基于内过氧化物的抗凝剂及应用

1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及基于内过氧化物的抗凝剂及应用。


背景技术：

2.传统的抗血栓药物已被证明在治疗血栓性疾病方面是有效的，但目前它们的使用仍然受到各种药物与患者因素的限制，当今多数新型抗血栓药物也因为会造成凝血障碍、严重出血等副作用而限制了其应用与推广，人们对开发具有高靶点选择性、生理性溶栓、生物相容性和最小出血风险的抗血栓药物非常感兴趣。在人体内，pmn产生的单线态氧具有显著的抑制血液凝固以及增强纤维蛋白溶解的作用效果，因此将单线态氧应用于抗血栓药物的研究具有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的是开发基于内过氧化物的抗凝剂。开发的基于内过氧化物的抗凝剂通过将萘类单线态氧载体内过氧化合物与水溶性磺酸盐或季铵盐基团相连。内过氧分子作为单线态氧载体可释放单线态氧，释放的单线态氧具有显著的抑制血液凝固以及增强纤维蛋白溶解的作用效果，并且离子型磺酸盐与季铵盐基团的引入很大程度的提高了单线态氧载体的水溶性，具有广阔的应用前景。
4.本发明的技术方案：基于内过氧化物的抗凝剂，该单线态氧抗凝剂具有如下结构：
[0005][0006]
其中，各自独立为或者
[0007][0008]r1-r3，r
5-r7，r
9-r
11
各自独立的为氢、羟基、三甲基硅基、氨基、碳原子数为2-6的烯基、碳原子数为2-6的炔基、碳原子数为1-2的烷氧基、碳原子数为1-6的烷胺基、碳原子数为2-6的烷氧基烷基、碳原子数为1-6的烷基、三氟甲基、卤素、碳原子数为2-6的烷氧基羰基、碳原子数为6-20的芳基、碳原子数为3-10的杂环烷基或者
[0009]
其中，x为1-2000的整数；
[0010]
r4，r8，r
12
各自独立的为或者其中，m为0-10的整数，n1与n2的和各自独立的为0-6的整数，n3与n4的和各自独立的为0-8的整数，n5与n6的和为0-7的整数，n7与n8的和为0-10的整数，n9与n
10
的和为0-4的整数，n为0-6的整数。
[0011]y+
为一价阳离子，z-为一价阴离子。
[0012]
优选的，r
1-r3，r
5-r7，r
9-r
11
各自独立的为氢、羟基、三甲基硅基、氨基、碳原子数为1-6的烷基、碳原子数为6-20的芳基或者
[0013]
其中，x为5-200的整数；
[0014]
r4，r8，r
12
各自独立的为或者其中，n1与n2的和各自独立的为0-6的整数，m为0-10的整数，n为0-6的整数。
[0015]y+
为na
+
、k
+
或者nh
4+
；z-为pf
6-、bf
4-、cl-、br-、i-、no
3-、so
42-、clo
4-、ch3coo-、ch3so
3-或者cf3so
3-。
[0016]
所述的基于内过氧化物的抗凝剂作为单线态氧载体递送单线态氧的应用。
[0017]
所述的基于内过氧化物的抗凝剂用于制备抗凝血与增强纤溶的药物。
[0018]
本发明的有益效果：基于内过氧化物的抗凝剂将萘类内过氧分子与离子型磺酸盐或季铵盐引入单线态氧输送体系中，通过磺酸根基团与季铵盐基团提高内过氧分子的水溶性，使其能够溶于血浆。在人体温度下释放单线态氧来对机体的凝血机制与纤溶机制进行调节。单线态氧的释放速度可通过设计不同的内过氧结构进行调控。引入离子型磺酸盐基团与季铵盐基团的内过氧体系在表现出较好的水溶性同时也在体外抗凝血测试中表现出了明显的活性。本发明涉及的离子型萘类单线态氧载体均具有良好的生物相容性和治疗活性，具有广泛的应用前景。
[0019]
含有磺酸盐基团的单线态氧抗凝剂采用五氟苯酚磺酸酯化合物(化合物a)在5％naoh w/w乙醇溶液中回流水解得到，含有季铵盐基团的单线态氧抗凝剂采用氨基化合物(化合物b)与碘甲烷反应后再与六氟磷酸钠反应得到。相应的五氟苯酚磺酸酯化合物、氨基化合物均可采用常规化学合成方法得到，具体转化过程如下：
[0020]
附图说明
[0021]
图1是内过氧化合物10的单线态氧释放强度随时间的变化图。
[0022]
图2是内过氧化合物11的单线态氧释放强度随时间的变化图。
[0023]
图3是空白对照组的单线态氧释放强度随时间的变化图。
[0024]
图4是内过氧化合物10、11与对照组的单线态氧释放情况分析图
[0025]
图5是37℃下cd3od中内过氧化物10的1h nmr光谱的时间演变。
[0026]
图6是37℃下cd3od中内过氧化物11的1h nmr光谱的时间演变。
