一种纳米荧光温度指示剂及其制备方法和应用

1.本发明属于高分子材料和生物医学工程技术领域，具体涉及一种纳米荧光温度指示剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前，对生物体的温度和温度场分布进行无损检测与监控是临床热疗研究的难点。传统的测温方式以热电耦、热敏电阻、光纤温度传感器等类型为主，其优点在于技术成熟且测温精确，但是上述测温方式属于有损测温，不仅测温时需要表面组织，并且其只能反应测温点的温度，无法全面反馈热疗目标区域温度的变化情况和温度场的分布情况。基于临床热疗对无损测温的需求，目前临床上最常采用的无损测温方式是红外成像测温。红外成像测温可以较为全面地反馈热疗目标区域温度的变化情况和温度场的分布情况，但是容易受被测体自身温度和环境温度的影响，因此测温的精准度较差。
3.为了解决上述问题，现有研究已经开发出多种可利用荧光变化测温的纳米温度计用于无损测温，包括量子点、稀土金属纳米颗粒、温敏荧光纳米凝胶等。这些纳米温度计通过构建荧光信号与温度间的相关性，例如与温度变化相关的荧光发射波长的强弱变化或者荧光发射波长的移动(红移或者蓝移)，来反映温度的高度和温度的分布。通过高精度检测设备对荧光信号的识别，这种纳米温度计可以实现对温度的高灵敏无损测量。但是上述纳米温度计不适用于肿瘤温和热疗的测温和监控。
4.由于临床肿瘤热疗的温度监控还有一定的特殊性，即热疗温度在一定的范围内(40℃～46℃之间)即可视为有效，低于该温度则视为无效，而高于该温度范围则被认为是过热，可能会引起其他严重的副作用。因此，临床肿瘤热疗的温度高低和温度场分布的监控不只是单一的温度测量，更重要是要实现对无效热疗(＜40℃)、有效热疗(40℃～46℃)和过高热(＞46℃)进行有效区分，而现有的测温技术不能满足上述需求。因此，需要构建一种能够满足临床热疗温度需求，实现实时监控热疗过程中温度的变化和温度场的分布的温度指示剂。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种纳米荧光温度指示剂及其制备方法和应用。本发明基于两嵌段双温敏荧光聚合物构成了纳米荧光温度指示剂，所述纳米荧光温度指示剂包括末端修饰了极性响应性荧光分子并且低临界溶解温度在40℃的温敏荧光聚合物a和末端修饰了可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子并且低临界溶解温度在46℃温敏荧光聚合物b；所述纳米荧光温度指示剂在所处环境温度低于40℃时无荧光，当温度升高到40℃～46℃时呈现绿色荧光，当温度高于46℃时呈现红色荧光；所述纳米荧光温度指示剂在细胞或亚细胞的温度探测以及局部热疗的实时测温和温度控制中具有很好的应用。
6.为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术手段：
7.本发明首先提供了一种纳米荧光温度指示剂，所述纳米荧光温度指示剂为温敏荧光聚合物a和经过马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b偶联得到的两嵌段双温敏荧光聚合物；
8.所述温敏荧光聚合物a由末端为羧基且低临界溶解温度为40℃的温敏聚合物与羟基修饰的极性响应性荧光分子构成；
9.所述温敏荧光聚合物b由末端为羧基且低临界溶解温度为46℃的温敏聚合物与马来酰亚胺修饰的可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子构成。
10.优选地，在400nm～450nm激发波下，当环境温度低于40℃时，所述纳米荧光温度指示剂呈现激发波的紫色；
11.当环境温度在40℃～46℃时，纳米荧光温度指示剂呈现绿色的发射光；
12.当环境温度在高于46℃时，纳米荧光温度指示剂呈现红色的发射光。
13.优选地，所述经羟基修饰的极性响应性荧光分子包括硝基苯并呋喃羟基衍生物(nbd-oh)、n,n-二甲氨基磺酰基苯并呋喃羟基衍生物(dbd-oh)、1-苯胺-8-萘磺酸羟基衍生物(ans-oh)、氨基磺酰基苯并呋喃羟基衍生物(abd-oh)或4-n,n-二甲氨基-1,8-萘酰亚胺羟基衍生物(4-dmn-oh)。
14.优选地，经马来酰亚胺修饰的可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子包括磺化罗丹明b马来酰亚胺衍生物(sulfo-rhb-mal)、德州红马来酰亚胺衍生物(texas red maleimide)、花青素磺化cy3马来酰亚胺衍生物(sulfo-cy3-mal)或花青素磺化cy3.5马来酰亚胺衍生物(sulfo-cy3.5-mal)。
15.本发明还提供了上述纳米荧光温度指示剂的制备方法，具体包括如下步骤：
16.(1)温敏荧光聚合物a的制备：
