新型羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法与流程

新型羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2020年11月30日提交的美国专利申请号63/119226的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
1.本披露涉及向植物赋予除草剂抗性或耐受性的新型羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)多肽以及编码其的核酸序列。本发明的方法涉及表达这些突变体hppd多肽并且对hppd除草剂具有抗性的植物的产生和用途。序列表
2.本技术附有标题为82212-wo-hppd_st25.txt的序列表，创建于2021年11月12日，大小为约612kb，并且通过引用以其整体并入本文。本序列表随同此申请经由efs-web提交，并且符合37c.f.r.
§
1.824(a)(2)-(6)和(b)。


背景技术：

3.羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)是催化对羟基苯丙酮酸(hpp)转化成尿黑酸盐的反应的酶。该反应在酶结合的铁(fe
2+
)和氧的存在下进行。通过抑制hppd来发挥作用的除草剂是熟知的，并且包括异噁唑、二酮腈、三酮和吡唑啉酸盐(pyrazolinate)(hawkes“hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(hppd)
–
the herbicide target[羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)
–
除草剂靶标].”,modern crop protection compounds[现代作物保护化合物].和schirmer编辑.魏因海姆,德国:wiley-vch[威利-vch出版社],2007.第4.2章,第211-220页)。hppd的抑制阻断从酪氨酸生物合成质体醌(pq)。pq是类胡萝卜素色素生物合成中的必需辅因子，类胡萝卜素色素是光合中心的光保护所必需的。抑制hppd的除草剂是韧皮部可移动的漂白剂，它们引起暴露于光的新的分生组织和叶子显现出白色。在不存在类胡萝卜素的情况下，叶绿素是光破坏性的并且经由单线态氧的光生作用自身变为光化裂解剂。
[0004]
用于提供耐受hppd除草剂的植物的方法也是已知的。这些方法包括：1)在植物中过表达hppd酶以产生关于给定除草剂足量的hppd酶，以具有足够的功能性酶可用于使该植物尽管在该除草剂存在下仍可成长；以及2)使特定hppd酶突变为对除草剂的抑制不太敏感的酶。用于使hppd酶突变以改进hppd除草剂耐受性的方法已有描述(参见例如，pct申请号wo 99/24585和wo 2009/144079)，并且植物hppd酶的一些特定突变(例如，拟南芥(arabidopsis)hppd序列中g422的突变)据称能够提供某种程度的对硝磺草酮和其他三酮除草剂的耐受性。然而，迄今所报道的酶动力学和全植物数据不足以推断出所报道的突变性变化是否赋予超过一种或多种相应野生型酶的商业上显著的益处。
[0005]
此外，尽管特定hppd酶可能提供对一些hppd抑制剂除草剂的有用水平的耐受性，但是相同的hppd可能相当不足以提供商业水平的对不同的更所期望的hppd抑制剂除草剂的耐受性(参见例如，美国专利申请公开号20040058427；pct公开号wo 98/20144和wo 02/
46387；还参见美国专利申请公开号20050246800，其涉及具有相对hppd耐受性的大豆品种的鉴定和标记)。此外，申请人期望具有改进的抗性的来自冷气候草(cool-climate grass)的hppd的突变形式。这样的突变体将是非常期望的，因为来自冷气候草的hppd在一些情况下可能优于其他类型(参见例如，pct申请号wo 02/46387和hawkes等人2001,proc.brit.crop prot.conf.weeds[英国作物保护会议论文集
‑‑
杂草]2,563)。因此，需要用于向不同的作物和作物品种赋予商业水平的hppd除草剂耐受性的新的方法和组合物。


技术实现要素：

[0006]
提供用于向植物赋予羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)除草剂抗性或耐受性的组合物和方法。这些组合物包括hppd多肽的核苷酸和氨基酸序列。在某些实施例中，本发明的多肽包括源自植物的新型hppd，这些hppd当在其他植物中异源表达时赋予对某些类别的抑制hppd的除草剂的抗性或耐受性。在特定实施例中，这些hppd包括seq id no:4至63和122至125所示的氨基酸序列，以及具有与seq id no:4-63和122-125中任一个的至少约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％序列同一性并展现hppd酶活性的新型多肽。
[0007]
示例性新型hppd同样是与现有技术的hppd酶相比展现对一个或多个类型的hppd除草剂的更高耐受性的那些，其中耐受性通过参数(k
off x k
cat
/k
m hpp
)的数值在体外表征，并且其中k
off
是控制hppd酶与除草剂的复合物的解离速率的速率常数，并且k
cat
/k
m hpp
是催化转化数除以底物hpp(4-羟苯丙酮酸)的km值。
[0008]
在本发明的另外的实施例中，因此还提供一种用于表征和选择赋予更高水平的对hppd除草剂的耐受性的hppd的体外方法，该方法基于测量和比较k
cat
/k
m hpp和k
off
或这些参数的功能等同物的值。
[0009]
在另外的实施例中，本发明的多肽是源自植物的催化活性的突变体hppd，并且这些多肽相对于相似的未突变酶赋予对某些类别的抑制hppd的除草剂的更高水平的抗性或耐受性。在特定实施例中，这些突变体hppd多肽包含选自seq id no:59-63的一个或多个氨基酸序列，其中seq id no:59-63具有如下所述的一个或多个氨基酸取代，并且其中seq id no:59-63的氨基酸取代的位置基于该序列与参考序列seq id no:1的比对：
[0010]
在一些实施例中，该突变体hppd可能源自单子叶植物，并且特别是源自凉爽气候草物种，如小麦、大麦、燕麦或黑麦。在一些实施例中，该突变体hppd可能源自黑麦草属(lolium)、阿披拉草属(apera)、狗尾草属(setaria)、燕麦属(avena)、早熟禾属(poa)、看麦娘属(alopecurus)或高粱属(sorghum)物种。在一些实施例中，该突变体hppd可能源自燕麦属、阿披拉草属或看麦娘属物种。示例性物种包括燕麦(avena sativa)、阿披拉草(apera spica)和大穗看麦娘(alopecurus myosuroides)。在一个实施例中，该突变体hppd可能源自seq id no:1-3的hppd多肽中的一种或多种。
[0011]
根据本发明的示例性hppd多肽和突变体hppd多肽对应于seq id no:4-63和122至125所示的氨基酸序列及其变体和功能片段。进一步提供包含编码本发明的这些特定hppd多肽的多核苷酸序列的核酸分子，例如，在seq id no:64-118和128-133。组合物还包括表达盒，该表达盒包含与编码本发明的hppd多肽的核苷酸序列可操作地连接的启动子，该核苷酸序列是单独的或与编码赋予所期望的性状的多肽的一种或多种另外的核酸分子组合，例如，seq id no:119-121。进一步提供包含本发明的表达盒的转化的植物、植物细胞和种子。本发明的实施例还可以包括用于编辑编码本文披露的特定hppd多肽的内源多核苷酸序列的组合物和方法。
[0012]
在针对向植物赋予除草剂抗性或耐受性、特别是对某些类别的抑制hppd的除草剂的抗性或耐受性的方法中，本发明的组合物是有用的。在特定实施例中，这些方法包括向植物中引入至少一种表达盒，该表达盒包含与编码本发明的hppd多肽的核苷酸序列可操作地连接的启动子。作为结果，该hppd多肽在该植物中表达，并且由于该hppd是基于其对抑制hppd的除草剂不太敏感而被选择，这导致该植物展现对抑制hppd的除草剂显著改进的抗性或耐受性。
[0013]
本发明的方法还包括选择性地控制作物场所的田地中的杂草。在一个实施例中，这样的方法涉及杂草控制量的hppd除草剂在含有表达本发明的hppd多肽的植物的作物场所的田地中的过多苗前或苗后施用。在其他实施例中，还提供用于本发明的hppd的测定、表征、鉴定和选择的方法。序列表说明
[0014]
seq id no:1是来自燕麦的天然hppd蛋白。
[0015]
seq id no:2是来自阿披拉草的天然hppd蛋白。
[0016]
seq id no:3是来自大穗看麦娘的天然hppd蛋白。
[0017]
seq id no:4是人工燕麦hppd蛋白，其被产生以包括相对于seq id no:1的天然燕麦hppd蛋白在a111处的缺失。
[0018]
seq id no:5-58是人工突变的hppd蛋白，其包含相对于相应天然hppd蛋白在所指示修饰位置加以修饰的氨基酸序列。
[0019]
seq id no:59-63是人工hppd多肽基序。
[0020]
seq id no:64-118是人工多核苷酸序列，其分别编码seq id no:4-58的突变的hppd蛋白。
[0021]
seq id no:119-121是人工dna序列，其分别对应于用于表达seq id no:11、14和17的突变的hppd蛋白的载体。
[0022]
seq id no:122-127是人工突变的hppd蛋白，其包含相对于相应天然hppd蛋白在所指示修饰位置加以修饰的氨基酸序列。
[0023]
seq id no:128-133是人工多核苷酸序列，其分别编码seq id no:122-127的突变的hppd蛋白。
[0024]
seq id no:134-188是来自hppd多肽的变体、同源物、直系同源物和旁系同源物的蛋白质序列。
附图说明
[0025]
图1显示用于植物转化的二元载体pbinavenasativahppdv207的图示，该植物转化以编码seq id no:11所示的氨基酸序列的突变的hppd基因赋予hppd抗性。
[0026]
图2显示用于植物转化的二元载体pbinavenasativahppdv208的图示，该植物转化以编码seq id no:14所示的氨基酸序列的突变的hppd基因赋予hppd抗性，并且还赋予对草甘膦(选择性标志物)的耐受性。
[0027]
图3显示用于植物转化的二元载体pbinavenasativahppdv209的图示，该植物转化以编码seq id no:17所示的氨基酸序列的突变的hppd基因赋予hppd抗性，并且还赋予对草甘膦(选择性标志物)的耐受性。
[0028]
图4显示转基因植物，其由于向该植物中引入编码seq id no:14所示的氨基酸序列的突变的hppd基因而展现对抑制hppd的除草剂的改进的抗性。
[0029]
图5显示相对于表达其他突变的hppd基因的转基因植物，表达编码seq id no:14所示的氨基酸序列的突变的hppd基因的转基因植物对抑制hppd的除草剂的更高相对耐受性。
具体实施方式
[0030]
本发明提供针对向植物赋予羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)除草剂抗性和耐受性的组合物和方法。组合物包括具有hppd酶活性的天然和突变体hppd多肽的氨基酸序列，及其变体和功能片段。还提供编码本发明的突变体hppd多肽的核酸。进一步提供用于向植物赋予除草剂抗性或耐受性、特别是对某些类别的抑制hppd的除草剂的抗性或耐受性的方法。还提供用于选择性地控制作物场所的田地中的杂草以及用于提供除草剂耐受性的本发明的突变体hppd的测定、表征、鉴定和选择的方法。
[0031]
在本发明的上下文内，术语羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-hppd)和对羟基苯丙酮酸双加氧酶(p-hppd)是同义的。
[0032]“hppd除草剂”是作为漂白剂并且主要作用位点是hppd的除草剂。许多是熟知的并且描述于本文其他地方和文献中(hawkes“hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(hppd)
–
the herbicide target[羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)
–
除草剂靶标].”,modern crop protection compounds[现代作物保护化合物].和schirmer编辑.魏因海姆,德国:wiley-vch[威利-vch出版社],2007.第4.2章,第211-220页；edmunds“hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(hppd)inhibitors:triketones[羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂：三酮].”,modern crop protection compounds[现代作物保护化合物].和schirmer编辑.魏因海姆,德国:wiley-vch[威利-vch出版社],2007.第4.2章,第221-242页)。如本文所用，术语“hppd除草剂”是指直接或间接作用以抑制hppd的除草剂，其中这些除草剂是漂白剂，并且其中对hppd的抑制是该除草剂对植物的作用模式的至少一部分。
[0033]
如本文所用，在用所述除草剂处理时，基本上“耐受”除草剂的植物展现当与具有类似经历的非耐受性样植物展现的剂量/反应曲线相比时向右移位的剂量/反应曲线。这样的剂量/反应曲线的“剂量”绘制在x轴上并且“杀伤或损害百分比”、“除草效果”等绘制在y轴上。如本领域技术人员所理解，在剂量/反应曲线上向右移位意味着，需要更高剂量的物质才能产生类似的反应。耐受性植物典型地将需要非耐受性样植物所需至少两倍的除草剂才能产生给定的除草效果。在以农业社区杀伤田地中的杂草典型地采用的浓度和比率经历除草剂时，对除草剂基本上“抗性”的植物展现极少(如果有的话)坏死、裂解、萎黄病或其他病变，或者至少不会显著影响植物产量。
[0034]
如本文所用，“非转基因样植物”是与转基因植物类似或相同但不含赋予除草剂抗性的转基因的植物。
[0035]
如本文所用，术语“赋予”是指向植物提供特征或性状，如除草剂耐受性或抗性和/或其他所期望的性状。
[0036]
如本文所用，关于序列的“异源的”是这样的序列，该序列源自外来物种，或者如果源自同一物种，则通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座方面对其天然形式进行实质性修饰。因此，在关于基因或核酸使用时，“异源的”是指编码因子的基因不在其自然环境中(即，已经人为改变)。例如，异源基因可以包括从一个物种引入另一个物种中的基因。异源基因还可以包括对生物来说是天然的基因，该基因已经以某种方式加以改变(例如，突变、以多个拷贝添加、连接至非天然启动子或增强子多核苷酸等)。异源基因还可以包括包含植物基因的cdna形式的植物基因多核苷酸；这些cdna可以以有义(以产生mrna)或反义取
向(以产生与mrna转录物互补的反义rna转录物)来表达。在本发明的一个方面，异源基因与内源性植物基因的区别在于，该异源基因多核苷酸典型地与包含调节元件如启动子的多核苷酸接合，未发现这些多核苷酸与该异源基因编码的蛋白质的基因或与染色体中的植物基因多核苷酸天然地相关联，或者这些多核苷酸与在自然界中未发现的染色体的部分(例如，在通常不表达该基因的基因座中表达的基因)相关联。另外，在实施例中，“异源的”多核苷酸是不与引入它的宿主细胞天然地相关联的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多个拷贝。
[0037]
如本文所用，嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。在特定实施例中，术语“异源的”意指来自另一来源，如来自另一生物体或另一植物(如不同物种或同一物种的另一植物)。在dna的情况下，“异源的”是指任何外来“非自身”dna，包括来自同一物种的另一植物的dna。
[0038]
冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”在本文中用于指代一个/一种或超过一个/超过一种(即，指代至少一个/至少一种)该冠词的语法宾语。举例来说，“一个要素”意指一个或多个要素。在整个说明书中，词语“包含(comprising)”或变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意指包括所述的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组，但是不排除任何其他要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。
[0039]
多个另外的术语定义或以其他方式表征于本文中。
[0040]
hppd序列
[0041]
本文披露的组合物包括分离的或基本上纯化的hppd多核苷酸和hppd多肽以及包含这些hppd多核苷酸并表达所编码的hppd多肽的宿主细胞。特别地，本发明提供hppd多肽及其变体和片段，这些hppd多肽具有hppd酶活性并且在植物中赋予对某些类别的抑制hppd的除草剂的增强的抗性或耐受性。还提供编码本发明的hppd多肽的核酸。
[0042]
本披露的突变体hppd多肽相对于衍生出它们的天然野生型hppd酶序列具有一个或多个位置处的氨基酸变化，并且展现相对于其未突变的对应物以及相对于其他突变体hppd增强的对一种或多种hppd抑制剂除草剂的耐受性。展现对hppd除草剂的增强的耐受性的hppd酶可能是由于相对于同样的未突变的天然hppd酶展现以下特点而如此：a)对于天然底物4-羟苯丙酮酸更低的km值；b)对于将4-羟苯丙酮酸转化为尿黑酸盐更高的k
cat
值；c)更低的表观速率常数k
on
的值，该常数控制酶:hppd抑制剂除草剂复合物的形成；d)增加的速率常数k
off
的值，该常数控制酶:hppd抑制剂除草剂复合物的解离；和/或e)由于c)和d)中一者或两者的变化，增加的平衡常数ki(也称为kd)的值，该常数控制酶:hppd抑制剂除草剂复合物的解离。编码这样的改进的突变的hppd的dna序列用于提供本发明的hppd植物、作物、植物细胞和种子，这些hppd植物、作物、植物细胞和种子提供如与表达未突变的天然酶的类似植物相比增强的对一种或多种hppd除草剂的耐受性或抗性。
[0043]
因此，选择示例性hppd作为如下的那些：与其他hppd酶(如其他突变体hppd或其他天然hppd)相比，展现对一个或多个类型的hppd除草剂的更高耐受性，其中耐受性通过参数(k
off xk
cat
/k
m hpp
)的数值在体外表征，并且其中k
off
是控制hppd酶与除草剂的复合物的解离速率的速率常数，并且k
cat
/k
m hpp
是催化转化数除以底物hpp(4-羟苯丙酮酸)的km值。
[0044]
因此，在本披露内容的一个实施例中，提供一种用于表征和选择赋予更高水平的对hppd除草剂的耐受性的hppd的体外方法，该方法基于测量和比较k
cat
/k
m hpp和k
off
或这些参数的功能等同物的值。
[0045]
本发明还提供用编码本发明的突变体hppd多肽的至少一个表达盒转化的植物，该突变体hppd多肽具有hppd酶活性并且在所转化植物中赋予对某些类别的抑制hppd的除草剂的抗性或耐受性。本披露的转化的植物展现与对一种或多种hppd抑制剂除草剂的耐受性相关的表型，该耐受性包括减少的萎黄病、减少的坏死、减少的矮化、减少的病变形成等中的一种或多种。
[0046]
进行编码hppd的基因的定点突变，其中选择突变以编码选自此处列出的那些的一个或多个氨基酸变化，如单一突变或突变组合。编码hppd的这样的突变体形式的基因对于使作物植物具有对抑制hppd的除草剂的抗性是有用的。如此修饰的hppd基因尤其适合用于转基因植物，以便向作物植物赋予除草剂耐受性或抗性。在本披露的一个实施例中，提供一种改进植物产量的方法，该方法包括在田地中选择性地生长包含本发明的突变体hppd的植物，以及向该田地施加(在苗前或苗后过多地)杂草控制量的hppd除草剂，转基因植物对该hppd除草剂具有增强的抗性或耐受性。
[0047]
修饰天然hppd序列以生成展现除草剂耐受性的突变体hppd多肽的实例方法也被披露，例如披露于pct公开号wo 2010/085705和wo 2011/068567中，这些申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0048]
许多hppd序列是本领域中已知的，并且可以通过进行对应于本文所述的那些的氨基酸取代而用于生成突变体hppd序列。在典型实施例中，本文使用的hppd源自植物。例如，可以使用标准序列比对工具如blastp将要通过突变改进的序列与例如seq id no:1-4的天然hppd序列(分别表示燕麦、阿披拉草(apera spica-venti)和大穗看麦娘的天然hppd)中的任一个相比对，并且可以在对应于参考序列中的位置的位置处进行本文关于seq id no:1-4所述的相应氨基酸取代。
[0049]
在其他实例中，可以针对seq id no:59-63的氨基酸基序的存在检查已知的或疑似的hppd序列，并且可以进行本文所述的相应变化。在hppd并非源自植物的情形中，可以基于与此处所指定基序的多序列比对和类似性进行此处指示的那些的等效变化。
[0050]
本文披露的所有组合物、方法、植物、植物部分和表达盒都可以包括源自本文列出的hppd序列(包括在表1.1、1.2和1.3中列出的那些)中的任一个的突变体hppd多肽。此外，这些突变体hppd多肽包含与参考表1.1、1.2和1.3中的任一个列出的氨基酸位置对应的一个或多个氨基酸取代。
[0051]
在特定实施例中，本发明的组合物包含具有与seq id no:1(燕麦的hppd氨基酸序列)或seq id no:2(阿披拉草的hppd氨基酸序列)的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的突变体hppd多肽，其中该多肽具有hppd酶活性，并且其中该多肽含有与表1.1的第1列中列出的seq id no:1或2或3的氨基酸位置对应的一个或多个取代。
[0052]
在特定实施例中，所提供的组合物包含源自seq id no 1、2、3和4中的任一个的突变体hppd多肽，其中该多肽包含与表1.1的第1列中列出的氨基酸位置对应的一个或多个氨基酸取代，如至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至
少八个、至少九个或至少十个取代，并且其中该多肽具有hppd酶活性。
[0053]
表1.1示例性hppd突变
[0054]
表1.2显示在hppd多肽的变体、同源物、直系同源物和旁系同源物的非限制性列表之间共享的示例性突变位点的概览。
[0055]
在非限制性实施例中，表1.1的第1列中列出的或如表1.2中列出的一个或多个位置处的氨基酸被任何其他氨基酸替代。在另一个实施例中，该多肽包含与表1.1-1.2中列出的一个或多个氨基酸取代或缺失对应的一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在又另一个
实施例中，该多肽包含与表1.1的第2列中列出的氨基酸的保守变体对应的一个或多个取代。在特定实施例中，本发明的组合物包含源自seq id no 1-4中的任一个的突变体hppd多肽，其中该多肽含有与表1.1的第2列中列出的氨基酸取代对应的一至十个氨基酸取代，如至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个取代，并且其中该多肽具有hppd酶活性。表1.3显示2、3、4、5、6、7、8、9和10个突变的非限制性实例组合，其中每个可突变位置是关于seq id no:1-3。
[0056]
表1.3.示例性hppd突变组合
[0057]
例如，该多肽可以包含与seq id no:1或2或3或4的氨基酸位置260对应的突变，其中该氨基酸被丙氨酸或丙氨酸的保守变体(例如，甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)替代。作为另一实例，该多肽可以包含与seq id no:1或2或3或4的氨基酸位置214对应的突变，其中该氨基酸被甘氨酸或甘氨酸的保守变体(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)替代。作为又另一实例，该多肽可以包含与seq id no:1或2或3或4氨基酸位置214和271对应的两个突变，其中每个位置处的氨基酸被所指示的氨基酸或其保守变体替代。