[0027]
图7是内过氧化物10的半衰期计算图。
[0028]
图8是内过氧化物11的半衰期计算图。
[0029]
图9是内过氧化合物10与化合物8对照的的体外抗凝血数据图。
[0030]
图10是内过氧化合物11与化合物9对照的的体外抗凝血数据图。
具体实施方式
[0031]
本发明用以下实施例加以说明但不局限于此，其中除非另有说明，所有的份数和百分数均以重量计。
[0032]
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例：
[0033]
实施例1
[0034][0035]
步骤a：化合物2的制备
[0036]
将甲氧基(环辛二烯)合铱二聚体(331mg,0.5mmol)，4,4'-二叔丁基-2,2'-二吡啶(268mg,1.0mmol)，双联频哪醇基二硼烷(2.79g,11.0mmol)和1,4-二甲基萘(1.54ml,10.0mmol)的混合物溶解于环己烷(38ml)中，并于60℃加热约20小时，反应结束后将反应混合物冷却至室温，浓缩有机相得到粗产物，通过硅胶柱色谱法纯化粗产物(洗脱剂：正己烷)，旋转蒸发除去洗脱剂后得到白色晶状物2.62g。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.48
–
8.39(m,1h),7.86(dd,j＝8.4,0.7hz,1h),7.80(dd,j＝8.4,1.2hz,1h),7.15
–
7.02(m,2h),2.61(s,3h),2.53(s,3h),1.27(s,12h).
[0037]
步骤b：化合物3的制备
[0038]
将化合物2(500mg,1.77mmol)与高碘酸钠(1.136g,5.31mmol)在12ml thf:h2o(4:1，v/v)中搅拌30分钟，此时向悬浮液中加入hcl水溶液(1n，1240μl)。反应混合物在室温下搅拌24小时。反应结束后，将反应混合物用水稀释并用etoac萃取。将合并的有机相用水洗涤，然后用盐水洗涤。有机相使用无水na2so4干燥，减压蒸发溶剂得到粗产物，粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷与甲醇体积比98:2)，获得白色固体化合物326mg。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.60(t,j＝1.0hz,1h),8.26(s,2h),8.03
–
7.95(m,2h),7.29(pd,j＝6.3,5.6,1.7hz,2h),2.71(s,3h),2.66(s,3h).
[0039]
步骤c：化合物4制备
[0040]
将化合物3(326mg,1.63mmol)与硝酸铋(iii)五水合物(1.58g,3.26mmol)的混合物溶解于甲苯(38ml)中，在80℃下加热4小时，反应结束后，将反应混合物冷却至室温，然后通过滤纸过滤。残留物用乙酸乙酯洗涤，然后用二氯甲烷洗涤。在真空中浓缩有机相，粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：正己烷与乙酸乙酯体积比99:1),获得黄色固体形式的化合物180mg。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.90(d,j＝2.3hz,1h),8.20(dd,j＝9.3,2.3hz,1h),8.05(d,j＝9.2hz,1h),7.36
–
7.26(m,2h),2.68(s,3h),2.63(s,3h).
[0041]
步骤d：化合物5制备
[0042]
将化合物4(302mg,1.50mmol)与氯化亚锡二水合物(1.69g,7.50mmol)的混合物溶解在无水乙醇(3.5ml)中，在氩气气氛下于70℃加热反应30min，反应结束后，将反应液冷
却，然后倒入冰水中，通过加入5％的氢氧化钠水溶液使ph为微碱性(ph 8)，所得碱性混合物继续搅拌一小时。含水混合物用乙酸乙酯萃取三次，有机相用盐水彻底洗涤，并用硫酸钠干燥。将溶剂蒸发后得到白色微红色针状晶体230mg。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.76(d,j＝8.9hz,1h),7.09
–
7.01(m,2h),6.90(ddd,j＝6.7,5.9,1.7hz,2h),2.52(s,3h),2.48(s,3h).
