Toll样受体2小分子抑制剂在治疗或预防炎症性肠病中的应用

toll样受体2小分子抑制剂在治疗或预防炎症性肠病中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及toll样受体2小分子抑制剂在制备治疗或预防炎症性肠病的药物中的用途。


背景技术：

2.炎症性肠病(ibd)，包括克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)，是一种慢性、复发性炎症性疾病，发病率在20岁左右达到高峰。由于炎症性肠病病因不明，病程不可预测，这些方面使ibd患者的身心健康受到严重影响，生活质量下降。尽管ibd的病因在很大程度上仍然未知，但它涉及遗传、环境或微生物因素与免疫反应之间的复杂相互作用。免疫学和遗传学的新研究表明，先天免疫反应在诱导肠道炎症中发挥重要作用。
3.先天免疫反应是我们抵御病原体的第一道防线。它是非特异性的，允许身体在几分钟或几小时内对刺激做出快速反应。先天免疫应答由多种不同类型的细胞介导，包括上皮细胞、中性粒细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞。这种形式的免疫是由模式识别受体介导的，包括细胞表面的toll样受体(tlrs)。当tlr与其配体结合后，其胞内区会激活特定的蛋白激酶，如丝裂原活化蛋白激酶(mapk)、抑制性蛋白nf-κb激酶(ikbα)，并活性下游的mapk和nf-κb信号通路，最终导致炎症因子的产生。理论上说，抑制tlr信号通路能通过减少炎症因子的产生发挥抗炎作用。最近的研究发现，介导先天免疫的tlrs蛋白的表达和功能在ibd患者中发生了显著改变。
4.目前，临床上用于治疗炎性肠病的药物主要为胺基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂、tnf-α单抗等。这些药物都存在不同程度的免疫抑制作用和毒副作用，患者治疗期间容易诱发各种感染。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于设计提供了toll样受体2小分子抑制剂在治疗或预防炎症性肠病中的应用。本发明提供的化合物是一类新型toll样受体2(tlr2)抑制剂。这些化合物具有全新的骨架，对于本发明涉及的化合物在制备治疗或预防炎性肠病药物中的用途属于首次公开。
6.炎性肠病是一种免疫异常引起的慢性疾病，免疫细胞异常攻击肠道中正常细胞导致炎症发生。toll样受体是一类与免疫相关的模式识别受体，能调节机体的免疫平衡。本发明tlr2小分子抑制剂通过抑制tlr2，调节肠道中异常激活的免疫反应，减轻炎性肠病的症状。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一方面，本发明提供了一种塔斯品碱衍生化合物，化学结构通式如下式(ⅰ)：
[0009][0010]
其中：当r1选自氢原子时，r2选自二甲胺基、四氢吡咯、哌啶、哌嗪、n-羟乙基哌嗪中的任意一个；当r1选自羰基时，r2选自羟基、二甲胺基、哌啶、环己胺、正丁胺、羟乙基吗啉、苯胺中的任意一个；当r1选自羟基时，r2选自-ch
2-r3，其中r3选自二甲胺基、哌啶、哌嗪、n-羟乙基哌嗪、环己胺中的任意一个。
[0011]
所述的一种塔斯品碱衍生化合物，包括以下化合物1-17中的任意一种：
[0012][0013]
第二方面，本发明提供了所述的塔斯品碱衍生化合物的制备方法，当r1选自氢原子时，包括以下步骤：
[0014]
制备化合物溶于ch2cl2中，加入r2，在常温下反应，采用薄层色谱跟踪反应至结束；加入氰基硼氢化钠，室温搅拌至反应结束；减压除去有机溶剂，残余物用硅胶柱层析分离，得到目标化合物1-5中的一种。
[0015]
所述的一种塔斯品碱衍生化合物的制备方法，当r1选自羟基，r2选自-ch
2-r3时，包括以下步骤：
[0016]
制备化合物溶于ch2cl2中，加入m-cpba，常温反应过夜，薄层色谱跟踪反应至结束；加入1mnaoh水溶液萃取两次，均保留ch2cl2相；减压除去ch2cl2，残余物在乙酸乙酯中重结晶；过滤除去乙酸乙酯，保留滤渣；滤渣溶于ch2cl2和甲醇混合体系中，ch2cl2与甲醇的体积比为4：1，加入三乙胺和r3，45℃搅拌反应，tlc监测反应至完全；减压除去有机溶剂，残余物用硅胶柱层析分离，得到目标化合物6-10中的一种。
[0017]
所述的一种塔斯品碱衍生化合物的制备方法，当r1选自羰基时，包括以下步骤：
[0018]
制备化合物溶于socl2中，加热回流反应，薄层色谱跟踪反应至结束；减压除去socl2，残余物加入ch2cl2溶解；加入三乙胺和r2反应底物；减压除去有机溶剂，残余物用硅胶柱层析分离，得到目标化合物12-17；
[0019]
或者，制备化合物加入二氯甲烷、去离子水和叔丁醇混合体系中，其中二氯甲烷、去离子水与叔丁醇的体积比为3：1：1，常温搅拌，加入nah2po4、naclo2和30％过氧化氢，常温搅拌，薄层色谱跟踪反应至结束，减压除去有机相，过滤，保留滤渣，经硅胶柱层析分离纯化得到目标化合物11。
[0020]
第三方面，本发明提供了所述的塔斯品碱衍生化合物在制备抑制toll样受体2的试剂中的应用。
[0021]
第四方面，本发明提供了所述的塔斯品碱衍生化合物在抑制toll样受体2及其下游myd88、nf-κb和mapk信号通路，减少人源或鼠源免疫细胞产生的炎症因子、减少tlr2激动剂引起的tlr2蛋白的上调中的应用。
[0022]