17.将含有羧基的链转移剂通过可逆加成-断裂链转移(raft)聚合反应制备低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物a；通过酯化反应，将经羟基修饰的极性响应性荧光分子偶联在温敏聚合物a的羧基端，得到温敏荧光聚合物a。
18.具体制备步骤为：含有羧基的链转移剂、温敏单体、调节单体加入反应溶剂中，室温下搅拌溶解，然后将空气置换成氩气，保证在无氧条件下升温到60℃～80℃进行可逆加成-断裂链转移(raft)聚合反应，反应结束后得到低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物a；
19.将温敏聚合物a与经羟基修饰的极性响应性荧光分子溶于无水溶剂中进行酯化反应，反应结束后得到温敏荧光聚合物a。
20.(2)温敏荧光聚合物b的制备：
21.选择含有羧基的链转移剂，然后利用可逆加成-断裂链转移(raft)聚合反应制备低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物b；所述温敏聚合物b的两个末端分别为羧基和硫代酯；
22.通过点击化学，将温敏聚合物b末端的硫代酯与经马来酰亚胺修饰的可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子偶联，得到温敏荧光聚合物b。
23.具体制备步骤为：所温敏荧光聚合物b的制备方法包括：在溶剂中加入含有羧基的链转移剂、温敏单体、调节单体，室温下搅拌溶解，按照温敏聚合物a的除氧方式除氧后升温到60℃～80℃进行可逆加成-断裂链转移(raft)聚合反应，反应结束后得到低临界溶解温度在46℃且末端分别为羧基和硫代酯的温敏聚合物b；
(2-氨乙基)马来酰亚胺或n-(4-氨苯基)马来酰亚胺；
46.含有氨基的马来酰亚胺和温敏荧光聚合物b的质量比为1：1～50：1；
47.所述酰胺化反应的条件为室温下反应1～72小时。
48.优选地，步骤(4)中，温敏荧光聚合物a和马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b的用量比为1：2～1：200；
49.反应条件为无氧条件，在室温下搅拌反应12～168小时，然后采用截留分子量500000～1000000的透析袋在42～44℃条件下透析，除去过量的马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b。
50.本发明还提供了上述纳米荧光温度指示剂在细胞或亚细胞的温度探测中的应用。
51.本发明还提供了上述纳米荧光温度指示剂在局部热疗的实时测温和温度控制中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
52.相比使用单一荧光染料，本发明采用两种不同的有机荧光染料，可以充分利用极性响应型的荧光染料性质，还可以利用两种染料之间的fret效应，从而实现多种荧光变化。相比于现有的温敏聚合物，本发明采用具有两个不同相变点的两嵌段温敏聚合物，从而实现一条聚合物链可以表征两个温度段的变化。本发明所述纳米荧光温度指示剂将不同的温敏嵌段与不同荧光激活机制的荧光染料结合，这样单一的两嵌段温敏聚合物就可以将不同的相变温度与极性荧光响应和极性荧光串联fret的荧光响应行为分别串联，从而实现不同温度段的荧光发射波长和荧光发射强度的变化，即直观观察中荧光颜色的变化，从而可以达到监测不同温度区间的目的。
53.本发明所述纳米荧光温度指示剂的激发波长在400nm～450nm，当纳米荧光温度指示剂所处环境温度低于40℃时，经400nm～450nm激发波激发，纳米荧光温度指示剂呈现激发波的紫色，当纳米荧光温度指示剂所处环境温度在40℃～46℃时，经400nm～450nm激发波激发，纳米荧光温度指示剂呈现绿色的发射光，当纳米荧光温度指示剂所处环境温度在高于46℃时，经400nm～450nm激发波激发，纳米荧光温度指示剂呈现红色的发射光。因此，可以用作纳米荧光温度计对细胞或者亚细胞温度探测拓展到局部热疗的实时测温和温度控制，在提高肿瘤局部热疗的疗效的同时避免高热而带来的不良反应以及对人体的伤害。
54.本发明所述纳米荧光温度指示剂制备方法简单，不需要特殊的设备，在常温常压下操作，可控性强，重复性好。
附图说明
55.图1为实施例1制备的纳米荧光温度指示剂的结构及作用示意图。
56.图2为实施例2制备的温敏荧光聚合物a和温敏荧光聚合物b的激发光谱与发射光谱。
57.图3为实施例3制备的温敏荧光聚合物a、温敏荧光聚合物b以及两嵌段双温敏荧光聚合物的透过率随温度变化图。
58.图4为实施例4制备的纳米荧光温度指示剂在紫外灯照射下不同温度情况下的照片。
具体实施方式
59.下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
60.实施例1：纳米荧光温度指示剂的制备
61.(1)温敏荧光聚合物a的制备：
