霉病抗侵染特性进行筛选，为筛选携带抗侵染优异等位变异的小麦材料提供便捷，提高小麦抗赤霉病育种效率。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
38.图1为实施例1中小麦赤霉病抗侵染qtl定位示意图，其中，图1a为6b染色体的部分遗传连锁图谱及qfhi-yaas-y4-6b定位示意图；图1b为3a染色体的部分遗传连锁图谱及qfhi-yaas-y5-3a定位示意图。
39.图2为实施例2中kasp.y4.6b标记和kasp.y5.3a标记应用在小麦自然群体基因型分型结果示意图。图2a为kasp.y4.6b标记在小麦自然群体基因型扩增检测结果；图2b为kasp.y5.3a标记在小麦自然群体基因型扩增检测结果。
具体实施方式
40.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。作为专业性农业研究机构，申请人长期保存有相关种质材料，而且相关小麦品种均是可以市场或者现有种质库中公开获得的。
41.实施例1筛选稳定的与小麦赤霉病抗侵染显著相关的位点
42.本实施例以151份来源于“扬麦4号
×
偃展1号”的重组自交系(f
10
)和143份来源于“扬麦5号
×
偃展1号”的重组自交系(f
10
)为材料，2020年、2021年和2022年连续3个生长季将该重组自交系及其亲本种植于江苏里下河地区万福试验基地赤霉病诱发鉴定大棚。采用随机区组设计，每个系种植2行，每行25粒，行长2m，行距0.20m，两次重复，常规大棚管理，不防治病虫害。田间亲本和家系、品种(系)的赤霉病调查为抗侵染类型。菌株采用f.graminearum的混合菌株(f4、f15、f34和f0609)。将感染赤霉病菌的病麦粒于孕穗期(抽穗前18天)撒到试验田里，每个小麦材料随机挑选生育进程一致的40个穗子进行标记，待小麦开花后10天开始调查每个穗子上受侵染的穗子的病小穗数(至少有一个小穗有病症状)
和总小穗数，每个家系或者品种调查至少30个穗子，病小穗数/总小穗数*100％＝平均病小穗率(percentage of diseased spikelets，简称pds)，以pds作为衡量赤霉病严重程度的指标(lin等，2006；xue等，2011)。
43.用ctab法从新鲜叶片组织中提取基因组dna(doyle等，1987)，利用凝胶电泳检测dna完整性和数量。首先利用在普通小麦中存在的4个主效抗赤霉病基因/qtl相关的pcr标记，包括wgrb619(fhb1)、wmc398和wgrb969(fhb2)、gwm149和gwm513(fhb4)、wmc752和mag9482(fhb5)，在亲本间进行多态性筛选(li等，2019b；zhang等，2021)，结果表明，本研究的亲本材料扬麦4号、扬麦5号和偃展1号均不携带这四种抗病基因/qtl。
44.利用中玉金标记(北京)生物技术有限公司提供的含有53063个snp的小麦55k单核苷酸多态性(snp)阵列对亲本和重组自交系群体进行基因分型。然后，选择与已报道的小麦其他功能基因相关的一共15个kasp和ssr标记，检测多态性(rasheed等，2016；zhang等，2019；xu等，2020；zhu等，2021)。将所有多态snp侧翼序列与国际小麦基因组测序联盟(iwgsc)ensembl plants数据库(http://plants.ensembl.org)中国春参考基因组v2.1(ref v2.1)进行比对，得到其物理位置，并以1e-10的期望值(e)作为显著性阈值。
45.首先对snp芯片结果进行初步质量控制，在icimapping v4.1中，利用“bin”功能可以同时删除缺失率大于20％、最小等位基因频率小于5％的和偏分离(χ2≥33.3％)的snps，删除冗余snps。将所有的多态性标记用于群体基因分型，并且将标记侧翼序列放在国际小麦基因组测序联盟数据库v2.1(international wheat genome sequencing consortium，iwgsc)比对物理位置(ma等，2021)(wheatomics 1.0，http://202.194.139.32/blast/blast.html)。利用“map”功能进行过滤后的标记进行分群(li等，2007；2008；meng等，2015)。在joinmap 4.0软件中使用kosambi映射函数计算每个群体的遗传距离(kosambi等，1944；van等，2006)。利用icimapping v4.1的“bip”功能进行完备区间作图法(icim)算法进行抗赤霉病qtl检测，lod域值被设置为3.0(li等，2021)。使用mapchart v2.32(voorrips，2002)绘制覆盖qtl区域的遗传图谱。位于重叠置信区间内的qtl被认为是相同的。将qtl侧翼标记的物理位置与此前报道的基因/qtl进行比较(http://202.194.139.32/blast/blast.html和http://wheatomics.sdau.edu.cn/genes/)。
46.扬麦4号/偃展1号群体中检测到1个在3年和blue值中稳定存在的抗侵染位点qfhi-yaas-y4-6b，扬麦4号为其提供了降低pds的效应，该位点为表型提供10.67
–
12.99％的贡献率，加性效应6.18
–
8.13(图1，表1)，经过与以往研究比对，这是一个新的小麦赤霉病抗侵染位点。
47.表1扬麦4号/偃展1号的抗侵染qtl定位结果
48.[0049][0050]
注释：
a 2020，2021和2022分别代表2020，2021和2022的扬州赤霉病抗侵染鉴定病圃，blue代表最优线性无偏性值。b代表基于中国春2.1版本的物理位置。c代表极大似然函数的常用对数.d代表表型贡献率。e代表加性效应(负值代表来源于扬麦4号的增加赤霉病抗性的等位基因型，正值代表来源于偃展1号的增加赤霉病抗性的等位基因型)。
[0051]