第五方面，本发明提供了所述的塔斯品碱衍生化合物在制备治疗或预防炎症性肠病的药物中的应用。
[0023]
所述的应用，所述炎症性肠病包括结肠炎。
[0024]
第六方面，本发明提供了一种用于抑制tlr2或者治疗/预防炎症性肠病的药物组合物，包含所述的塔斯品碱衍生化合物或其药物可接受盐；
[0025]
优选，所述药物组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂；
[0026]
优选，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0028]
本发明通过实验验证了化合物1-17对tlr2均有较好的抑制活性，其中化合物6(smu-6)对tlr2抑制活性最好。化合物smu-y6能显著减少人源或鼠源免疫细胞产生的炎症因子。蛋白实验证明smu-y6能抑制tlr2及其下游nf-κb和mapk信号通路。smu-y6在结肠炎模型中能缓解小鼠结肠炎，减少结肠组织中的炎症因子的产生，增加小鼠体重。该发明能够为临床治疗炎性肠病提供良好的候选药物，具有十分良好的应用前景。
附图说明
[0029]
图1为smu-y6对人源或鼠源免疫细胞产生的炎症因子产生影响的检测结果图，其中，a为smu-y6对小鼠原代腹腔巨噬细胞炎症因子tnf-α产生影响的检测结果图，b为smu-y6对小鼠原代腹腔巨噬细胞炎症因子il-6产生影响的检测结果图，c为smu-y6对人单核细胞白血病细胞(thp-1)炎症因子tnf-α产生影响的检测结果图；
[0030]
图2为smu-y6对tlr2蛋白的影响的检测结果图；
[0031]
图3为smu-y6对tlr2/myd88/nf-κb和mapk信号通路的影响的检测结果图；
[0032]
图4为smu-y6对结肠炎影响的检测结果图，其中a为smu-y6对结肠炎小鼠的体重影响的检测结果图；b为smu-y6对小鼠结肠影响的检测结果图，c为smu-y6对小鼠结肠组织中的炎症因子tnf-α和il-6影响的检测结果图。
具体实施方式
[0033]
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
[0034]
实施例1：制备化合物1，即(2-(二甲胺基)乙烷基)-3,8-二甲氧基苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5，10-二酮)
[0035]
步骤1：制备化合物包括以下步骤：
[0036][0037]
步骤2：将化合物(30mg,0.7mmol)加入二氯甲烷(10ml)中，常温搅
拌溶解。将二甲胺的四氢呋喃溶液加入上述体系中，常温搅拌，薄层色谱(tlc)监测反应至完全。加入氰基硼氢化钠，常温搅拌，tlc监测反应至完全。反应结束后，减压除去有机相，残余物经硅胶柱层析分离纯化得到目标化合物1，其结构式为
[0038]
化合物1的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.18(d,j＝8.5hz,1h),7.30(d,j＝8.6hz,1h),7.18(s,1h),4.10(s,6h),3.50(t,2h),2.66(t,2h),2.38(s,6h).esi-hrmsm/z:c
20h20
no6[m+h]
+
370.1276。
[0039]
实施例2：制备化合物2，即3,8-二甲氧基-1-(2-(吡咯烷-1-yl)乙烷基)苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0040]
化合物2的制备方法和化合物1相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为四氢吡咯，得到目标化合物2，其结构式为
[0041]
化合物2的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ9.85(d,j＝8.8hz,1h),9.01(d,j＝8.9hz,1h),8.84(s,1h),5.64(s,3h),5.62(s,3h),5.29(t,j＝8.2hz,4h),4.97(m,2h),4.58(m,j＝12hz,2h)3.57(d,j＝14.4hz,2h)3.46(t,j＝10.6hz2h).esi-hrmsm/z:c
22h22
no6[m+h]
+
396.1411。
[0042]
实施例3：制备化合物3，即3,8-二甲氧基-1-(2-(吡啶-1-yl)乙烷基)苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0043]
化合物3的制备方法和化合物1相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为哌啶，得到目标化合物3，其结构式为
[0044]
化合物3的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ9.90(d,j＝8.2hz,1h),9.04(d,j＝8.2hz,1h),8.86(s,1h),5.67(s,3h),5.65(s,3h),5.30(t,4h),4.99(m,2h),4.60(m,j＝10.8hz,2h),3.61(d,j＝14.1hz,2h),3.58-3.49(m,3h),3.14-3.08(m,1h).esi-hrmsm/z:c
23h24
no6[m+h]
+
410.1583。
[0045]