62.本反应先以3-苯甲巯基硫代羰基丙酸为链转移剂，n-异丙基丙烯酰胺(nipam)为温敏单体，n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam)为调节单体，制备低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物p(nipam-co-dmam)。具体步骤为：
63.在以二甲亚砜为反应介质，按照摩尔比为1：300：60，加入3-苯甲巯基硫代羰基丙酸(1mmol)、n-异丙基丙烯酰胺(nipam，300mmol)、n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam，60mmol)，经抽真空/氩气置换3次后，在氩气保护下，60℃反应12小时，得到低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物p(nipam-co-dmam)，分子量为20800，分子量分布为1.02。
64.将硝基苯并呋喃羟基衍生物(nbd-oh)与p(nipam-co-dmam)按照100:1的摩尔比加入到无水二甲亚砜中，在50℃且无水条件下搅拌2小时，得到温敏荧光聚合物a，记为nbd-p(nipam-co-dmam)。
65.(2)温敏荧光聚合物b的制备：
66.本反应以2-(乙巯基硫代甲酰硫基)-2-甲基丙酸为链转移剂，n-异丙基甲基丙烯酰胺(nipmam)为温敏单体，制备低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物pnipmam。具体步骤为：
67.二氧六环为反应溶剂，按照摩尔比为1：1200，加入2-(乙巯基硫代甲酰硫基)-2-甲基丙酸(0.5mmol)、n-异丙基甲基丙烯酰胺(nipmam，600mmol)，通入高纯氩气30分钟后，在氩气保护下，升温至80℃，反应12小时，得到低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物pnipmam，分子量为61000，分子量分布为1.04。
68.将磺化罗丹明b马来酰亚胺衍生物(sulfo-rhb-mal)与pnipmam按照摩尔比1：1的加入到n,n-二甲基甲酰胺中，经抽真空/氩气置换3次后，在氩气保护下搅拌反应72小时，得到温敏荧光聚合物b，记为pnipmam-sulfo-rhb。
69.(3)马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b的制备：
70.以二甲基亚砜为反应介质，n-(2-氨基丙基)马来酰亚胺：温敏荧光聚合物b按照摩尔比为1：1进行该反应。反应条件为室温、反应时间为70小时，得到马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b，记为mal-pnipmam-sulfo-rhb。
71.(4)纳米荧光温度指示剂的制备：
72.nbd-p(nipam-co-dmam)：mal-pnipmam-sulfo-rhb按照摩尔比1：2，加入二氧六环中，通入高纯氩气除氧30分钟，然后在氩气保护下，在室温反应160小时，然后采用截留分子量500000的透析袋在42℃条件下透析，得到两嵌段双温敏荧光聚合物，即所述纳米荧光温度指示剂，记为nbd-p(nipam-co-dmam)-b-pnipmam-sulfo-rhb。
73.图1为本实施例制备的纳米荧光温度指示剂的结构及作用示意图，从图中可以看出，当温度低于40℃时，纳米荧光温度指示剂无规则分散在水中，此时用400nm～450nm激发波激发时呈激发波的紫色；当温度升高至40℃时，纳米荧光温度指示剂呈两亲性，极性响应性荧光分子位于疏水内核，此时用400nm～450nm激发波激发时呈现绿色；当温度升高至46
℃以上时，纳米荧光温度指示剂完全形成胶束，此时用400nm～450nm激发波激发时呈现红色。
74.本实施例中还考察了上述制备得到的纳米荧光温度指示剂对热疗温度段的分段指示，具体考察步骤如下所示：
75.将上述纳米荧光温度指示剂分散在水中使得浓度为5mg/ml，然后从36℃开始升温，每隔1℃在410nm激发波长下观察纳米荧光温度指示剂水溶液的颜色。在环境温度低于40℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现激发波的紫色，当环境温度在40℃～45℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现绿色，当环境温度在达到或者高于46℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现红色。这说明制备的纳米荧光温度指示剂可以实现对热疗温度段的分段指示。
76.实施例2：纳米荧光温度指示剂的制备
77.(1)温敏荧光聚合物a的制备：
