一株罗伊氏乳杆菌在制备防治急性辐射肠损伤功能产品中的应用

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1.本发明属于微生物技术领域以及医药技术领域，涉及一株母乳来源罗伊氏乳杆菌在制备防治急性辐射肠损伤功能产品中的应用。


背景技术：

2.盆腔癌是指发生在盆腔内的癌症(即从腰椎l4至肛门边缘)，包括妇科肿瘤、泌尿系肿瘤或下消化道肿瘤。放疗常用于腹腔和盆腔癌的治疗。在腹腔或盆骨肿瘤的放射治疗中，部分小肠、结肠或直肠不可避免地包括在治疗范围内，胃肠道副反应在其中较为常见，超过70％的患者会出现急性胃肠道症状。急性放疗性肠损伤患者主要会出现腹泻、腹痛、便秘、便血、体重减轻等症。急性辐射肠损伤的进展与不同的病理机制有关，辐射对肠道的总体急性后果是紧密连接完整性降低，隐窝上皮细胞以及绒毛上部细胞死亡，这取决于辐射强度。这些作用可导致炎症的发展和黏膜屏障的破坏，使腔内内容物，特别是微生物，涌入固有层，引发进一步的炎症。
3.由于越来越多的腹部和盆腔癌症接受了放疗，放射治疗或放疗引起的胃肠道疾病(包括腹泻)的发病率也随之上升。腹、盆腔、腹膜后恶性肿瘤的发生率居高不下，在治疗方案的选择中，放射治疗的作用不可或缺。在英国，每年有17000名患者接受盆腔放疗；事实上，在发达国家，估计每年有15万到30万患者接受这种治疗。然而“物理精准”的运用并不能完全地解决射线照射对周边正常器官、结构等的毒性所造成的严重不良反应。随着盆腔癌长期生存者数量的持续增长，减少副作用的策略也被认为变得越来越重要。
4.目前针对盆腔放疗产生的肠道损害的治疗，主要包括营养支持、药物治疗、益生菌制剂、高压氧治疗、内镜治疗、手术治疗、干细胞治疗。2019年癌症支持治疗多国协会(mulinational association of supportive care in cancer,mascc)更新了指南，建议使用含乳杆菌属的益生菌预防放疗引起的腹泻。乳杆菌属可以维持肠道机械和免疫屏障，肠道经照射后紧密连接蛋白的表达及黏液层的厚度减少，肠道通透性增加，而乳杆菌属可以上调肠紧密连接蛋白zo-1和封闭蛋白，促进杯状细胞产生黏液，从而维护肠道健康。
5.乳杆菌保护肠道黏膜的作用具有菌株依赖性，亟需发现可保护肠黏膜发挥治疗和预防急性辐射肠损伤的乳杆菌。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一株罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)fn041的新用途，用于缓解急性辐射肠损伤。
7.为了实现上述目的，本发明提供一株罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)fn041在制备用于目标人群预防和/或治疗放疗后急性辐射肠损伤的产品中的应用；所述目标人群为盆腔放疗患者。
8.本发明所述罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)fn041保藏于广东省微生物
菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.60546，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。所述罗伊氏乳杆菌fn041已公开于公开号为cn110205261a的专利文献中。
9.本发明所述预防和/或治疗急性辐射肠损伤包括(a)～(e)所示任一：
10.(a)减轻放疗后的腹泻、腹胀情况；
11.(b)减轻放疗后的体重减轻；
12.(c)降低炎性细胞浸润，重塑肠隐窝结构；
13.(d)减轻肠通透性的改变；
14.(e)增强紧密连接蛋白的表达，改善肠屏障功能。
15.本发明所述产品的使用时期为放疗之前以及放疗全程。
16.本发明所述产品包括但不限于食品、药物或药物组合物和/或保健品。
17.本发明所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的冻干保护剂、赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。