实施例4：制备化合物4，即3,8-二甲氧基-1-(2-(哌嗪-1-yl)乙烷基)苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0046]
化合物4的制备方法和化合物1相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为哌嗪，得到
化合物4，其结构式为
[0047]
化合物4的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.24(d,j＝8.6hz,1h),7.55(s,1h),7.33(d,j＝8.6hz,1h),4.15(s,3h),4.11(s,3h),3.98-3.90(m,2h),3.67(s,2h),3.29-3.21(m,2h),2.80(s,2h),2.25(s,2h),1.95(m,3h).esi-hrmsm/z:c
22h23
no6[m+h]
+
410.1636。
[0048]
实施例5：制备化合物5，即1-(2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-yl)乙烷基)-3,8-d二甲氧基苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0049]
化合物5的制备方法和化合物1相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为n-羟乙基哌嗪，得到化合物5，其结构式为
[0050]
化合物5的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ＝8.20(d,j＝8.7hz,1h),7.30(d,j＝8.7hz,1h),7.18(s,1h),4.10(s,6h),3.63(t,j＝4.4hz,2h),3.55-3.49(m,2h),2.72-2.56(m,12h).esi-hrmsm/z:c
24h27
n2o7[m+h]
+
455.1801。
[0051]
实施例6：制备化合物6，即1-(3-(二甲胺基)-2-羟丙基)-3,8-二甲氧基苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0052]
步骤1：制备化合物包括以下步骤：
[0053][0054]
步骤2：化合物溶解于二氯甲烷中，加入m-cpba(75％)常温搅拌，tlc监测反应至完全。反应结束后，用1mnaoh溶液萃取有机相两次，保留ch2cl2相，然后减压浓缩除去有机溶剂。残余物使用乙酸乙酯重结晶可得白色固体，该固体不经纯化直接用于下一步反
应。
[0055]
步骤3：上一步反应中得到得粗产物溶解于二氯甲烷：甲醇(4：1)的反应体系中。于上述体系中加入二甲胺和三乙胺，45℃搅拌反应，tlc监测反应至完全。反应结束后，减压除去有机相，残余物经硅胶柱层析法分离纯化得到化合物6，其结构式为
[0056]
化合物6的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ＝9.99(d,j＝8.1hz,1h),9.22(s,1h),9.04(d,j＝8.1hz,1h),8.95(s,1h),6.26(s,1h),5.68(s,6h),5.46(d,j＝13.1hz,1h),5.14(s,2h),4.81(m,1h),4.67(s,3h),4.60(s,3h).esi-hrmsm/z:c
21h22
no7[m+h]
+
400.1391。
[0057]
实施例7：制备化合物7，即1-(2-羟基-3-(哌啶-1-yl)丙基)-3,8-二甲氧基苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0058]
化合物7的制备方法和化合物6相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为哌啶，得到化合物7，其结构式为
[0059]
化合物7的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ＝9.95(d,j＝8.3hz,1h),9.13(d,j＝8.2hz,1h),9.05(s,1h),8.74(s,1h),6.43(s,1h),5.78(s,6h),5.56(d,j＝12.3hz,1h),5.45-5.36(dd,j＝29.6,7.9hz,2h),5.18(d,2h),4.85(d,2h),4.66(s,1h),3.95(s,1h),3.64-3.55(m,5h),3.21(m,1h).esi-hrmsm/z:c
24h26
no7[m+h]
+
440.1694。
[0060]
实施例8：制备化合物8，即1-(2-羟基-3-(哌嗪-1-yl)丙基)-3,8-二甲氧基苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0061]
化合物8的制备方法和化合物6相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为哌嗪，得到化合物8，其结构式为
[0062]
化合物8的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ＝9.88(d,j＝8.1hz,1h),9.03(d,j＝8.0hz,1h),8.92(s,1h),6.39(s,1h),5.75-5.72(m,2h),5.66(s,6h),5.57-5.41(m,8h),5.30(s,2h),4.80(s,1h).esi-hrmsm/z:c