78.本反应先以2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸为链转移剂，n-正丙基丙烯酰胺(nnpam)为温敏单体，n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam)为调节单体，制备低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物p(nnpam-co-dmam)。具体步骤为：
79.在以二甲亚砜为反应介质，按照摩尔比为1：1000：500，加入2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(1mmol)、n-正丙基丙烯酰胺(nnpam，1000mmol)、n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam，500mmol)，经抽真空/氩气置换3次后，在氩气保护下，70℃反应24小时，得到低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物p(nnpam-co-dmam)，分子量为49500，分子量分布为1.19。
80.将n,n-二甲氨基磺酰基苯并呋喃羟基衍生物(dbd-oh)与p(nnpam-co-dmam)按照70：1的摩尔比加入到无水二甲亚砜中，在20℃下强烈搅拌20小时，得到温敏荧光聚合物a，记为dbd-p(nnpam-co-dmam)。
81.(2)温敏荧光聚合物b的制备：
82.本反应以4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸为链转移剂，n-异丙基丙烯酰胺(nipam)为温敏单体，n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam)为调节单体，制备低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物p(nipam-co-dmam)。具体步骤为：
83.二氧六环为反应溶剂，按照摩尔比为1：2500：1000，加入4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸(0.5mmol)、n-异丙基丙烯酰胺(nipam，1250mmol)、n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam，500mmol)，通入高纯氩气40分钟后，在氩气保护下，升温至70℃，反应28小时，得到低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物p(nipam-co-dmam)，分子量为99800，分子量分布为1.2。
84.然后将德州红马来酰亚胺衍生物(texas red maleimide)与p(nipam-co-dmam)按照1：50的摩尔比加入到n,n-二甲基甲酰胺中，经抽真空/氩气置换3次后，在氩气保护下搅拌反应34小时，得到温敏荧光聚合物b，记为p(nipam-co-dmam)-tr。
85.(3)马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b的制备：
86.以二甲基亚砜为反应介质，n-(2-氨乙基)马来酰亚胺：温敏荧光聚合物b按照摩尔比为20：1进行该反应。反应条件为室温、反应时间为50小时，得到马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b，记为mal-p(nipam-co-dmam)-tr。
87.(4)纳米荧光温度指示剂的制备：
88.dbd-p(nnpam-co-dmam)：mal-p(nipam-co-dmam)-tr按照摩尔比1：50，加入二氧六环中，通入高纯氩气除氧35分钟，然后在氩气保护下，在室温反应100小时，然后采用截留分子量1000000的透析袋在42℃条件下透析，得到两嵌段双温敏荧光聚合物，即所述纳米荧光温度指示剂，记为dbd-p(nnpam-co-dmam)-b-p(nipam-co-dmam)-tr。
89.图2为本实施例中温敏荧光聚合物a和温敏荧光聚合物b的激发光谱与发射光谱，从图中可以看出，400nm～450nm的激发波可以激发温敏荧光聚合物a，而不能激发温敏荧光聚合物b；温敏荧光聚合物a的发射光谱与温敏荧光聚合物b的激发光谱有较多的重叠，二者之间可以发生荧光共振能量转移。本实施例中还考察了上述制备得到的纳米荧光温度指示剂对热疗温度段的分段指示，具体考察步骤如下所示：
