一种真菌橙花醇合酶PgfB及其编码基因和应用

一种真菌橙花醇合酶pgfb及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种真菌橙花醇合酶pgfb及其编码基因和应用。


背景技术：

2.萜类化合物是自然界众多结构类型的天然产物中数量和种类最多的一类，且具有广泛的生理和药理活性。橙花醇(nerol，c
10h18
o)是一种具有令人愉快的玫瑰和橙花香气的无环单萜化合物，广泛应用于食品、药品、化妆品等行业，有着重要商业价值。全球每年对橙花醇的需求量超过5000吨，但其年生产能力仅为3000吨左右，存在生产能力不足的问题。
3.橙花醇天然存在于植物精油中，但从植物中直接提取萜类化合物，由于栽培难度大、产量低、提取分离成本高，效率低，无法满足橙花醇的需求。目前大规模生产橙花醇主要是通过化学合成方法，但是其成本高，工艺复杂，污染严重，收率低，副产物多等缺点，极大地限制了橙花醇的生产及其应用。因此，与上述方法相比，微生物代谢工程和合成生物学已成为获得橙花醇的环境友好且高效的方法，具有广阔的发展前景。在橙花醇生物合成途径中，橙花醇合酶是催化产生橙花醇的关键酶，可催化前体底物直接合成得到橙花醇。然而，迄今为止尚未有真菌来源的橙花醇合酶基因被克隆和鉴定。
4.灰黄青霉菌是一种重要的植物病原真菌，基因组挖掘显示其含有多个萜类合成相关的基因，但灰黄青霉菌中未见单萜合成酶基因的相关报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种真菌橙花醇合酶pgfb；本发明的目的之二在于提供编码真菌橙花醇合酶pgfb的基因；本发明的目的之三在于提供含有所述真菌橙花醇合酶pgfb基因的重组表达载体；本发明的目的之四在于提供所述重组表达载体在大肠杆菌中生产pgfb重组蛋白中的应用；本发明的目的之五在于提供所述重组表达载体在酵母中生产橙花醇中的应用。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.1、一种真菌橙花醇合酶pgfb，所述真菌橙花醇合酶pgfb的蛋白序列如seq id no.6所示。
8.2、编码真菌橙花醇合酶pgfb的基因，所述真菌橙花醇合酶pgfb基因的核酸序列如seq id no.5所示。
9.3、含有所述真菌橙花醇合酶pgfb基因的重组表达载体。
10.本发明优选的，所述重组表达载体通过同源重组的方式，将seq id no.3和seq id no.4所示的引物序列扩增得到的真菌橙花醇合酶pgfb基因片段构建到原核表达载体pq8上。
11.本发明优选的，所述重组表达载体通过ndei和swai酶切位点将真菌橙花醇合酶pgfb基因构建到酵母表达载体pyeu上。
12.4、所述重组表达载体在大肠杆菌中生产pgfb重组蛋白中的应用。
13.本发明优选的，包含如下步骤：将所述的重组表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)，经iptg诱导表达后，收集菌体后裂解，取上清液经糊精琼脂糖凝胶纯化，麦芽糖洗脱得到带mbp标签的pgfb重组蛋白。
14.5、所述重组表达载体在酵母中生产橙花醇中的应用。
15.本发明优选的，将所述重组表达载体转化酿酒酵母，获得转基因菌株，经缺u培养基培养后，即获得含有橙花醇的发酵液，正己烷萃取，减压浓缩干后，得到橙花醇。
16.本发明的有益效果在于：
17.本发明从灰黄青霉菌中克隆得到单萜合酶基因pgfb，利用融合标签在大肠杆菌中表达获得可溶性蛋白pgfb。体外酶活实验证明，pgfb可直接催化底物gpp反应生成橙花醇，证明该基因编码橙花醇合酶，且pgfb具有严格的底物选择性，并不能识别其他碳链长的底物。同时，本发明还成功构建得到含有pgfb基因的重组表达载体并在酿酒酵母体内表达，实现了橙花醇高效异源生产。因此，本发明首次从真菌中克隆得到橙花醇合酶基因pgfb，可用于体内或体外合成橙花醇，本发明涉及的酵母异源表达合成橙花醇，环境友好，易于实现，具有潜在的工业化应用前景。
附图说明
18.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
19.图1为p.griseofulvum nrrl 35584总rna核酸电泳图；
20.图2为pgfb基因片段核酸电泳图；
21.图3为pq8-pgfb重组质粒图谱；
22.图4为纯化后的pgfb蛋白sds-page检测；
23.图5为pgfb与gpp的体外酶活实验；
24.图6为pgfb与fpp和ggpp体外酶活实验；
25.图7为pyeu-pgfb重组质粒图谱；
26.图8为gc-ms分析基因pgfb酵母异源表达产物；
27.图9为化合物结构鉴定结果。
具体实施方式
28.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
29.本发明所使用的试剂：
30.限制性内切酶购自takara；hieff canace