23h25
n2o7[m+h]
+
441.1656。
[0063]
实施例9：制备化合物9，即1-(2-羟基-3-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-yl)丙基)-3,8-二甲氧基苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0064]
化合物9的制备方法和化合物6相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为n-羟乙基哌嗪，得到化合物9，其结构式为
[0065]
化合物9的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ＝9.91(d,j＝8.0hz,1h),9.07(d,j＝8.1hz,1h),8.95(s,1h),6.42(s,1h),5.84-5.79(m,8h),5.71(s,6h),5.57-5.47(m,5h),5.21(s,2h),4.86(s,1h).esi-hrmsm/z:c
25h29
n2o9[m+h]
+
485.1914。
[0066]
实施例10：制备化合物10，即1-(3-(环己胺)-2-羟丙基)-3,8-二甲氧基苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0067]
化合物10的制备方法和化合物6相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为环己胺，得到化合物10，其结构式为
[0068]
化合物10的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,meod)δ＝8.10(d,j＝8.7hz,1h),7.51(d,j＝8.8hz,1h),7.37(s,1h),4.25-4.11(m,j＝11.0,3.8hz,1h),4.12(s,3h),4.11(s,3h),3.75-3.71(dd,j＝12.9,4.1hz,1h),3.28-3.25(dd,1h),3.16-3.10(dd,j＝12.6,9.2,3.9hz,3h),2.18(d,j＝6.0hz,1h),2.09(d,j＝7.5hz,1h),1.88(dd,j＝10.9hz,2h),1.72(d,j＝11.2hz,1h),1.46-1.34(m,4h),1.27-1.21(m,1h).esi-hrmsm/z:c
25h28
no7[m+h]
+
454.1849。
[0069]
实施例11：制备化合物11，即2-(3,8-二甲氧基-5,10-二氧-5,10-二氢苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-1-yl)乙酸
[0070]
将化合物(50mg,0.15mmol)加入二氯甲烷(3ml)，去离子水(1ml)，叔丁醇(1ml)混合体系中，常温搅拌。将nah2po4(11mg,0.07mmol)，naclo2(27mg,0.3mmol)，30％过氧化氢(47μl,0.45mmol)加入上述体系中，常温搅拌反应，tlc监测反应至完全。反应结束后，减压除去有机相，过滤，保留滤渣，经硅胶柱层析分离纯化得到目标化合
物11，其结构式为
[0071]
化合物11的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.05(d,j＝8.7hz,1h),7.56(d,j＝8.7hz,1h),7.54(s,1h),4.15(s,2h),4.05(s,6h).esi-hrmsm/z:c
18h11
o8[m+h]
+
355.0601。
[0072]
实施例12：制备化合物12，即2-(3,8-二甲氧基-5,10-二氧-5,10-二氢苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-1-yl)-n,n-二甲基乙酰胺
[0073]
步骤1：制备化合物包括以下步骤：
[0074][0075]
步骤1.将化合物加入二氯亚砜中，加热回流反应，tlc监测反应至结束。反应结束后减压除去二氯亚砜，所得粗产品不经分离直接用于下一步反应。
[0076]
步骤2.将上述所得的粗产物溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和二甲胺的四氢呋喃溶液在45℃条件下加热反应，tlc监测反应至结束。反应结束后减压除去二氯甲烷，所得残余
物经硅胶柱层析分离纯化得到目标化合物12，其结构式为
[0077]
化合物12的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ＝8.24(d,j＝8.7hz,1h),7.35(d,j＝8.7hz,1h),7.18(s,1h),4.11(s,8h),3.22(s,3h),2.83(s,3h).esi-hrmsm/z:c
20h18
no7[m+na]
+
408.0521。
[0078]
实施例13：制备化合物13，即3,8-二甲氧基-1-(2-氧代-2-(吡啶-1-yl)乙烷基)苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-5,10-二酮
[0079]
化合物13的制备方法和化合物12相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为哌啶，得到化合物13，其结构式为