在扬麦5号/偃展1号群体检测到1个在2年和blue值中稳定存在的抗侵染位点qfhi-yaas-y5-3a，抗性效应来源于扬麦5号，可解释7.49
–
10.56％的表型变异，加性效应3.92
–
6.44(图1，表2)，经过与以往研究比对，这是一个新的小麦赤霉病抗侵染位点。
[0052]
表2扬麦5号/偃展1号的抗侵染qtl
[0053][0054]
注释：
a 2020，2021和2022分别代表2020，2021和2022的扬州赤霉病抗侵染鉴定病圃，blue代表最优线性无偏性值。b代表基于中国春2.1版本的物理位置。c代表极大似然函数的常用对数。d代表表型贡献率。e代表加性效应(负值代表来源于扬麦4号的增加赤霉病抗性的等位基因型，正值代表来源于偃展1号的增加赤霉病抗性的等位基因型)。
[0055]
实施例2明确赤霉病抗侵染qtl与农艺性状的关系
[0056]
利用qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a侧翼标记和株高、抽穗期、穗长、小穗数、小穗密度、穗粒数、千粒重、粒长和粒宽的blue值分析这三个抗侵染qtl对各个农艺性状的影响，结果表明qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a对各个农艺性状均无显著性影响，是两个利用价值较高的赤霉病抗侵染位点(表3)。
[0057]
表3qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a对农艺性状的效应分析(blue值)
[0058][0059]
注释：blue代表最优线性无偏估计值。ns表示与偃展1号的表型相比，差异未达到显著水平。
[0060]
实施例3开发与qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a连锁的kasp标记
[0061]
上述研究结果表明qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a与农艺性状无显著相关性。我们利用小麦参考基因组信息将这两个位点峰值区间的侧翼snp标记ax109922067和ax110621643转化为kasp标记kasp.y4.6b和kasp.y5.3a。kasp.y4.6b和kasp.y5.3a的引物序列如表4。
[0062]
表4kasp.y4.6b和kasp.y5.3a的引物序列
[0063]
[0064][0065]
注释：f1和f2是正向引物，r是反向引物。竞争性引物下面有下划线。
[0066]
kasp引物的制备和pcr反应
[0067]
利用小麦参考基因组信息将有育种价值的赤霉病抗侵染位点峰值区间的侧翼snp转化为kasp标记，引物的设计利用在线软件primer 3.0。根据kasp设计原理每个标记设计2条特异性引物(f1/f2)和一条通用引物(r)，f1尾部添加与fam荧光结合的特异性序列，f2尾部添加与hex荧光结合的特异性序列。引物由北京嘉程生物科技有限公司合成。kasp反应总体系为6μl，包含2
×
kasp master mix 3.5μl、kasp引物混合工作液0.1μl、浓度为20ngμl-1
的模板dna2.4μl。kasp反应程序第一步为94℃，15min；第二步为94℃，25s，61
–
55℃，1min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步为94℃，20s，55℃，45s，共进行29个循环。利用kasp荧光分析仪(lgc公司，pherastar plus)分析kasp分型结果。
[0068]
两套ril群体连同亲本按照如上方法进行kasp.y4.6b和kasp.y5.3a扩增。kasp.y4.6b扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近x轴的位置(蓝色)，与扬麦4号相同，即证明这些小麦在分子标记kasp.y4.6b侧翼核苷酸序列(如seq id no.4)的第36位碱基(snp位点)的基因型为g；而扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在坐标系中靠近y轴的位置(红色)，与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦在该snp位点的基因型为t。材料分型良好，kasp引物组设计成功。
[0069]
kasp.y5.3a扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近x轴的位置(蓝色)，与扬麦5号相同，即证明这些小麦在分子标记kasp.y5.3a侧翼核苷酸序列(如seq id no.4)的第36位碱基(snp位点)的基因型为c；而扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在坐标系中靠近y轴的位置(红
色)，与扬麦5号分型不同，则证明这些小麦在该snp位点的基因型为t。材料分型良好，kasp引物组设计成功。
[0070]
表5携带不同基因型的ril家系的t测验结果
[0071][0072]
注释：a数字后面的不同小写字母表示有极显著差异(p《0.01)；bt值后面的**表示有极显著差异(p《0.01)。
[0073]
表5所示利用excel 2019的双样本t测验，可以看出，kasp.y4.6b基因型是gg的家系比tt的家系pss显著低(降低26.80％)(p《0.01)；kasp.y5.3a基因型是cc的家系比tt的家系pss显著低(降低24.39％)(p《0.01)(统计方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”中公开的内容)。
[0074]
上述两套kasp的引物组及基因型检测体系各自单独应用或者同时应用于小麦赤霉病抗侵染强弱的材料选择中，qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a的效应显著，说明kasp标记开发成功，可进一步用于育种材料检测。