tm
high-fidelity dna polymerase、transcriptor first strand cdna synthesis kit和one step cloning kit购自yeasen；frozen-ez酵母转化ii试剂盒购自zymo research；trizol购自ambion；fastpure gel dna extraction mini kit和bca蛋白定量试剂盒购自鼎国昌盛生物科技有限公司；gpp购自sigma-aldrich；橙花醇标准品购自aladdin；dh5a和bl21(de3)大肠感受态细胞购自擎科生物试剂有限公司。
31.本发明所使用的引物：
32.利用snapgene软件设计包含完整开放阅读框的引物(表1)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司(成都分公司)进行引物合成。
33.表1.本发明所涉及引物
[0034][0035]
实施例1、灰黄青霉菌总rna提取及cdna第一链的合成
[0036]
p.griseofulvum nrrl 35584孢子液接种于40ml pdb培养基中，25℃、220rpm培养3天，离心收集菌体。然后将菌体置于预冷无菌的研钵中，加入液氮，用研杵迅速研磨，循环研磨三次至菌体成粉末状。使用trizol试剂，参照说明书要求从菌体组织样中提取总rna，并用无rnase的dnase i去除基因组dna以得到纯化的rna(图1)。最后，采用transcriptor first strand cdna synthesis kit试剂盒，配制反转录反应体系，合成得到第一链cdna，反转录反应体系(20μl)及反应程序见表2。
[0037]
表2.反转录反应体系及反应程序
[0038][0039]
实施例2、pgfb基因的扩增及回收
[0040]
以合成的cdna为模板，参照hieff canacetmhigh-fidelity dna polymerase试剂盒操作说明，用引物对pyeu-pgfb-f/r和pq8-pgfb-f/r分别pcr扩增得到pgfb完整基因片段，大小约为1011bp。然后，采用fastpure gel dna extraction mini kit试剂盒回收目的基因片段，最后核酸电泳检测发现均得到单一明显的大小符合预期的核酸电泳条带，表明成功扩增并纯化得到目的基因片段(图2)。pcr反应体系及反应程序如表3、表4所示。
[0041]
表3.pcr反应体系
[0042][0043]
表4.pcr反应程序(34个循环)
[0044][0045]
扩增得到pgfb基因编码序列如下：
[0046]
核酸序列：
[0047][0048]
氨基酸序列：
[0049][0050]
实施例3、原核表达重组质粒pq8-pgfb的构建
[0051]
利用限制性内切酶hindⅲ对原核表达载体pq8(载体来源参考文献：qian wei,haichun zeng,yi zou.divergent biosynthesis of fungal dioxafenestrane sesquiterpenes by the cooperation of distinctive baeyer-villiger monooxygenases andα-ketoglutarate-dependent dioxygenases,acs catalysis,2021,11(2):948-957)进行单酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳回收得到载体片段。然后参照one step cloning kit(yeasen公司)的操作说明，将引物对pq8-pgfb-f/r扩增的基因片段构建到携带有mbp(麦芽糖结合蛋白，40kda)标签的原核表达载体pq8上，得到重组质粒pq8-pgfb(图3)，反应体系包括pgfb基因片段3μl、pq8线性载体2μl以及2
×
hieffenzyme premix 5μl，并于50℃温度，反应20min，体外一步克隆法将pgfb连接到pq8载体上。然后，采用热击法将重组质粒转化至dh5a大肠感受态细胞，用灭菌涂棒均匀涂布于含有50ug/ml kan抗性的lb固体平板上，37℃培养过夜形成单菌落。挑取单菌落为模板，利用引物对pq8-pgfb-f/r进行菌落pcr验证，将阳性单菌落摇菌提质粒后，利用限制性内切酶kpni进行酶切验证。最后，将酶切验证正确的质粒送至上海生工生物工程技术服务有限公司(成都分公
pgfb(图7)，反应体系包括pgfb基因片段3μl、pyeu线性载体2μl以及2
×
hieffenzyme premix 5μl，并于50℃温度，反应20min，体外一步克隆法将pgfb连接到pyeu载体上。然后，采用热击法将重组质粒转化至dh5a大肠感受态细胞，用灭菌涂棒均匀涂布于含有100ug/ml amp抗性的lb固体平板上，37℃培养过夜形成单菌落。挑取单菌落为模板，用引物对pyeu-pgfb-f/r进行菌落pcr验证，将阳性单菌落摇菌提质粒后，利用限制性内切酶ecorv和noti进行酶切验证。最后，将酶切验证正确的质粒送至上海生工生物工程技术服务有限公司(成都分公司)进行测序。测序结果通过snapgene软件进行比对，对测序结果正确的菌液进行保菌。