90.将上述纳米荧光温度指示剂分散在水中使得浓度为5mg/ml，然后从36℃开始升温，每隔1℃在410nm激发波长下观察纳米荧光温度指示剂水溶液的颜色。在环境温度低于40℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现激发波的紫色，当环境温度在40℃～45℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现绿色，当环境温度在达到或者高于46℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现红色。这说明制备的纳米荧光温度指示剂可以实现对热疗温度段的分段指示。
91.实施例3：纳米荧光温度指示剂的制备
92.(1)温敏荧光聚合物a的制备：
93.本反应先以s-(硫代苯甲酰基)硫代乙酸为链转移剂，n-乙烯基己内酰胺(vcl)为温敏单体，n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam)为调节单体，制备低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物p(vcl-co-dmam)。具体步骤为：
94.在以n’n-二甲基甲酰胺为反应介质，按照摩尔比为1：700：160，加入s-(硫代苯甲酰基)硫代乙酸(1mmol)、n-乙烯基己内酰胺(vcl，700mmol)、n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam，160mmol)，经抽真空/氩气置换3次后，在氩气保护下，70℃反应35小时，得到低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物p(vcl-co-dmam)，分子量为41900，分子量分布为1.16。
95.将氨基磺酰基苯并呋喃羟基衍生物(abd-oh)与p(vcl-co-dmam)按照70：1的摩尔比加入到无水二甲亚砜中，在30℃且无水条件下搅拌36小时，得到温敏荧光聚合物a，记为abd-p(vcl-co-dmam)。
96.(2)温敏荧光聚合物b的制备：
97.本反应以4-氰基-4-(硫代苯甲酰硫基)戊酸为链转移剂、n-乙烯基己内酰胺(vcl)为温敏单体、n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam)为调节单体，制备低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物p(vcl-co-dmam)。具体步骤为：
98.二氧六环为反应溶剂，按照摩尔比为1：1500：500，加入4-氰基-4-(硫代苯甲酰硫基)戊酸(0.5mmol)、n-乙烯基己内酰胺(vcl，750mmol)、n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam、250mmol)，通入高纯氩气45分钟后，在氩气保护下，升温至80℃，反应33小时，得到低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物p(vcl-co-dmam)，分子量为70500，分子量分布为1.12。
99.将花青素磺化cy3马来酰亚胺衍生物(sulfo-cy3-mal)与p(vcl-co-dmam)按照摩尔比30：1的加入到n,n-二甲基甲酰胺中，经抽真空/氩气置换3次后，在氩气保护下搅拌反应24小时，得到温敏荧光聚合物b，记为p(vcl-co-dmam)-sulfo-cy3。
100.(3)马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b的制备：
101.以二甲基亚砜为反应介质，n-(4-氨苯基)马来酰亚胺：温敏荧光聚合物b按照摩尔比为35：1进行该反应。反应条件为室温、反应时间为45小时，得到马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b，记为mal-p(vcl-co-dmam)-sulfo-cy3。
102.(4)纳米荧光温度指示剂的制备：
103.abd-p(vcl-co-dmam)：mal-p(vcl-co-dmam)-sulfo-cy3按照摩尔比1：120，加入二氧六环中，通入高纯氩气除氧50分钟，然后在氩气保护下，在室温反应24小时，然后采用截留分子量1000000的透析袋在42℃条件下透析，得到两嵌段双温敏荧光聚合物，即所述纳米荧光温度指示剂，记为abd-p(vcl-co-dmam)-b-p(vcl-co-dmam)-sulfo-cy3。
104.图3为本实施例中制备的温敏荧光聚合物a、温敏荧光聚合物b以及两嵌段双温敏荧光聚合物的透过率随温度变化图，从图中可以看出，温敏荧光聚合物a、温敏荧光聚合物b以及两嵌段双温敏荧光聚合物的透过率均随着温度的升高而降低，根据变化曲线可以计算出温敏荧光聚合物a和温敏荧光聚合物b的低临界溶解温度分别为40℃、46℃；同时两嵌段双温敏荧光聚合物出现了两个转折，说明两嵌段双温敏荧光聚合物具有40℃和46℃两个低临界溶解温度。