[0058]
在特定实施例中，本发明的突变体hppd多肽的氨基酸序列选自由seq id no:4-63和122-127组成的组。
[0059]
在一个实施例中，分离的或重组的多肽包含编码对hppd抑制剂除草剂具有耐受性的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)蛋白的氨基酸序列。在非限制性实施例中，所述突变体hppd蛋白包含具有与seq id no:1、2或3的至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、位置271或位置304对应的氨基酸位置处的取代。在所述蛋白质的一个实例性实施例中，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被甘氨酸取代。在所述蛋白质的另一实例性实施例中，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置271对应的氨基酸位置被天冬酰胺取代。在所述蛋白质的另一实例性实施例中，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置304对应的氨基酸位置被苏氨酸取代。
[0060]
在另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白具有与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且进一步包含在与seq id no:1、2或3的氨基酸位置218、260、327、340、359或411对应的一个或多个氨基酸位置处的取代。在所述蛋白质的一个实例性实施例中，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被异亮氨酸取代。在所述蛋白质的另一实例性实施例中，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置260对应的氨基酸位置被丙氨酸取代。在所述蛋白质的另一实例性实施例中，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被精氨酸取代。在所述蛋白质的另一实例性实施例中，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被谷氨酸取代。在所述蛋白质的另一实例性实施例中，与seq id no:1或2或3或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被甲硫氨酸取代。在所述蛋白质的另一实例性实施例中，与seq id no:1的氨基酸位置411对应的氨基酸位置被丙氨酸取代。在所述蛋白质的另一实例性实施例中，与seq id no:1的氨基酸位置404对应的氨基酸位置被天冬酰胺取代。
[0061]
在另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白具有与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、327、340和359中的每一个对应的氨基酸位置处的取代。例如，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，和/或与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代。
[0062]
在另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白具有与seq id no:1具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1的氨基酸位置218、327、340、359和g411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代。例如，与seq id no:1的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代，并且与氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代。
[0063]
在另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白具有与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、260、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代。例如，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与氨基酸位置260对应的氨基酸位置被a取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代，并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代。
[0064]
在另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白具有与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨
基酸位置218、271、327、340和359中的每一个对应的氨基酸位置处的取代。例如，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置271对应的氨基酸位置被n取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代。
[0065]
在另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白具有与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、218、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代。例如，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被g取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被y取代，并且与氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代。
[0066]
在另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白具有与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、218、304、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代。例如，与seq id no:1的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被g取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置304对应的氨基酸位置被t取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被y取代；并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代。
[0067]
在另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白具有与seq id no:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、122、123、124、125、126或127中的任一个具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在又另一实例性实施例中，所述突变体hppd蛋白包含seq id no:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、122、123、124、125、126或127中任一个的氨基酸序列。
[0068]
在另外的实施例中，上文提及的实施例中任一个的突变体hppd蛋白进一步包含与seq id no:59、60、61、62或63所示的基序对应的、包含一个或多个氨基酸取代或缺失的多肽基序，其中该基序中一个或多个氨基酸取代的位置是相对于seq id no:1或2或3中相应的一个或多个氨基酸。
[0069]
在另外的实施例中，提供分离的或重组的多核苷酸，其编码本文披露的突变体hppd蛋白或多肽中的任一种。作为非限制性实施例，编码突变体hppd蛋白的分离的或重组的多核苷酸包含具有与seq id no:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、
79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、132或133的至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在该分离的或重组的多核苷酸的实施例，该分离的或重组的多核苷酸的核苷酸序列被优化用于在植物中表达。在该分离的或重组的多核苷酸的另外的实施例中，该多核苷酸与启动子可操作地连接。在实例性实施例中，该启动子驱动在植物或植物细胞中的表达。
[0070]
在实施例中，提供表达盒，其包含本文披露的编码突变体hppd蛋白的分离的或重组的多核苷酸。在实施例中，除了编码突变体hppd蛋白的分离的或重组的多核苷酸外，该表达盒进一步包含另一个可操作地连接的、编码赋予所期望的性状的多肽的重组的或分离的多核苷酸序列。在实例性实施例中，该所期望的性状是对除草剂的抗性，例如，该所期望的性状是对以下的抗性：hppd抑制剂、草甘膦、ppo抑制剂、或草铵膦或茄尼基二磷酸合酶(sdps)抑制剂。在实例性实施例中，赋予所期望的性状的多肽是细胞色素p450或其变体。在其他实例性实施例中，赋予所期望的性状的多肽是epsps(5-烯醇-丙酮酰-莽草酸-3-磷酸-合酶)。在仍其他实例性实施例中，赋予所期望的性状的多肽是茄尼基二磷酸合酶(sdps)。在仍其他实例性实施例中，赋予所期望的性状的多肽是膦丝菌素乙酰转移酶(pat)或ppo。可以与本文提供的突变体hppd蛋白组合使用的突变体ppo多肽的非限制性实例包括：us 2015252379、us 10041087、us 10087460、us 10308953、us 2019161478、us 2020270625，它们披露来自苋属(amaranthus)和大穗看麦娘以及其他生物体的各种突变体ppo蛋白，这些申请各自通过引用以其整体并入本文。可以与本文提供的突变体hppd蛋白组合使用的突变体ppo多肽的另外的实例包括：us 10717985、us 2020277619、us 2019330650、us 10844395、us 20210095305、wo 2020251313和wo 2021133049，它们披露来自蓝细菌(cyanobacteria)的各种突变体ppo蛋白，这些申请各自通过引用以其整体并入本文。可以与本文提供的突变体hppd蛋白组合使用的突变体spds多肽的非限制性实例包括2019年5月20日提交的标题为“compositions and methods for weed control[用于杂草控制的组合物和方法]”的美国临时申请号us 62/850,248，该申请披露各种突变体spds蛋白，该申请通过引用以其整体并入本文。
[0071]
在实施例中，提供载体，其包含含有编码本文披露的突变体hppd蛋白中的任一种的分离的或重组的多核苷酸的表达盒。在实例性实施例中，该载体包含seq id no:119、120或121中的一个。
[0072]
在实施例中，提供细胞，其包含编码本文披露的突变体hppd多肽中的任一种的异源多核苷酸。在实例性实施例中，该细胞是植物细胞。在实施例中，提供植物或植物部分，其具有稳定整合至其基因组中的编码突变体hppd多肽的异源多核苷酸。在该植物或植物部分的实例性实施例中，将包含编码突变体hppd蛋白的分离的或重组的多核苷酸的表达盒稳定掺入该植物的基因组中。在该植物或植物部分的实例性实施例中，已通过转化将编码所述异源多肽的多核苷酸引入该植物或植物部分中。在该植物或植物部分的实例性实施例中，已通过基因组修饰将编码所述异源多肽的多核苷酸引入该植物或植物部分的基因组中。在另外的实施例中，当在该植物中表达时，如与该植物的相应野生型品种相比，所述重组的多肽赋予该植物增强的除草剂耐受性。在该植物或植物部分的实例性实施例中，该植物是单
子叶植物，例如，该植物是玉米、黑麦、大麦、稻、高粱、燕麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、芒草或小麦。在该植物或植物部分的其他实例性实施例中，该植物是双子叶植物，例如，该植物是大豆、向日葵、番茄、甜菜、烟草、油菜作物、马铃薯、甘薯、木薯、红花、树、紫花苜蓿、豌豆和棉花。
[0073]
在实施例中，该植物部分包括在其基因组中稳定掺入编码突变体hppd多肽的多核苷酸的种子。在实例性实施例中，如与该种子的野生型品种相比，该种子对于增强的对抑制hppd的除草剂的抗性是纯育的。
[0074]
在实施例中，提供一种方法，其用于在植物中赋予对hppd抑制剂的抗性，该方法包括将包含编码本文披露的突变体hppd蛋白的分离的或重组的多核苷酸的表达盒引入该植物中，或者将编码突变体hppd多肽的多核苷酸引入该植物中。
[0075]
在另外的实施例中，提供一种在栽培区域中控制不期望的植被的方法，其中该方法包括以下步骤：在所述栽培区域提供具有稳定整合至其基因组中的编码突变体hppd多肽的异源多核苷酸的植物；以及向所述栽培区域施加有效量的hppd抑制剂除草剂或包含一种或多种另外的除草剂的组合物。在该方法的实例性实施例中，该植物包含含有编码除草剂耐受性酶的核苷酸序列的至少一种另外的异源核酸。在该方法的实例性实施例中，该hppd抑制剂除草剂与一种或多种另外的除草剂同时或依序施加。在该方法的实例性实施例中，该hppd抑制剂除草剂选自由以下组成的组：氟吡草酮(cas rn 352010-68-5)、双环磺草酮(cas rn 156963-66-5)、吡草酮(cas rn 82692-44-2)、ketospiradox(cas rn 192708-91-1)或其游离酸(cas rn 187270-87-7)、异噁氯草酮(cas rn 141112-06-3)、异噁唑草酮(cas rn 141112-29-0)、硝磺草酮(cas rn 104206-82-8)、磺酰草吡唑(cas rn 365400-11-9)、吡唑特(cas rn 58011-68-0)、苄草唑(cas rn 71561-11-0)、磺草酮(cas rn 99105-77-8)、呋喃磺草酮(cas rn 473278-76-1)、环磺酮(cas rn 335104-84-2)、苯吡唑草酮(cas rn 210631-68-8)及其农化上可接受的盐。在一个实例性实施例中，该hppd抑制剂是硝磺草酮。
[0076]
在实例性实施例中，提供一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，该方法包括以下步骤：提供转化的植物或其植物部分，其中所述转化的植物或植物部分包含与驱动在该植物或植物部分中的表达的启动子可操作地连接的编码突变体hppd多肽的多核苷酸；使该转化的植物或植物部分与至少一种hppd抑制剂化合物接触；确定该植物或植物部分是否受该hppd抑制化合物影响；以及鉴定或选择具有所述多核苷酸的转化的植物或植物部分。在另一实例性实施例中，提供一种方法，其用于使用编码突变体hppd多肽的多核苷酸转化的植物生长，同时控制所述植物附近的杂草，所述方法包括以下步骤：使所述植物生长；以及将有效量的包含hppd抑制剂的除草剂组合物施加至该植物和杂草。
[0077]
在实施例中，提供可用于杂草控制的组合，其包含编码如本文所披露的突变体hppd多肽的多核苷酸，该多核苷酸能够在植物中表达，从而向该植物提供对抑制hppd的除草剂的耐受性；以及抑制hppd的除草剂。在实施例中，提供一种工艺，其用于制备可用于杂草控制的组合，该工艺包括：提供编码如本文所披露的突变体hppd多肽的多核苷酸，该多核苷酸能够在植物中表达，从而向该植物提供对抑制hppd的除草剂的耐受性；以及(b)提供抑制hppd的除草剂。在该工艺的实例性实施例中，所述提供多核苷酸的步骤包括提供含有该
多核苷酸的植物。在该工艺的其他实例性实施例中，所述提供多核苷酸的步骤包括提供含有该多核苷酸的种子。在该工艺的实例性实施例中，该植物是单子叶植物，例如，该植物是玉米、黑麦、大麦、稻、高粱、燕麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、芒草或小麦。在该工艺的其他实例性实施例中，该植物是双子叶植物，例如，该植物是大豆、向日葵、番茄、甜菜、烟草、油菜作物、马铃薯、甘薯、木薯、红花、树、紫花苜蓿、豌豆和棉花。在该工艺的实例性实施例中，该抑制hppd的除草剂选自由以下组成的组：氟吡草酮(cas rn 352010-68-5)、双环磺草酮(cas rn 156963-66-5)、吡草酮(cas rn 82692-44-2)、ketospiradox(cas rn 192708-91-1)或其游离酸(cas rn 187270-87-7)、异噁氯草酮(cas rn 141112-06-3)、异噁唑草酮(cas rn 141112-29-0)、硝磺草酮(cas rn 104206-82-8)、磺酰草吡唑(cas rn 365400-11-9)、吡唑特(cas rn 58011-68-0)、苄草唑(cas rn 71561-11-0)、磺草酮(cas rn 99105-77-8)、呋喃磺草酮(cas rn 473278-76-1)、环磺酮(cas rn 335104-84-2)、苯吡唑草酮(cas rn 210631-68-8)及其农化上可接受的盐。在一个实例性实施例中，该抑制hppd的除草剂是硝磺草酮。在另外的实施例中，该工艺进一步包括将该抑制hppd的除草剂施加至该种子的步骤。还提供所披露的组合用于在植物栽培地点控制杂草的用途的实施例。
[0078]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。本发明的多肽可以从本文披露的核酸产生，或者通过使用标准分子生物学技术来产生。例如，本发明的截短的蛋白质可以通过在适当的宿主细胞中表达本发明的重组核酸来产生，或者可替代地通过离体程序的组合(如蛋白酶消化和纯化)来产生。因此，本发明还提供包含编码突变体hppd多肽及其变体和片段的多核苷酸序列的核酸分子，这些突变体hppd多肽具有hppd酶活性并且在植物中赋予对某些类别的抑制hppd的除草剂的抗性和耐受性。总体上，本发明包括编码本文所述的突变体hppd多肽中的任一种的任何多核苷酸序列，以及编码相对于本文所述的突变体hhpd多肽具有一个或多个保守氨基酸取代的hppd多肽的任何多核苷酸序列。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表格是本领域中熟知的。以下五组各自含有互为保守取代的氨基酸：脂肪族组：甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)；芳香族组：苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；含硫组：甲硫氨酸(m)、半胱氨酸(c)；碱性组：精氨酸(r)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)；酸性组：天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)。
[0079]
在一个实施例中，本发明提供一种多核苷酸序列，其编码具有与seq id no:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、122、123、124、125、126或126中的任一个的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，其中该hppd氨基酸序列源自植物，其中该多肽具有hppd酶活性，并且其中该多肽含有如下文所讨论的一个或多个取代、添加或缺失。
[0080]
在另一个实施例中，本发明提供多核苷酸序列，其与seq id no:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、132或133中的任一个具有至少约40％、45％、
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
[0081]
如本文所用，“核酸”包括提及呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的必要性质的已知类似物(例如，肽核酸)：它们以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。
[0082]
如本文所用，术语“编码(encoding)”或“编码(encoded)”当在指定核酸的情况下使用时意指，该核酸包含引导将核苷酸序列翻译为指定蛋白质或氨基酸序列的必要信息。用于编码蛋白质的信息通过使用密码子来详细说明。编码蛋白质的核酸可以在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如，内含子)，或者可能缺少这样的间插非翻译序列(例如，如在cdna中)。
[0083]
如本文所用，“重组的多核苷酸”包括并非呈天然或天然存在的状态的多核苷酸，例如，该多核苷酸包含在自然界中未发现的核苷酸序列，或者该多核苷酸处于并非天然发现它的背景中，例如，与其在自然界中典型地靠近的核苷酸序列分离，或者邻近(或邻接)典型地不与其靠近的核苷酸序列。例如，该多核苷酸序列可以与驱动该多核苷酸序列的转录的异源启动子可操作地连接。作为另一实例，可以将该多核苷酸序列克隆至载体中，或者以其他方式与其在自然界中不会与之组合的一种或多种另外的核酸重组。“重组的多肽”是通过重组的多核苷酸的翻译产生的多肽。
[0084]
本发明涵盖分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物活性部分实质上或基本上不含如在该多核苷酸或蛋白质的天然存在的环境中所发现的通常与其伴随或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质在通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。例如，分离的多核苷酸或多肽通过多种核酸或蛋白质纯化方法中的任一种与典型地与其相连的其他细胞组分分离。在特定实施例中，“分离的”多核苷酸不含在衍生出该多核苷酸的生物体的基因组dna中天然地侧接该多核苷酸的序列(最佳地蛋白质编码序列)(即，位于该多核苷酸5'和3'端的序列)。例如，在不同的实施例中，分离的多核苷酸可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在衍生出该多核苷酸的细胞的基因组dna中天然地侧接该多核苷酸的核苷酸序列。基本上不含干扰酶活性并且能够关于其催化、动力学和分子特性加以表征的蛋白质包括具有小于约98％、95％、90％、80％、70％、60％或50％(以干重计)的污染蛋白质的相当粗制的蛋白质制剂(例如在细胞提取物中重组产生的)，以及通过本领域中已知的方法进一步纯化为具有40％、30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染蛋白质的制剂。在实施例中，与野生型细胞中呈其天然状态的多肽相比，“分离的多肽”在细胞中(或从细胞)更富集，例如，超过约5％富集、超过约10％富集、或超过约20％富集、或超过约50％富集或者更富集。可替代地，这可以表示为：相对于以100％标准化的野生型，105％、110％、120％、150％或更富集。这样的富集并非野生型植物的天然反应。
[0085]