18.本发明所述食品包括含有所述罗伊氏乳杆菌的固体饮料、片剂、软糖果和滴剂，以及使用含有罗伊氏乳杆菌的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、果蔬制品或饮料。
19.在一种实施方式中，所述食品、保健品中还包含常规辅料，所述辅料包括冻干保护剂、填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂以及营养强化剂中的一种或多种。
20.本发明所述产品以活菌数不低于1
×
109cfu/天的剂量提供给盆腔放疗患者。
21.本发明所述罗伊氏乳杆菌的形态包括活细胞、失活的细胞或罗伊氏乳杆菌的发酵产物或代谢物的形式，或上述任一所述形态的混合物形式。
22.本发明所述产品中罗伊氏乳杆菌的含量不低于1
×
109cfu/ml或1
×
109cfu/g。
23.本发明所述产品的剂型包括但不限于：片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、液体或果冻。
24.本发明与现有技术相比，提供了罗伊氏乳杆菌fn041在缓解急性辐射肠损伤中的新用途，效果良好，通过动物实验得知，罗伊氏乳杆菌fn041具有预防急性辐射肠损伤的作用，在制备用于目标人群预防和/或治疗放疗后急性辐射肠损伤的产品中具有巨大的应用前景。
25.动物实验表明：
26.(1)小鼠从辐射前一周开始服用罗伊氏乳杆菌fn041可预防急性辐射肠损伤，表现为显著抑制小鼠体重减轻，减轻小鼠辐射后腹泻症状；
27.(2)小鼠从辐射前一周开始服用罗伊氏乳杆菌fn041，可改善小鼠肠黏膜肿胀程度和炎性细胞浸润水平，重塑肠隐窝形态；
28.(3)小鼠从辐射前一周开始服用罗伊氏乳杆菌fn041可降低小鼠的肠上皮通透性；
29.(4)小鼠从辐射前一周开始服用罗伊氏乳杆菌fn041可增强紧密连接蛋白的表达，改善肠屏障功能。
30.人群试验表明：在给患盆腔放疗患者服用含有罗伊氏乳杆菌fn041的益生菌菌粉之后，可以调整患者的菌群失调、显著降低患者的腹泻功能状态评分(kps)、腹泻频率。
附图说明：
31.图1为本发明涉及的实施例1罗伊氏乳杆菌fn041对预防辐射肠损伤影响的实验过程示意图。
32.图2为本发明涉及的实施例1罗伊氏乳杆菌fn041对预防辐射肠损伤影响的实验结果示意图，其中，a为小鼠的体重监测图；b为各组小鼠的结肠切片图；c为各组小鼠结肠病理切片图；d为各组小鼠结肠损伤评分图。
33.图3为本发明涉及的实施例2罗伊氏乳杆菌fn041对辐射小鼠肠屏障的影响实验结果示意图，其中，a为结肠组织ab-pas染色；b为结肠组织粘液素2(muc2)免疫荧光染色；c为结肠隐窝深度测量；d为结肠隐窝中杯状细胞染色强度统计；e为结肠组织中muc2染色强度统计；f为zo-1与封闭蛋白免疫荧光染色。
34.图4为本发明涉及的实施例3罗伊氏乳杆菌fn041对肠道黏膜炎症因子的影响实验结果示意图，其中，a为血清脂多糖的含量；b为血清二胺氧化酶的含量；c为肠组织中白介素6的含量；d为肠组织中肿瘤坏死因子α的含量。
35.图5为本发明涉及的实施例4中fn041缓解盆腔放疗病人腹泻效果研究临床试验流程图。
具体实施方式：
36.下面通过具体实施例并结合附图对本发明进行进一步的阐述。
37.下述实施例中涉及的酶水解脱脂乳、葡萄糖﹑胰蛋白胨与酵母浸膏购自上海医药集团股份有限公司。
38.下述实施例中涉及的检测方法如下：
39.活菌数的检测方法：采用国标《gb 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
40.下述实施例中所使用的罗伊氏乳杆菌fn041公开于专利公开号为cn110205261a的专利文献中。
41.实施例l：
42.本实施例涉及罗伊氏乳杆菌fn041对预防辐射肠损伤影响的实验，具体实验过程如下：
43.将8周龄雄性c57bl6j小鼠60只饲养在聚丙烯笼子中，适应性喂养一周以后随机分为4组，分别为：空白组(cn)、辐射模型组(tai)、辐射且灌胃罗伊氏乳杆菌fn041组(fn041)、辐射且灌胃鼠李糖乳杆菌gg组(lgg)，其中，fn041组、lgg组均为治疗组。
44.在辐射前一周开始灌胃治疗：空白组和辐射模型组灌胃pbs(每天1次，每次200μl)，fn041组每天灌胃罗伊氏乳杆菌fn041(1