13
c nmr(101mhz,chloroform-d)δ143.70,134.15,132.26,130.19,126.99,126.74,126.12,123.08,117.25,106.33,19.48,19.32.hrms(esi,m/z):[m+h]+calcd for target,172.1121；fond 172.1124.
[0043]
步骤e：化合物6制备
[0044]
在50ml圆底烧瓶中，将化合物5(103mg，0.60mmol)溶于无水乙醇(3.0ml)和hbf4水溶液(48％，0.15ml)的混合物中，然后在0℃下滴加t-buono(0.16ml)。在室温下搅拌一小时后，加入乙醚(10ml)使重氮化合物沉淀，过滤沉淀出的深绿色固体，并用乙醚(3
×
10ml)洗涤，得到产物130mg.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.72(d,j＝2.1hz,1h),8.52(d,j＝9.3hz,1h),8.49
–
8.42(m,1h),7.80(d,j＝7.3hz,1h),7.68(d,j＝7.3hz,1h),2.73(s,3h),2.71(s,3h).
[0045]
步骤f：化合物7制备
[0046]
将化合物6(405mg,1.5mmol)，1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷二(二氧化硫)加合物(480mg,2.0mmol)，碘化亚铜(38mg,0.2mmol),与五氟苯酚(185mg.1.0mmol)溶解于乙腈(10ml)中，然后将混合物在85℃下搅拌12小时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯(25ml)稀释，通过二氧化硅塞过滤，并用乙酸乙酯(40ml)洗涤。然后用无水硫酸镁干燥滤液，并在真空下浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：正己烷与乙酸乙酯体积比98:2),获得化合物7(140mg)。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.69(d,j＝1.9hz,1h),8.22(d,j＝9.0hz,1h),7.98(dd,j＝9.0,2.0hz,1h),7.46(d,j＝7.1hz,1h),7.40(d,j＝7.2hz,1h),2.72(s,6h).
19
f nmr
[0047]
(377mhz,chloroform-d)δ-150.35,-150.40,-155.40,-155.46,-155.52,-161.03,-161.08(d,j＝4.4hz),-161.14.
[0048]
步骤g：化合物8制备
[0049]
将五氟苯基磺酸酯溶于5％naoh w/w乙醇溶液中，并在回流下加热30分钟。反应结束后，加入5％的hcl水溶液以使ph在4-6之间。用乙酸乙酯将水相反应液萃取三次。然后，有机相使用无水硫酸钠干燥。减压蒸发溶剂，加入乙醚以沉淀1,4-二甲基萘磺酸盐。过滤并用乙醚洗涤后得到纯产物。1hnmr(400mhz,methanol-d4)δ8.55(d,j＝1.8hz,1h),8.08(d,j＝8.8hz,1h),7.93(dd,j＝8.8,1.9hz,1h),7.28(s,2h),2.68(s,3h),2.65(s,3h).
13
c nmr(101mhz,methanol-d4)δ141.28,133.22,133.12,132.11,131.75,127.43,126.84,124.67,122.16,121.99,17.95,17.89.hrms(esi,m/z):[m-na]-calcd for target,235.0434；fond 235.0435.
[0050]
步骤h：化合物9制备
[0051]
向化合物5(86mg，0.5mmol)和碳酸钾(345mg，2.5mmol)在乙腈(5ml)中的混合物中加入碘甲烷(355mg，2.5mmol)，并在室温下搅拌该混合物过夜。然后，过滤反应混合物，并在真空中浓缩滤液。残留物用乙醚洗涤数次。将碘盐分散在3ml丙酮中，然后加入饱和的nh4pf6水溶液，直到获得澄清的溶液。将溶液进一步搅拌4小时后，减压蒸发溶剂，白色固体沉淀出
来，过滤，用水洗涤，然后干燥，得到白色固体的化合物116mg。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.35(d,j＝2.8hz,1h),8.27(d,j＝9.4hz,1h),8.15(dd,j＝9.4,2.8hz,1h),7.43(s,2h),3.74(s,9h),2.72(s,3h),2.67(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ144.53,133.82,132.66,132.27,132.02,128.83,128.71,127.84,117.86,116.53,56.88,19.34,19.25.hrms(esi,m/z):m+calcd for target,214.1590；fond 214.1594.