[0062]
实施例8、基因pgfb酵母异源表达菌株发酵检测
[0063]
将重组质粒pyeu-pgfb导入酿酒酵母(ura，leu和his营养缺陷型菌株)感受态中，涂布于缺ura固体培养基(酪蛋白酸水解物5g/l，葡萄糖20g/l，ynb 6.7g/l，腺嘌呤2g/l，色氨酸2g/l，琼脂20g/l)上，28℃培养箱倒置培养3～4天待长出单菌落。然后利用引物对pyeu-pgfb-f/r进行菌落pcr验证，挑取阳性酵母转化子继续在缺ura液体培养基(不含琼脂的缺ura固体培养基)中，28℃，250rpm培养过夜。然后将种子液按2％接种量转接至20ml ypd液体培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)中，25℃，250rpm发酵培养两天，同时在相同条件下发酵酿酒酵母野生型作为对照。取适量发酵液，等体积正己烷萃取，减压浓缩干后，进行gc-ms检测。结果显示，与野生型对照相比，pgfb基因在酵母中表达后能够特异性检测到大量橙花醇的产生(图8)。
[0064]
实施例9、样品gc-ms检测方法
[0065]
使用安捷伦7890b-5977a气质联用仪检测样品，色谱柱型号为hp-5ms ultra inert，30m
×
250μm
×
0.25μm，采用电离方式为电子撞击电离(ei)，电子能量70ev，氦气作为载气，流速为1.0ml/min。气相进样口温度为260℃，以不分流模式进样。柱箱初始温度80℃，保持1min，然后以10℃/min速率升温至190℃，保持2min，最后以20℃/min速率升温至280℃，保持11.5min。ms采集范围35～500m/z。通过样品的保留时间和质谱信息与标准品进行比对，并结合国家标准与技术研究所质谱数据库(nist)检索，以鉴定化合物结构(图9)。
[0066]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.一种真菌橙花醇合酶pgfb，其特征在于，所述真菌橙花醇合酶pgfb的蛋白序列如seq id no.6所示。2.编码真菌橙花醇合酶pgfb的基因，其特征在于，所述真菌橙花醇合酶pgfb基因的核酸序列如seq id no.5所示。3.含有权利要求2所述真菌橙花醇合酶pgfb基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过同源重组的方式，将seq id no.3和seq id no.4所示的引物序列扩增得到的真菌橙花醇合酶pgfb基因片段构建到原核表达载体pq8上。5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过ndeⅰ和swaⅰ酶切位点将真菌橙花醇合酶pgfb基因构建到酵母表达载体pyeu上。6.权利要求4所述重组表达载体在大肠杆菌中生产pgfb重组蛋白中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包含如下步骤：将权利要求4所述的重组表达载体转化大肠杆菌bl 21(de3)，经iptg诱导表达后，收集菌体后裂解，取上清液经糊精琼脂糖凝胶纯化，麦芽糖洗脱得到带mbp标签的pgfb重组蛋白。8.权利要求5所述重组表达载体在酵母中生产橙花醇中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将权利要求5所述重组表达载体转化酿酒酵母，获得转基因菌株，经缺ura培养基培养后，即获得含有橙花醇的发酵液，正己烷萃取，减压浓缩干后，得到橙花醇。

技术总结
本发明公开了一种真菌橙花醇合酶PgfB及其编码基因和应用，所述真菌橙花醇合酶PgfB的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示，所述真菌橙花醇合酶PgfB基因的核酸序列如SEQ ID NO.5所示；利用融合标签在大肠杆菌中表达真菌橙花醇合酶PgfB获得可溶性蛋白PgfB，体外酶活实验证明，PgfB可直接催化底物GPP反应生成橙花醇；构建含有pgfB基因的重组表达载体并在酿酒酵母体内表达，实现了橙花醇高效异源生产；本发明首次从真菌中克隆得到橙花醇合酶基因pgfB，可用于体内或体外合成橙花醇，本发明涉及的酵母异源表达合成橙花醇，环境友好，易于实现，具有潜在的工业化应用前景。潜在的工业化应用前景。潜在的工业化应用前景。


技术研发人员：曾海春 李茹梦 姚波 柴水琴
受保护的技术使用者：重庆科技学院
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/8/24