用于调节宿主细胞表面与人巨细胞病毒相互作用的方法与流程

用于调节宿主细胞表面与人巨细胞病毒相互作用的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年11月27日提交的美国专利申请第63/118,859号的优先权，该美国专利申请的全部内容通过引用整体并入本文。
3.序列表
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技术领域
5.本文提供治疗或防止人巨细胞病毒(hcmv)感染的方法，该方法包括调节hcmv ghglgo三聚体与质膜表达的宿主细胞蛋白之间的相互作用，以及提供鉴定此类相互作用的调节剂的方法。


背景技术：

6.人巨细胞病毒(hcmv)是疱疹病毒科乙型疱疹病毒亚科的成员，其在超过70％的人群中引起终生感染。初次感染后，hcmv潜伏，并且其再活化会导致免疫抑制或者接受器官或造血干细胞(hsc)移植的个体的严重发病率和死亡率。hcmv在怀孕期间尤其具有威胁性，因为它能够穿过胎盘屏障并感染胎儿。hcmv感染影响0.3％至2.3％的新生儿，是导致先天性出生缺陷的主要原因，包括脑损伤、听力损失、学习障碍、心脏病和智力迟钝。由于这些原因，hcmv已被医学研究所鉴定为首要疾病靶标。有效的抗病毒疗法或疫苗应针对hcmv感染周期的早期步骤，包括病毒进入宿主细胞。hcmv使用几种包膜糖蛋白复合物进入不同的细胞系，包括两种ghgl包膜糖蛋白复合物、ghglgo(三聚体)和ghglpul128-131a(五聚体)，以及糖蛋白b(gb)。hcmv三聚体或五聚体结合至细胞宿主受体通过尚未鉴定的机制为hcmv糖蛋白gb提供触发信号，以催化病毒与受感染细胞之间的膜融合。此种融合允许hcmv进入细胞、复制并建立其潜伏期。
7.经由与结构和功能不同的受体蛋白的相互作用，hcmv表现出广泛的细胞向性，包括成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞。最近的证据表明三聚体复合物对所有细胞类型的感染起主要作用。三聚体介导的成纤维细胞感染得到了最佳研究，并且涉及三聚体与受体酪氨酸激酶3(rtk3)家族的成员pdgfrα的相互作用。还发现tgfβr3以高亲和力结合hcmv三聚体，代表额外的假定细胞受体，从而可以解释hcmv的广泛细胞向性。
8.在过去的几十年中，已经做出了重大努力来开发针对hcmv感染的候选疫苗。然而，最近的临床试验结果表明，hcmv疫苗在防止病毒感染方面仅显示出适度的功效。因此，开发针对hcmv的有效疗法代表了重要的未满足的医疗需求。