105.本实施例中还考察了上述制备得到的纳米荧光温度指示剂对热疗温度段的分段指示，具体考察步骤如下所示：
106.将上述纳米荧光温度指示剂分散在水中使得浓度为5mg/ml，然后从36℃开始升温，每隔1℃在410nm激发波长下观察纳米荧光温度指示剂水溶液的颜色。在环境温度低于40℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现激发波的紫色，当环境温度在40℃～45℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现绿色，当环境温度在达到或者高于46℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现红色。这说明制备的纳米荧光温度指示剂可以实现对热疗温度段的分段指示。
107.实施例4：纳米荧光温度指示剂的制备
108.(1)温敏荧光聚合物a的制备：
109.本反应先以2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸为链转移剂，n-异丙基丙烯酰胺(nipam)为温敏单体，n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam)为调节单体，制备低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物p(nipam-co-dmam)。具体步骤为：
110.在以二甲亚砜为反应介质，按照摩尔比为1：500：100，加入2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(1mmol)、n-异丙基丙烯酰胺(nipam，500mmol)、n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam，100mmol)，经抽真空/氩气置换3次后，在氩气保护下，80℃反应24小时，得到低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物p(nipam-co-dmam)，分子量为30300，分子量分布为1.08。
111.将1-苯胺-8-萘磺酸羟基衍生物(ans-oh)与p(nipam-co-dmam)按照1：1的摩尔比加入到无水二甲亚砜中，在50℃且无水条件下搅拌72小时，得到温敏荧光聚合物a，记为ans-p(nipam-co-dmam)。
112.(2)温敏荧光聚合物b的制备：
113.本反应以2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸为链转移剂，甲基乙烯基醚(mve)为温敏单体，n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam)为调节单体，制备低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物p(mve-co-dmam)。具体步骤为：
114.二氧六环为反应溶剂，按照摩尔比为1：1200：400，加入2-(十二烷基硫基硫代羰基
硫基)-2-甲基丙酸(0.5mmol)、甲基乙烯基醚(mve，600mmol)、n,n-二甲基丙烯酰胺(dmam，200mmol)，通入高纯氩气60分钟后，在氩气保护下，升温至75℃，反应48小时，得到低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物p(mve-co-dmam)，分子量为82100，分子量分布为1.18。
115.温敏聚合物b与经马来酰亚胺修饰的可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子的质量摩尔比为1：1～1：100；所述点击反应的条件为无氧条件室温下搅拌反应1～72小时。
116.将花青素磺化cy3.5马来酰亚胺衍生物(sulfo-cy3.5-mal)与p(mve-co-dmam)按照按照摩尔比100：1的加入到n,n-二甲基甲酰胺中，经抽真空/氩气置换3次后，在氩气保护下搅拌反应1小时，得到温敏荧光聚合物b，记为p(mve-co-dmam)-sulfo-cy3.5。
117.(3)马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b的制备：
118.含有氨基的马来酰亚胺和温敏荧光聚合物b的摩尔比为1：1～50：1；
119.所述酰胺化反应的条件为室温下反应1～72小时。
120.以二甲基亚砜为反应介质，n-(2-氨基丙基)马来酰亚胺：温敏荧光聚合物b按照摩尔比为50：1进行该反应。反应条件为室温、反应时间为1小时，得到马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b，记为mal-p(mve-co-dmam)-sulfo-cy3.5。