[0075]
实施例4kasp引物组育种应用
[0076]
田间试验：本实施例以211份来源于长江中下游的小麦材料为研究对象，2020年、2021年和2022年连续3个生长季将211份小麦材料种植于江苏里下河地区万福试验基地赤霉病诱发鉴定大棚。采用随机区组设计，每个系种植2行，每行25粒，行长2m，行距0.20m，两次重复，常规大棚管理，不防治病虫害。田间赤霉病调查为抗侵染类型。菌株采用f.graminearum的混合菌株(f4、f15、f34和f0609)。将感染赤霉病菌的病麦粒于孕穗期(抽穗前18天)撒到试验田里，每个小麦材料随机挑选生育进程一致的40个穗子进行标记，待小麦开花后10天开始调查受侵染的穗子的病小穗数(至少有一个小穗有病症状)和总小穗数，每个品种(系)调查至少30个穗子，病小穗数/总小穗数*100％＝平均病小穗率(percentage of diseased spikelets，简称pds)，以pds作为衡量赤霉病严重程度的指标(lin等，2006；xue等，2011)。
[0077]
利用实施例1获得的kasp引物组对211份小麦品种(系)进行基因分型，2020年、2021年和2022年的大田试验赤霉病鉴定结果的平均值以及基因型检测结果如表5和图2所示。kasp.y4.6b扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近x轴的位置(蓝色)，与扬麦4号相同，即证明这些小麦在分子标记kasp.y4.6b侧翼核苷酸序列(如seq id no.4)的第36位碱基(snp位点)的基因型为g，扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在坐标系中靠近y轴的位置(红色)，与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦在该snp位点的基因型为t；kasp.y5.3a扩增产物的荧
光信号数据经kluster caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近x轴的位置(蓝色)，与扬麦5号相同，即证明这些小麦在分子标记kasp.y5.3a侧翼核苷酸序列(如seq id no.4)的第36位碱基(snp位点)的基因型为c；而扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在坐标系中靠近y轴的位置(红色)，与扬麦5号分型不同，则证明这些小麦在该snp位点的基因型为t。
[0078]
表6 211份小麦品种(系)的基因型和平均表型值结果
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084][0085]
表7携带不同基因型的供试品种(系)的t测验结果
[0086][0087]
注释：数字后面的***表示相对于“tt+tt”在p《0.001具有显著差异，**表示相对于“tt+tt”在p《0.01具有显著差异。
[0088]
表6是211份小麦材料的分型和表型结果，表7利用excel 2019的双样本t测验结果表明211份小麦品种(系)中，qfhi-yaas-y4-6b是扬麦4号基因型(gg)和qfhi-yaas-y5-3a是扬麦5号基因型(cc)时，pss最低，相对于qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a都是偃展1号基因型(tt+tt)时，降低29.87％(p《0.001)；当qfhi-yaas-y4-6b是扬麦4号基因型(gg)且qfhi-yaas-y5-3a是偃展1号基因型时，相对于“tt+tt，”品种(系)的pss降低17.11％(p《0.01)；当qfhi-yaas-y4-6b是偃展1号基因型(tt)且qfhi-yaas-y5-3a是扬麦5号基因型(cc)时，相对于“tt+tt，”品种(系)的pss降低18.91％(p《0.001)。说明聚合qfhi-yaas-y4-6b的扬麦4号基因型(gg)和qfhi-yaas-y5-3a的扬麦5号基因型(cc)具有显著加性效应，对于增强赤霉病抗性最有效。上述两套ka sp的引物组及基因型检测体系可以各自单独应用或者同时应用于小麦赤霉病抗侵染种质材料的筛选和分子标记辅助选择育种中。
[0089]
由上述实验结果可以得出：通过本发明的两套kasp引物组对小麦基因组dna进行pcr扩增，可以直接通过kasp分型判断是否携带扬麦4号的赤霉病抗侵染基因型和扬麦5号的抗侵染基因型，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显有效，利用这两套kasp引物组可以大大提高赤霉病抗侵染的小麦的分子标记辅助选择育种工作效率。
[0090]
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

技术特征：