技术实现要素：

9.在一个方面，本公开的特征在于人巨细胞病毒(hcmv)ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至go亚单元的无糖基化表面并且使得go亚单元与pdgfrα的结合减少。
10.在一些方面，该调节剂结合至：(a)go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个；(b)go亚单元的残基n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个或多个；以及(c)go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个。
11.在另一方面，本公开的特征在于一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至：(a)go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个；(b)go亚单元的n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123；以及(c)go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个，并且使得go亚单元与pdgfrα的结合减少。
12.在一些方面，该调节剂结合至go亚单元的残基r230、r234、v235、k237、y238、n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121、v123、r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的全部23个。
13.在一些方面，调节剂进一步结合至hcmv的gh亚单元的残基r47、y84和n85中的一个或多个。
14.在一些方面，该调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸。在一些方面，抑制性核酸为aso或sirna。
15.在一些方面，抗原结合片段为双-fab、fv、fab、fab'-sh、f(ab')2、双体抗体(diabody)、线性抗体、scfv、scfab、vh结构域或vhh结构域。
16.在一些方面，该抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。在一些方面，该双特异性抗体或多特异性抗体结合至go亚单元的至少三个不同的表位。在一些方面，该至少三个不同的表位包括：(a)第一表位，其包括go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个；(b)第二表位，其包括go亚单元的残基n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个或多个；以及(c)第三表位，其包括go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个。
17.在一些方面，该调节剂为pdgfrα的模拟物。
18.在另一方面，本公开的特征在于一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至pdgfrα的d1(seq id no:11)、d2(seq id no:12)和d3(seq id no:13)结构域并且使得go亚单元与pdgfrα的结合减少。
19.在一些方面，该调节剂结合至：(a)pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个；(b)pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个；以及(c)pdgfrα的残基n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个。
20.在另一方面，本公开的特征在于一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至：(a)pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个；(b)pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个；以及(c)pdgfrα的残基n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个，并且
使得go亚单元与pdgfrα的结合减少。
21.在一些方面，该调节剂结合至pdgfrα的残基t107、e108、e109、m133、l137、i139、y206、l208、e263和k265中的全部十个。
22.在一些方面，该调节剂进一步结合至pdgfrα的残基e52、s78和l80中的一个或多个。
23.在一些方面，该调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸。在一些方面，抑制性核酸为aso或sirna。
24.在一些方面，抗原结合片段为双-fab、fv、fab、fab'-sh、f(ab')2、双体抗体(diabody)、线性抗体、scfv、scfab、vh结构域或vhh结构域。
25.在一些方面，该抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。在一些方面，该双特异性抗体或多特异性抗体结合至pdgfrα的至少三个不同的表位。在一些方面，该至少三个不同的表位包括：(a)第一表位，其包括pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个；(b)第二表位，其包括pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个；以及(c)第三表位，其包括pdgfrα的残基n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个。
26.在一些方面，该调节剂为hcmv ghglgo三聚体的go亚单元的模拟物。
27.在一些方面，该调节剂使hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα的结合减少至少50％。在一些方面，该调节剂使hcmv三聚体的go亚单元与pdgfrα的结合减少至少90％。
28.在一些方面，该调节剂使hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与tgfβr3的结合减少至少50％。
29.在一些方面，通过表面等离子体共振、生物膜干涉技术或酶联免疫吸附测定(elisa)测量结合的减少。
30.在一些方面，该调节剂与pdgfrα的触发下游信号传导的区域具有最小的结合。
31.在一些方面，该调节剂不结合至pdgfrα的触发下游信号传导的区域。
32.在一些方面，该pdgfrα的触发下游信号传导的区域为pdgf的结合位点。