×
109cfu/天，每天1次，每次200μl)，lgg组每天灌胃鼠李糖乳杆菌gg(1
×
109cfu/天，每天1次，每次200μl)；后辐射模型组、fn041组和lgg组进行辐射处理，待小鼠麻醉后，置于6-mv直线加速器进行x线腹部辐射，暴露全部腹部，照射野为胸骨剑突至耻骨联合，在500cgy/min的剂量率下照射，总照射剂量为12gy，持续2.4分钟；空白对照组不进行辐射。继续灌胃饲养，辐射后3.5天处死小鼠(每组5只)，剩余小鼠做30天生存实验，继续灌胃干预，直至整个生存实验期结束。在整个实验过程中对小鼠体重进行监测，对处死小鼠的结肠进行组织学分析，实验结果如图2所示。
45.由图2可知，辐射后，fn041组与lgg组两个治疗组显著抑制了小鼠的体重减轻(p《0.05)(图2a)，与lgg组相比，罗伊氏乳杆菌fn041组小鼠生存率更高，辐射后小鼠体重恢复得更快。在辐射后第3.5天，辐射使小鼠肠内固体容物减少，内有水样内容物，小鼠结肠切片
(图2b)显示，fn041干预减轻了辐射肠损伤程度。通过小鼠结肠切片he染色(图2c)可以看出，辐射模型组小鼠结肠存在炎性细胞浸润和上皮细胞损伤。与辐射模型组比较，fn041组结肠上皮细胞炎性细胞浸润和损伤显著改善。
46.实施例2：
47.本实施例涉及罗伊氏乳杆菌fn041对辐射小鼠肠屏障的影响实验，具体实验过程同实施例1，对辐射后3.5天处死小鼠的结肠组织进行免疫荧光和免疫组化屏障相关蛋白检测，结果如图3所示。
48.从图3可以看出，利用免疫荧光和免疫组化技术检测结肠组织中屏障相关蛋白，评估fn041对tai诱导急性辐射肠损伤小鼠屏障功能的影响结果表明，与辐射模型组小鼠相比，fn041组小鼠经罗伊氏乳杆菌fn041预处理干预后，改善了辐照导致的隐窝变深，隐窝深度恢复至正常水平(p＜0.05)，同时杯状细胞的数量增加，对应的结肠中muc2的表达增强(p＜0.05)。辐射模型组处理的小鼠肠道紧密连接蛋白zo-1与封闭蛋白的表达在辐射后降低，而fn041组在用fn041预处理的小鼠中，zo-1和封闭蛋白的表达恢复，与空白组处理小鼠相似，这些数据表明，辐射导致肠屏障被破坏，而fn041干预能够维持肠道屏障完整性。
49.实施例3：
50.本实施例涉及罗伊氏乳杆菌fn041对结肠炎症因子的影响实验，具体实验过程同实施例1，对辐射后3.5天处死的各组小鼠的结肠炎性因子进行检测，结果如图4所示。
51.从图4可看出，fn041组的白介素6水平和肿瘤坏死因子α水平均低于辐射模型组，说明罗伊氏乳杆菌fn041的干预显著降低了辐射后小鼠结肠中白介素6水平(p《0.05)。fn041组的脂多糖的水平相比于单纯辐射组要低(p＜0.05)，说明罗伊氏乳杆菌fn041的干预能够抑制小鼠肠通透性的增加。此外，罗伊氏乳杆菌fn041对血清二胺氧化酶水平有降低趋势。
52.实施例4：
53.本实施例涉及罗伊氏乳杆菌fn041对盆腔放疗患者腹泻的影响试验，具体试验过程如下：
54.本次临床试验共招募41名盆腔放疗患者，所有患者被随机分为2组，对照组:18例患者采用单纯放疗(20人)；试验组:18例患者采用放疗+预防性口服罗伊氏乳杆菌fn041固体饮料(21人)。每例患者均放疗2个周期(6周)以上，试验组患者从放疗前1天开始口服罗伊氏乳杆菌fn041固体饮料1条，每日1次，连服6周。放疗之前常规查血生化、便常规等。其中，对照组仅放疗；试验组服用的是含有罗伊氏乳杆菌fn041(活菌数1
×
109cfu/条)的益生菌固体饮料。
55.患者纳入标准为：1)经细胞学或病理结果证实的腹部或盆腔的恶性肿瘤患者，诊断明确；2)接受强放射治疗，盆腔腹部受到部分或全部照射；3)kps评分》70分；4)无放疗禁忌症，可耐受放射治疗；5)生存时间》3个月，能准确地进行急性放射性肠道损伤的评估。
56.排除标准：1)放疗中断，因故未完成放疗者或射野范围内危及器官未涉及小肠；2)既往有炎症性肠病病史，并在急性观察期内发作；3)肿瘤累及压迫肠管者；4)随访期间难以进行准确评估急性放射性肠道损伤分级者；5)放疗前已存在腹泻(这种腹泻不是由于放疗相关性腹泻，而是由肿瘤本身引起的)的病例。
57.在整个试验过程中，罗伊氏乳杆菌fn041给菌方式为益生菌固体饮料，用量为1条/