1.一种筛选赤霉病抗侵染小麦的kasp引物组，其特征在于，所述kasp引物组为用于检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是tt、还是gg、还是t和g的成套引物x1，和用于检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是tt、还是cc、还是t和c的成套引物x2的组合。2.根据权利要求1所述的kasp引物组，其特征在于，所述成套引物x1中含有两条上游引物和一条下游引物；所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为t，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为g；所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。3.根据权利要求1所述的kasp引物组，其特征在于，所述成套引物x2中含有两条上游引物和一条下游引物；所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为t，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为c；所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。4.根据权利要求2或3所述的kasp引物组，其特征在于，所述成套引物x1由所述上游引物序列seq id no.1、seq id no.2及所述下游引物的序列seq id no.3组成；所述成套引物x2由所述上游引物序列seq idno.5、seq id no.6及所述下游引物的序列seq id no.7组成。5.权利要求1-4任一项所述的kasp引物组在如下任一中的应用：(a)鉴定或辅助鉴定小麦的赤霉病抗侵染性状；(b)比较待测小麦赤霉病抗侵染能力的强弱；(c)选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；(d)选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种；(e)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的赤霉病抗侵染性状的产品；(f)制备用于选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；(g)制备用于选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的产品。6.如下任一方法：方法a：一种比较待测小麦赤霉病抗侵染能力强弱的方法，包括如下步骤(a1)或(a2)：(a1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；(a2)按照如下确定所述待测小麦赤霉病抗侵染能力强弱：基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是gg且基因组中染色体3a上seq id no.8所示
分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是cc的纯合体，所述待测小麦具有赤霉病抗侵染能力强；方法b：一种选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：(b1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；(b2)选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c的纯合体的小麦，最终获得赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；方法c：一种选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：(c1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；(c2)选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体的小麦，最终获得赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述(a1)(b1)(c1)具体操作为，采用权利要求1-4任一所述的kasp引物组对待测小麦基因组dna进行pcr扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体6b上seq id no.4所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类和所述待测小麦基因中染色体3a上seq idno.8所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g的纯合体，或所述待测小麦基因组中染色体3a上seq idno.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c的纯合体；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为红色，则所述待测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体，或所述待测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体。

技术总结
本发明公开了筛选赤霉病抗侵染小麦的KASP引物组及其应用。本发明利用小麦Wheat55K高通量基因芯片获取基因型数据，在小麦6B和3A染色体上检测到分别来源于扬麦4号和扬麦5号的赤霉病抗侵染位点QFhi-yaas-Y4-6B和QFhi-yaas-Y5-3A，根据它们的紧密连锁标记信息开发了2个KASP标记引物组KASP.Y4.6B和KASP.Y5.3A。通过实验证明本发明所述KASP分子标记KASP.Y4.6B和KASP.Y5.3A可用于赤霉病抗侵染小麦的分子标记辅助选择育种。KASP.Y4.6B和KASP.Y5.3A的开发和利用为小麦赤霉病抗侵染育种提供了有力工具。染育种提供了有力工具。染育种提供了有力工具。


技术研发人员：胡文静 高德荣 吴迪 蒋正宁 张勇 汪尊杰 李东升 程晓明 赵蝶
受保护的技术使用者：江苏里下河地区农业科学研究所
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/8/22