一株解淀粉芽孢杆菌JDF630菌株及其在防治黄栌枯萎病中的应用

一株解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株及其在防治黄栌枯萎病中的应用
1.本技术要求于2022年10月26日提交中国专利局、申请号为202211318266.1、发明名称为“一株解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株及其在防治黄栌枯萎病中的应用”，申请人为河北农业大学的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
2.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株及其在防治黄栌枯萎病中的应用。


背景技术：

3.黄栌(cotinus coggygria)是漆树科(anacardiaceae)黄栌属(cotinus)植物，树冠圆形，高可达3～8m，在秋季温差大于10℃时叶片变红，树姿优美，茎叶都有较高的观赏价值。研究表明大丽轮枝菌(verticillium dahliae)是引起黄栌枯萎病的病原菌，健康黄栌林地受到大丽轮枝菌侵染以后，树木开始出现叶片失水萎蔫症状，严重时甚至整株枯萎最终死亡。
4.目前对于黄栌枯萎病的防治主要集中在化学防治，化学防治的优点是方便、经济、不受季节限制，非常受市场的欢迎，已成为枯萎病防治最常用的手段，但长期使用化学药剂会使病原物产生抗药性，并且会污染土壤、水体，破坏生态平衡，因此化学药剂并不是长久之计。
5.芽孢杆菌属为革兰氏阳性菌，营养需求简单，繁殖速度快，广泛地分布在空气、水体环境、植物以及动物肠道内，与人类生活密切相关，是重要的微生物资源之一。目前研究表明解淀粉芽孢杆菌及其代谢产物可用于防治多种植物病害，如中国专利公开的解淀粉芽孢杆菌ba-ka3就能够抑制多种植物病害，但是并非是任意的解淀粉芽孢杆菌都具有相似的效果，为扩大抑菌的选择，筛选新的微生物是一项极重要的工作。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株及其在防治黄栌枯萎病中的应用，所述菌株发酵后抑菌谱广，可用于绿色防治黄栌枯萎病等多种植物病害。
7.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株，于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25289。
9.该菌株是从健康黄栌根际土壤中分离得到，经形态学、不同管家基因多位点序列分析等方法鉴定为该菌株属于芽孢杆菌属(bacillus sp.)解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)，命名为jdf630。jdf630菌株在lb平板上37℃培养24h，菌落呈米白色，边缘不规则，表面干燥。
10.本发明通过对多种不同植物病原菌的拮抗活性测定表明，jdf630菌株对植物病原
菌禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、色二孢(diplodia seriata)、间座壳属真菌(diaporthe eres)、链格孢菌(alternaria alternata)、葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)以及多隔镰刀菌(fusarium decemcellulare)都具有较强的拮抗活性，抑制率分别为84.3％、73.41％、61.92％、60.69％、57.60％和40.43％。
11.本发明提供所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株和/或其菌液在抑制植物病原菌、在制备植物病原菌抑制剂或防治由植物病原菌引起的植物病害中的应用。
12.特别地，本发明研究表明解淀粉芽孢杆菌jdf630对上述几种植物病原菌都具有较好的抑制效果，那么jdf630菌株对由这几种植物病原菌引起的病害也具有一定的防治效果。
13.本发明提供一种植物病原菌抑制剂，含所述解淀粉要报杆菌jdf630菌株和/或其菌液。
14.本发明提供一种抑制植物病原菌和/或防治农业病害的方法，采用所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株对患病寄主进行处理。
15.优选地，将解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株配制成菌液以后直接灌根处理到患病寄主上。