本发明的这些蛋白质可以以不同的方式进行改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法通常是本领域中已知的。例如，突变体hppd蛋白的氨基酸序列变体和片段可以通过dna中的突变来制备。用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域中熟知的。参见例如，kunkel(1985)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]82:488-492；
kunkel等人(1987)methods in enzymol.[酶学方法]154:367-382；美国专利号4,873,192；walker和gaastra编辑(1983)techniques in molecular biology[分子生物学技术](纽约麦克米伦出版公司(macmillan publishing company,new york))以及其中引用的参考文献。关于通常不影响感兴趣的蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以发现于dayhoff等人(1978)atlas of protein sequence and structure[蛋白质序列与结构图谱](natl.biomed.res.found.[国家生物医药研究基金会],华盛顿特区)的模型中。保守取代(如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换)可能是最佳的。
[0086]
本发明的多核苷酸还可以用于从其他生物体、特别是其他植物分离相应序列。以这种方式，可以使用诸如pcr、杂交等的方法基于序列与本文所示序列的序列同源性来鉴定这样的序列。
[0087]
在pcr方法中，可以设计寡核苷酸引物用于在pcr反应中从提取自感兴趣的任何植物的cdna或基因组dna扩增相应的dna序列。用于设计pcr引物和pcr克隆的方法通常是本领域中已知的。参见例如，sambrook等人(1989)molecular cloning:alaboratory manual[分子克隆：实验室手册](第2版,冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),纽约普莱恩维尤(plainview,new york))。还参见innis等人编辑(1990)pcr protocols:a guide to methods and applications[pcr方案：方法和应用指南](纽约学术出版社(academic press,new york))；innis和gelfand编辑(1995)pcr strategies[pcr策略](纽约学术出版社(academic press,new york))；以及innis和gelfand编辑(1999)pcr methods manual[pcr方法手册](纽约学术出版社(academic press,new york))。
[0088]
在杂交技术中心，使用已知多核苷酸的全部或部分作为探针，该探针与来自所选生物体的所克隆基因组dna片段或cdna片段的群体(即，基因组或cdna文库)中存在的其他相应多核苷酸选择性杂交。杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如
32
p或任何其他可检测标志物来标记。用于制备杂交探针和用于构建cdna和基因组文库的方法通常是本领域中已知的，并且披露于sambrook等人(1989)molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册](第2版,冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),纽约普莱恩维尤(plainview,new york))中。
[0089]“与
……
杂交”或“与
……
特异性杂交”是指分子在严格条件下仅与特定核苷酸序列结合、双链化或杂交(在该序列存在于复合混合物(例如，总细胞)dna或rna中时)。“基本上结合”是指探针核酸与靶核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，这些错配可以通过降低杂交介质的严格性来适应，以实现对靶核酸序列的期望检测。
[0090]
在核酸杂交实验如dna杂交和rna杂交的情况下，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。更长的序列在更高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导发现于以下文献中：tijssen(1993)laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第i部分第2章"overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays[杂交原理和核酸探针测定策略综述]"纽约爱思唯尔公司(elsevier,new york)。通常，高严格杂交和洗涤条件被选择为比特定序列在限定离子强度和ph下的热熔点
(tm)低约5℃。典型地，在“严格条件”下，谭振江与其靶序列杂交，但是不与其他序列杂交。
[0091]
tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和ph下)。非常严格的条件被选择为等于特定探针的tm。用于互补核酸(它们在dna印迹或rna印迹中在过滤器上具有超过100个互补残基)的杂交的严格杂交条件的实例是在42℃下具有1mg肝素的50％甲酰胺，且该杂交进行过夜。高严格洗涤条件的实例是0.15m nacl在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是0.2x ssc洗涤在65℃下持续15分钟(参见，sambrook,下文，对于ssc缓冲液的描述)。通常，在高严格度洗涤之前进行低严格度洗涤，以去除背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的实例性中等严格度洗涤是1x ssc在45℃下持续15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的实例性低严格度洗涤是4-6x ssc在40℃下持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型地涉及在ph 7.0至8.3下小于约1.0m na离子的盐浓度，典型地约0.01至1.0m na离子浓度(或其他盐)，并且温度典型地为至少约30℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。通常，信噪比是在特定杂交测定中针对无关探针所观察到者的2倍(或更高)表明检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则这些核酸仍然是基本上相同的。这在使用遗传密码所允许的最大密码子简并度产生核酸拷贝时发生。
[0092]
以下是可以用来克隆作为本发明的参考核苷酸序列的同源物的核苷酸序列的杂交/洗涤条件集的实例：参考核苷酸序列优选地在以下条件下与参考核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m napo4、1mm edta中在50℃下杂交，且在2x ssc、0.1％sds中在50℃下洗涤；更合意地在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mm edta中在50℃下杂交，且在1x ssc、0.1％sds中在50℃下洗涤；更合意地仍在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mm edta中在50℃下杂交，且在0.5x ssc、0.1％sds中在50℃下洗涤；优选地在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m napo4、1mm edta中在50℃下杂交，且在0.1x ssc、0.1％sds中在50℃下洗涤；更优选地在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m napo4、1mm edta中在50℃下杂交，且在0.1x ssc、0.1％sds中在65℃下洗涤。
[0093]
所披露的核苷酸序列的片段和变体以及由其编码的蛋白质也被涵盖在本发明中。“片段”意图意指核苷酸序列的一部分或由其编码的氨基酸序列和因此蛋白质的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留突变体hppd蛋白的生物活性且因此具有hppd酶活性的蛋白质片段。可替代地，可用作杂交探针或者可在诱变和混编反应中用于生成又其他hppd变体的核苷酸序列的片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段的范围可以从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至编码本发明的多肽的全长核苷酸序列。
[0094]
编码本发明的突变体hppd蛋白的生物活性部分的核苷酸序列的片段将编码至少15、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、180、200、250、300、350个连续氨基酸，或者直至本文提供的全长突变体hppd多肽中存在的氨基酸的总数(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、122、123、124、125、126或126)。可用作杂交探针或pcr引物的核苷酸序列的片段通常不需要编码hppd蛋白的生物活性部分。
[0095]
如本文所用，关于指定多核苷酸的“全长序列”意指具有天然或突变的hppd序列的
整个核酸序列。“天然序列”意图意指内源序列，即，在生物体的基因组中发现的非工程化序列。
[0096]
因此，本发明的核苷酸序列的片段可以编码突变体hppd多肽的生物活性部分，或者它可以是可以用作杂交探针等或使用下文披露的方法的pcr引物的片段。突变体hppd多肽的生物活性部分可以通过以下方式来制备：分离本发明的核苷酸序列之一的一部分，表达突变体hppd蛋白的编码部分(例如，通过体外重组表达)，以及评估突变体hppd蛋白的编码部分的活性。作为本发明的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少15、20、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200或1300个连续核苷酸，或者直至本文披露的全长核苷酸序列(即，seq id no:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、128、129、130、131、132或133中的任一个)中存在的核苷酸数量。
[0097]“变体”意图意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在参考多核苷酸内的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在突变体hppd多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。类似地，对于多肽，变体包含在参考多肽内的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加，和/或在突变体hppd多肽中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代。如本文所用，“参考”多核苷酸或多肽可以包含突变体hppd核苷酸序列或氨基酸序列。可替代地，“参考”(或“对照”)多核苷酸或多肽包括天然多核苷酸或多肽。作为非限制性实例，包含两个位点处的氨基酸取代的突变体hppd多肽可以在本文中用作突变体hppd多肽的参考，该突变体hppd多肽包含在相同的两个位点和一个或多个另外的位点处的氨基酸取代。可替代地，包含在三个位点处的氨基酸取代的第一突变体hppd多肽可以用作包含在三个位点处的氨基酸取代的不同的第二突变体hppd多肽的参考，其中第二多肽的该三个位点与第一多肽的该三个位点部分重叠或不重叠。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，本发明的核酸的变体将被构建而使得维持开放阅读框。对于多核苷酸，保守变体包括因为遗传密码的简并性而编码本发明的突变体hppd多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体(如这些)可以通过使用如下文所概述的熟知的分子生物学技术(如例如使用聚合酶链式反应(pcr))和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，如例如通过使用定点诱变来生成但仍编码本发明的突变体hppd蛋白的那些。通常，本发明的特定多核苷酸的变体将具有与该特定多核苷酸的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数所确定。
[0098]
本发明的突变体hppd多肽可以通过以下方式来生成：借助基因组修饰技术原位编辑内源hppd基因以提供对抑制hppd的除草剂具有耐受性的突变体hppd多肽。引入可以通过本领域中已知的任何方式来完成，该方式包括但不限于：渐渗、转基因或通过使用dna修饰酶。
[0099]
特别地，对核酸序列的修饰可以借助定点核酸酶(sdn)来引入。更特别地，该sdn选自：兆核酸酶、锌指、转录激活因子样效应子核酸酶系统(talen)或成簇规律间隔短回文重
复系统(crispr)系统。sdn也被称为“基因组编辑”，或使用工程化核酸酶的基因组编辑(geen)。这是一种类型的基因工程，其中使用在基因组中的期望位置处产生位点特异性双链断裂(dsb)的工程化核酸酶在生物体的基因组中进行dna的插入、缺失或替代。通过非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)修复所诱导的双链断裂，从而得到靶向的突变(“编辑”)。特别地，sdn可以包括诸如以下的技术：兆核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)(feng等人2013cell res.[细胞研究]23,1229-1232；sander和joung nat.biotechnol.[自然生物技术]32,347-355 2014)和成簇规律间隔短回文重复(crispr-cas)系统。
[0100]
因此，本披露内容还涉及用于编辑的载体。该载体包括编码dna修饰酶的核酸，该dna修饰酶如定点核酸酶，例如，cas9核酸酶、cfpl核酸酶、dcas9-foki、dcpfl-fokl、嵌合cas9-胞苷脱氨酶、嵌合cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合fenl-foki、和mega-tals、切口酶cas9(ncas9)、嵌合dcas9非fokl核酸酶和dcpfl非fokl核酸酶。质粒还包括至少一种指导rna。载体还可以包括另外的组分，例如，它们可以包括grna启动子以调节至少一种grna的表达，该grna启动子例如prosu3-01，它是非编码rna的pol iii依赖性转录的稻u3启动子。载体可以类似地包括另外的特征，如选择性标志物，例如磷酸甘露糖异构酶(pmi)，并且可以与甘露糖选择一起用于回收稳定转化的植物。另外的特征包括用于调节选择性标志物的表达的调节序列，例如，启动子和终止子。
[0101]
载体可以进一步包括用于辅助转化的另外的特征，例如用于辅助如上所述的土壤杆菌(agrobacterium)介导的转化的特征。靶序列可变并且可以包括长15-25个核苷酸的序列，包括编码表1或表2的氨基酸的序列，例如，3个核苷酸的序列。
[0102]
本发明的特定多核苷酸(即，参考多核苷酸)的变体还可以通过比较变体多核苷酸编码的多肽与该参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比来评价。因此，例如，披露编码如下多肽的多核苷酸，该多肽具有与seq id no:4-63和122-128的多肽的给定序列同一性百分比。这样的多核苷酸序列的非限制性实例披露于seq idno:64-118和128-133中。任两个多肽之间的序列同一性百分比可以使用本文其他地方描述的序列比对程序和参数来计算。在通过比较本发明的任何给定多核苷酸对编码的两个多肽共享的序列同一性百分比来评价这两个多核苷酸的情况下，两个所编码多肽之间的序列同一性百分比是跨越本文所述的hppd序列的全部的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
[0103]“变体”蛋白意图意指通过突变体hppd蛋白中一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失或添加和/或突变体hppd蛋白中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代从参考蛋白衍生的蛋白质。本发明所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有突变体hppd蛋白的期望生物活性，也就是说，如本文所述的hppd酶活性和/或除草剂耐受性。这样的变体可以从例如遗传多态性或从人工操作得到。本发明的突变体hppd蛋白的生物活性变体将具有跨越突变体hppd蛋白的全部氨基酸序列的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，如通过本文其他地方描述的序列比对程序和参数来确定。本发明的蛋白质的生物活性变体可以与该蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个氨基酸残基(如6-10个氨基酸残基)、少至5个氨基酸残基、少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
[0104]
用于比较的序列比对方法是本领域中熟知的，并且可以使用数学算法来完成，这些数学算法如myers和miller(1988)cabios[生物科学中的计算机应用]4:11-17的算法；smith等人(1981)adv.appl.math.[应用数学进展]2:482的局部比对算法；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453的局部比对算法；以及karlin和altschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]872264的算法，在karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90:5873-5877中改良。这些数学算法的计算机实现可以用于序列比较以确定序列同一性。这样的实现包括但不限于：pc/gene程序(可从intelligenetics公司，加利福尼亚山景城(mountain view,california)获得)中的clustal；align程序(2.0版)、gcg wisconsin genetics软件包10版(可从accelrys公司，美国加利福尼亚圣地亚哥斯克兰顿路9685号(9685scranton road,san diego,california,usa)获得)中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta，以及geneious prime软件包(可从biomatters公司，2365northside dr.suite 560,加利福尼亚圣地亚哥(san diego,ca)92108获得)中的blosum62。
[0105]
在两个核酸或氨基酸序列的情况下，术语“同一性”或“相同的”是指在全面比对两个序列时，如与测试(“受试”)序列相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或氨基酸序列中相同核苷酸或氨基酸的百分比。除非另有陈述，否则如本文所用的序列同一性是指如下获得的值：使用在emboss needle比对工具中实现的needleman和wunsch算法((1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)，使用默认矩阵文件eblosum62(用于蛋白质)和默认参数(空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10，末端空位延伸＝0.5)或dnafull(用于核酸)和默认参数(空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10，末端空位延伸＝0.5)；或其任何等效程序。emboss needle可从例如embl-ebi获得，如在以下网站获得：ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/，并且如以下出版物中所述：“the embl-ebi search and sequence analysis tools apis in 2019[2019年的embl-ebi搜索和序列分析工具api]”。madeira等人nucleic acids research[核酸研究],2019年6月,47(w1):w636-w641。如本文所用，术语“等效程序”是指任何序列比较程序，对于任两个所讨论序列，在与通过emboss needle生成的相应比对相比时，该程序生成具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。在优选实施例中，基本上相同的核酸或氨基酸序列可以发挥基本上相同的功能。
[0106]
当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时，也可以认为这两个序列是基本上相同的。在代表性实施例中，被认为基本上相同的两个核苷酸序列在高严格条件下彼此杂交。
[0107]
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括提及如下条件，在这些条件下，核酸将与靶序列以明显高于其他序列的程度选择性杂交(例如，超过非靶序列至少2倍)，并且任选地可以基本上排除与非靶序列的结合。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情况下将会改变。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格度，可以鉴定可能与参考核苷酸序列高达100％互补的靶序列。可替代地，可以使用中等或甚至低严格度的条件来允许序列中的一些错配，从而检测到更低程度的序列相似性。例如，本领域技术人员将理解，为了起到引物或探针的作用，核酸序列仅需要在所采用的条件下与靶序列充分互补以与其实质性结合，以形成稳定的双链结构。因此，可以在高、中等或甚至低严格度的条件下使用引物或探针。同样，低或中
等严格度的条件可以有利于检测序列同一性程度低于在高严格条件下可鉴定的程度的同源物、直系同源物和/或旁系同源物序列。
[0108]
如本文所用，术语“互补的”或“互补性”(和类似术语)是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对进行的天然结合。例如，序列“a-g-t”与互补序列“t-c-a”结合。两个单链分子之间的互补可能是部分的，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在全互补性时，该互补性可能是完全的。核酸链之间的互补性程度对于分子之间杂交的效率和强度具有显著影响。如本文所用，术语“基本上互补的”(和类似术语)意指，两个核酸序列是至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多互补的。可替代地，术语“基本上互补的”(和类似术语)可以意指，两个核酸序列可以在高严格度条件(如本文所述)下杂交在一起。
[0109]
如本文所用，“特异性地”或“选择性地”杂交(和类似术语)是指分子在严格条件下与特定核酸靶序列的结合、双链化或杂交(在该序列存在于复合混合物(例如，总细胞dna或rna)中时)，以基本上排除非靶核酸，或甚至与非靶序列没有可检测的结合、双链化或杂交。特异性或选择性杂交序列典型地是至少约40％互补的，并且任选地是基本上互补的或甚至完全互补的(即，100％相同的)。