[0080]
化合物13的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ＝8.22(d,j＝8.4hz,1h),7.33(d,j＝8.4hz,1h),7.10(s,1h),4.47(s,2h),4.09(s,6h),3.49-3.43(d,2h),2.05-2.00(m,2h),1.83-1.67(m,4h),1.46(s,2h).esi-hrmsm/z:c
23h22
no7[m+h]
+
426.1005。
[0081]
实施例14：制备化合物14，即n-环己胺基-2-(3,8-二甲氧基-5,10-二氧-5,10-二氢苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-1-yl)乙酰胺
[0082]
化合物14的制备方法和化合物12相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为环己胺，得到化合物14，其结构式为
[0083]
化合物14的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ＝9.22(d,j＝8.6hz,1h),9.05(d,j＝8.6hz,1h),9.03(s,1h),5.66(d,8h),3.69(d,j＝7.9hz,2h),3.36(d,j＝10.0hz,2h),3.23(d,j＝12.4hz,1h),3.03-2.89(m,j＝11.5,5hz,5h),2,79-2.74(m,1h).esi-hrmsm/z:c
24h24
no7[m+h]
+
438.1544。
[0084]
实施例15：制备化合物15，即2-(3,8-二甲氧基-5,10-二氧-5,10-二氢苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-1-yl)-n-(2-吗啉乙基)乙酰胺
[0085]
化合物15的制备方法和化合物12相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为羟乙基吗
啉，得到化合物15，其结构式为
[0086]
化合物15的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ＝9.97(d,j＝8.5hz,1h),9.13(d,j＝8.5hz,1h),8.95(s,1h),6.11(s,2h),5.97(d,j＝13.3hz,2h),5.77-5.72(m,12h),5.31(s,2h),5.05-5.00(t,j＝11.6hz,2h).esi-hrmsm/z:c
24h25
n2o8[m+h]
+
471.1211。
[0087]
实施例16：制备化合物16，即n-丁基-2-(3,8-二甲氧基-5,10-二氧-5,10-二氢苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-1-yl)乙酰胺
[0088]
化合物16的制备方法和化合物12相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为正丁胺，得到化合物16，其结构式为
[0089]
化合物16的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,cf3cood)δ＝9.97(d,j＝8.7hz,1h),9.12(d,j＝8.7hz,1h),9.10(s,1h),6.17(s,2h),5.73(s,6h),3.16-3.13(m,2h),2.47-2.44(m,j＝6.9hz,3h),2.39-2.35(m,1h).esi-hrmsm/z:c
22h22
no7[m+h]
+
386.0681。
[0090]
实施例17：制备化合物17，即2-(3,8-二甲氧基-5,10-二氧-5,10-二氢苯并吡喃[5,4,3-cde]苯并吡喃-1-yl)-n-苯乙酰胺
[0091]
化合物17的制备方法和化合物12相同，区别仅在于将原料二甲胺替换为苯胺，得到化合物17，其结构式为
[0092]
化合物17的核磁共振氢谱和高分辨质谱结果为：1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ＝11.99(s,1h),8.16(d,j＝8.5hz,1h),7.96(d,j＝7.8hz,2h),7.65(d,j＝8.5hz,1h),7.57(s,1h),7.49-7.46(t,j＝7.5hz,2h),7.31(t,j＝7.2hz,1h).esi-hrmsm/z:c
24h18
no7[m+h]
+
432.1075。
[0093]
实施例18：化合物1-17对tlr2的抑制活性
[0094]
实验中的hekbluetlr2细胞为本科室所有；胎牛血清购自美国gibico公司；细胞培养板购自美国康宁公司；dmem培养基购自美国gibico公司；quanti-blue购自美国invivogen公司；化合物为本科室合成。
[0095]
(1)quanti-blue溶液的配置：按照说明书的使用方法，将quanti-blue粉末溶于
50ml无菌水，常温溶解完全后，分装，置于-20℃冰箱中避光保存。
[0096]
