一种适用于强疏水短肽的沉淀剂

一种适用于强疏水短肽的沉淀剂
所属技术领域：
1.本发明涉及一种适用于强疏水短肽的沉淀剂，具体来讲：就是以氟苯和七氟醚按照一定比例混合配制而成，适用于长度不超过5个氨基酸且带有连续疏水残基多肽的沉淀试剂。


背景技术：

2.在固相多肽合成的最后阶段中，多肽被三氟乙酸切割剂混合物(cleavage cocktail)从树枝上切割下来。随后，乙醚通常被用于沉淀多肽粗品，使多肽与三氟乙酸切割剂混合物残余等杂质分离开来。这是因为乙醚是一种高度挥发性的非极性溶剂，对绝大多数多肽溶解性差，而对三氟乙酸等合成中引入的杂质溶解度则较高。除了选择性溶解能力，乙醚可以通过蒸发快速有效地去除。因此乙醚成为分离多肽和其他小分子杂质的首选。此外，乙醚在多肽合成中要求被冷冻使用，这是因为用冷乙醚沉淀更有效，因为肽的溶解度在低温下更低。这种降低的溶解度促进了多肽的聚集，使其可以通过过滤或离心轻松去除。总体而言，冷乙醚是一种可靠且有效的肽沉淀溶剂，广泛用于肽纯化方案。
3.虽然使用冷乙醚沉淀多肽粗产品有诸多优势，但它在多肽合成中的使用也会带来一些问题。主要的挑战在于乙醚在多肽合成中的使用量巨大：当乙醚在沉淀并清洗多肽时，切割剂中的三氟乙酸也在不断地在乙醚中积累。含有一定量三氟乙酸的乙醚，对于多肽的溶解度会大幅提升，导致大量的多肽产品溶解于乙醚中而损失掉。一般化学家会大幅提高乙醚的使用量，以减少三氟乙酸在乙醚中的浓度。乙醚的使用量并没有硬性规定，一般优选的是乙醚与旋蒸浓缩后的多肽粗产品(溶于三氟乙酸切割剂的多组分混合物)体积比40:1；但对于百克级或千克级多肽的制备，使用如此大量的乙醚是不现实的，因此往往会被迫减少用量至10:1甚至更低。乙醚的挥发性很高，并不易回收。它易燃易引起火灾，对人体健康有害，可能引起眩晕、头痛、恶心等不适症状。长期接触乙醚还可能对神经系统和肝脏造成损害。沉淀后弃置的废液中大量的乙醚存放时，容易与氧气形成爆炸性混合物，造成安全事故。
4.近年来，也有许多报道使用乙醚的替代品，如甲乙醚和环戊基甲醚。甲乙醚和乙醚性质十分相似，业界使用甲乙醚往往只是为了规避乙醚的易制毒试剂法规管制。环戊基甲醚是新型研发的一种乙醚的替代试剂，具备了疏水性较高、液体状态的范围较广、易于蒸馏回收、不易生成过氧化物和爆炸范围较小等特点。虽然环戊基甲醚拥有优秀的性能，但其价格为乙醚的上百倍。值得注意的是，环戊基甲醚即使在含有少量的三氟乙酸的情况，其对多肽的沉淀能力会大大下降。因此和乙醚一样，环戊基甲醚作为多肽沉淀剂的使用量依然很大，无疑大大提高了多肽制备的成本。此外，环戊基甲醚和乙醚一样，并不适用于对强疏水肽的分离。特别是一些具有连续疏水残基的短肽，在乙醚和环戊基甲醚等醚类试剂中溶解度较大甚至会完全溶解。这就造成了一种两难的局面，即醚试剂中用量过多，可能溶解强疏水短肽；用量少，则沉淀时混有的三氟乙酸浓度过高，也会造成多肽的溶解。特别是带有连续相同疏水氨基酸残基的短肽，由于所有残基不仅本身疏水，而且相邻支链相同导致空取
向高度一致或对称，从而展现出异乎寻常的超强疏水能力，是目前已知所有类型中最容易溶于含三氟乙酸乙醚的一类多肽，因此难以通过常规的冷乙醚或其他类似醚类试剂从三氟乙酸中分离出来。
5.为了解决强疏水肽在醚类试剂中的沉淀分离问题，本发明旨在开发一种新型的多肽沉淀剂，以实现在常温下，以较少用量即可实现切割剂混合物杂质的去除和强疏水短肽的高效沉淀分离，同时具备了稳定的化学性质，不易氧化或爆炸。