[0110]
对于dna-dna杂合物，tm可以从meinkoth和wahl,anal.biochem.[分析生物化学]138:267-84(1984)的等式中进行估计：tm＝81.5℃+16.6(log m)+0.41(gc％)-0.61(甲酰胺％)-500/l；其中m是单价阳离子的摩尔浓度，gc％是dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，甲酰胺％是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且l是该杂合物以碱基对计的长度。tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度及ph下)。对于每1％的错配，tm降低约1℃；因此，可以调整tm、杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性程度的序列杂交。例如，如果寻找具有》90％同一性的序列，可以使tm降低10℃。通常，严格条件被选择为比特定序列及其补体在限定的离子强度及ph下的热熔点(tm)低约5℃。然而，高严格条件可以利用在热熔点(tm)或比热熔点(tm)低1℃、2℃、3℃或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在比热熔点(tm)低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下杂交和/或洗涤；低严格度条件可以利用在比热熔点(tm)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下杂交和/或洗涤。如果期望的错配程度导致tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则任选地可以增加ssc浓度以使得可以使用更高温度。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：tijssen,laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交],第i部分,第2章,“overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays[杂交原理和核酸探针测定策略综述],”纽约爱思唯尔公司(elsevier,new york)(1993)；current protocols in molecular biology[现代分子生物学实验技术],第2章,ausubel等人编辑,格林出版社(greene publishing)和wiley-interscience公司,纽约(1995)；以及green和sambrook,molecular cloning,a laboratory manual,4th edition[分子克隆，实验室手册，第4版],冷泉港出版社(cold spring harbor press),纽约冷泉港(cold spring harbor,n.y.)(2012)。
[0111]
典型地，严格条件是如下那些：其中在约ph 7.0至ph 8.3下盐浓度小于约1.5m na离子，典型地约0.01m至1.0m na离子浓度(或其他盐)，并且温度为至少约30℃(对于短探
针，例如，10至50个核苷酸)和至少约60℃(对于长探针，例如，大于50个核苷酸)。严格条件可以通过添加去稳定剂如甲酰胺或denhardt's(在500ml水中的5g ficoll、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)来实现。示例性低严格度条件包括用30％至35％甲酰胺、1m nacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交以及在1x至2x ssc(20x ssc＝3.0m nacl/0.3m柠檬酸三钠)中在50℃至55℃下洗涤。示例性中等严格度条件包括在40％至45％甲酰胺、1m nacl、1％sds中在37℃下杂交以及在0.5x至1x ssc中在55℃至60℃下洗涤。示例性高严格度条件包括在50％甲酰胺、1m nacl、1％sds中在37℃下杂交以及在0.1x ssc中在60℃至65℃下洗涤。高严格度条件的另一非限制性实例包括在4x ssc、5x denhardt's、0.1mg/ml煮鲑鱼精dna和25mm磷酸na中在65℃下杂交以及在0.1x ssc、0.1％sds中在65℃下洗涤。高严格度杂交条件的另一说明包括在7％sds、0.5m napo4、1mm edta中在50℃下杂交以及在2x ssc、0.1％sds中在50℃下洗涤，可替代地在1x ssc、0.1％sds中在50℃下洗涤，可替代地在0.5x ssc、0.1％sds中在50℃下洗涤，或者可替代地在0.1x ssc、0.1％sds中在50℃下洗涤，或者甚至在0.1xssc、0.1％sds中在65℃下洗涤。本领域技术人员将了解，特异性典型地是杂交后洗涤的函数，相关参数是最终洗涤溶液的离子强度和温度。
[0112]
如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的(例如，由于遗传密码的简并性)。
[0113]
两个核酸序列或蛋白质基本上相同的另一个指示是，第一核酸编码的蛋白质在免疫学上与第二核酸编码的蛋白质交叉反应。因此，一种蛋白质典型地与第二种蛋白质基本上相同，例如，在这两种蛋白质的区别仅为保守取代的情况下。
[0114]
基因叠加
[0115]
在某些实施例中，可以将编码保留hppd酶活性的天然或突变体hppd多肽或其变体的本发明的多核苷酸(例如，编码选自由seq id no:4-63和122-127组成的组的氨基酸序列或其变体或片段的多核苷酸序列)与感兴趣的多核苷酸序列的任何组合叠加，以产生具有期望性状的植物。如本文所用，性状是指源自特定序列或序列组的表型。例如，可以将编码保留hppd酶活性的突变体hppd多肽或其变体的多核苷酸与编码赋予所期望的性状的多肽的任何其他多核苷酸叠加，该所期望的性状包括但不限于对疾病、昆虫和除草剂的抗性、对热和干旱的耐受性、缩短的至作物成熟的时间、改进的工业加工(如用于将淀粉或生物质转化为可发酵的糖)以及改进的农艺质量(如高油含量和高蛋白质含量)。
[0116]
在本发明的特定实施例中，可以叠加多核苷酸(或者，可替代地，可以将多个表达盒叠加在单一多核苷酸上)，以在植物内表达超过一种类型的hppd多肽。这在如下情况下是特别有利的：例如，一种hppd特别适合于提供对一个类别的hppd除草剂的抗性，而另一种hppd提供改进的对不同类别的hppd除草剂的耐受性。在一种多肽表达固有的除草剂抗性但是稍微不稳定的情况下，叠加hppd多肽也是一种优点。然后通过形成混合的酶二聚体，这种除草剂抗性hppd可以在与例如类似的但温度不稳定程度较低的hppd的混合表达中被稳定。
[0117]
可以与编码保留hppd酶活性的突变体hppd多肽或其变体的本发明的多核苷酸叠加的示例性多核苷酸包括编码赋予对害虫/病原体(如病毒、线虫、昆虫或真菌等)的抗性的多肽的多核苷酸。可以与本发明的多核苷酸叠加的示例性多核苷酸包括编码以下的多核苷酸：具有杀有害生物和/或杀昆虫活性的多肽，如其他苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)毒性蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,
2021133049，它们披露来自蓝细菌(cyanobacteria)的各种突变体ppo蛋白，这些申请各自通过引用以其整体并入本文。在另外的实例性实施例中，赋予所期望的性状的多肽是sdps。可以与本文提供的突变体hppd蛋白组合使用的突变体spds多肽的非限制性实例包括2019年5月20日提交的标题为“compositions and methods for weed control[用于杂草控制的组合物和方法]”的美国临时申请号us 62/850,248，该申请披露各种突变体spds蛋白，该申请通过引用以其整体并入本文。
[0119]
这些叠加的组合可以通过任何方法来产生，该方法包括但不局限于通过任何常规方法或顶交方法对植物进行杂交育种，或者遗传转化。如果这些序列是通过将植物遗传转化来叠加的，那么感兴趣的多核苷酸序列可以在任何时间并且以任何顺序进行组合。例如，包含一种或多种期望性状的转基因植物可以用作靶标以通过随后的转化来引入其他性状。这些性状可以在共转化方案中与通过转化盒的任何组合提供的感兴趣的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入两个序列，这两个序列可以含于单独转化盒中(反式)或含于同一转化盒上(顺式)。这些序列的表达可以由相同启动子或由不同启动子驱动。在某些情形中，引入会抑制感兴趣的多核苷酸的表达的转化盒可能是所期望的。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合组合，以在植物中生成期望的性状组合。进一步认识到的，可以使用位点特异性重组系统在期望的基因组位置处叠加多核苷酸序列。参见例如，pct公开号wo 99/25821、wo 99/25854、wo 99/25840、wo 99/25855、以及wo 99/25853。
[0120]
植物表达盒
[0121]
本发明的组合物可以另外含有用于在感兴趣的植物中转化和表达的核酸序列。这些核酸序列可以存在于dna构建体或表达盒中。如本文所用，“表达盒”意指能够引导特定核苷酸序列在适当宿主细胞中的表达的核酸分子，该核酸分子包含与感兴趣的核苷酸序列(即，编码保留hppd酶活性的突变体hppd多肽或其变体的多核苷酸，该多核苷酸是单独的或与编码赋予所期望的性状的多肽的一种或多种另外的核酸分子组合)可操作地连接的启动子，该感兴趣的核苷酸序列与终止信号可操作地连接。它还典型地包含核苷酸序列的适当翻译所需的序列。编码区通常编码感兴趣的蛋白质，但是也可以在正义或反义方向上编码感兴趣的功能rna，例如反义rna或非翻译rna。包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着其组分中的至少一种关于它的其他组分中的至少一种是异源的(例如，启动子对于其转录的突变体hppd多肽是异源的)。表达盒还可以是天然存在的但已经以用于异源表达的重组形式获得的表达盒。然而，典型地，表达盒关于宿主是异源的，即，该表达盒的特定dna序列并非天然存在于该宿主细胞中，并且必须已经通过转化事件被引入该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。核苷酸序列在表达盒中的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，该启动子只在宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时才启动转录。另外，该启动子也可以对特定的组织或器官或发育阶段具有特异性。
[0122]
本发明涵盖用能够表达感兴趣的多核苷酸以产生感兴趣的多肽的表达盒来转化植物，该感兴趣的多核苷酸即编码保留hppd酶活性的突变体hppd多肽或其变体的多核苷酸，其是单独的或与编码赋予所期望的性状的多肽的一种或多种另外的核酸分子组合。该表达盒将以5'-3'的转录方向包括转录和翻译起始区(即，启动子)以及编码感兴趣的多肽的多核苷酸开放阅读框。该表达盒可以任选地包含在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。在一些实施例中，该表达盒包含选择性标志物基因以允许选择稳定的转化
体。在一些实施例中，该表达盒可以包括一个或多个另外的调节元件以增强感兴趣的多肽的表达，这些调节元件如增强子、内含子等。本发明的表达构建体还可以包含前导序列和/或允许感兴趣的多核苷酸的诱导型表达的序列。允许诱导型表达的序列的实例参见guo等人(2003)plant j.[植物杂志]34:383-92以及chen等人(2003)plant j.[植物杂志]36:731-40。
[0123]
该表达构建体的调节序列与感兴趣的多核苷酸可操作地连接。“可操作地连接”意图是指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中该启动子序列起始并介导与该第二序列对应的dna序列的转录。通常，可操作地连接意味着所连接的核苷酸序列是邻接的。
[0124]
在本发明的实践中可以使用能够在感兴趣的植物中驱动表达的任何启动子。该启动子对于植物宿主可以是天然的或类似的或外来的或异源的或外源的。术语“异源的”和“外源的”在用于本文中时是指核酸序列(例如dna或rna序列)或基因，是指如下序列，该序列源自对于特定宿主细胞为外来的来源，或者如果来自同一来源，则从其初始形式加以修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括如下基因，该基因对于特定宿主细胞是内源的，但是已经通过例如使用dna混编、基因编辑、诱变等加以修饰。这些术语还包括非天然存在的多个拷贝的天然存在的dna序列。因此，这些术语是指如下dna区段，该dna区段对于细胞是外来的或异源的，或者对于细胞是同源的，但是处于宿主细胞核酸内通常找不到该元件的位置中。表达外源dna区段以产生外源多肽。
[0125]“同源的”核酸(例如，dna)序列是与引入它的宿主细胞天然地相关联的核酸(例如，dna或rna)序列。
[0126]
要包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、诱导性、期望的表达水平以及细胞或组织优先表达。通过适当地选择启动子和其他调节区域并相对于序列来定位而调节该序列的表达是本领域技术人员的常规操作。用于一种或多种转基因的表达的启动子可以是强植物启动子、病毒启动子或由可操作地连接的元件构成的嵌合启动子，这些可操作地连接的元件如：来自任何基因的tata盒(或者是合成的，基于对植物基因tata盒的分析)，其任选地与植物启动子的tata盒5'的区域融合(这引导组织和时间上适当的基因表达)，任选地与1个或多个增强子(如35s增强子、fmv增强子、cmp增强子、rubisco small subunit增强子、plastocyanin增强子)融合。
[0127]
示例性组成型启动子包括例如rsyn7启动子的核心启动子和wo 99/43838和美国专利号6,072,050中披露的其他组成型启动子；核心camv 35s启动子(odell等人(1985)nature[自然]313:810-812)；稻肌动蛋白(mcelroy等人(1990)plant cell[植物细胞]2:163-171)；泛素(christensen等人(1989)plant mol.biol.[植物分子生物学]12:619-632和christensen等人(1992)plant mol.biol.[植物分子生物学]18:675-689)；pemu(last等人(1991)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]81:581-588)；mas(velten等人(1984)embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]3:2723-2730)；als启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括于例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中。
[0128]
对于如在某些组织中表达转基因，同时使在其他组织如种子或生殖组织中的表达最小化的应用，适当的植物或嵌合启动子是有用的。示例性的细胞类型启动子或组织优先启动子优选在靶组织中驱动表达，但是也可以在其他细胞类型或组织中引起一定表达。用
于鉴定和表征植物基因组dna中的启动子区域的方法包括例如以下参考文献中所述的那些：jordano等人,plant cell[植物细胞],1:855-866(1989)；bustos等人,plant cell[植物细胞],1:839-854(1989)；green等人,embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]7,4035-4044(1988)；meier等人,plant cell[植物细胞],3,309-316(1991)；以及zhang等人,plant physiology[植物生理学]110:1069-1079(1996)。
[0129]
在本发明的其他实施例中，诱导型启动子可能是期望的。诱导型启动子响应于外部刺激(如化学试剂或环境刺激)而驱动转录。例如，诱导型启动子可以响应于激素(如赤霉酸或乙烯)或响应于光或干旱而赋予转录。
[0130]
多种转录终止子可用于在表达盒中使用。这些转录终止子负责转基因以外的转录终止以及正确的mrna多腺苷酸化。终止区可以天然地与转录起始区在一起，可以天然地与可操作地连接的感兴趣的dna序列在一起，可以天然地与植物宿主在一起，或者可能衍生自另一来源(即，对于启动子、感兴趣的dna序列、植物宿主或其任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括camv 35s终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子以及豌豆rbcs e9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。此外，可以使用基因的天然转录终止子。
[0131]
通常，表达盒将包含选择性标志物基因用于选择转化的细胞。利用选择性标志物基因来选择转化的细胞或组织。在一个实例中，该标志物基因是磷酸甘露糖异构酶(pmi)，其编码将甘露糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸的酶。只有具有该标志物基因的转化的细胞才能够利用甘露糖作为碳源。
[0132]
已经发现多个序列增强来自转录单位内的基因表达，并且这些序列可以与本发明的基因结合使用以增加它们在转基因植物中的表达。
[0133]
已经显示多个内含子序列增强表达，特别是在单子叶植物细胞中的表达。例如，已经发现在被引入玉蜀黍细胞中时，玉蜀黍adhl基因的内含子显著增强野生型基因在其同源启动子下的表达。发现内含子1特别有效并且增强在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(callis等人,genes develop.[基因与发育]1:1183-1200(1987))。在相同的实验体系中，来自玉蜀黍青铜1基因(maize bronze1gene)的内含子在增强表达方面具有类似效果。已经将内含子序列常规掺入植物转化载体中，典型地在非翻译前导序列内。
[0134]
也已知多种源自病毒的非翻译前导序列增强表达，并且这些序列在双子叶植物细胞中特别有效。特别地，已经显示来自烟草花叶病毒(tmv，“w序列”)、玉蜀黍褪绿斑驳病毒(mcmv)和紫花苜蓿花叶病毒(amv)的前导序列在增强表达方面是有效的(例如，gallie等人nucl.acids res.[核酸研究]15:8693-8711(1987)；skuzeski等人plant molec.biol.[植物分子生物学]15:65-79(1990))。本领域中已知的其他前导序列包括但不限于：小rna病毒前导序列，例如，emcv前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(elroy-stein,o.,fuerst,t.r.和moss,b.pnas usa[美国国家科学院院刊]86:6126-6130(1989))；马铃薯y病毒前导序列，例如，烟草蚀纹病毒(tev)前导序列(allison等人,1986)；玉蜀黍矮小花叶病毒(mdmv)前导序列；(virology[病毒学]154:9-20)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)前导序列(macejak,d.g.和samow,p.,nature[自然]353:90-94(1991))；来自紫花苜蓿花叶病毒的包被蛋白mrna的非翻译前导序列(amv rna 4)(jobling,s.a.和gehrke,l.,nature[自然]325:622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(tmv)(gallie,d.r.等人,molecular biology of rna
esculenta)、咖啡(咖啡属物种(coffea spp.))、椰子(coconut，cocos nucifera)、菠萝(pineapple，ananas comosus)、柑橘树(柑橘属物种(citrus spp.))、可可(cocoa，theobroma cacao)、茶(tea，camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属物种(musa spp.))、油梨(avocado，persea americana)、无花果(fig，ficus casica)、番石榴(guava，psidium guajava)、芒果(mango，mangifera indica)、橄榄(油橄榄(olea europaea))、番木瓜(papaya，carica papaya)、腰果(cashew，anacardium occidentale)、夏威夷果(澳洲坚果(macadamia integrifolia))、扁桃(almond，prunus amygdalus)、甜菜(sugar beets，beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属物种(saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和松柏植物。
[0141]
蔬菜包括番茄(tomato，lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(lactuca sativa))、绿豆(菜豆(phaseolus vulgaris))、利马豆(棉豆(phaseolus limensis))、豌豆(山黧豆属物种(lathyrus spp.))以及甜瓜属(cucumis)成员，如黄瓜(cucumber，c.sativus)、哈密瓜(甜瓜(c.cantalupensis))和香瓜(生瓜(c.meld))。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃花属物种(rhododendron spp.))、八仙花(hydrangea，macrophylla hydrangea)、木槿(朱槿(hibiscus rosasanensis))、玫瑰(蔷薇属物种(rosa spp.))、郁金香(郁金香属物种(tulipa spp.))、水仙花(水仙属物种(narcissus))、喇叭花(矮牵牛(petunia hybrida))、康乃馨(香石竹(dianthus caryophyllus))、一品红(poinsettia，euphorbia pulcherrima)和菊花。
[0142]
可以用于实践本披露的方法的松柏植物包括例如松树，如火炬松(loblolly pine，pinus taeda)、湿地松(slash pine，pinus elliotii)、西黄松(ponderosa pine，pinus ponderosa)、美国黑松(扭叶松(pinus contorta))和蒙特利松树(辐射松(pinus radiata))；花旗松(douglas-fir，pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(加拿大铁杉(tsuga canadensis))；西加云杉(白云杉(picea glauca))；红木(加州红杉(sequoia sempervirens))；真冷杉，如银杉(温哥华冷杉(abies amabilis))和香脂冷杉(balsam fir，abies balsamea)；以及雪松，如西部红雪松(北美乔柏(thuja plicata))和阿拉斯加柏木(黄扁柏(chamaecyparis nootkatensis))以及杨树(poplar)和桉树(eucalyptus)。在特定实施例中，本披露的植物是作物植物(例如，玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，并且在又其他实施例中，玉米植物是最佳的。