[0052]
步骤i：化合物10制备
[0053]
将化合物8(20.3mg，0.07mmol)溶于氘代甲醇中。加入微粒亚甲基蓝，使溶液呈现明显的蓝色。将反应混合物在冰浴中冷却至0℃。在氧气通过的同时用红光(18w，630nm)照射。反应6小时后，通过200目活性炭除去亚甲基蓝后减压蒸发溶剂得到化合物10。1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ7.79(d,j＝1.6hz,1h),7.76(dd,j＝7.8,1.7hz,1h),7.41(d,j＝7.7hz,1h),6.76
–
6.68(m,2h),1.84(s,3h),1.83(s,3h).
13
c nmr(101mhz,methanol-d4)δ143.51,143.27,141.47,139.10,138.83,124.07,119.61,117.46,78.49,78.39,14.89,14.82.hrms(esi,m/z):[m-na]-calcd for target,267.0332；fond 267.0326.
[0054]
步骤j：化合物11制备
[0055]
将化合物9(21.6mg，0.06mmol)溶于氘代甲醇中。加入微粒亚甲基蓝，使溶液呈现明显的蓝色。将反应混合物在冰浴中冷却至0℃。在氧气通过的同时用红光(18w，630nm)照射。反应6小时后，通过200目活性炭除去亚甲基蓝后减压蒸发溶剂得到化合物11。1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ7.86(d,j＝2.7hz,1h),7.81(dd,j＝8.4,2.8hz,1h),7.59(d,j＝8.4hz,1h),6.76(d,j＝2.0hz,2h),3.68(s,9h),1.91(s,3h),1.86(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ146.25,143.49,143.23,139.74,139.48,121.84,119.17,113.51,78.86,78.34,57.04,16.30,16.13.hrms(esi,m/z):m+calcd for target,246.1488；fond 246.1493.
[0056]
实施例2
[0057]
内过氧化物的体外单线态氧释放实验。使用sosg作为单线态氧捕获试剂，将内过氧化物(0.5mm)与sosg(1.25μm)混合，使用激发光504nm检测单线态氧的释放情况。如图1、2、3所示分别为内过氧化合物10、11以及空白对照组的单线态氧释放情况，横坐标为波长，纵坐标为单线态氧释放强度变化。图4为单线态氧释放情况分析图，结果表明内过氧化合物可以快速释放单线态氧。
[0058]
实施例3
[0059]
37℃下内过氧化合物环还原反应速率实验。如图5、6所示，分别为内过氧化合物10、11向化合物8、9转化时1h nmr的变化，溶剂为氘代甲醇，并根据内过氧化合物的含量随时间的变化进行半衰期的计算，根据所选峰的归一化积分值的出现/消失，观察到化合物10在37℃下具有2.0小时的半衰期，化合物11在37℃下具有3.3小时的半衰期。速率常数和半衰期的计算是根据一阶反应速率方程进行的。方程式如下：
[0060]
ln[a]＝ln[a0]-kt
[0061]
t
1/2
＝0.693/k
[0062]
方程式中，a为t时刻内过氧化合物占体系中总物质的百分比，a0为内过氧化合物起始含量，k为反应速率常数，t
1/2
为为半衰期。根据测试结果所得方程如图7、8所示。
[0063]
实施例4
[0064]
内过氧化合物10与内过氧化合物11的体外抗凝血测试是在37℃下使用无菌抗凝
绵羊血(柠檬酸钠：血，1/9，v/v)进行的，为了精确分离单线态氧对测试凝血参数的影响，分别使用化合物8和化合物9作为内过氧化合物10和内过氧化合物11的对照，将化合物与绵羊血浆共同孵育30min。然后，活化部分凝血活酶时间(aptt)、凝血酶原时间(pt)、凝血酶时间(tt)和纤维蛋白原(fib)使用血液凝固分析仪(pun-2048b)通过相应测定试剂盒进行测试。每组测试重复三次(n＝3)，结果显示为平均值