16.优选地，所述菌液的配制方法为：将jdf630菌株接种于lb培养基中，至于37℃，培养24h，180rpm即得。
17.优选地，所述菌液浓度为1
×
108cfu/ml。
18.本发明具有以下有益效果：
19.本发明提供的jdf630菌株对多种植物病原菌有抑制效果，可以抑制病原菌禾谷镰刀菌、色二孢、间座壳属真菌、链格孢菌、葡萄座腔菌以及多隔镰刀菌；同时还可以抑制大丽轮枝菌对黄栌的侵染，经过jdf630菌株处理后能显著地降低黄栌枯萎病的发病率。因此该菌株可以作为一种环境友好型的绿色药剂替代化学农药用于黄栌枯萎病以及上述病原菌引起的植物病害的防治中，提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。
20.生物保藏信息
21.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)jdf630，于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏编号为cgmcc no.25289，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
22.图1为拮抗菌初筛结果图，图中a为拮抗菌a与大丽轮枝菌对峙培养；b为拮抗菌b与大丽轮枝菌对峙培养；c为拮抗菌c与大丽轮枝菌对峙培养；ck为大丽轮枝菌单独培养；
23.图2为拮抗菌复筛结果图，图中a为大丽轮枝菌在含拮抗菌a无菌滤液培养基上培养；b为大丽轮枝菌在含拮抗菌b无菌滤液培养基上培养；ck为大丽轮枝菌在pda培养基上培养；
24.图3为jdf630菌株在lb培养基上的菌落形态；
25.图4为本发明提供的jdf630菌株的系统发育树；
26.图5为jdf630菌株对植物病原菌的拮抗效果图，图中a、a0表示多隔镰刀菌与解淀
粉芽孢杆菌jdf630对峙培养及其单菌落培养；b、b0表示链格孢菌与解淀粉芽孢杆菌jdf630对峙培养及其单菌落培养；c、c0表示色二孢与解淀粉芽孢杆菌jdf630对峙培养及其单菌落培养；d、d0表示葡萄座腔菌与解淀粉芽孢杆菌jdf630对峙培养及其单菌落培养；e、e0表示禾谷镰刀菌与解淀粉芽孢杆菌jdf630对峙培养及其单菌落培养；f、f0表示间座壳属真菌与解淀粉芽孢杆菌jdf630对峙培养及其单菌落培养；
27.图6为jdf630菌株对黄栌枯萎病的防治效果图，图中a为施用jdf630菌液；ck为对照组；
28.图7为解淀粉芽孢杆菌jdf630单因素筛选结果图，图中a为最优培养基筛选；b为最适温度筛选；c为最适ph筛选；d为最适接种量筛选；不同小写字母表示0.05水平上差异显著。
具体实施方式
29.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
30.除非特别说明，以下实例所用试剂盒材料为市购。
31.lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，灭菌备用。
32.lb液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，灭菌备用。
33.实施例1菌株的筛选分离
34.选取健康黄栌3株，采集根际土，采集前将工具用75％的酒精消毒，用无菌袋收集土壤样品，做好标记。将土壤带回实验室后进行去杂和过筛处理，未处理土样置于冰箱(4℃)中保存。
35.进行拮抗菌分离时首先称5g土与45ml无菌水混合，振荡30分钟，准备4个2ml离心管，将离心管中加入900μl无菌水，吸100μl震荡以后的土壤悬浮液到第1个离心管中，混匀，从第1个离心管里吸100μl液体依次稀释到第4个离心管中，分别得到10-5
g/ml、10-6
g/ml、10-7
g/ml的土壤悬浮液，在对应的稀释梯度土壤悬浮液中吸取100μl到培养皿上，涂布器涂均匀，细菌分离培养采用lb培养基。对分离出的细菌进行分离纯化最后将分离纯化的菌株保存备用。
36.共从健康黄栌根际土壤中分离出细菌138株、真菌96株、放线菌46株。通过平板对峙法初筛，获得3株对大丽轮枝菌有明显拮抗作用的菌株(图1)。菌株a对大丽轮枝菌抑制率为88.63％，菌株b抑制率为88.45％，菌株c抑制率为83.3％(表1)，菌株a与菌株b对大丽轮枝菌抑制率无显著性差异(p《0.05)。
37.表1拮抗菌初筛
[0038][0039]
注：表中数据为平均值
±
标准误，不同小写字母表示0.05水平上差异显著(下同)。
[0040]
选择菌株a、b使用含发酵滤液平板法进行复筛(图2，表2)，试验结果表明，细菌菌株a对大丽轮枝菌拮抗能力最强，抑制率达到86.55％，细菌b抑制率为67.18％。因此细菌a被选用于进一步的研究工作，命名为jdf630。