[0143]
感兴趣的其他植物包括提供感兴趣的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。感兴趣的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、紫花苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
[0144]
另外，术语“作物”应理解为还包括由于常规的育种或基因工程方法而已经被赋予对除草剂或除草剂类别(如例如，als抑制剂，例如氟嘧磺隆、氟磺隆和三氟啶磺隆、epsps(5-烯醇-丙酮酰-莽草酸-3-磷酸-合酶)抑制剂、gs(谷氨酰胺合成酶)抑制剂)的耐受性的作物。已经通过基因工程方法被赋予对除草剂或除草剂类别的耐受性的作物的实例包括可以商标名和商购的草甘膦抗性和草铵膦抗性作物品种。根据本发明的方法尤其适合于保护也已经被赋予对草甘膦、麦草畏、2,4-d和/或草铵膦
的任何组合的耐受性的大豆作物，并且其中hppd除草剂与其他这样的除草剂(例如草铵膦和/或草甘膦)一起用于杂草控制程序中用于杂草控制。
[0145]
进一步考虑到，可以将本发明的构建体引入植物品种中，这些植物品种具有对于特定的下游用途适合或最佳的改进的特性。例如，天然存在的遗传变异性使植物具有对hppd抑制剂或其他除草剂的抗性或耐受性，并且这样的植物也可用于本发明的方法中。根据本发明的方法可以通过以下方式进一步优化：将提供一定耐受性水平的转基因与在小部分大豆品系中发现的展现增强的对hppd抑制剂的耐受性水平的大豆栽培品种杂交。
[0146]
植物转化
[0147]
一旦将单独的或与编码赋予所期望的性状的多肽的一种或多种另外的核酸分子组合的除草剂抗性或耐受性突变体hppd多核苷酸克隆至表达系统中，其就被引入植物细胞中。可以以多种本领域认可的方式将本发明的表达盒引入植物细胞中。在多核苷酸(例如，感兴趣的核苷酸构建体)的情况下，术语“引入”意图意指以使该多核苷酸得以进入植物细胞内部的方式将该多核苷酸呈递到植物中。在要引入超过一个多核苷酸的情况下，这些多核苷酸可以被组装为单一核苷酸构建体的一部分，或者被组装为单独的核苷酸构建体，并且可以位于同一或不同转化载体上。因此，可以在单一转化事件中，在单独的转化事件中，或者例如在植物中作为育种方案的一部分，将这些多核苷酸引入感兴趣的宿主细胞中。本发明的方法并不依赖于用于将一个或多个多核苷酸引入植物中的特定方法，只要该一个或多个多核苷酸得以进入植物的至少一个细胞内部。用于将多核苷酸引入植物中的方法是本领域中已知的，包括但不限于瞬时转化方法、稳定转化方法和病毒介导的方法。
[0148]
在多核苷酸的情况下，“瞬时转化”意图意指将多核苷酸引入植物中并且不整合到该植物的基因组中。
[0149]“稳定转化”或“稳定转化的”意图意指，被引入植物中的多核苷酸(例如，本文所述的核苷酸构建体)整合至该植物的基因组中，并且能够被其后代继承，更特别地，被多个连续世代的后代继承。
[0150]
可用于植物转化的多种转化载体是植物转化领域的普通技术人员已知的，并且与本发明有关的基因可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术和用于转化的目标物种。对于某些目标物种，不同的抗生素或除草剂选择性标志物可以是优选的。转化中常规使用的选择标志物包括nptll基因，其赋予对卡那霉素和相关抗生素的抗性(messing和vierra gene[基因]19:259-268(1982)；bevan等人,nature[自然]304:184-187(1983))；pat和bar基因，其赋予对除草剂草铵膦(也称为膦丝菌素)的抗性(参见white等人,nucl.acids res[核酸研究]18:1062(1990)，spencer等人theor.appl.genet[理论与应用遗传学]79:625-631(1990)以及美国专利号5,561,236和5,276,268)；hph基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性(blochinger和diggelmann,mol.cell biol.[分子细胞生物学]4:2929-2931)；和dhfr基因，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(bourouis等人,embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]2(7):1099-1104(1983))；epsps基因，其赋予对草甘膦的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)；草甘膦n-乙酰转移酶(gat)基因，其也赋予对草甘膦的抗性(castle等人(2004)science[科学],304:1151-1154；美国专利申请公开号20070004912、20050246798和20050060767)；以及甘露糖-6-磷酸异构酶基因，其提供代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。可替代地，以及在一个优选实施例中，
本发明的hppd基因与使用hppd除草剂作为选择剂组合，它自身被用作选择性标志物。
[0151]
用于植物再生的方法也是本领域熟知的。例如，已经利用ti质粒载体用于递送外来dna，以及直接dna摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微弹。另外，来自土壤杆菌属的细菌可以用于转化植物细胞。以下是对用于转化双子叶和单子叶植物二者的代表性技术连同代表性质体转化技术的描述。
[0152]
许多载体可用于使用根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)的转化。这些典型地携带至少一个t-dna边界序列并且包括诸如pbin19的载体(bevan,nucl.acids res.[核酸研究](1984))。对于可用于土壤杆菌转化中的载体的构建，参见例如，美国专利申请公开号2006/0260011。
[0153]
不使用根癌土壤杆菌的转化避开了所选转化载体中对t-dna序列的需要，因此，除了含有t-dna序列的载体(如上述载体)以外，还可以利用缺少这些序列的载体。不依赖于土壤杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄取(例如，peg和电穿孔)和显微注射进行转化。载体的选择很大程度上取决于所转化物种的优先选择。对于这样的载体的构建，参见例如，美国专利申请公开号20060260011。
[0154]
对于本发明的核苷酸序列在植物质体中的表达，使用质体转化载体pph143(参见pct公开号wo 97/32011，实例36)。将该核苷酸序列插入pph143中，由此替代protox编码序列。然后将该载体用于质体转化以及针对大观霉素抗性对转化体的选择。可替代地，该核苷酸序列被插入pph143中，使得它替代aadh基因。在这种情形中，针对对protox抑制剂的抗性选择转化体。
[0155]
用于双子叶植物的转化技术是本领域中熟知的，并且包括基于土壤杆菌的技术和不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术涉及直接由原生质体或细胞摄取外源遗传物质。这可以通过peg或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的递送或显微注射来完成。这些技术的实例描述于以下文献中：paszkowski等人,embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]3:2717-2722(1984)；potrykus等人,mol.gen.genet.[分子遗传学与基因组学]199:169-177(1985)；reich等人,biotechnology[生物技术]4:1001-1004(1986)；以及klein等人,nature[自然]327:70-73(1987)。在每个情形中，使用本领域已知的标准技术使转化的细胞再生为完整植株。
[0156]
土壤杆菌介导的转化是用于转化双子叶植物的优选技术，因为它具有高转化效率并且具有使用许多不同物种的广泛实用性。土壤杆菌转化典型地涉及将携带感兴趣的外来dna的二元载体(例如，pcib200或pcib2001)转移至适当的土壤杆菌菌株中，这可以取决于由宿主土壤杆菌菌株在共驻ti质粒上或在染色体中携带的vir基因的补体(例如，用于pcib200和pcib2001的菌株cib542(uknes等人plant cell[植物细胞]5:159-169(1993)))。将重组二元载体转移至土壤杆菌中是通过三亲交配程序来完成，该程序使用携带该重组二元载体的大肠杆菌(e.coli)、携带诸如prk2013的质粒并且能够使该重组二元载体移动到靶土壤杆菌菌株的辅助大肠杆菌菌株。可替代地，可以通过dna转化将该重组二元载体转移到土壤杆菌(hofgen和willmitzer,nucl.acids res.[核酸研究]16:9877(1988))。
[0157]
通过重组土壤杆菌转化目标植物物种通常涉及将该土壤杆菌与来自该植物的外植体共栽培，并遵循本领域中熟知的方案。在携带存在于二元质粒t-dna边界之间的抗生素或除草剂抗性标志物的选择性培养基上使转化的组织再生。
[0158]
用基因转化植物细胞的另一种方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物活性颗粒。该技术披露于美国专利号4,945,050、5,036,006和5,100,792(都属于sanford等人)中。通常，该程序涉及在有效穿透细胞的外表面并提供在细胞内部中掺入的条件下在细胞处推进惰性或生物活性颗粒。在利用惰性颗粒时，可以通过用含有期望基因的载体包被这些颗粒以将该载体引入细胞中。可替代地，可以使靶细胞被载体包围以使得该载体通过颗粒的尾流而被带入该细胞中。还可以将生物活性颗粒(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，其各自含有寻求引入的dna)推进到植物细胞组织中。
[0159]
大多数单子叶植物物种的转化现在也已经变成了常规操作。优选的技术包括使用peg或电穿孔技术将基因直接转移至原生质体中，以及粒子轰击至愈伤组织中。转化可以用单一dna种类或多个dna种类(即，共转化)来进行，并且这两种技术都适用于本发明。共转化可以具有如下优点：避免完整载体构建以及生成具有感兴趣的基因和选择性标志物的非伴性基因座的转基因植物，使得能够在随后的世代中去除该选择性标志物(如果这被认为所期望的话)。然而，使用共转化的缺点在于，单独dna种类整合至基因组中的频率低于100％(schocher等人biotechnology[生物技术]4:1093-1096(1986))。
[0160]
欧洲专利ep 0 292 435和ep 0 392 225以及pct公开号wo 93/07278描述了用于从玉蜀黍的良种近交系制备愈伤组织和原生质体、使用peg或电穿孔转化原生质体以及从转化的原生质体使玉蜀黍植株再生的技术。gordon-kamm等人(plant cell[植物细胞]2:603-618(1990))和fromm等人(biotechnology[生物技术]8:833-839(1990))已经发表了用于使用粒子轰击转化a188衍生的玉蜀黍品系的技术。此外，pct公开号wo 93/07278和koziel等人(biotechnology[生物技术]11:194-200(1993))描述了用于通过粒子轰击转化玉蜀黍的良种近交系的技术。这种技术利用了在授粉后14-15天从玉蜀黍穗切除的1.5mm-2.5mm长的不成熟玉蜀黍胚，以及用于轰击的pds-1000he biolistics装置。
[0161]
稻的转化也可以通过利用原生质体的直接基因转移技术或粒子轰击来进行。已经描述用于日本产植物(japonica)类型和印度产植物(indica)类型的原生质体介导的转化(zhang等人plant cell rep[植物细胞报告]7:379-384(1988)；shimamoto等人nature[自然]338:274-277(1989)；datta等人biotechnology[生物技术]8:736-740(1990))。两种类型也都是可使用粒子轰击常规转化的(christou等人biotechnology[生物技术]9:957-962(1991))。此外，pct公开号wo 93/21335描述了用于通过电穿孔转化稻的技术。
[0162]
欧洲专利ep 0 332 581描述用于早熟禾亚科(pooideae)原生质体的生成、转化和再生的技术。这些技术允许转化鸭茅(dactylis)和小麦。此外，小麦转化已经由vasil等人(biotechnology[生物技术]10:667-674(1992))描述为使用粒子轰击至c型长期可再生愈伤组织的细胞中，并且还由vasil等人(biotechnology[生物技术]11:1553-1558(1993))和weeks等人(plant physiol.[植物生理学]102:1077-1084(1993))描述为使用不成熟胚和不成熟胚衍生的愈伤组织的粒子轰击。然而，用于小麦转化的优选技术涉及通过不成熟胚的粒子轰击转化小麦，并且包括在基因递送之前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击前，将任何数量的胚(长度为0.75mm-1mm)铺板至含有3％蔗糖(murashiga和skoog,physiologia plantarum[植物生理学]15:473-497(1962))和3mg/l 2,4-d的ms培养基上，用于诱导体细胞胚，允许其在黑暗中进行。在所选的轰击当天，从诱导培养基取出胚并置于渗压剂(即含有以期望浓度(典型地15％)添加的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)上。允许这些胚质壁分离
2-3小时，然后进行轰击。每个目标板二十个胚是典型的，但并不是关键。使用标准程序使适当的携带基因的质粒(如pcib3064或psog35)沉淀至微米级金颗粒上。用dupont氦装置使用约1000psi的爆破压力使用标准80目网筛射击每个板的胚。在轰击之后，将这些胚放回到黑暗中恢复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂上取出这些胚并将其放回到诱导培养基上，它们在再生前在这里停留约1个月。大约一个月之后，将具有发育中的胚性愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基(ms+1mg/l naa，5mg/l ga)中，该再生培养基进一步含有适当的选择剂(在pcib3064的情形中是10mg/l basta，并且在psog35的情形中是2mg/l甲氨蝶呤)。大约一个月后，将发育的嫩枝转移到称为“ga7”的无菌容器中，这些容器含有半强度ms、2％蔗糖和相同浓度的选择剂。
[0163]
还已经描述使用土壤杆菌转化单子叶植物。参见pct公开号wo 94/00977、美国专利号5,591,616以及negrotto等人,plant cell reports[植物细胞报告]19:798-803(2000)。例如，稻(水稻(oryza sativa))可以用于生成转基因植物。可以使用各种稻栽培品种(hiei等人,1994,plant journal[植物杂志]6:271-282；dong等人,1996,molecular breeding[分子育种]2:267-276；hiei等人,1997,plant molecular biology[植物分子生物学],35:205-218)。而且，下文描述的各种培养基成分的量可以改变或者可以被替代。胚性反应被启动和/或通过在ms-cim培养基(ms基础盐，4.3g/l；b5维生素(200x)，5ml/l；蔗糖，30g/l；脯氨酸，500mg/l；谷氨酰胺，500mg/l；水解酪蛋白，300mg/l；2,4-d(1mg/ml)，2ml/l；用1n koh将ph调整至5.8；phytagel，3g/l)上培养从成熟的胚建立培养。将在培养反应初始阶段的成熟胚或已建立的培养系接种并与含有期望载体构造的根癌土壤杆菌菌株lba4404(土壤杆菌)共栽培。将来自甘油母液的土壤杆菌在28℃下在固体ypc培养基(100mg/l大观霉素和任何其他适当抗生素)上培养约2天。使土壤杆菌重悬于液体ms-cim培养基中。将土壤杆菌培养物稀释至od
600
为0.2-0.3，并添加乙酰丁香酮至最终浓度为200μm。在将该溶液与稻培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导土壤杆菌将dna转移至植物细胞中。对于接种，将植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除液体细菌悬浮液并将接种的培养物置于共栽培培养基上，并在22℃下孵育两天。然后将培养物转移至含有替卡西林(400mg/l)的ms-cim培养基以抑制土壤杆菌生长。对于利用pmi选择性标志物基因的构建体(reed等人,in vitro cell.dev.biol.-plant[体外细胞与发育生物学—植物]37:127-132)，在7天后将培养物转移到含有甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基(含有2％甘露糖、300mg/l替卡西林的ms)上，并在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基(不含2,4-d，含有0.5mg/liaa、1mg/l玉米素、200mg/l特美汀、2％甘露糖和3％山梨醇的ms)并在黑暗中生长14天。然后将增殖的菌落转移到另一轮再生诱导培养基并且移到光照生长室中。将再生的嫩枝转移到含有ga7-1培养基(不含激素且含有2％山梨醇的ms)的ga7容器中持续2周，然后在它们足够大并具有足够的根时将其移到温室中。将植物在温室中移植到土壤(t0世代)，生长至成熟，并收获t1种子。
[0164]
在本发明中通过用感兴趣的核酸序列转化获得的植物可以是众多个植物物种中的任一种，包括单子叶植物和双子叶植物的那些种类；然而，用于本发明方法中的植物优选地选自本文其他地方所示的农艺学上重要的目标作物的列表。本发明的基因的表达与对于产量和质量重要的其他特征的组合可以通过育种掺入植物品系中。育种的方法和技术是本领域中已知的。参见例如，welsh j.r.,fundamentals of plant genetics and breeding
[植物遗传育种基础],纽约约翰威利父子出版公司(john wiley&sons,ny)(1981)；crop breeding[作物育种],wood d.r.(编辑)威斯康辛州麦迪逊的美国农学会(american society of agronomy madison,wis.)(1983)；mayo o.,the theory of plant breeding,second edition[植物育种理论第二版],牛津克拉伦登出版社(clarendon press,oxford)(1987)；singh,d.p.,breeding for resistance to diseases and insect pests[抗病虫害育种],纽约施普林格出版社(springer-verlag,ny)(1986)；以及wricke和weber,quantitative genetics and selection plant breeding[数量遗传学与选择植物育种],柏林沃尔特
·
德
·
格鲁伊特公司(walter de gruyter and co.,berlin)(1986)。
[0165]
对于质体的转化，使烟草(nicotiana tabacum c.v.)的种子“xanthienc”在t琼脂培养基上的1"圆形阵列中以每板七个发芽，并在播种后12-14天用基本上如所述用来自质粒pph143和pph145的dna包被的1μm钨颗粒(m10，加利福尼亚州赫拉克勒斯伯乐公司(biorad,hercules,calif.))进行轰击(svab,z.和maliga,p.(1993)pnas[美国国家科学院院刊]90,913-917)。将轰击的幼苗在t培养基上孵育两天，之后切除叶并以远轴侧朝上在含有500μg/ml盐酸大观霉素(密苏里州圣路易斯西格玛公司(sigma,st.louis,mo))的rmop培养基(svab,z.,hajdukiewicz,p.和maliga,p.(1990)pnas[美国国家科学院院刊]87,8526-8530)的板上置于强光(350-500μmol光子/m2/s)中。将轰击后三至八周出现在褪色的叶下面的抗性嫩枝亚克隆到相同的选择培养基上，允许其形成愈伤组织，并且对二次枝进行分离和亚克隆。独立的亚克隆中转化的质体基因组拷贝的完全分离(同质性(homoplasmicity))通过标准dna印迹技术加以评估(sambrook等人,(1989)molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],冷泉港的冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory,cold spring harbor))。在1％tris-硼酸(tbe)琼脂糖凝胶上分离bamhi/ecori消化的总细胞dna(mettler,i.j.(1987)plant mol biol reporter[植物分子生物学导报]5,346349)，将其转移至尼龙膜(amersham)上，并用含有rps 7/12质体靶向序列的一部分的对应于来自pc8的0.7kb bamhi/hindiii dna片段的
32
p标记的随机引发的dna序列进行探测。使同质性嫩枝在含有大观霉素的ms/iba培养基(mcbride,k.e.等人(1994)pnas[美国国家科学院院刊]91,7301-7305)上无菌生根，并将其转移至温室中。
[0166]
将工程化至上述转基因种子和植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长进行传递，并且可以因此在后代植物中维持和传播。通常，维持和传播利用已知的农业方法，开发这些方法以适合特定的目的，如耕种、播种或收获。
[0167]
可以在植物育种中进一步利用根据本发明的转基因植物和种子的有利的遗传特性。根据期望的特性，采取不同的育种措施。相关的技术是本领域中熟知的，并且包括不仅限于：杂交、自交、回交育种、多系育种、品种共混(variety blend)、种间杂交、非整倍体技术等。因此，根据本发明的转基因种子和植物可以用于改良植物品系的育种，从而例如提高常规方法(如除草剂或杀有害生物剂处理)的有效性，或由于其改良的遗传特性而允许免除所述方法。
[0168]
如本文所用，术语“品种”是指定义为共享共同的特征或性状集合的物种内的一组植物，本领域技术人员承认该特征或性状集合足以区分一个栽培品种或品种与另一个栽培品种或品种。如果在纯育的栽培品种或品种自花授粉时，所有后代都含有特定性状，则该栽
培品种或品种被视为对于该性状是“纯育的”。术语“育种系”或“品系”是指定义为共享共同的特征或性状集合的栽培品种内的一组植物，本领域技术人员承认该特征或性状集合足以区分一个育种系或品系与另一个育种系或品系。如果在纯育系或育种系自花授粉时，所有后代都含有特定性状，则该育种系或品系被视为对于该性状是“纯育的”。作为一个实例，hppd抗性性状源于植物或植物种子的hppd基因中的突变。
[0169]
使用合适的选择标志物(如卡那霉素)、二元载体(如来自土壤杆菌)和植物再生(如例如来自烟草叶盘)的许多合适的转化方法是本领域中熟知的。任选地，将对照植物群体同样用表达对照hppd的多核苷酸进行转化。可替代地，未转化的双子叶植物如拟南芥或烟草可以用作对照，因为其在任何情形中都表达其自己的内源hppd。
[0170]
除草剂抗性
[0171]
本发明提供已经用编码赋予对除草剂的抗性或耐受性的突变体hppd或其变体的核酸分子转化的转基因植物、植物细胞、组织和种子，该核酸分子是单独的或与编码赋予所期望的性状的多肽的一个或多个另外的核酸分子组合。
[0172]