±
标准偏差(sd)。凝血测试结果如图9、10所示，横坐标为用于测试的化合物的最终浓度(0-10mm)，纵坐标为相应凝血参数的测试结果。由测试结果可知，两类内过氧化合物相比于其对照化合物均表现出呈浓度依赖性的tt、fib时间延长，fib浓度降低，表明所设计的两类内过氧化合物降低了正常纤维蛋白原的含量或是影响了纤维蛋白原向纤维蛋白转化的能力，具有抑制凝血与增强纤溶的显著效果，因此，我们设计的两类单线态氧抗凝剂具有较大的应用潜力。

技术特征：
1.基于内过氧化物的抗凝剂，其特征在于，所述抗凝剂具有如下结构：其中，各自独立为或者r
1-r3，r
5-r7，r
9-r
11
各自独立的为氢、羟基、三甲基硅基、氨基、碳原子数为2-6的烯基、碳原子数为2-6的炔基、碳原子数为1-2的烷氧基、碳原子数为1-6的烷胺基、碳原子数为2-6的烷氧基烷基、碳原子数为1-6的烷基、三氟甲基、卤素、碳原子数为2-6的烷氧基羰基、碳原子数为6-15的芳基、碳原子数为3-10的杂环烷基或者其中，x为1-2000的整数；r4，r8，r
12
各自独立的为或者其中，n1与n2的和各自独立的为0-6的整数，n为0-6的整数，m为0-10的整数；y
+
为一价阳离子，z-为一价阴离子。2.根据权利要求1所述的基于内过氧化物的抗凝剂，其特征在于，r
1-r3，r
5-r7，r
9-r
11
各自独立的为氢、羟基、三甲基硅基、氨基、碳原子数为1-6的烷基、碳原子数为6-20的芳基或者其中，x为5-200的整数；r4，r8，r
12
各自独立的为或者其中，n1与n2的和各自独立的为0-6的整数，m为0-10的整数，n为0-6的整数；y
+
为na
+
、k
+
或者nh
4+
；z-为pf
6-、bf
4-、cl-、br-、i-、no
3-、clo
4-、ch3coo-、ch3so
3-或者cf3so
3-。3.根据权利要求2所述的基于内过氧化物的抗凝剂，其特征在于，r
1-r3，r
5-r7，r
9-r
11
各自独立的为氢、羟基、三甲基硅基、氨基、碳原子数为1-6的烷基、碳原子数为6-10的芳基或者其中，x为5-200的整数；r4，r8，r
12
各自独立的为或者其中，n1与n2的和各自独立的为0-6的整
数，m为0-10的整数，n为0-6的整数；y
+
为na
+
，z-为pf
6-。4.根据权利要求3所述的基于内过氧化物的抗凝剂，其特征在于，r
1-r3，r
5-r7，r
9-r
11
各自独立的为氢、羟基、三甲基硅基、氨基、碳原子数为1-6的烷基、苯基或者其中，x为5-200的整数；r4，r8，r
12
各自独立的为其中，n为0-6的整数；y
+
为na
+
；z-为pf
6-。5.根据权利要求4所述的基于内过氧化物的抗凝剂，其特征在于，r
1-r3，r
5-r7，r
9-r
11
各自独立的为氢、碳原子数为1-6的烷基；r4，r8，r
12
各自独立的为其中，n为0-6的整数；y
+
为na
+
；z-为pf
6-。6.根据权利要求1-5任意一项所述的基于内过氧化物的抗凝剂在制备作为单线态氧载体递送单线态氧药物中的应用。7.根据权利要求1-5任意一项所述的基于内过氧化物的抗凝剂在制备增强凝血抑制与激活纤溶活性的药物中的应用。

技术总结
基于内过氧化物的抗凝剂及应用，属于生物医药领域。设计的抗凝剂由萘类内过氧分子和水溶性离子型基团组成（季铵盐和磺酸盐）。离子型基团的引入增加了单线态氧抗凝剂溶于血浆的能力，内过氧结构作为单线态氧载体可热循环逆转释放单线态氧，所设计的两类离子型萘类内过氧化合物均能降低纤维蛋白原的含量或是影响纤维蛋白原向纤维蛋白转化的能力，表现出抑制凝血与增强纤溶的显著效果。因此，我们设计的两类离子型萘类单线态氧抗凝剂具有较大的应用前景。用前景。用前景。


技术研发人员：安晋U.阿卡亚 王星旗 王磊
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/8/24