技术实现要素：

6.发明首次提出了以氟苯和七氟醚按照一定比例混合配制而成，适用于多肽沉淀，特别适用于强疏水短肽的沉淀试剂。所述的沉淀试剂中氟苯和七氟醚的体积比为85:15，按照此比例配制的沉淀剂的沉淀能力最优，几乎不受三氟乙酸等杂质的影响，较少的用量可以降低成本，同时其稳定的化学性质也降低了生产的安全风险，为强疏水短肽的分离提供了完备的解决方案。所述的强疏水短肽是指包含3-5个相同且连续的亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)或缬氨酸(val)。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种适用于强疏水短肽的沉淀剂，主要由氟苯和七氟醚制备而成。进一步的，所述适用于强疏水短肽的沉淀剂中氟苯和七氟醚的体积比为85:15。所述适用于强疏水短肽的沉淀剂的制备方法，将氟苯和七氟醚混合均匀，充分混合后得到沉淀剂。
8.与现有技术相比，本发明所述的适用于强疏水短肽的沉淀剂的创新与优势在于：
9.1.本发明所述的适用于强疏水短肽的沉淀剂，对三氟乙等多肽切割剂常见成分溶解度高，对多肽的分离纯化能力较强。
10.2.本发明所述的适用于强疏水短肽的沉淀剂，能很好地沉淀常见类型的多肽，特别对于包含3-5个相同且连续的疏水氨基酸残基的强疏水短肽有着优异的聚集沉淀作用。更重要的是，室温下即可发生完全沉淀，低温并非是必须的。
11.3.本发明所述的适用于强疏水短肽的沉淀剂对三氟乙酸的耐受力强。即使按照4:1的体积比对多肽与切割剂混合物进行分离，其对于多肽依然保持着良好的沉淀效率。因此只需要很少量的沉淀剂即可对多肽进行沉淀。另一方面，在毫克至克级多肽的合成中，沉淀步骤前旋蒸去除大部分三氟乙酸的操作也不再是必需的。
12.4.本发明所述的适用于强疏水短肽的沉淀剂的理化性质十分稳定，几乎不和任何化学试剂反应，因此没有易氧化或易爆的疑虑。
13.5.本发明所述的适用于强疏水短肽的沉淀剂的熔沸点差距大，液态范围广，因此处置回收方便，结合用量小和安全成本低的优点，总体成本反而比乙醚更低。
具体实施方式：
14.下述实施例中所使用的实验材料、试剂等均可通过商业途径或已知实验方法获得。下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.实施例1，冷乙醚沉淀三氟乙酸中的多肽leu-leu-leu-oh。
16.将5ml含有71.5mg疏水多肽leu-leu-leu-oh的三氟乙酸溶液在5℃下逐步滴加至50ml的冷乙醚中，少量白色沉淀析出后。将混合物进行离心分离后，并以5ml乙醚洗涤沉淀即溶解。因此最终多肽产物的收率为0％。
17.实施例2，氟苯和七氟醚沉淀三氟乙酸中的多肽leu-leu-leu-oh。
18.将5ml含有71.5mg疏水多肽leu-leu-leu-oh的三氟乙酸溶液在室温下逐步滴加至20ml的氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂中，直至白色沉淀生成完全。将混合物进行离心分离后，并以5ml氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂洗涤沉淀2次。添加5ml正戊烷后冻干结晶。通过高效液相色谱法(hplc)与标样峰面积对比确定最终多肽产物的纯度为99.8％和收率为98.12％。
19.实施例3，冷乙醚沉淀三氟乙酸中的多肽leu-leu-leu-leu-oh。
20.将5ml含有94.1mg疏水多肽leu-leu-leu-leu-oh的三氟乙酸溶液在5℃下逐步滴加至50ml的冷乙醚中，少量白色沉淀析出后即消失，无法离心分离。因此最终多肽产物的收率为0％。
21.实施例4，氟苯和七氟醚沉淀三氟乙酸中的多肽leu-leu-leu-leu-oh。
22.将5ml含有94.1mg疏水多肽leu-leu-leu-leu-leu-oh的三氟乙酸溶液在室温下逐步滴加至20ml的氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂中，直至白色沉淀生成完全。将混合物进行离心分离后，并以5ml氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂洗涤沉淀2次。添加5ml正戊烷后冻干结晶。通过高效液相色谱法(hplc)与标样峰面积对比确定最终多肽产物的纯度为99.2％和收率为98.52％。
23.实施例5，冷乙醚沉淀三氟乙酸中的多肽leu-leu-leu-leu-leu-oh。
24.将5ml含有116.8mg疏水多肽leu-leu-leu-leu-leu-oh的三氟乙酸溶液在5℃下逐步滴加至50ml的冷乙醚中，少量白色沉淀析出后即消失，无法离心分离。因此最终多肽产物的收率为0％。
25.实施例6，氟苯和七氟醚沉淀三氟乙酸中的多肽leu-leu-leu-leu-leu-oh。
26.将5ml含有116.8mg疏水多肽leu-leu-leu-leu-leu-oh的三氟乙酸溶液在室温下逐步滴加至20ml的氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂中，直至白色沉淀生成完全。将混合物进行离心分离后，并以5ml氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂洗涤多肽2次。添加5ml正戊烷后冻干结晶。通过高效液相色谱法(hplc)与标样峰面积对比确定最终多肽产物的纯度为99.4％和收率为98.65％。