天。
58.试验预备期1周，临床试验期6周，共计7周。
59.预备期：在试验前1周联系盆腔放放疗患者，统计有意参与试验人数，向患者及其家属解释说明试验性质和内容，签订知情同意书，同时协调医院和医生的时间，以及准备试验所需的材料。
60.临床试验期：经过医生确诊、自愿、家属同意参加试验的患者，服用益生菌固体饮料，持续6周。实验前对患者及家属进行一次集中教育，说明引起急性放射肠损伤的原因和饮食、生活中避免腹泻的措施，希望他们在试验期间坚持相应原则。
61.在预备期结束后、临床试验初和结束后，进行诊断。记录腹泻次数，对患者进行kps评分，记录不良反应。采用菌群失调、kps评分和腹泻频率等评估对轻度急性辐射肠损伤程度，包括：
62.1.患者的大便标本用无菌容器盛放，进行革兰染色，对菌群分布情况进行百分比测定，革兰染色阳性球菌≥50％界定为菌群失调；
63.2.腹泻的诊断标准和分级
64.腹泻是指排便次数增多＞3次/天或每日总量＞200g，粪质稀薄，含水量＞80％。临床典型表现为放疗期间出现无痛性腹泻或伴轻度腹痛，水样便，一天数次或数十次；
65.3.腹泻的分级标准按照nci ctc3.0标准统一判定:
66.①ⅰ
级:大便次数增加(＜4次/天)，排出物量轻度增加；
67.②ⅱ
级:大便次数增加(4～6次/天)，排出物量中度增加，不影响日常生活；
68.③ⅲ
级:大便次数增加(≥7次/天)，失禁，需24小时静脉补液，并住院治疗，排出物量重度增加，影响日常生活；
69.④ⅳ
级:危及生命(如血液动力学衰竭)；
70.观察指标:菌群失调的情况，放疗前后患者腹泻功能状态评分(kps)的变化及腹泻的频率。
71.本实施例的临床试验流程如图5所示，排除5名患者，最终共36名完成了临床研究，试验组患者除却正常放疗外还服用6周的益生菌固体饮料，对照组患者仅放疗。试验组3例(16.7％)发生菌群失调，而对照组有9例(50％)发生菌群失调，2组比较差异有统计学意义(p＜0.05)，两组患者kps的变化如表1所示，服用益生菌固体饮料组放疗前后kps无明显变化，差异无统计学意义。对照组放疗后kps明显下降，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明放疗联合罗伊氏乳杆菌fn041固体饮料可稳定和改善患者的生活质量。
72.表1放疗前后患者腹泻功能状态评分(kps)
[0073][0074]
两组患者放疗后腹泻的发生率及分级结果见表2。从表2可以看出，服用益生菌固体饮料的试验组ⅰ～ⅱ级腹泻发生率为33.3％，对照组为50％，两组差异有统计学意义(p＜0.01)。服用益生菌固体饮料的试验组ⅲ～ⅳ级腹泻发生率为5.5％，对照组为27.8％，差异
有统计学意义(p＜0.01)。说明罗伊氏乳杆菌fn041能够缓解放疗引起的腹泻。
[0075]
表2放疗后患者腹泻发生率和腹泻分级
[0076][0077]
实施例5：
[0078]
本实施例涉及含有罗伊氏乳杆菌fn041的发酵果蔬饮料的制备方法，具体步骤如下：
[0079]
先将新鲜蔬菜、水果洗净后榨汁，然后将获得的果蔬汁在温度140℃下高温热杀菌2秒后立即降温到温度约42℃，按106cfu/ml果蔬汁接种罗伊氏乳杆菌fn041，最后将接种后的果蔬汁于在42℃下发酵16h，即得含有罗伊氏乳杆菌fn041活菌的发酵果蔬饮料。
[0080]
经检测，此含有罗伊氏乳杆菌fn041活菌的发酵果蔬饮料的ph为3.6，活菌数可达l.5
×
109cfu/ml。
[0081]
将此含有罗伊氏乳杆菌fn041活菌的发酵果蔬饮料连续一周给盆腔放疗的患者服用，可有效调整菌群失调，也可降低患者kps和腹泻率，使患者症状与生活质量出现明显的改善。
[0082]
实施例6：
[0083]
本实施例涉及含有罗伊氏乳杆菌fn041的发酵乳的制备方法，具体步骤如下：
[0084]
先将乳中(脱脂奶、鲜奶、复原奶等)添加2％酪蛋白肽，后经95℃、20分钟或140℃、2秒钟的高强度热处理后冷却至40℃，然后将罗伊氏乳杆菌fn041按照体积百分比3～5％的接种量接种到灭菌后的乳中，再在接种了罗伊氏乳杆菌fn041的乳中按照体积百分比3～5％的接种量接种可共生的制备酸奶的商业发酵剂保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌，最后将接种后的乳于42℃混菌发酵4小时，即得到含有本发明罗伊氏乳杆菌fn041活菌的发酵乳。