(2)检测方法：1、将hek-bluehtlr2细胞铺于96孔板中，每孔加入100μl的培养基，共4*104个细胞。2、将化合物在培养基中稀释成相应的倍数后，加入100μl含化合物的培养基。3、在细胞孵育箱放置24h后，吸取50μl培养基上清于另一96孔板中，加入配置好的quanti-blue溶液50μl，避光。10-60分钟后，溶液由紫色变为蓝紫色，使用酶标仪进行读数测定，波长为620nm。结果如下表1所示。
[0097]
表1化合物1-17对tlr2的抑制活性
[0098]
化合物ic
50
/μm化合物ic
50
/μm11.42
±
0.33105.92
±
0.6925.83
±
2.1911》10031.70
±
0.1512》10042.55
±
0.0713》10051.44
±
0.2514》10060.11
±
0.0415》10071.34
±
0.1916》10083.05
±
0.1617》10092.30
±
0.07
ꢀꢀ
[0099]
从表1的数据可知，这些化合物对tlr2都存在较好的抑制活性，其中化合物6对tlr2的抑制活性最佳，具有良好的开发潜力。
[0100]
实施例19：化合物6(smu-y6)对炎症因子的抑制活性
[0101]
实验中的腹腔巨噬细胞来源于c57/bl6野生型小鼠；thp-1细胞为本科室所有；胎牛血清购自美国gibico公司；细胞培养板购自美国康宁公司；rpmi1640培养基购自美国gibico公司；tnf-α和il-6试剂盒购买于美国bd公司。
[0102]
(1)试剂配制：
[0103]
1、pbs：氯化钠80g，磷酸二氢钠11.6g，磷酸二氢钾2g，氯化钾2g，将上述试剂置于1l容量瓶中，加入800ml的超纯水，超声溶解后，加入超纯水定容至1l，调节ph至7.0。
[0104]
2、pbst：在上述配置的pbs中加入0.5％的吐温20。
[0105]
3、coatingbuffer：
[0106]
a：0.2m磷酸氢钠溶液(ph＝6.5)：磷酸氢二钠6.25g，磷酸二氢钠7.73g置于500ml容量瓶中，加入400ml超纯水超声溶解。超纯水定容至500ml。
[0107]
b：0.1m碳酸氢钠溶液(ph＝9.5)：碳酸氢钠，碳酸钠3.56g，碳酸钠0.8g置于500ml容量瓶中，加入400ml超纯水超声溶解。超纯水定容至500ml。
[0108]
4、封闭液：将10％fbs(65℃灭活30min)加入上述pbs溶液中。
[0109]
5、终止液：2mh2so4溶液。
[0110]
6、细胞因子标准品曲线建立：将鼠tnf-α(1000pg/ml)、鼠il-6(1000pg/ml)、人tnf-α(500pg/ml)和人il-1β(250pg/ml)母液倍半稀释成不同浓度的标准品。
[0111]
(2)elisa测定
[0112]
1、细胞上清收集：
[0113]
a、将鼠源腹腔巨噬细胞细胞铺在12孔板中，每孔0.5*106个细胞，1mlrpmi1640(含
10％fbs+1％青霉素/链霉素)，于细胞孵育箱中静置过夜。加入500μl含不同浓度的药物和不同tlr配体(tlr2-pam3csk4100ng/ml,tlr3-polyi:c10μg/ml,tlr4-lps100ng/ml,tlr7-r84810μg/ml,tlr9-odn23952mmol/ml)的rpmi1640基础培养基，于细胞孵育箱中静置24小时。收集细胞培养上清，12000rpm离心10分钟后再收集上清用于测试。
[0114]
b、thp-1细胞铺在12孔板中，每孔0.5*106个细胞，1mlrpmi1640(含10％fbs+1％青霉素/链霉素)。加入100nm佛波酯(pma)诱导thp-1细胞分化成巨噬细胞24小时。第二天除去培养基上清，加入pbs润洗细胞3次，加入新鲜的含血清培养基。细胞在孵育箱中静置1天。第三天后除去上清，加入1ml含不同浓度的药物和100ng/mlpam3csk4或lps的rpmi1640基础培养基，于细胞孵育箱中静置24小时。收集细胞培养上清，12000rpm离心10分钟后再收集细胞上清用于测试。
[0115]
2、elisa测试：
[0116]
a、一抗植板：将captureantibody与coatingbuffer按照1：250(体积比)混合均匀，取50μl加入96孔highbinding的elisa板中，于4℃中静置过夜。第二天弃去上清，pbst洗涤3次，最后一次甩干溶液。
[0117]
b、封闭：每孔加入125μl封闭液，室温下静置1小时。静置后，pbst洗涤5次，最后一次甩干溶液。
[0118]
c、上样：每孔加入50μl的待测样品，室温下静置2小时。静置结束后，pbst洗涤5次，最后一次甩干溶液。
[0119]
d、二抗：1)鼠tnf-α、鼠il-6、人tnf-α：按照封闭液：detectionantibody：链霉亲和素-辣根过氧化酶结合物＝250：1：1(体积比)的比列混合均匀后，每孔加入50μl，室温下静置1小时。静置结束后，pbst洗涤7次，最后一次甩干溶液。2)人il-1β：按照封闭液：detectionantibody＝250：1(体积比)的比列混合均匀后，每孔加入50μl，室温下静置1小时。静置结束后，pbst洗涤7次，最后一次甩干溶液。按照封闭液：链霉亲和素-辣根过氧化酶结合物＝250：1(体积比)的比列混合均匀后，每孔加入50μl，室温下静置1小时。静置结束后，pbst洗涤7次，最后一次甩干溶液。
[0120]
e、显色：将四甲基联苯胺与过氧化氢1：1(体积比)混合均匀后，每孔加入50μl，避光室放置。孔内溶液由无色逐渐变为蓝色后，加入终止液。酶标仪在450nm和560nm下测量吸光度，拟合标准曲线，计算样品中因子的含量。
[0121]