[0041]
表2拮抗菌复筛
[0042][0043]
注：表中数据为平均值
±
标准误，不同小写字母表示0.05水平上差异显著，*表示0.05水平上差异显著。
[0044]
实施例2菌株的分类鉴定
[0045]
1、形态学鉴定
[0046]
将实施例1得到的菌株置于lb培养基上，37℃倒置培养24h，选择生长出的单菌落进行观察，参照《常见细菌系统鉴定手册》。生长形态如图3所示：菌落呈米白色，边缘不规则，表面干燥，有褶皱。
[0047]
2、不同管家基因多位点序列分析(mlsa)鉴定
[0048]
采用粪便基因dna提取试剂盒(tianamp stool dnakit)对筛选出的拮抗菌株进行dna提取。以glpf、ilvd、pta、purh、pyca、rpod和tpia 7个管家基因的内部片段序列为基础。
[0049]
表3管家基因序列
[0050][0051][0052]
pcr反应体系采用总量50μl，具体用量为：taq酶25μl，模板dna 1μl，正向引物2μl，反向引物2μl，ddh2o 20μl。7个基因扩增采用单循环程序，95℃预变性3min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，最后72℃延伸5min，共40个循环，4℃终止反应。
[0053]
将获得的dna序列进行blast分析，结果显示与该菌株序列相近的多为芽孢杆菌属。利用phylosuite软件将获得的序列串联为一个菌株的序列，利用mega软件构建基于临域连接的系统发育树，确定菌种的分类地位，jdf630菌株与解淀粉芽孢杆菌同源性最高(图4)。
[0054]
根据上述形态学鉴定以及mlsa鉴定结果确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株，该菌株于于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.25289。
[0055]
实施例3菌株的广谱抑菌性
[0056]
1、jdf630菌株对植物病原菌的拮抗活性测定
[0057]
供试链格孢菌(alternaria alternata)分离于感病侧柏病枝、多隔镰刀菌(fusarium decemcellulare)、色二孢(diplodia seriata)、间座壳属真菌(diaporthe eres)均分离于白蜡树韧皮部、葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)分离于感病富士苹果树树干、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)分离于染病小麦穗部，以上病原菌均保存在4℃冰箱中，由河北农业大学林木病理实验室提供。
[0058]
将供试植物病原菌菌转接到pda平板上进行活化培养，5d以后用打孔器(直径6mm)在菌落边缘打孔并分别接种在pda培养基中间，在距离平板中心2.5cm位置，点接过夜培养
的jdf630菌液(上下左右4个方向)，以不接jdf630菌株作为对照。每种处理3个重复，倒置于25℃、黑暗恒温培养箱中。7d以后测量病原菌菌落直径，计算抑菌率。
[0059]
抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径
×
100，结果如图5所示，表明解淀粉芽孢杆菌jdf630与6种病原菌对峙培养处均出现明显的隔离带，处于对峙培养的禾谷镰刀菌以及间座壳属真菌的菌落(图5中f，f0)已经基本停止生长。从抑制效果来看，解淀粉芽孢杆菌jdf630对禾谷镰刀菌抑制作用最好，抑制率为84.3％(图5中e，e0)；其次是色二孢，抑制率为74.31％(图5中c，c0)；对间座壳属真菌抑制率为61.92％(图5中f，f0)；对链格孢菌抑制率为60.69％(图5中b，b0)；对葡萄座腔菌抑制率为57.6％(图5中d，d0)；对多隔镰刀菌抑制率为40.43％(图5中a，a0)。
[0060]
表4解淀粉芽孢杆菌jdf630对6种植物病原菌的抑制作用
[0061][0062]
实施例4jdf630菌株对黄栌枯萎病的防治
[0063]
1、盆栽苗防治试验
[0064]
将大丽轮枝菌打6mm菌碟接种至pda培养基上，25℃恒温培养箱培养5-6天，待菌落长满全板以后，从菌落边缘挑取菌饼，接种于含有300ml pda液体培养基的锥形瓶中，摇床条件设置为28℃，180r/min，黑暗培养5d，将大丽轮枝菌培养液经4层纱布过滤掉菌丝，最终将培养液的孢子浓度稀释至1
×
108cfu/ml备用。
[0065]