27.实施例7，冷乙醚沉淀三氟乙酸中的多肽ile-ile-ile-ile-ile-oh。
28.将5ml含有116.8mg疏水多肽ile-ile-ile-ile-ile-oh的三氟乙酸溶液在5℃下逐步滴加至50ml的冷乙醚中，无沉淀析出。因此最终多肽产物的收率为0％。
29.实施例8，氟苯和七氟醚沉淀三氟乙酸中的多肽ile-ile-ile-ile-ile-oh。
30.将5ml含有116.8mg疏水多肽ile-ile-ile-ile-ile-oh的三氟乙酸溶液在室温下逐步滴加至20ml的氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂中，直至白色沉淀生成完全。将混合物进行离心分离后，并以5ml氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂洗涤多肽2次。添加5ml正戊烷后冻干结晶。通过高效液相色谱法(hplc)与标样峰面积对比确定最终多肽产物的纯度为99.2％和收率为97.75％。
31.实施例9，冷乙醚沉淀三氟乙酸中的多肽phe-phe-phe-phe-phe-oh。
32.将5ml含有150.8mg疏水多肽phe-phe-phe-phe-phe-oh的三氟乙酸溶液在5℃下逐步滴加至50ml的冷乙醚中，少量白色沉淀析出后即消失，无法离心分离。因此最终多肽产物的收率为0％。
33.实施例10，氟苯和七氟醚沉淀三氟乙酸中的多肽phe-phe-phe-phe-phe-oh。
34.将5ml含有150.8mg疏水多肽phe-phe-phe-phe-phe-oh的三氟乙酸溶液在室温下逐步滴加至20ml的氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂中，直至白色沉淀生成完全。将混合物进行离心分离后，并以5ml氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂洗涤多肽2次。添加5ml正戊烷后冻干结晶。通过高效液相色谱法(hplc)与标样峰面积对比确定最终多肽产物的纯度为99.9％和收率为87.05％。
35.实施例11，冷乙醚沉淀三氟乙酸中的多肽trp-trp-trp-trp-trp-oh。
36.将5ml含有189.8mg疏水多肽trp-trp-trp-trp-trp-oh的三氟乙酸溶液在5℃下逐步滴加至50ml的冷乙醚中，析出少量白色沉淀。将混合物进行离心分离后，并以5ml冷乙醚洗涤多肽2次。添加5ml正戊烷后冻干结晶。通过高效液相色谱法(hplc)与标样峰面积对比确定最终多肽产物的纯度为99.5％和收率为26.70％。
37.实施例12，氟苯和七氟醚沉淀三氟乙酸中的多肽trp-trp-trp-trp-trp-oh。
38.将5ml含有189.8mg疏水多肽trp-trp-trp-trp-trp-oh的三氟乙酸溶液在室温下逐步滴加至20ml的氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂中，直至白色沉淀生成完全。将混合物进行离心分离后，并以5ml氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂洗涤多肽2次。添加5ml正戊烷后冻干结晶。通过高效液相色谱法(hplc)与标样峰面积对比确定最终多肽产物的纯度为99.2％和收率为99.47％。
39.实施例13，冷乙醚沉淀三氟乙酸中的多肽val-val-val-val-val-oh。
40.将5ml含有102.7mg疏水多肽val-val-val-val-val-oh的三氟乙酸溶液在5℃下逐步滴加至50ml的冷乙醚中，无沉淀析出。因此最终多肽产物的收率为0％。
41.实施例14，氟苯和七氟醚沉淀三氟乙酸中的多肽val-val-val-val-val-oh。
42.将5ml含有102.7mg疏水多肽val-val-val-val-val-oh的三氟乙酸溶液在室温下逐步滴加至20ml的氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂中，直至白色沉淀生成完全。将混合物进行离心分离后，并以5ml氟苯和七氟醚(体积比85:15)沉淀剂洗涤多肽2次。添加5ml正戊烷后冻干结晶。通过高效液相色谱法(hplc)与标样峰面积对比确定最终多肽产物的纯度为99.6％和收率为96.28％。
43.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均包括在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种适用于强疏水短肽的沉淀剂。由氟苯和七氟醚按照一定比例混合制备而成。其特征在于：所述的一种适用于强疏水短肽的沉淀试剂中氟苯和七氟醚的体积比为85:15。所述的强疏水短肽是指长度不超过5个氨基酸且带有连续相同疏水氨基酸残基的多肽。所述的疏水氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。

技术总结
本发明涉及一种适用于强疏水短肽的沉淀剂。本发明提供的沉淀剂氟苯和七氟醚按照一定比例混合配制而成，具有对强疏水短肽沉淀能力强、可在室温下使用、用量少，性质稳定、不易燃不易爆和可回收等优点，是应用前景广阔的新一代多肽沉淀试剂。代多肽沉淀试剂。


技术研发人员：陈铭
受保护的技术使用者：烟台大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/8/24