[0085]
经检测，此含有罗伊氏乳杆菌fn041活菌发酵乳的滴定酸度达到了75
°
t，活菌数达到了1
×
109cfu/ml。
[0086]
将此含有罗伊氏乳杆菌fn041活菌的发酵乳连续一周给盆腔放疗的患者服用，可有效调整菌群失调，也可降低患者kps和腹泻率，使患者症状与生活质量出现明显的改善。

技术特征：
1.罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，罗伊氏乳杆菌fn041能够减轻放疗后的腹泻情况；和/或减轻体重降低；和/或降低炎性细胞浸润，重塑肠隐窝结构；和/或减轻肠通透性的改变；和/或增强紧密连接蛋白的表达，改善肠屏障功能；所述罗伊氏乳杆菌fn041保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：60546。2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述产品的使用时期为放疗前以及放疗期间持续使用。3.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述产品包括但不限于食品、药物或药物组合物和/或保健品。4.根据权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。5.根据权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述食品包括含有所述罗伊氏乳杆菌的固体饮料、片剂、软糖果和滴剂，以及使用含有罗伊氏乳杆菌的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、果蔬制品或饮料。6.根据权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述食品、保健品中还包含常规辅料，所述辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂以及营养强化剂中的一种或多种。7.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述产品以活菌数不低于1
×
109cfu/天的剂量提供给盆腔放疗患者。8.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌的形态包括活细胞、失活的细胞或罗伊氏乳杆菌的发酵产物或代谢物的形式，或上述任一所述形态的混合物形式。9.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述产品中罗伊氏乳杆菌的含量不低于1
×
109cfu/ml或1
×
109cfu/g。10.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌fn041在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的产品中的应用，其特征在于，所述产品的剂型包括但不限于：片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、液体或果冻。

技术总结
本发明属于微生物技术领域以及医药技术领域，涉及一种母乳来源罗伊氏乳杆菌在制备防治急性辐射肠损伤功能产品中的应用。本发明提供了罗伊氏乳杆菌FN041在预防和/或治疗急性辐射肠损伤中的新用途，可以预防小鼠急性辐射肠损伤的发生，抑制小鼠体重减轻和炎症等；显著提高小鼠结肠杯状细胞的数量以及Muc2的表达，促进肠屏障的恢复；同时，可调整菌群失调，改善盆腔放疗患者的KPS指数、降低患者腹泻频率。因此，罗伊氏乳杆菌FN041在制备预防和/或治疗急性辐射肠损伤中具有巨大的应用前景。治疗急性辐射肠损伤中具有巨大的应用前景。


技术研发人员：孙进 齐策 钟凤
受保护的技术使用者：青岛大学
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/8/24