在一个实施例中，本发明的转基因植物展现对以以下量施用的除草剂的抗性或耐受性：约5至约2,000克每公顷(g/ha)，包括例如约5g/ha、约10g/ha、约15g/ha、约20g/ha、约25g/ha、约30g/ha、约35g/ha、约40g/ha、约45g/ha、约50g/ha、约55g/ha、约60g/ha、约65g/ha、约70g/ha、约75g/ha、约80g/ha、约85g/ha、约90g/ha、约95g/ha、约100g/ha、约110g/ha、约120g/ha、约130g/ha、约140g/ha、约150g/ha、约160g/ha、约170g/ha、约180g/ha、约190g/ha、约200g/ha、约210g/ha、约220g/ha、约230g/ha、约240g/ha、约250g/ha、约260g/ha、约270g/ha、约280g/ha、约290g/ha、约300g/ha、约310g/ha、约320g/ha、约330g/ha、约340g/ha、约350g/ha、约360g/ha、约370g/ha、约380g/ha、约390g/ha、约400g/ha、约410g/ha、约420g/ha、约430g/ha、约440g/ha、约450g/ha、约460g/ha、约470g/ha、约480g/ha、约490g/ha、约500g/ha、约510g/ha、约520g/ha、约530g/ha、约540g/ha、约550g/ha、约560g/ha、约570g/ha、约580g/ha、约590g/ha、约600g/ha、约610g/ha、约620g/ha、约630g/ha、约640g/ha、约650g/ha、约660g/ha、约670g/ha、约680g/ha、约690g/ha、约700g/ha、约710g/ha、约720g/ha、约730g/ha、约740g/ha、约750g/ha、约760g/ha、约770g/ha、约780g/ha、约790g/ha、约800g/ha、约810g/ha、约820g/ha、约830g/ha、约840g/ha、约850g/ha、约860g/ha、约870g/ha、约880g/ha、约890g/ha、约900g/ha、约910g/ha、约920g/ha、约930g/ha、约940g/ha、约950g/ha、约960g/ha、约970g/ha、约980g/ha、约990g/ha、约1,000g/ha、约1,010g/ha、约1,020g/ha、约1,030g/ha、约1,040g/ha、约1,050g/ha、约1,060g/ha、约1,070g/ha、约1,080g/ha、约1,090g/ha、约1,100g/ha、约1,110g/ha、约1,120g/ha、约1,130g/ha、约1,140g/ha、约1,150g/ha、约1,160g/ha、约1,170g/ha、约1,180g/ha、约1,190g/ha、约1,200g/ha、约1,210g/ha、约1,220g/ha、约1,230g/ha、约1,240g/ha、约1,250g/ha、约1,260g/ha、约1,270g/ha、约1,280g/ha、约1,290g/ha、约1,300g/ha、约1,310g/ha、约1,320g/ha、约1,330g/ha、约1,340g/ha、约1,350g/ha、约360g/ha、约1,370g/ha、约1,380g/ha、约1,390g/ha、约1,400g/ha、约1,410g/ha、约1,420g/ha、约1,430g/ha、约1,440g/ha、约1,450g/ha、约1,460g/ha、约1,470g/ha、约1,480g/ha、约1,490g/ha、约1,500g/ha、约1,510g/ha、约1,520g/ha、约1,530g/ha、约1,540g/ha、约1,550g/ha、约1,560g/ha、约1,570g/ha、约1,580g/ha、约1,590g/ha、约1,600g/ha、约1,610g/ha、约1,620g/ha、约1,630g/ha、约1,640g/ha、约1,650g/
ha、约1,660g/ha、约1,670g/ha、约1,680g/ha、约1,690g/ha、约1,700g/ha、约1,710g/ha、约1,720g/ha、约1,730g/ha、约1,740g/ha、约1,750g/ha、约1,760g/ha、约1,770g/ha、约1,780g/ha、约1,790g/ha、约1,800g/ha、约1,810g/ha、约1,820g/ha、约1,830g/ha、约1,840g/ha、约1,850g/ha、约1,860g/ha、约1,870g/ha、约1,880g/ha、约1,890g/ha、约1,900g/ha、约1,910g/ha、约1,920g/ha、约1,930g/ha、约1,940g/ha、约1,950g/ha、约1,960g/ha、约1,970g/ha、约1,980g/ha、约1,990g/ha或约2,000g/ha。
[0173]
在一系列不同除草剂浓度下，基于植物损害、分生组织脱色症状等，以正常方式评价一系列初级植物转化事件的除草剂耐受性或抗性水平的平均值和分布。这些数据可以以例如源自剂量/反应曲线的gr
50
值的方式来表示，这些曲线将“剂量”绘制于x轴上，并将“杀伤百分比”、“除草效果”、“新出现的绿色植物的数量”等绘制于y轴上，其中gr
50
值增加对应于固有抑制剂耐受性的水平增加(例如，k
off
/k
mhpp
值增加)和/或所表达hppd多肽的表达水平增加。
[0174]
本发明的方法对于保护作物免受hppd抑制剂除草剂的除草剂损伤尤其有用。hppd抑制剂选自由以下组成的组：氟吡草酮(cas rn 352010-68-5)、双唑草酮(bipyrazone，cas rn 1622908-18-2)、喹草酮(benquitrione，cas rn 1639426-14-4)、双环磺草酮(cas rn 156963-66-5)、吡草酮(cas rn 82692-44-2)、环吡氟草酮(cypyrafluone，cas rn 1855929-45-1)、ketospiradox(cas rn 192708-91-1)或其游离酸(cas rn 187270-87-7)、二氧代吡啶三酮(dioxopyritrione，cas rn 2222257-79-4＝化合物c)、异噁氯草酮(cas rn 141112-06-3)、芬喹酮(fenquinotrione，cas rn 1342891-70-6)、苯唑氟草酮(fenpyrazone，cas rn 1992017-55-6)、异噁唑草酮(cas rn 141112-29-0)、氧戊磺草酮(lancotrione，cas rn 1486617-21-3)、硝磺草酮(cas rn 104206-82-8)、磺酰草吡唑(cas rn 365400-11-9)、吡唑特(cas rn 58011-68-0)、苄草唑(cas rn 71561-11-0)、磺草酮(cas rn 99105-77-8)、呋喃磺草酮(cas rn 473278-76-1)、环磺酮(cas rn 335104-84-2)、tolpyralate(cas rn 1101132-67-5)、苯吡唑草酮(cas rn 210631-68-8)、三唑磺草酮(tripyrasulfone，cas rn 1911613-97-2)及其农化上可接受的盐。
[0175]
hppd抑制剂进一步包括以下文献中披露的化合物：wo 2012/002096(例如6-(2,6-二氧代环己烷羰基)-4-(4-氟苯基)-2-甲基-1,2,4-三嗪-3,5-二酮)、wo2012/126932(例如2-甲基-n-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-甲基磺酰基-4-(三氟甲基)苯甲酰胺)、wo 2012/028579(例如2-氯-3-甲基硫烷基-n-(1-甲基四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺)、wo 2013/092834、wo 2013/139760、wo 2013/144231、wo 2014/192936、wo 2015/128424、wo 2016/038173、wo 2016/135196、wo 2018/050677(例如n-(1-甲基四唑-5-基)-2-(1,2,4-三唑-1-基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-甲酰胺＝化合物d)、wo2018/077875、wo2019/141740、wo2019/196904(例如3-(3-氯苯基)-6-(5-羟基-1,3-二甲基-吡唑-4-羰基)-1,5-二甲基-喹唑啉-2,4-二酮和[4-[3-(3-氯苯基)-1,5-二甲基-2,4-二氧代-喹唑啉-6-羰基]-2,5-二甲基-吡唑-3-基]n,n-二乙基氨基甲酸酯)、wo 2019/243358、wo 2020/108518(例如2-氟-n-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-[(r)-丙基亚磺酰基]-4-(三氟甲基)苯甲酰胺和2-氟-n-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-丙基亚磺酰基-4-(三氟甲基)苯甲酰胺)、wo 2020/189576(例如3-(异丙基磺酰基甲基)-n-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-5-(三氟甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-8-甲酰胺)、wo 2021/013969、wo 2021/094505和wo 2021/
209383。
[0176]
使用方法
[0177]
本发明进一步提供一种在包含作物植物和杂草的场所选择性地控制杂草的方法，其中这些植物是通过上述本发明的任何方法获得的，其中该方法包括向该场所施用杂草控制量的一种或多种除草剂。本文描述的任何转基因植物可以用于本发明的这些方法内。术语“场所”可以包括土壤、种子、幼苗、田地以及已建立的植被。可以在作物或杂草的苗前或苗后合适地施加除草剂。
[0178]
术语“杂草控制量”意欲包括在功能上能够影响给定杂草的生长或发育的除草剂的量。因此，该量可以小到足以仅迟滞或抑制给定杂草的生长或发育，或者该量可以大到足以不可逆地破坏给定杂草。此外，该量可以是其间的任何量。
[0179]
由此，本发明提供一种在场所控制杂草的方法，该方法包括向该场所施加杂草控制量的一种或多种除草剂，其中该场所包含已经用编码赋予对hppd除草剂的抗性或耐受性的突变体hppd多肽或其变体的核酸分子转化的转基因植物，该核酸分子是单独的或与编码赋予所期望的性状的多肽的一种或多种另外的核酸分子组合。在一个实施例中，所期望的性状是对除草剂的抗性或耐受性，该除草剂包括例如选自由以下组成的组的除草剂：hppd抑制剂、草甘膦和草铵膦。在另一个实施例中，该场所包含已经用上述核酸分子的任何组合转化的转基因植物，这些核酸分子包括编码赋予对除草剂的抗性或耐受性的突变体hppd多肽或其变体的一种或多种核酸分子，这些核酸分子与编码赋予所期望的性状的多肽的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种另外的核酸分子组合。
[0180]
在一个实施例中，本发明提供用于在作物田地中控制不期望的植物物种的转基因植物和方法，其中通过转化以表达编码突变体hppd多肽的基因而使这些作物植物对hppd化学具有抗性，并且其中以能够杀伤不期望的植被或植物物种(杂草物种，或者例如所期望的作物植物的田地中的遗留(carry-over)或“劣种”或“自播”作物植物)或削弱其生长的量作为过多施用来施加hppd除草剂。该施用可以在作物植物或不期望物种的苗前或苗后进行，并且可以与作物天然耐受的或者作物通过一种或多种其他除草剂抗性转基因的表达而具有抗性的其他除草剂的施用组合。参见例如，美国专利申请公开号2004/0058427和pct公开号wo 98/20144。
[0181]
与抑制hppd的除草剂组合施加的该一种或多种其他除草剂可以在不影响除草剂抗性植物的产量或生长的情况下依序(例如，相继)或同时施加。这包括基于该抑制hppd的除草剂的施用根据时间表施加该一种或多种其他除草剂。在同时施加时，将有效量的每种除草剂同时(例如，在植物生长的同一阶段，和/或作为包含该一种或多种除草剂和该抑制hppd的除草剂的除草剂组合物的成分)施加至植物。作为非限制性实例，将包含硝磺草酮和草铵膦的除草剂组合物施用至包含本披露的突变体hppd的植物是同时施用的一个实例。在依序施加时，将有效量的每种除草剂相继施加至植物。作为非限制性实例，在将草铵膦施用至包含本披露的突变体hppd的植物后施用硝磺草酮是同时施用的一个实例。在同时施用的替代性实例中，硝磺草酮施用发生在将草铵膦施用至包含本披露的突变体hppd的植物之前。
[0182]
在另一个实施例中，本发明还涉及一种保护作物植物免受除草剂损伤的方法。在作物植物的栽培中，尤其是在商业规模上，正确轮作对于产量稳定性(长时期实现良好质量
的高产量)以及对于农艺学业务的经济成功是极其重要的。例如，横跨美国大面积的主要玉蜀黍种植地区(“中央玉米带”)，在超过75％的情形中大豆作为玉蜀黍的后续作物来种植。人们越来越多地使用hppd抑制剂除草剂对玉蜀黍作物进行选择性杂草控制。尽管该类别的除草剂非常适合于该目的，但是它可能对后续作物中的作物植物造成在农艺学上无法接受的植物毒性损害(“遗留”损害)。例如，即使这样的hppd抑制剂除草剂的残留物极少，某些大豆品种也是敏感的。因此，本发明的除草剂抗性或耐受性植物也可用于在来自先前施用的除草剂的任何短期遗留的场所中种植(例如，通过在施用除草剂的后一年中种植本发明的转基因植物以降低该除草剂的土壤残留物造成损害的风险)。
[0183]
通常，术语“除草剂”在本文中用于意指杀伤、控制植物或以其他方式不利地改变植物生长的活性成分。除草剂的“有效量”或“有效浓度”意图分别意指足以杀伤类似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长的量和浓度，但是该所述量不会同样严重地杀伤本发明的除草剂抗性植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞或抑制其生长。典型地，除草剂的有效量是在农业生产系统中常规用于杀伤目的杂草(如在除草剂抗性植物附近生长的杂草)的量。这样的量是本领域技术人员已知的。当在任何生长阶段或者在种植或出苗前将可用于本发明的除草剂直接施加至植物或植物的场所(如在种植植物的栽培区域)时，这些除草剂展现除草活性。所观察到的效果取决于要控制的植物物种、植物的生长阶段、稀释液的施用参数和喷雾剂液滴大小、固体组分的粒径、使用时的环境条件、所采用的特定化合物、所采用的特定佐剂和载体、土壤类型等，以及所施加的化学物质的量。可以调整这些和其他因素以促进非选择性或选择性除草作用。在一个实例中，除草剂是在苗后施加至相对不成熟的不所期望的植被，以实现对杂草的最大控制。
[0184]
如在“除草剂抗性”或“除草剂耐受性”植物的情形中，“除草剂抗性”或“除草剂耐受性”意图是指植物对通常会杀伤正常或野生型植物或抑制其生长的水平的至少一种除草剂具有抗性。具有“除草剂抗性”或“除草剂耐受性”的突变体hppd蛋白意图是指，这样的hppd蛋白相对于相应的天然或野生型hppd蛋白包含一个或多个氨基酸缺失、添加或取代，从而当在已知会干扰hppd活性的至少一种除草剂的存在下以及在已知会抑制野生型hppd蛋白的hppd活性的除草剂的浓度或水平下时，导致相对于相应天然或野生型hppd蛋白的hppd活性更高的hppd活性。此外，这样的除草剂耐受性或除草剂抗性突变的hppd蛋白的hppd活性在本文中可以被称为“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”hppd活性。
[0185]
本发明的非限制性实施例包括：
[0186]
1.一种分离的或重组的多肽，其包含编码对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂除草剂化合物具有耐受性的hppd蛋白的氨基酸序列，其中所述蛋白质包含：(a)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、位置271或位置304对应的氨基酸位置处的取代；(b)(a)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被g取代；(c)(a)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置271对应的氨基酸位置被n取代；(d)(a)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置304对应的氨基酸
位置被t取代；(e)(a)的氨基酸序列，其进一步包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、260、327、340、359或411对应的一个或多个氨基酸位置处的取代；(f)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代；(g)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置260对应的氨基酸位置被a取代；(h)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代；(i)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代；(j)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代；(k)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置g411对应的氨基酸位置被a取代；(l)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、327、340和359中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(m)(l)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代；(n)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、327、340、359和g411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(m)(n)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代，并且与氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代；(o)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、260、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(p)(o)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置260对应的氨基酸位置被a取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代，并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代；(q)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1的氨基酸位置
218、271、327、340和359中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(r)(q)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置271对应的氨基酸位置被n取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代；(s)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、218、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(t)(s)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被g取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被y取代，并且与氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代；(u)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、218、304、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(v)(u)的氨基酸序列，其中与seq id no:1的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被g取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置304对应的氨基酸位置被t取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被y取代；并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代；(w)与seq id no:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、122、123、124、125、126或127中的任一个具有至少85％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列；(x)seq id no:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、122、123、124、125、126或127中的任一个所示的氨基酸序列；(y)(a)-(w)的氨基酸序列，其进一步包含与seq id no:59、60、61、62或63所示的基序对应的、包含一个或多个氨基酸取代或缺失的多肽基序，并且其中该基序的一个或多个氨基酸取代的位置是相对于seq id no:1或2或3中相应的一个或多个氨基酸。2.一种分离的或重组的多核苷酸，其编码如实施例1所述的多肽。3.如实施例2所述的分离的或重组的多核苷酸，其中该多核苷酸包含seq id no:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、132或133。
4.如实施例2或3所述的分离的或重组的多核苷酸，其中该分离的多核苷酸的核苷酸序列被优化用于在植物中表达。5.如实施例2、3或4所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述多核苷酸与启动子可操作地连接。6.如实施例5所述的分离的或重组的多核苷酸，其中该启动子驱动在植物或植物细胞中的表达。7.一种表达盒，该表达盒包含如实施例2、3、4、5或6所述的分离的多核苷酸。8.如实施例7所述的表达盒，该表达盒进一步包含可操作地连接的、编码赋予所期望的性状的多肽的重组的或分离的多核苷酸序列。9.如实施例8所述的表达盒，其中该所期望的性状是对除草剂的抗性。10.如实施例9所述的表达盒，其中所述所期望的性状是对hppd抑制剂、草甘膦、ppo抑制剂或草铵膦的抗性。11.如实施例10所述的表达盒，其中所述赋予所期望的性状的多肽是细胞色素p450或其变体。12.如实施例10所述的表达盒，其中所述赋予所期望的性状的多肽是epsps(5-烯醇-丙酮酰-莽草酸-3-磷酸-合酶)。13.如实施例10所述的表达盒，其中所述赋予所期望的性状的多肽是膦丝菌素乙酰转移酶(pat)或ppo。14.一种载体，该载体包含如实施例7、8或9所述的表达盒。15.如实施例14所述的载体，其中该载体包含seq id no:119、120或121中的一个。16.一种细胞，该细胞包含编码如权利要求实施例所述的多肽的异源多核苷酸。17.如实施例16所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。18.一种植物或植物部分，该植物或植物部分具有稳定整合至其基因组中的编码如实施例1所述的多肽的异源多核苷酸。19.如实施例18所述的植物或植物部分，其中所述植物具有稳定掺入其基因组中的如实施例7-13中任一项所述的表达盒。20.如实施例18所述的植物或植物部分，其中所述编码所述异源多肽的多核苷酸已通过转化被引入该植物或植物部分中。21.如实施例18所述的植物或植物部分，其中所述编码所述异源多肽的多核苷酸已通过基因组修饰被引入基因组中。22.如实施例18、19、20或21所述的植物或植物部分，其中当在该植物中表达时，如与该植物的相应野生型品种相比，所述重组的多肽赋予该植物增强的除草剂耐受性。23.如实施例18、19、20、21或22所述的植物或植物部分，其中所述植物是单子叶植物。24.如实施例23所述的植物或植物部分，其中所述单子叶植物是玉米、黑麦、大麦、稻、高粱、燕麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、芒草或小麦。25.如实施例18、19、20、21或22所述的植物或植物部分，其中所述植物是双子叶植物。26.如实施例25所述的植物或植物部分，其中所述双子叶植物是大豆、向日葵、番