如图1所示，化合物smu-y6在人源或鼠源细胞上均能显著抑制tlr2引起的炎症因子的产生。如图1a所示，smu-y6减少小鼠原代腹腔巨噬细胞炎症因子tnf-α的产生；如图1b所示smu-y6减少小鼠原代腹腔巨噬细胞炎症因子il-6的产生；如图1c所示smu-y6减少人单核细胞白血病细胞(thp-1)炎症因子tnf-α的产生。
[0122]
实施例20：smu-y6对tlr2信号通路抑制作用
[0123]
(一)试剂准备
[0124]
1、细胞ripa裂解液：将ripa裂解液与蛋白酶抑制剂混合物、磷酸蛋白酶抑制剂混合物按照100：1：1(体积比)的方式混合均匀，置于冰上备用。
[0125]
2、bca蛋白定量液：将bca试剂盒中的a液与b液按照50：1(体积比)混合均匀。
[0126]
3、蛋白标准曲线制备：将bca试剂盒中的bsa标准溶液(2000μg/ml)倍半稀释成1500μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml各200μl。
[0127]
4、1.5mtrishcl溶液(ph＝8.8)：将24.7g的tris-base溶解于90ml的超纯水中，超纯水定容至100ml。浓hcl调节ph至8.8，常温放置备用。
[0128]
5、10％过硫酸铵(aps)溶液：称量1g的aps，加入9ml的超纯水中溶解后，超纯水定容至10ml，室温放置备用。
[0129]
6、电泳缓冲液：甘氨酸14.4g、tris-base3.03g、十二烷基硫酸钠(sds)1g溶解1于900ml超纯水后，超纯水定容至1l。
[0130]
7、转膜缓冲液：甘氨酸14.4g、tris-base3.03g溶解于700ml超纯水后，超纯水定容至800ml，加入200ml甲醇。
[0131]
8、tbst缓冲液：甘氨酸14.4g、氯化钠8g溶解于900ml的超纯水后，超纯水定容至1l。浓hcl调节ph至7.5-7.6后，加入1ml吐温20。
[0132]
9、封闭液：将1g脱脂奶粉加入20ml的tbst中，使其均匀分散。
[0133]
10、聚丙烯酰胺凝胶制备：将玻璃板固定于制胶器中，检漏。往玻璃板中加入配置好的10％的分离胶(配方表所示)约10ml，随后加入无水乙醇液峰，置于37℃条件下使胶体凝固。分离胶凝固结束后，弃去上层无水乙醇，使用超纯水洗涤分离胶上层，吸水纸除去水。加入浓缩胶(配方如表所示)约1ml，将15孔梳子插入浓缩胶中，常温放置凝固。分离胶与浓缩胶的配置参数如下表2所示。
[0134]
表2分离胶与浓缩胶的配置
[0135]
试剂10％分离胶浓缩胶10％aps112.5μl90μl30％丙烯酰胺7.5ml0.75mltemed11.25μl6μl10％sds225μl65μlh2o9ml3.6ml1.5mtrishcl溶液(ph8.8)5.625ml-1mtrishcl溶液(ph6.8)-1.5ml
[0136]
11、ecl发光液：将a液与b液等体积混合均匀。
[0137]
(二)细胞蛋白提取与样品制备
[0138]
1、细胞蛋白提取：药物处理完细胞后，弃去上清。使用pbs洗涤细胞表面三次，每次1ml。每孔加入100μl的细胞ripa裂解液，在冰上裂解细胞10分钟。收集细胞裂解液，12000rpm离心10分钟，收集上清。
[0139]
2、蛋白浓度定量：取96孔板，取上述所得的细胞裂解液10μl于孔板中，每孔加入200μl的bca蛋白定量液。样品在37℃条件下孵育30分钟，然后在酶标仪560nm下测量吸光度，根据蛋白标准曲线计算样品蛋白浓度。
[0140]
3、上样制备与蛋白变性：根据计算得到的样品蛋白浓度，配置相同浓度相同体积的样品，总蛋白含量为10μg，体积为50μl，多余体积使用细胞裂解液补齐。加入上样缓冲液，95℃加热变性10分钟。
[0141]
(三)sds-page凝胶电泳
[0142]
1、上样：将制得的胶体放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液淹没胶体。将已变性的蛋白样品混匀后，按照顺序加入相同体积至浓缩胶槽孔中。电泳槽外围加入1/2的电泳缓冲液。
[0143]
2、电泳：仪器连接好后，先用80v恒压电泳20分钟。当样品进入到分离胶后，电压改为120v恒压电泳1.5小时。
[0144]
3、转膜：将pvdf膜裁剪到与胶体大小相似，并在甲醇中浸泡3分钟活化。活化后将pvdf膜浸泡在转膜缓冲液中备用。按照滤纸-聚丙烯酰胺凝胶-pvdf膜-滤纸的顺序夹紧并转移至转膜槽中，加入转膜缓冲液至完全浸泡样品。冰浴条件下以恒流300ma转膜75分钟。
[0145]
4、封闭：转膜完成后，取出pvdf膜并浸泡在tbst中，润洗3遍。润洗结束后，加入封闭液封闭1小时。
[0146]
5、一抗：将相应的抗体用一抗稀释液配置完后，将裁剪好的pvdf膜置于一抗溶液中浸泡，4℃摇动孵育过夜。第二天回收抗体后，使用tbst洗涤3次，每次10分钟。
[0147]
6、二抗：根据抗体的稀释倍数，将抗体与封闭液混合均匀后，浸泡相应pvdf条带，室温孵育1小时。弃去二抗，使用tbst润洗条带5次，每次10分钟。
[0148]
7、显影：将洗涤好的pvdf条带与ecl发光液浸泡，取出条带置于曝光机中显影。
[0149]
如图2所示，smu-y6能以浓度依赖的方式显著减少tlr2激动剂pam3csk4引起的tlr2蛋白的上调。如图3所示，smu-y6减少tlr2/myd88复合物的形成，并减少p65、ikkα/β、p38、erk1/2的磷酸化和ikbα的降解，最终抑制nf-κb和mapk信号通路。
[0150]
实施例21：smu-y6体内抗结肠炎试验