121.(4)纳米荧光温度指示剂的制备：
122.ans-p(nipam-co-dmam)：mal-p(mve-co-dmam)-sulfo-cy3.5按照摩尔比1：200，加入二氧六环中，通入高纯氩气除氧60分钟，然后在氩气保护下，在室温反应12小时，然后采用截留分子量1000000的透析袋在42℃条件下透析，得到两嵌段双温敏荧光聚合物，即所述纳米荧光温度指示剂，记为ans-p(nipam-co-dmam)-b-p(mve-co-dmam)-sulfo-cy3.5。
123.图4为本实施例制备的纳米荧光温度指示剂在紫外灯照射下不同温度情况下的照片，从图中可以看出，所述纳米荧光温度指示剂的激发波长在400nm～450nm，当纳米荧光温度指示剂所处环境温度低于40℃时，经400nm～450nm激发波激发，纳米荧光温度指示剂呈现激发波的紫色，当纳米荧光温度指示剂所处环境温度在40℃～46℃时，经400nm～450nm激发波激发，纳米荧光温度指示剂呈现绿色的发射光，当纳米荧光温度指示剂所处环境温度在高于46℃时，经400nm～450nm激发波激发，纳米荧光温度指示剂呈现红色的发射光。因此，可以用作纳米荧光温度计对细胞或者亚细胞温度探测拓展到局部热疗的实时测温和温度控制，在提高肿瘤局部热疗的疗效的同时避免高热而带来的不良反应以及对人体的伤害。
124.本实施例中还考察了上述制备得到的纳米荧光温度指示剂对热疗温度段的分段指示，具体考察步骤如下所示：
125.将上述纳米荧光温度指示剂分散在水中使得浓度为5mg/ml，然后从36℃开始升温，每隔1℃在410nm激发波长下观察纳米荧光温度指示剂水溶液的颜色。在环境温度低于40℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现激发波的紫色，当环境温度在40℃～45℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现绿色，当环境温度在达到或者高于46℃时，纳米荧光温度指示剂水溶液呈现红色。这说明制备的纳米荧光温度指示剂可以实现对热疗温度段的分段指示。
126.综上所述，本发明基于两嵌段双温敏荧光聚合物构成了纳米荧光温度指示剂，所述纳米荧光温度指示剂包括末端修饰了极性响应性荧光分子并且低临界溶解温度在40℃
的温敏荧光聚合物a和末端修饰了可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子并且低临界溶解温度在46℃温敏荧光聚合物b；所述纳米荧光温度指示剂在所处环境温度低于40℃时无荧光，当温度升高到40℃～45℃时呈现绿色荧光，当温度高于46℃时呈现红色荧光；所述纳米荧光温度指示剂在细胞或亚细胞的温度探测以及局部热疗的实时测温和温度控制中具有很好的应用。
127.所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种纳米荧光温度指示剂，其特征在于，所述纳米荧光温度指示剂为温敏荧光聚合物a和经过马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b偶联得到的两嵌段双温敏荧光聚合物；所述温敏荧光聚合物a由末端为羧基且低临界溶解温度为40℃的温敏聚合物a和羟基修饰的极性响应性荧光分子偶联得到；所述温敏荧光聚合物b由末端为羧基且低临界溶解温度为46℃的温敏聚合物b与马来酰亚胺修饰的可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子偶联得到。2.根据权利要求1所述的纳米荧光温度指示剂，其特征在于，在400nm～450nm激发波下，当环境温度低于40℃时，所述纳米荧光温度指示剂呈现激发波的紫色；当环境温度在40℃～46℃时，纳米荧光温度指示剂呈现绿色的发射光；当环境温度在高于46℃时，纳米荧光温度指示剂呈现红色的发射光。3.根据权利要求1所述的纳米荧光温度指示剂，其特征在于，所述羟基修饰的极性响应性荧光分子包括硝基苯并呋喃羟基衍生物、n,n-二甲氨基磺酰基苯并呋喃羟基衍生物、1-苯胺-8-萘磺酸羟基衍生物、氨基磺酰基苯并呋喃羟基衍生物或4-n,n-二甲氨基-1,8-萘酰亚胺羟基衍生物中的任一种。4.根据权利要求1所述的纳米荧光温度指示剂，其特征在于，所述经马来酰亚胺修饰的可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子包括磺化罗丹明b马来酰亚胺衍生物、德州红马来酰亚胺衍生物、花青素磺化cy3马来酰亚胺衍生物或花青素磺化cy3.5马来酰亚胺衍生物中的任一种。5.