将菌株jdf630划线于lb固体平板上，37℃，黑暗培养箱中培养24h，待长出单独菌落以后，用灭菌挑针挑取单菌落接种于含有300ml lb液体培养基的锥形瓶中，摇床条件设置为37℃，180r/min，黑暗培养24h，将菌体浓度稀释至1
×
108cfu/ml，备用。
[0066]
选择60盆生长状况一致的健康黄栌植株，采用伤根法接入黄栌枯萎病原菌，用长15cm左右的小刀在植株周围的土中穿刺，深度约为10cm，以造成伤根，每盆用相同大丽轮枝菌的培养液(1
×
108cfu/ml)400ml灌根，7d时选择其中30盆施用400ml拮抗菌培养液(1
×
108cfu/ml)灌根，30盆施用清水400ml作为对照，调查黄栌发病率和病情指数，计算防治效果。
[0067]
发病率(％)＝发病株数/调查总株数
×
100
[0068]
病情指数＝σ(各级病株数
×
各级代表值)/总株数
×
最高级代表值
[0069]
防治效果(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100
[0070]
表5盆栽苗黄栌枯萎病分级标准
[0071][0072]
结果如图6所示，解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株，该菌株具有广谱抑菌性，对jdf630菌株对植物病原菌禾谷镰刀菌、色二孢、间座壳属真菌、链格孢菌、葡萄座腔菌以及多隔镰刀菌都具有较强的拮抗活性，抑制率分别为84.3％、73.41％、61.92％、60.69％、57.60％和40.43％。而解淀粉芽孢杆菌jdf630还可以有效的抑制大丽轮枝菌对黄栌的侵染。黄栌枯萎病在发病时发病时叶片变黄，大部分叶片会掉落，少数叶片留在树上也会变为焦枯状，表明该试验中大丽轮枝菌可以成功地侵染黄栌，而施用jdf630菌液的植株虽然也有叶片变黄的现象但明显优于对照组，表明jdf630菌液可以有效的抑制大丽轮枝菌对黄栌的侵染，降低黄栌枯萎病的发生。
[0073]
表6黄栌枯萎病盆栽苗防治效果调查
[0074][0075]
注：*表示0.05水平上差异显著(下同)。
[0076]
2、田间防治试验
[0077]
2022年5月以树龄树势和发病情况一致的黄栌树(地径》10cm)为对象，选择5棵树用30l拮抗菌(1
×
108cfu/ml)进行灌根处理，5棵用清水30l进行处理。对树木的东、南、西、北四个方向分别选取一米长的分枝，测量分枝上的新生枝条数量、新生枝条长度、以及树木的地径。同年8月、9月再次对以上指标进行测量，计算地径增长量、新生枝条长度增长量以及新生枝条数量增长量，并对不同方向分枝上新生枝条的发病情况进行调查，计算发病率，病情指数和防治效果。计算方式同上。
[0078]
田间调查表明(表7)，施用拮抗菌jdf630以后，黄栌树的地径增长量为0.72cm，对照0.39cm，为新生枝条长度增长量为9.26cm，对照为3.18cm，新生枝条数量增长量为37，对照为17，均显著高于对照组(p《0.05)，且田间防治效果达到了66.25％。
[0079]
表7黄栌枯萎病田间防治效果调查
[0080][0081]
实施例5拮抗菌发酵条件优化
[0082]
1、种子液制备
[0083]
将分离纯化好的拮抗菌用灭菌挑针挑取单菌落，接入lb培养基中，设置摇床条件为37℃、180r/min黑暗条件下培养24h，用分光光度计测定od
600
，作为种子液备用。
[0084]
2、发酵条件单因素筛选
[0085]
将lb培养基、pdb培养基、ypg培养基、tsa培养基、na培养基、可溶性淀粉培养基分别装入300ml锥形瓶中，每瓶装液量为200ml。3瓶用于接种拮抗菌，接种量为1％，3瓶用于对照，不接入拮抗菌。培养液置于摇床37℃，180r/min黑暗条件下培养24h，用可见光分光光度计测定od
600
，以确定最优培养基。
[0086]
最优培养基接入种子液，接种量为1％，摇床转速设置为180r/min黑暗条件下培养，培养温度分别设置为28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃。培养24h后测定菌液od600，确定最优发酵温度。每处理水平重复3次。
[0087]
设置不同ph为：5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，其他条件不变，每种处理3个重复，24h以后测量od
600
，确定最优ph。
[0088]
设置不同接种量为1％、5％、10％、15％、20％、25％，摇床转速设置为180r/min黑暗条件下培养，每种处理3个重复，24h以后测量od
600
，确定最优接种量。
[0089]
单因素筛选结果如图7所示，解淀粉芽孢杆菌jdf630在6种供试培养基生长情况显著不同(p＜0.05)。其中lb为最适培养基，发酵液od