[0151]
(一)模型构建
[0152]
取25只体重接近的c57bl/6雄性小鼠，称重，随机平均分为5组，分别为空白组、模型组、5mg/kgsmu-y6组、25mg/kgsmu-y6组、25mg/kg地塞米松组。除了空白对照组外，其余小鼠均给予3.5％葡聚糖硫酸钠(dss)日常饮用水，空白组给予正常饮用水。所有小鼠每天观察生理情况，称重记录。从第二天起，模型组、5mg/kgsmu-y6组、25mg/kgsmu-y6组、25mg/kg地塞米松组分别每天灌胃给予纯净水、5mg/kgsmu-y6水溶液、25mg/kg smu-y6水溶液、25mg/kg地塞米松水溶液。从第五天起，其他组均撤去3.5％葡聚糖硫酸钠(dss)日常饮用水，给予正常的饮用水。第八天，取材，收集小鼠的结肠，血液。
[0153]
(二)结肠组织炎症因子测定
[0154]
取小鼠结肠部分组织，置于离心管中，加入200μlripa细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂混合物)在低温超声破碎机下匀浆组织。样品超声破碎结束后，4℃离心30分钟，12000g。收集离心后的上清，通过bca试剂盒进行蛋白定量，调节使样品蛋白浓度相同。样品用于随后的tnf-α和il-6的elisa测试。
[0155]
如图4所示，smu-y6显著缓解小鼠结肠炎中体重的下降，减轻小鼠结肠损伤。smu-y6可减少小鼠消化道出血现象和结肠组织中炎症因子的释放，减少小鼠结肠组织中的炎症因子tnf-α和il-6的产生。可见，smu-y6在体内可缓解小鼠结肠炎损伤。

技术特征：
1.一种塔斯品碱衍生化合物，其特征在于，化学结构通式如下式(ⅰ)：其中：当r1选自氢原子时，r2选自二甲胺基、四氢吡咯、哌啶、哌嗪、n-羟乙基哌嗪中的任意一个；当r1选自羰基时，r2选自羟基、二甲胺基、哌啶、环己胺、正丁胺、羟乙基吗啉、苯胺中的任意一个；当r1选自羟基时，r2选自-ch
2-r3，其中r3选自二甲胺基、哌啶、哌嗪、n-羟乙基哌嗪、环己胺中的任意一个。2.如权利要求1所述的一种塔斯品碱衍生化合物，其特征在于，包括以下化合物1-17中的任意一种：3.如权利要求1或2所述的一种塔斯品碱衍生化合物的制备方法，其特征在于，当r1选自氢原子时，包括以下步骤：
制备化合物溶于ch2cl2中，加入r2，在常温下反应，采用薄层色谱跟踪反应至结束；加入氰基硼氢化钠，室温搅拌至反应结束；减压除去有机溶剂，残余物用硅胶柱层析分离，得到目标化合物1-5中的一种。4.如权利要求1或2所述的一种塔斯品碱衍生化合物的制备方法，其特征在于，当r1选自羟基，r2选自-ch
2-r3时，包括以下步骤：制备化合物溶于ch2cl2中，加入mcpba，常温搅拌反应过夜，薄层色谱跟踪反应至结束；加入1mnaoh水溶液萃取两次，均保留ch2cl2相；减压除去ch2cl2，残余物在乙酸乙酯中重结晶；过滤除去乙酸乙酯，保留滤渣；滤渣溶于ch2cl2和甲醇混合体系中，ch2cl2与甲醇的体积比为4：1，加入三乙胺和r3，搅拌反应，tlc监测反应至完全；减压除去有机溶剂，残余物用硅胶柱层析分离，得到目标化合物6-10中的一种。5.如权利要求1或2所述的一种塔斯品碱衍生化合物的制备方法，其特征在于，当r1选自羰基时，包括以下步骤：制备化合物溶于socl2中，加热回流反应，薄层色谱跟踪反应至结束；减压除去socl2，残余物加入ch2cl2溶解；加入三乙胺和r2反应底物；减压除去有机溶剂，残余物用硅胶柱层析分离，得到目标化合物12-17；或者，制备化合物加入二氯甲烷、去离子水和叔丁醇混合体系中，其中二氯甲烷、去离子水与叔丁醇的体积比为3：1：1，常温搅拌，加入nah2po4、naclo2和30％过氧化氢，常温搅拌，薄层色谱跟踪反应至结束，减压除去有机相，过滤，保留滤渣，经硅胶柱层析分离纯化得到目标化合物11。6.如权利要求1或2所述的塔斯品碱衍生化合物在制备抑制toll样受体2的试剂中的应用。7.如权利要求1或2所述的塔斯品碱衍生化合物在抑制toll样受体2及其下游myd88、nf-κb和mapk信号通路，减少人源或鼠源免疫细胞产生的炎症因子、减少tlr2激动剂引起的tlr2蛋白的上调中的应用。8.如权利要求1或2所述的塔斯品碱衍生化合物在制备治疗或预防炎症性肠病的药物
中的应用。9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述炎症性肠病包括结肠炎。10.一种用于抑制tlr2或者治疗/预防炎症性肠病的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的塔斯品碱衍生化合物或其药物可接受盐；优选，所述药物组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂；优选，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

技术总结
Toll样受体2小分子抑制剂在治疗或预防炎症性肠病中的应用，属于生物医药技术领域。本发明保护化合物的结构通式如式(Ⅰ)：其中：当R1选自氢原子时，R2选自二甲胺基、四氢吡咯、哌啶、哌嗪、N-羟乙基哌嗪中的任意一个；当R1选自羰基时，R2选自羟基、二甲胺基、哌啶、环己胺、正丁胺、羟乙基吗啉、苯胺中的任意一个；当R1选自羟基时，R2选自-CH


技术研发人员：程魁 杨俊杰 谭丽仪 陈丹蕾
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/8/24