权利要求1～4任一项所述纳米荧光温度指示剂的制备方法，其特征在于，包括：(1)温敏荧光聚合物a的制备：将含有羧基的链转移剂通过可逆加成-断裂链转移聚合反应制备低临界溶解温度在40℃的温敏聚合物a；通过酯化反应，将经羟基修饰的极性响应性荧光分子偶联在温敏聚合物a的羧基端，得到温敏荧光聚合物a；(2)温敏荧光聚合物b的制备：选择含有羧基的链转移剂，然后利用可逆加成-断裂链转移聚合反应制备低临界溶解温度在46℃的温敏聚合物b；所述温敏聚合物b的两个末端分别为羧基和硫代酯；通过点击化学，将温敏聚合物b末端的硫代酯与经马来酰亚胺修饰的可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子偶联，得到温敏荧光聚合物b；(3)马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b的制备：利用酰胺化反应，将含有氨基的马来酰亚胺偶联在温敏荧光聚合物b的羧基端，得到马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b；(4)纳米荧光温度指示剂的制备：利用点击化学反应，将温敏荧光聚合物a与马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b的进行反应，得到了两嵌段双温敏荧光聚合物，即纳米荧光温度指示剂。6.根据权利要求5所述的纳米荧光温度指示剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，所述含有羧基的链转移剂包括2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸、3-苯甲巯基硫代羰基丙酸、2-(乙巯基硫代甲酰硫基)-2-甲基丙酸、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸、s-(硫代苯甲酰基)硫代乙酸或4-氰基-4-(硫代苯甲酰硫基)戊酸中的任一种；
所述可逆加成-断裂链转移聚合反应的条件均为在无氧条件下，60℃～80℃下搅拌反应12～48小时。7.根据权利要求5所述的纳米荧光温度指示剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述温敏聚合物a的分子量为20000～50000，分子量分布为1.0～1.2；所述温敏聚合物a与经羟基修饰的极性响应性荧光分子的摩尔比为1：1～1：100；所述酯化反应的条件为在10℃～50℃且无水条件下搅拌反应2～72小时；步骤(2)中，所述温敏聚合物b的分子量为60000～100000，分子量分布为1.0～1.2；所述温敏聚合物b与经马来酰亚胺修饰的可被温敏荧光聚合物a激发的非极性响应性荧光分子的摩尔比为1：1～1：100；所述点击反应的条件为无氧条件室温下搅拌反应1～72小时。8.根据权利要求5所述的纳米荧光温度指示剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，含有氨基的马来酰亚胺包括n-(2-氨基丙基)马来酰亚胺、n-(2-氨乙基)马来酰亚胺或n-(4-氨苯基)马来酰亚胺；含有氨基的马来酰亚胺和温敏荧光聚合物b的摩尔比为1：1～50：1；所述酰胺化反应的条件为室温下反应1～72小时。9.据权利要求5所述的纳米荧光温度指示剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，温敏荧光聚合物a和马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b的用量比为1：2～1：200；反应条件为无氧条件，室温下搅拌反应12～168小时，然后采用截留分子量500000～1000000的透析袋在42～44℃条件下透析，除去过量的马来酰亚胺修饰的温敏荧光聚合物b。10.权利要求1～4任一项所述纳米荧光温度指示剂、权利要求5～9任一项所述方法制备的纳米荧光温度指示剂在细胞或亚细胞的温度探测中的应用、或在局部热疗的实时测温和温度控制中的应用。

技术总结
本发明提供了一种纳米荧光温度指示剂及其制备方法和应用，属于高分子材料和生物医学工程技术领域；本发明基于两嵌段双温敏荧光聚合物构成了纳米荧光温度指示剂，所述纳米荧光温度指示剂包括末端修饰了极性响应性荧光分子并且低临界溶解温度在40℃的温敏荧光聚合物A和末端修饰了可被温敏荧光聚合物A激发的非极性响应性荧光分子并且低临界溶解温度在46℃温敏荧光聚合物B；所述纳米荧光温度指示剂在所处环境温度低于40℃时无荧光，当温度升高到40℃～46℃时呈现绿色荧光，当温度高于46℃时呈现红色荧光；所述纳米荧光温度指示剂在细胞或亚细胞的温度探测以及局部热疗的实时测温和温度控制中具有很好的应用。测温和温度控制中具有很好的应用。测温和温度控制中具有很好的应用。


技术研发人员：屈阳 刘春雷 黄大绍 胡世杰 孙淼 辛渊蓉 刘宏飞
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/8/24