600
吸光度最大；其次是pdb培养基。解淀粉芽孢杆菌jdf630在可溶性淀粉培养基中生长情况最差。37℃和40℃为jdf630最适培养温度，28℃时菌株jdf630发酵效果最差。ph对解淀粉芽孢杆菌jdf60发酵的影响为先上升后下降的趋势，其中ph为6时，发酵液的od
600
吸光值达到最大，ph为5时最不利于菌株的生长；不同接种量对解淀粉芽孢杆菌jdf630发酵的影响亦不相同，其中当接种量达到10％时，od
600
最高，随着接种量再增大，发酵液的吸光度开始变小，接种量为25％时od
600
最低，因此最优的接种量为10％。
[0090]
3、发酵条件正交试验设计
[0091]
根据单因素试验筛选结果，将温度、ph、接种量3个影响发酵的因素进行正交试验设计，每个因素选择3个水平，利用spss生成3因素3水平正交试验表，每种处理3个重复，摇床转速设置为180r/min黑暗条件下培养，24h以后测量od
600
值与含菌量，确定最终的发酵条件。
[0092]
正交试验结果如表8所示，温度为37℃、接种量为10％、ph为5.5时，解淀粉芽孢杆菌jdf630发酵液吸光值最大，为2.04，浓度为4.65
×
10
10
cfu/ml。
[0093]
表8正交试验设计结果
[0094][0095]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)jdf630菌株，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株的保藏编号为cgmccno.25289。2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株接种到液体培养基中进行暗培养，得发酵液；所述液体培养基为pda或lb。3.根据权利要求2所述发酵方法，其特征在于，所述接种量为1～20％；所述暗培养时，ph值为5.5～7.5，温度为34～40℃。4.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株和/或发酵液在抑制植物病原菌或制备植物病原菌抑制剂中的应用。5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株和/或发酵液在防治由植物病原菌引起的农业病害中的应用。6.根据权利4或5所述应用，其特征在于，所述植物病原菌包括以下菌种中的至少一种：大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、色二孢(diplodiaseriata)、间座壳属真菌(diaportheeres)、链格孢菌(alternariaalternata)、葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)和多隔镰刀菌(fusariumdecemcellulare)。7.一种植物病原菌的抑制剂，其特征在于，含权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株和/或发酵液。8.一种抑制植物病原菌和/或防治所述植物病原菌引发病害的方法，其特征在于，包括采用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌jdf630菌株和/或发酵液对患病寄主进行处理。9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述处理包括灌根。10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述病害包括枯萎病。

技术总结
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌JDF630菌株及其在防治黄栌枯萎病中的应用，属于微生物技术领域。本发明所述解淀粉芽孢杆菌JDF630菌株于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.25289。本发明研究表明JDF630菌株对多种植物病原菌具有广谱抑菌性，经过JDF630处理后能显著地降低黄栌枯萎病原菌对黄栌的危害，为植物病原菌的防治提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。具有很好的生物防治效果。具有很好的生物防治效果。


技术研发人员：李会平 史丹阳 朱会营 苏筱雨 王华玲 曾健勇 王世娴 史昊东
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/8/24