茄、甜菜、烟草、油菜作物、马铃薯、甘薯、木薯、红花、树、紫花苜蓿、豌豆和棉花。27.一种由如实施例18-26中任一项所述的植物产生的种子，其中所述种子具有稳定掺入其基因组中的编码如实施例1所述的多肽的多核苷酸。28.如权利要求27所述的种子，其中如与该种子的野生型品种相比，该种子对于增强的对抑制hppd的除草剂的抗性是纯育的。29.一种用于在植物中赋予对hppd抑制剂的抗性的方法，该方法包括将如实施例7-13中任一项所述的表达盒引入该植物中或者将编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸引入该植物中。30.一种在栽培区域中控制不期望的植被的方法，该方法包括a)在所述栽培区域提供如实施例18-26中任一项所述的植物，b)向所述栽培区域施加有效量的hppd抑制剂化合物。31.如实施例30所述的方法，其中该植物包含含有编码除草剂耐受性酶的核苷酸序列的至少一种另外的异源核酸。32.如实施例30或31所述的方法，其中该hppd抑制剂除草剂与一种或多种另外的除草剂同时或依序施加。33.如实施例29-32中任一项所述的方法，或如实施例1-28中任一项所述的组合物，其中该一种或多种hppd抑制剂选自由以下组成的组：氟吡草酮(cas rn 352010-68-5)、双环磺草酮(cas rn 156963-66-5)、吡草酮(cas rn 82692-44-2)、ketospiradox(cas rn 192708-91-1)或其游离酸(cas rn 187270-87-7)、异噁氯草酮(cas rn 141112-06-3)、异噁唑草酮(cas rn 141112-29-0)、硝磺草酮(cas rn 104206-82-8)、磺酰草吡唑(cas rn 365400-11-9)、吡唑特(cas rn 58011-68-0)、苄草唑(cas rn 71561-11-0)、磺草酮(cas rn 99105-77-8)、呋喃磺草酮(cas rn 473278-76-1)、环磺酮(cas rn 335104-84-2)、苯吡唑草酮(cas rn 210631-68-8)及其农化上可接受的盐。34.如实施例29-32中任一项所述的方法或如实施例1-28中任一项所述的组合物，其中该一种或多种hppd抑制剂是硝磺草酮。35.一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，该方法包括：i)提供转化的植物或其植物部分，其中所述转化的植物或植物部分包含与驱动该植物或植物部分的表达的启动子可操作地连接的、编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸；ii)使该转化的植物或植物部分与至少一种hppd抑制剂化合物接触；iii)确定该植物或植物部分是否受该hppd抑制化合物影响；以及iv)鉴定或选择具有所述多核苷酸的转化的植物或植物部分。35.一种用于使如实施例18-26中任一项所述的植物生长，同时控制所述植物附近的杂草的方法，所述方法包括以下步骤：a)使所述植物生长；以及b)将有效量的包含hppd抑制剂的除草剂组合物施加至该植物和杂草。36.一种可用于杂草控制的组合，该组合包含(a)编码如实施例1所述的多肽的多核苷酸，该多核苷酸能够在植物中表达，从而
向该植物提供对抑制hppd的除草剂的耐受性；以及(b)抑制hppd的除草剂。37.一种用于制备可用于杂草控制的组合的工艺，该工艺包括(a)提供编码如实施例1所述的hppd多肽的多核苷酸，该多核苷酸能够在植物中表达，从而向该植物提供对抑制hppd的除草剂的耐受性；以及(b)提供抑制hppd的除草剂。38.如实施例37所述的工艺，其中所述提供多核苷酸的步骤包括提供含有该多核苷酸的植物。39.如实施例37所述的工艺，其中所述提供多核苷酸的步骤包括提供含有该多核苷酸的种子。40.如权利要求39所述的工艺，该工艺进一步包括将该抑制hppd的除草剂施加至该种子的步骤。41.如实施例26所述的组合控制植物栽培地点的杂草的用途。42.如权利要求35所述的方法或如权利要求37-40中任一项所述的工艺，其中该植物是单子叶植物，任选地其中该单子叶植物是玉米、黑麦、大麦、稻、高粱、燕麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、芒草或小麦。43.如权利要求35所述的方法或如权利要求37-40中任一项所述的工艺，其中该植物是双子叶植物，任选地其中该双子叶植物是大豆、向日葵、番茄、甜菜、烟草、油菜作物、马铃薯、甘薯、木薯、红花、树、紫花苜蓿、豌豆和棉花。44.如权利要求35所述的方法或如权利要求37-43中任一项所述的工艺，其中该一种或多种hppd抑制剂选自由以下组成的组：氟吡草酮、双环磺草酮、吡草酮、ketospiradox或其游离酸、异噁氯草酮、异噁唑草酮、硝磺草酮、磺酰草吡唑、吡唑特、苄草唑、磺草酮、呋喃磺草酮、环磺酮、苯吡唑草酮及其农化上可接受的盐。
[0187]
实例
[0188]
现在参照以下实例描述本发明。提供这些实例仅用于说明性目的，并且本发明不限于这些实例，但是更确切地说涵盖了所有的由于本文提供的传授的内容而明显的变体。
[0189]
实例1：燕麦属、看麦娘属和阿披拉草属衍生的hppd序列的克隆、表达和测定以及所得hppd突变体对各种hppd除草剂的ic50值的确定。
[0190]
将由金唯智公司(genewiz，美国)合成以在大肠杆菌中表达以编码源自燕麦(seq id no:122、124)、大穗看麦娘(seq id no:126)或阿披拉草(seq id no:123、125)的hppd变体(seq id no:5-58、122、124、125和127)的dna序列(seq id no:65-118、128、130、131和133)转化至大肠杆菌bl21(de3)(新英格兰生物实验室(new england biolabs))中并在0.5ml terrific肉汤+50ug/ml卡那霉素培养基中在96深孔块中生长过夜(37℃，900rpm)。将25ul过夜培养物接种至新鲜的含有1ml formedium自诱导培养基(formedium autoinduction media)(aim)的96深孔块中。使aim培养物在37℃(900rpm)下生长3h，然后将其转移至20℃过夜(900rpm)以允许蛋白质表达。将过夜培养物离心并添加500ul的cellytic b(西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich))以使细胞沉淀重悬。使用偶联的hgo测定(siehl等人,2014)生成感兴趣的hppd变体的ic50值。
[0191]
用含有c末端his标记的拟南芥hgo基因的pet24a载体转化大肠杆菌bl21(de3)细
胞，如上文针对hppd变体所述使其生长并诱导过夜。使细胞沉淀重悬于含有10％甘油、1mm tris[2-羧乙基]膦
–
hcl(tcep)加30mm咪唑的磷酸盐缓冲盐水(ph 7.4)中，并使用溶菌酶/benzonase进行裂解。通过低速离心使提取物澄清，并在相同缓冲液中沿1ml his gravitrap柱向下纯化。在0.25m咪唑中洗脱结合的hgo并合并级分，并将其珠化(beaded)至液氮中。除了离心和珠化步骤以外的所有程序都是在氮气氛下进行的。
[0192]
偶联的hgo测定是通过以下方式来进行：将10ul的hppd提取物添加至96孔板中，然后添加40ul的反应缓冲液(50mm bis tris丙烷，ph7.0，25mm l-抗坏血酸钠，400μm巯基乙醇，50μmfe(ii)so4)。将这些板在冰上静置孵育5分钟。将1ul感兴趣的hppd抑制剂以一系列浓度添加至孔中以允许计算ic50值(如0.1
–
500um)。然后将200ul的hpp/hgo(如上所述的反应缓冲液中的197μm羟苯丙酮酸、16μl/ml尿黑酸氧化酶)缓冲液添加至孔中，并且定期(例如每30秒-5分钟)在330nm下监测反应的吸光度持续给定时间段(例如，持续15分钟
–
60分钟之间)。然后使用这些数据来计算每种感兴趣的hppd变体的ic50值。
[0193]
所测试的感兴趣的hppd抑制剂选自由以下组成的组：氟吡草酮(cas rn 352010-68-5)、双唑草酮(cas rn 1622908-18-2)、喹草酮(cas rn 1639426-14-4)、双环磺草酮(cas rn 156963-66-5)、吡草酮(cas rn 82692-44-2)、环吡氟草酮(cas rn 1855929-45-1)、ketospiradox(cas rn 192708-91-1)或其游离酸(cas rn 187270-87-7)、二氧代吡啶三酮(cas rn 2222257-79-4，本文中称为除草剂c)、异噁氯草酮(cas rn 141112-06-3)、芬喹酮(cas rn 1342891-70-6)、苯唑氟草酮(cas rn 1992017-55-6)、异噁唑草酮(cas rn 141112-29-0)、氧戊磺草酮(cas rn 1486617-21-3)、硝磺草酮(cas rn 104206-82-8)、磺酰草吡唑(cas rn 365400-11-9)、吡唑特(cas rn 58011-68-0)、苄草唑(cas rn 71561-11-0)、磺草酮(cas rn 99105-77-8)、呋喃磺草酮(cas rn 473278-76-1)、环磺酮(cas rn 335104-84-2)、tolpyralate(cas rn 1101132-67-5)、苯吡唑草酮(cas rn 210631-68-8)、三唑磺草酮(cas rn 1911613-97-2)及其农化上可接受的盐。
[0194]
hppd抑制剂进一步包括以下文献中披露的化合物：wo2012/002096(例如6-(2,6-二氧代环己烷羰基)-4-(4-氟苯基)-2-甲基-1,2,4-三嗪-3,5-二酮)、wo2012/126932(例如2-甲基-n-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-甲基磺酰基-4-(三氟甲基)苯甲酰胺)、wo 2012/028579(例如2-氯-3-甲基硫烷基-n-(1-甲基四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺)、wo 2013/092834、wo 2013/139760、wo 2013/144231、wo 2014/192936、wo 2015/128424、wo 2016/038173、wo 2016/135196、wo 2018/050677(例如n-(1-甲基四唑-5-基)-2-(1,2,4-三唑-1-基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-甲酰胺，本文中称为除草剂d)、wo 2018/077875、wo 2019/141740、wo 2019/196904(例如3-(3-氯苯基)-6-(5-羟基-1,3-二甲基-吡唑-4-羰基)-1,5-二甲基-喹唑啉-2,4-二酮和[4-[3-(3-氯苯基)-1,5-二甲基-2,4-二氧代-喹唑啉-6-羰基]-2,5-二甲基-吡唑-3-基]n,n-二乙基氨基甲酸酯)、wo 2019/243358、wo 2020/108518(例如2-氟-n-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-[(r)-丙基亚磺酰基]-4-(三氟甲基)苯甲酰胺和2-氟-n-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-丙基亚磺酰基-4-(三氟甲基)苯甲酰胺)、wo 2020/189576(例如3-(异丙基磺酰基甲基)-n-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-5-(三氟甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-8-甲酰胺)、wo 2021/013969、wo 2021/094505和pct/ep2021/059431。
[0195]
表2显示感兴趣的hppd变体对于硝磺草酮、氟吡草酮、除草剂c和除草剂d的ic50
值。值。
[0196]
根据表2中的ic50数据明显看出，与燕麦属对照序列seq id no:122相比，在一个或多个变体(例如，seq id no:50、seq id no:8或seq id no:14的变体)中发现的另外的突变显示对硝磺草酮、氟吡草酮以及除草剂d的耐受性增强。与对照序列(分别为seq id no:126和seq id no:123)相比，看麦娘属和阿披拉草属hppd基因中的等效突变也展示ic50值的类似增加。从表2还看出，在一些hppd变体(例如seq id no:20或seq id no:32)中发现的另外的突变可以增加对除草剂c或除草剂d或者除草剂c与除草剂d二者的ic50值。一个实例是seq id no:14，其使对除草剂c的ic50值增加》200倍，或者seq id no:17，其使对除草剂d的ic50值增加约14倍，或者seq id no:8，其使对除草剂d的ic50值增加约80倍。
[0197]
使用该表中的数据可以清楚，不同的hppd变体对所列出的每种除草剂具有不同的耐受性水平；例如，seq id no:53相对于seq id no:122的ic50改进倍数对于硝磺草酮为》43x，对于氟吡草酮为110x，对于除草剂d为36x，但是对于除草剂c没有改进；而seq id no:47与seq id no:122相比的改进倍数对于硝磺草酮为4.3x，对于氟吡草酮为27x，对于除草剂c为》200x并且对于除草剂d为29x。
[0198]
实例2：用于用hppd变体转化植物的二元载体的构建
[0199]
使用本领域技术人员熟知的方法(如重叠pcr、dna合成、限制性片段亚克隆以及连接)的组合来构建上述二元载体。它们的独特结构明确示于图1(载体pbinavenasativahppdv207)、图2(载体pbinavenasativahppdv208)和图3(载体pbinavenasativahppdv209)中以及序列表(seq id no:119-121)中。关于图1-图3中所示载体的另外的信息提供于下文中。
[0200]
图1(载体pbinavenasativahppdv207)中使用的特征描述如下：编码seq id no:11的hppd基因-燕麦hppd(起点：843，终点：2169)；新霉素磷酸转移酶-cnpt2-01-04(起点：2771，终点：3746)；新霉素磷酸转移酶-cnpt3-01-01(起点：8048，终点：8839)；四环素抗性的基因-ctetr-01-01(起点：12452，终点：13102)；烟草花叶病毒(tmv)ω5'utr前导序列
–
etmv-01-01(起点：773，终点：840)；来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子-p35s-07-01(起点：21，终点：347)；来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子-p35s-10-01(起点：348，终点：764)；nos启动子-pnos-01-01(起点：2463，终点：2769)；根癌土壤杆菌胭脂碱ti-质粒的t-dna的左边界重复区-bnlb-01-01(起点：4925，终点：5072)；根癌土壤杆菌胭脂碱ti-质粒
的t-dna的右边界重复区-bnrb-01-03(起点：13476，终点：13637)；rk2复制起点-ork2-01-01(起点：10496，终点：11113)；cole1复制起点-ocole-03-01(起点：11903，终点：12218)；胭脂碱合酶的终止子-tnos-01-01(起点：2196，终点：2450；另一起点：3965，终点：4219)。
[0201]
图2(载体pbinavenasativahppdv208)中使用的特征描述如下：编码seq id no:14的hppd基因-燕麦hppd(起点：843，终点：2169)；新霉素磷酸转移酶-cnpt2-01-04(起点：2771，终点：3746)；新霉素磷酸转移酶-cnpt3-01-01(起点：8048，终点：8839)；四环素抗性的基因-ctetr-01-01(起点：12452，终点：13102)；烟草花叶病毒(tmv)ω5'utr前导序列
–
etmv-01-01(起点：773，终点：840)；来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子-p35s-07-01(起点：21，终点：347)；来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子-p35s-10-01(起点：348，终点：764)；nos启动子-pnos-01-01(起点：2463，终点：2769)；根癌土壤杆菌胭脂碱ti-质粒的t-dna的左边界重复区-bnlb-01-01(起点：4925，终点：5072)；根癌土壤杆菌胭脂碱ti-质粒的t-dna的右边界重复区-bnrb-01-03(起点：13476，终点：13637)；rk2复制起点-ork2-01-01(起点：10496，终点：11113)；cole1复制起点-ocole-03-01(起点：11903，终点：12218)；胭脂碱合酶的终止子-tnos-01-01(起点：2196，终点：2450；另一起点：3965，终点：4219)。
[0202]
图3(载体pbinavenasativahppdv209)中使用的特征描述如下：编码seq id no:17的hppd基因-燕麦hppd(起点：843，终点：2169)；新霉素磷酸转移酶-cnpt2-01-04(起点：2771，终点：3746)；新霉素磷酸转移酶-cnpt3-01-01(起点：8048，终点：8839)；四环素抗性的基因-ctetr-01-01(起点：12452，终点：13102)；烟草花叶病毒(tmv)ω5'utr前导序列
–
etmv-01-01(起点：773，终点：840)；来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子-p35s-07-01(起点：21，终点：347)；来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子-p35s-10-01(起点：348，终点：764)；nos启动子-pnos-01-01(起点：2463，终点：2769)；根癌土壤杆菌胭脂碱ti-质粒的t-dna的左边界重复区-bnlb-01-01(起点：4925，终点：5072)；根癌土壤杆菌胭脂碱ti-质粒的t-dna的右边界重复区-bnrb-01-03(起点：13476，终点：13637)；rk2复制起点-ork2-01-01(起点：10496，终点：11113)；cole1复制起点-ocole-03-01(起点：11903，终点：12218)；胭脂碱合酶的终止子-tnos-01-01(起点：2196，终点：2450；另一起点：3965，终点：4219)。
[0203]
实例3：表达异源hppd酶的稳定转基因植物品系的制备和测试
[0204]
在转基因烟草中表达燕麦hppd或其直系同源物和变体(例如seq id 1-63和122-127)。编码这些多肽的dna序列(优化用于烟草，或者任选地，根据目标作物如大豆进行密码子优化)是合成制备的。每个序列设计为包括与tmvω5'前导序列的5'融合物，使得它们在5'端侧接有xhoi且在3'端侧接有kpni，以促进直接克隆至适合于基于土壤杆菌的植物转化的二元载体中。
[0205]
在一个实例中，使用xhoi/kpni切除tmvω5'前导序列和感兴趣的hppd编码基因并将其克隆至类似地消化的二元载体pbin 19中(bevan,nucl.acids res.[核酸研究](1984))，在双重增强的35s启动子之后且在nos 3'转录终止子之前，然后将其转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中。使用从大肠杆菌回收的dna来转化根癌土壤杆菌lba4404，并且在含有利福平和卡那霉素的培养基上选择转化的细菌。使用本领域充分描述或如本文所述的方法使烟草组织经历土壤杆菌介导的转化。例如，使用含有表达hppd的二元载体的根癌土壤杆菌的母板使用单一细菌菌落来接种含有100mg/l利福平加50mg/l卡那霉素的10ml lb(l肉汤)。将此培养物在28℃和200rpm振荡下孵育过夜。使用该整个过夜培养物来接种50ml
体积的含有相同抗生素的lb。将此培养物在28℃和200rpm振荡下再次培养过夜。通过以3000rpm离心15分钟使土壤杆菌细胞沉淀，然后将其重悬于含有30g/l蔗糖的ms(murashige和skoog)培养基(ph 5.9)中至od(600nm)＝0.6。将该悬浮液以25ml等分试样分配到皮氏培养皿中。
[0206]
使用以克隆方式微体繁殖的烟草嫩枝培养物来切除嫩(尚未完全展开)叶。去除并丢弃中脉和外叶缘，并将剩余叶片切成1cm方形物。将这些方形物转移到土壤杆菌悬浮液中持续20分钟。然后取出外植体，在无菌滤纸上轻拍以去除过多悬浮液，然后将其转移至固体nbm培养基(含有30g/l蔗糖、1mg/l bap(苄基氨基嘌呤)和0.1mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，ph 5.9，并用8g/l植物琼脂固化)上，其中每个外植体的远轴表面与培养基接触。每个板上转移大约7个外植体，然后将板密封并在光照孵育器中在25℃下维持16小时光周期，持续3天。
[0207]
然后将外植体转移到含有100mg/l卡那霉素加抗生素的nbm培养基上以防止土壤杆菌的进一步生长(200mg/l特美汀和250mg/l羧苄西林)。然后每2周进行进一步传代培养至该相同培养基上。
[0208]
当嫩枝开始从愈伤组织叶外植体再生时，将这些嫩枝移出到嫩枝伸长培养基中(ms培养基，30g/l蔗糖、8g/l植物琼脂、100mg/l卡那霉素、200mg/l特美汀、250mg/l羧苄西林，ph 5.9)。稳定的转基因植物在2周内容易地生根。为了对每个事件提供多种植物，以最终允许对每种转基因植物进行超过一种除草剂测试，对所有生根的嫩枝进行微体繁殖以生成3个或更多个生根的克隆。
[0209]
通过pcr使用扩增hppd转基因内的500bp片段的引物对在掺入卡那霉素的培养基上生根并显示旺盛的嫩枝生长的假定转基因植物进行分析。在未转化的烟草上对该相同引物集的评价最终显示，这些引物不会扩增来自天然烟草hppd基因的序列。
[0210]
将转化的嫩枝分成2或3个克隆并从卡那霉素抗性愈伤组织再生。使嫩枝在含有卡那霉素的ms琼脂上生根。使存活的生根外植体再次生根以提供大约50个卡那霉素抗性事件，这些事件表示为来自每个事件的约3个克隆小植株。
[0211]
一旦生根，将小植株从琼脂转移并盆栽至3英寸圆盆或4英寸方盆中的含有缓释肥料的50％泥炭、50％john innes 3号土壤或例如380土壤(华盛顿州贝尔维尤的太阳格罗园艺公司(sun gro horticulture,bellevue,wa))中，并在温室中保持定期浇水以建立8-12d。温室条件为白天约24-27℃；晚上18-21℃，以及大约14h(或在英国夏天，更长时间)光周期。将湿度调整至约65％并且在工作台上所用光级度高达2000umol/m2。一旦出现新组织且植物达到2-4叶片阶段，用选自参考实例1列出的除草剂的感兴趣的hppd抑制剂对每个事件的一些克隆进行喷雾。例如，以150g/ha-800g/ha比率的硝磺草酮对植物进行喷雾。例如，将在水中与0.2-0.25％x-77表面活性剂混合，并且在devries喷雾室(明尼苏达州霍兰戴尔(hollandale,mn))中在以2mph移动的合适的轨道喷雾器上从喷杆进行喷雾，喷嘴距植物顶部约2英寸。喷量合适地为25加仑/英亩或者例如200l/ha，比率为150g硝磺草酮/ha。
[0212]
评估植物的损害并且在例如处理后7天和14天(dat)进行评分。多种hppd变体基因产生约20-30个t0事件。获得每种hppd变体的结果(平均抗性水平、在给定比率下展现小于10％损害的植物的数量等)，并且因此，针对抗性并且与用相应天然hppd(seq id no:1-2)
以及相应基础hppd变体seq id 122-125(用作对照或参考)的表达获得的结果相比，对每个集合进行评分。例如，可以发现，一些hppd的表达导致植物展现对hppd抑制剂的显著抗性，此外，相对于对照或参考序列seq id no:122-125的类似表达所赋予的除草剂抗性，除草剂抗性显著(1.4-2x)增强。
[0213]
图4显示用除草剂c以300ai/ha进行喷雾的表达多个拷贝的seq id no:14的转基因植物相对于未喷雾对照的比较。另外，将这些转基因植物与表达衍生出seq id no:14的hppd变体的野生型hppd基因(seq id no:1)的转基因植物进行比较。在用hppd变体seq id no:14转化的一些多拷贝事件中，几乎未观察到萎黄病。另外，与表达野生型hppd的植物相比，矮化显著减少。
[0214]
使显示最小损害的事件的植物生长至开花，然后装袋(bagged)并且使其自花授粉(self)。收集来自所选事件的种子并在盆中再次播种，并且针对对hppd除草剂(例如硝磺草酮)的抗性在喷雾测试中再次测试除草剂抗性。通过它们的3:1分离比率(关于卡那霉素和/或除草剂)并且通过定量rt-pcr来鉴定t1植物品系中的单一拷贝事件。将来自由此选择的t1烟草(samsun变种)品系的种子播种于含有50％泥炭和50％john innes 3号土壤的直径3英寸的盆中。在生长至3叶片阶段后，如上所述对植物进行喷雾以相对于类似处理的非转基因烟草植物测试除草剂耐受性，并且也与类似处理的表达基础hppd seq id 122-125的t1植物相比较。通过蛋白质印迹分析来监测hppd表达水平。
[0215]
表3.1
[0216]
表3.1显示在处理后7天对转基因烟草植物的除草剂损害评分。100分＝完全死亡，并且0分＝未观察到损害。
[0217]
将表达seq id no:122或seq id no:14的烟草植物用除草剂c以等效于100g/ha的比率进行喷雾。从结果清楚可知，与seq id no:122相比，表达seq id no:14的许多品系显示显著改进的对该除草剂的耐受性，有几种显示小于10％损害。
[0218]
图5显示在用除草剂c以等效于50g/ha的比率进行喷雾的表达seq id no:122或seq id no:14或seq id no:17的烟草植物之间的实例比较。如与表达seq id no:122的参考植物以及表达替代性hppd突变体seq id no:17的转基因植物相比，表达seq id no:14的转基因植物展示显著减少的萎黄病(叶组织变黄)。
[0219]
在另一喷雾测试中，随后用800g/ha硝磺草酮、400g/ha环磺酮或400g/ha异噁唑草酮处理来自每个群体的最佳事件。除草剂损害得分显示于表3.2中。
[0220]
表3.2表3.2
[0221]
表3.2显示在处理后14天对转基因烟草植物的除草剂损害评分。100分＝完全死亡，并且0分＝未观察到损害。
[0222]
结果显示，表达seq id 14的植物与表达seq id 122的那些植物对硝磺草酮和异噁唑草酮具有同等耐受性。来自环磺酮喷雾的结果显示，与表达seq id 122的植物相比，表达seq id 14的植物的耐受性增强。
[0223]
现在将表达seq id 122的烟草品系与表达seq id 20的烟草群体相比较。将这些植物用800g/ha氟吡草酮进行喷雾，并针对损害进行评分。表3.3显示损害评分。
[0224]
表3.3：
[0225]
表3.3显示在处理后14天对转基因烟草植物的除草剂损害评分。100分＝完全死亡，并且0分＝未观察到损害。
[0226]
结果证实，与表达seq id 122的事件相比，表达seq id 20的几个事件对氟吡草酮的耐受性增强，例如，事件#3267和3281。
[0227]
在另一实验中，产生表达序列seq id 125或seq id 9的转基因烟草事件。然后将这些植物用100g/ha或200g/ha的除草剂c进行喷雾。
[0228]
表3.4：
[0229]
表3.4显示在处理后14天对转基因烟草植物的除草剂损害评分。100分＝完全死亡，并且0分＝未观察到损害。
[0230]
喷雾测试的结果证实，表达seq id 125或seq id 9的植物展示对100g/ha除草剂c的耐受性。然而，与表达seq id 125的那些植物(例如事件#3482)相比，表达seq id 9的那些植物显示对200g/ha除草剂c的耐受性更高。
[0231]
实例4：表达异源hppd酶的稳定转基因植物品系的制备和测试
[0232]
使用先前在实例3中描述的方法生成表达野生型燕麦hppd或其直系同源物和变体的转基因植物。表4.1
–
表4.9显示在处理后7天对转基因烟草植物的除草剂损害评分。100分＝完全死亡，并且0分＝未观察到损害。
[0233]
表4.1：野生型烟草植物的喷雾测试数据
[0234]
表4.2：表达突变体hppd(seq id no:124)的植物的喷雾测试数据
[0235]
表4.3：表达突变体hppd(seq id no:125)的植物的喷雾测试数据
[0236]
表4.4：表达突变体hppd(seq id no:122)的植物的喷雾测试数据
[0237]
表4.5：表达突变体hppd(seq id no:8)的植物的喷雾测试数据
[0238]
表4.6：表达突变体hppd(seq id no:9)的植物的喷雾测试数据
[0239]
表4.7：表达突变体hppd(seq id no:21)的植物的喷雾测试数据
[0240]
表4.8：表达突变体hppd(seq id no:14)的植物的喷雾测试数据
[0241]
表4.9：表达突变体hppd(seq id no:15)的植物的喷雾测试数据
[0242]
从表4.1-表4.9的数据得出多个结论。seq id no:4-63和122-127的突变体hppd的特性表明，相对于衍生出突变体的相应的对照或参考hppd序列(例如，seq id no:122-125)，某些位置处的某些取代提供除草剂耐受性的显著改进。如较低损害评定所示，表达包含表1中披露的位置处的一个或多个突变的突变体hppd的转基因植物对一种或多种已知hppd除草剂如硝磺草酮、环磺酮、异噁唑草酮和氟吡草酮的除草剂耐受性有显著改进。
[0243]
与表达hppd seq id 122、124或125的烟草植物相比，在用200g/ha的除草剂c进行喷雾时，表达突变体hppd seq id 14的烟草植物展示降低的损害。与表达hppd seq id 122、124或125的烟草植物相比，在用2000g/ha的除草剂d进行喷雾时，表达突变体hppd seq id 8、9或21的烟草植物展示显著降低的损害。在用2000g/ha的除草剂d进行喷雾后，表达突变体hppd seq id 8、9或21的许多转基因事件展现完全没有损害。这证实了与相应的对照相比，这些事件对除草剂c和d的耐受性有所增强。
[0244]
因此，关于为提供对hppd除草剂的耐受性提供更好的选择，且尤其关于所例示的化学类别，多个本文所述的新hppd序列提供相对于现有技术的显著改进。
[0245]
本说明书中提到的所有专利、专利申请以及公开文献都指示了本发明涉及的本领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请以及公开文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开文献或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而并入。
[0246]
虽然已经参考具体实施例披露本发明，但应清楚，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其他实施例和变体。所附的权利要求包括所有这样的实施例和等效变体。
[0247]
表5：序列表中的序列的总结

技术特征：
1.一种分离的或重组的多肽，其包含编码对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂除草剂化合物具有耐受性的hppd蛋白的氨基酸序列，其中所述蛋白质包含：(a)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、位置271或位置304对应的氨基酸位置处的取代；(b)(a)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被g取代；(c)(a)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置271对应的氨基酸位置被n取代；(d)(a)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置304对应的氨基酸位置被t取代；(e)(a)的氨基酸序列，其进一步包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、260、327、340、359或411对应的一个或多个氨基酸位置处的取代；(f)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代；(g)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置260对应的氨基酸位置被a取代；(h)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代；(i)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代；(j)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代；(k)(e)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置g411对应的氨基酸位置被a取代；(l)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、327、340和359中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(m)(l)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代；(n)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、327、340、359和g411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(m)(n)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代，并且与氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代；
(o)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218、260、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(p)(o)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置260对应的氨基酸位置被a取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代，并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代；(q)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1的氨基酸位置218、271、327、340和359中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(r)(q)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置271对应的氨基酸位置被n取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置359对应的氨基酸位置被m取代；(s)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、218、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(t)(s)的氨基酸序列，其中与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被g取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被y取代，并且与氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代；(u)与seq id no:1或2或3具有至少50％、60％、65％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在与seq id no:1或2或3的氨基酸位置214、218、304、327、340、359和411中的每一个对应的氨基酸位置处的取代；(v)(u)的氨基酸序列，其中与seq id no:1的氨基酸位置214对应的氨基酸位置被g取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸218对应的氨基酸位置被i取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置304对应的氨基酸位置被t取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置327对应的氨基酸位置被r取代，与seq id no:1或2或3的氨基酸位置340对应的氨基酸位置被e取代，并且与氨基酸位置359对应的氨基酸位置被y取代；并且与seq id no:1或2或3的氨基酸位置411对应的氨基酸位置被a取代；(w)与seq id no:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、122、123、124、125、126或127中的任一个具有至少85％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列；(x)seq id no:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、122、123、124、125、126或127中的任一个所示的氨基酸序列；(y)(a)-(w)的氨基酸序列，其进一步包含与seq id no:59、60、61、62或63所示的基序对应的、包含一个或多个氨基酸取代或缺失的多肽基序，并且其中所述基序的一个或多个氨基酸取代的位置是相对于seq id no:1或2或3中相应的一个或多个氨基酸。2.一种分离的或重组的多核苷酸，其编码如权利要求1所述的多肽。3.如权利要求2所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含seq id no:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、132或133。4.如权利要求2或3所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸的核苷酸序列被优化用于在植物中表达。5.如权利要求2、3或4所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述多核苷酸与启动子可操作地连接。6.如权利要求5所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述启动子驱动在植物或植物细胞中的表达。7.一种表达盒，所述表达盒包含如权利要求2、3、4、5或6所述的分离的多核苷酸。8.如权利要求7所述的表达盒，所述表达盒进一步包含可操作地连接的、编码赋予所期望的性状的多肽的重组的或分离的多核苷酸序列。9.如权利要求8所述的表达盒，其中所述所期望的性状是对除草剂的抗性。10.如权利要求9所述的表达盒，其中所述所期望的性状是对hppd抑制剂、草甘膦、ppo抑制剂或草铵膦的抗性。11.如权利要求10所述的表达盒，其中所述赋予所期望的性状的多肽是细胞色素p450或其变体。12.如权利要求10所述的表达盒，其中所述赋予所期望的性状的多肽是epsps(5-烯醇-丙酮酰-莽草酸-3-磷酸-合酶)。13.如权利要求10所述的表达盒，其中所述赋予所期望的性状的多肽是膦丝菌素乙酰转移酶(pat)或ppo。14.一种载体，所述载体包含如权利要求7、8或9所述的表达盒。15.如权利要求14所述的载体，其中所述载体包含seq id no:119、120或121中的一个。16.一种细胞，所述细胞包含编码如权利要求1所述的多肽的异源多核苷酸。17.如权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。18.一种植物或植物部分，其具有稳定整合至其基因组中的编码如权利要求1所述的多肽的异源多核苷酸。19.如权利要求18所述的植物或植物部分，其中所述植物具有稳定掺入其基因组中的如权利要求7-13中任一项所述的表达盒。20.如权利要求18所述的植物或植物部分，其中所述编码所述异源多肽的多核苷酸已通过转化被引入所述植物或植物部分中。21.如权利要求18所述的植物或植物部分，其中所述编码所述异源多肽的多核苷酸已通过基因组修饰被引入基因组中。
22.如权利要求18、19、20或21所述的植物或植物部分，其中当在所述植物中表达时，如与所述植物的相应野生型品种相比，所述重组的多肽赋予所述植物增强的除草剂耐受性。23.如权利要求18、19、20、21或22所述的植物或植物部分，其中所述植物是单子叶植物。24.如权利要求23所述的植物或植物部分，其中所述单子叶植物是玉米、黑麦、大麦、稻、高粱、燕麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、芒草或小麦。25.如权利要求18、19、20、21或22所述的植物或植物部分，其中所述植物是双子叶植物。26.如权利要求25所述的植物或植物部分，其中所述双子叶植物是大豆、向日葵、番茄、甜菜、烟草、油菜作物、马铃薯、甘薯、木薯、红花、树、紫花苜蓿、豌豆和棉花。27.一种由如权利要求18-26中任一项所述的植物产生的种子，其中所述种子具有稳定掺入其基因组中的编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸。28.如权利要求27所述的种子，其中如与所述种子的野生型品种相比，所述种子对于增强的对抑制hppd的除草剂的抗性是纯育的。29.一种用于在植物中赋予对hppd抑制剂的抗性的方法，所述方法包括将如权利要求7-13中任一项所述的表达盒引入所述植物中或者将编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸引入所述植物中。30.一种在栽培区域中控制不期望的植被的方法，所述方法包括a)在所述栽培区域提供如权利要求18-26中任一项所述的植物，b)向所述栽培区域施加有效量的hppd抑制剂化合物。31.如权利要求30所述的方法，其中所述植物包含含有编码除草剂耐受性酶的核苷酸序列的至少一种另外的异源核酸。32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述hppd抑制剂除草剂与一种或多种另外的除草剂同时或依序施加。33.如权利要求30-32中任一项所述的方法或如权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种hppd抑制剂选自由以下组成的组：氟吡草酮(cas rn 352010-68-5)、双环磺草酮(cas rn 156963-66-5)、吡草酮(cas rn 82692-44-2)、ketospiradox(cas rn 192708-91-1)或其游离酸(cas rn 187270-87-7)、异噁氯草酮(cas rn 141112-06-3)、异噁唑草酮(cas rn 141112-29-0)、硝磺草酮(cas rn 104206-82-8)、磺酰草吡唑(cas rn 365400-11-9)、吡唑特(cas rn 58011-68-0)、苄草唑(cas rn 71561-11-0)、磺草酮(cas rn 99105-77-8)、呋喃磺草酮(cas rn 473278-76-1)、环磺酮(cas rn 335104-84-2)、苯吡唑草酮(cas rn 210631-68-8)及其农化上可接受的盐。34.如权利要求30-32中任一项所述的方法或如权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种hppd抑制剂是硝磺草酮。35.一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，所述方法包括：i)提供转化的植物或其植物部分，其中所述转化的植物或植物部分包含与驱动所述植物或植物部分的表达的启动子可操作地连接的、编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸；ii)使所述转化的植物或植物部分与至少一种hppd抑制剂化合物接触；iii)确定所述植物或植物部分是否受所述hppd抑制化合物影响；以及
iv)鉴定或选择具有所述多核苷酸的转化的植物或植物部分。35.一种用于使如权利要求18-26中任一项所述的植物生长，同时控制所述植物附近的杂草的方法，所述方法包括以下步骤：a)使所述植物生长；以及b)将有效量的包含hppd抑制剂的除草剂组合物施加至所述植物和杂草。36.一种可用于杂草控制的组合，所述组合包含(a)编码如实施例1所述的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸能够在植物中表达，从而向该植物提供对抑制hppd的除草剂的耐受性；以及(b)抑制hppd的除草剂。37.一种用于制备可用于杂草控制的组合的工艺，所述工艺包括(a)提供编码如权利要求1所述的hppd多肽的多核苷酸，所述多核苷酸能够在植物中表达，从而向该植物提供对抑制hppd的除草剂的耐受性；以及(b)提供抑制hppd的除草剂。38.如权利要求37所述的工艺，其中所述提供多核苷酸的步骤包括提供含有所述多核苷酸的植物。39.如权利要求37所述的工艺，其中所述提供多核苷酸的步骤包括提供含有所述多核苷酸的种子。40.如权利要求39所述的工艺，所述工艺进一步包括将所述抑制hppd的除草剂施加至所述种子的步骤。41.如权利要求26所述的组合控制植物栽培地点的杂草的用途。42.如权利要求35所述的方法或如权利要求37-41中任一项所述的工艺，其中所述植物是单子叶植物，任选地其中所述单子叶植物是玉米、黑麦、大麦、稻、高粱、燕麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、芒草或小麦。43.如权利要求35所述的方法或如权利要求37-41中任一项所述的工艺，其中所述植物是双子叶植物，任选地其中所述双子叶植物是大豆、向日葵、番茄、甜菜、烟草、油菜作物、马铃薯、甘薯、木薯、红花、树、紫花苜蓿、豌豆和棉花。44.如权利要求35所述的方法或如权利要求37-43中任一项所述的工艺，其中所述一种或多种hppd抑制剂选自由以下组成的组：氟吡草酮、双环磺草酮、吡草酮、ketospiradox或其游离酸、异噁氯草酮、异噁唑草酮、硝磺草酮、磺酰草吡唑、吡唑特、苄草唑、磺草酮、呋喃磺草酮、环磺酮、苯吡唑草酮及其农化上可接受的盐。

技术总结
提供了新型羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)多肽、其变体和片段，以及编码其的多核苷酸，其能够向植物赋予商业水平的赋予HPPD除草剂抗性或耐受性。组合物包括HPPD多肽的氨基酸序列及其变体和片段，以及编码其的多核苷酸。还提供了用于产生和使用表达这些新型HPPD多肽的HPPD除草剂抗性植物的方法，用于在作物场所的田地中选择性控制杂草的方法，以及用于表征、鉴定和选择这些新型HPPD的方法。鉴定和选择这些新型HPPD的方法。鉴定和选择这些新型HPPD的方法。


技术研发人员：R
受保护的技术使用者：先正达农作物保护股份公司
技术研发日：2021.11.17
技术公布日：2023/8/24