33.在一些方面，与不存在该调节剂的情况下的信号传导相比，该调节剂使得通过pdgfrα的信号传导减少小于20％。
34.在一些方面，与不存在该调节剂的情况下的信号传导相比，该调节剂不使得通过pdgfrα的信号传导减少。
35.在一些方面，相对于不存在该调节剂的情况下的感染，该调节剂使得hcmv对细胞的感染减少。在一些方面，如在使用假型颗粒的病毒感染测定或病毒进入测定中所测量，感染减少至少40％。
36.在一些方面，该调节剂进一步包含药用载体。
37.在另一方面，本公开的特征在于一种治疗个体的hcmv感染的方法，该方法包括向该个体施用有效量的本文提供的调节剂，从而治疗该个体。在一些方面，相对于未施用该调节剂的个体，hcmv感染的持续时间或严重程度减少至少40％。
38.在另一方面，本公开的特征在于一种防止个体的hcmv感染的方法，该方法包括向该个体施用有效量的本文提供的调节剂，从而防止该个体的hcmv感染。
39.在另一方面，本公开的特征在于一种针对预防个体的继发性hcmv感染的方法，该
方法包括向该个体施用有效量的本文提供的调节剂，从而防止该个体的继发性hcmv感染。在一些方面，该继发性感染为未经感染组织的hcmv感染。在一些方面，该个体是免疫功能不全的、是怀孕的或者为婴儿。
附图说明
40.图1a是示出与中和fab 13h11和msl-109结合的人巨细胞病毒(hcmv)ghglgo糖蛋白三聚体复合物的整体冷冻电子显微术(cryo-em)图。红色：go亚单元。粉红色：gl亚单元。蓝色：gh亚单元。灰色(左)：fab 13h11。灰色(右)：fab msl-109。
41.图1b是示出hcmv ghglgo三聚体复合物的前视图(左)和后视图(右)的一对带状图。红色：go亚单元。粉红色：gl亚单元。蓝色：gh亚单元。
42.图1c是示出在-10至+10kev的范围内的hcmv ghglgo三聚体复合物的静电表面(与图1b中的视图相同)的一对图。红色：带负电。蓝色：带正电。
43.图1d是示出hcmv ghglgo三聚体复合物的糖基化位点(彩色)分布的一对图(与图1b中的视图相同)。
44.图2a是示出hcmv三聚体复合物(彩色)的ghgl亚单元叠加至hcmv五聚体复合物(灰色，pdb代码：5vob)的ghgl亚单元上的图。
45.图2b是示出hcmv三聚体ghgl糖基化位点(彩色)叠加至hcmv五聚体ghgl糖基化位点(灰色，pdb代码：5vob)上的图。
46.图2c是一对图，其示出：hcmv三聚体远侧区域的前视图，其示出gh n末端、gl和go(顶部图)；以及gl-go相互作用区域的近视图，其突出显示残基a131与v151之间的gl环以及gl残基c144与go残基c343之间的二硫键(底部图)。红色：go亚单元。粉红色(顶部图)：gl亚单元。蓝色：gh亚单元。
47.图2d是一对图，其示出了hcmv五聚体远侧区域的前视图，其示出了gh n末端、gl、ul130、ul131和ul128(顶部图)；以及gl-ul128相互作用区域的近视图，其突出显示残基a131与v151之间的gl螺旋以及gl残基c144与ul128残基c162之间的二硫键(底部图)。粉红色(顶部图)：gl亚单元。蓝色：ul131。绿色：ul128。橙色：ul130。
48.图3a是示出与中和fab 13h11和msl-109结合的hcmv ghglgo三聚体复合物的前视图的图。红色：go亚单元。粉红色：gl亚单元。蓝色：gh亚单元。绿色和浅绿色：13h11。橙色和浅橙色：msl-109。
49.图3b是示出了与gh的c末端区域结合的13h11和msl-109的可变fab区域的一组图。插图1-3示出了13h11与hcmv三聚体gh亚单元之间的关键相互作用位点的近视图。插图4示出了msl-109与hcmv三聚体gh亚单元之间的关键相互作用区域的近视图。gh上的fab接触区域以粉红色突出显示。绿色：13h11。橙色：msl-109。
50.图3c是一组图，其示出了13h11的可变fab区域和gh(左)上13h11重链(深绿色)与轻链(浅绿色)的突出显示的相互作用表面，以及msl-109的可变fab区域和gh(右)上msl-109重链(深橙色)与轻链(浅橙色)链的突出显示的相互作用表面。
51.图4a是示出hcmv go亚单元结构的图，其中以颜色指示了结构域布局。
52.图4b是示出hcmv go亚单元的结构域布局的示意图，其中指示了二级结构元素。结构域1-5：n末端β链。结构域6、9-10、12：中央α螺旋。结构域16-17：c末端α螺旋。
53.图4c是一对图，其示出了hcmv go亚单元(左)的c末端结构域和flt3配体(右；pdb代码：3qs7)的短链细胞因子折叠以进行结构比较。以粉红色示出的螺旋代表折叠成细胞因子结构域的go和flt3区域。
54.图4d是示出hcmv go亚单元内的半胱氨酸残基(粉红色)和二硫键的分布的图。
55.图4e是示出在-10kev至+10kev的范围内的hcmv go亚单元的静电表面的一对图。红色：带负电。蓝色：带正电。
56.图4f是示出基于来自93个疱疹病毒5株的序列对hcmv go亚单元进行保守性分析的结果的一对图。保守性：从低到高(绿色到紫色)。
57.图4g是示出hcmv go亚单元上的糖基化位点(彩色)分布的一对图。
58.图5a是示出hcmv三聚体(菌株：merlin和vr1814)与细胞表面受体发现平台结果的所指示人类受体蛋白结合的水平(hcmv三聚体的归一化结合信号，表示为最大信号的百分比)的图。
59.图5b是示出人类pdgfrα的结构域布局的示意图。结构域：d1、d2、d3、d4、d5、跨膜(tm)结构域和激酶结构域。
60.图5c是示出与pdgfrα结构域d1-d3结合的hcmv ghglgo三聚体复合物的前视图的图。绿色：pdgfrα。红色：go亚单元。粉红色：gl亚单元。蓝色：gh亚单元。
61.图5d是示出hcmv三聚体远侧区域(包括go、gl和gh n末端以及pdgfαd1-d4)的视图的一组图。pdgfrαd4以低不透明度示出，以说明受体相对于宿主细胞膜的定向。底部图示出位点1-4残基的相互作用。绿色：pdgfrα的d1-d4。红色：go亚单元。粉红色：gl亚单元。蓝色：gh亚单元。
62.图5e是在图5d中描述的近视图中示出hcmv三聚体远侧区域的图，其中突出显示的表面积(绿色)涉及与pdgfrα的相互作用。
63.图5f是示出基于go和gh的93种疱疹病毒5株以及gl的59种疱疹病毒5株的序列对hcmv go-gl+gh n末端进行保守性分析的结果的图。保守性范围：低到高(绿色到紫色)。
64.图5g是条形图，其示出hcmv ghglgo三聚体与pdgfrα-fc蛋白的结合水平(表示为相对于野生型(wt)pdgfrα的结合百分比)，其中引入了表2中所述的单糖基化位点或电荷突变(e52r、l80r、e108r、e111r、l137e、i139e、l208r、m260e、l261r、e263r、k265e)的组合。
65.图5h是一组图，其示出了表2中描述的hcmv ghglgo三聚体和pdgfrα-fc相互作用的生物膜干涉技术(bli)结合曲线。
66.图6a是示出hcmv三聚体(菌株：merlin和vr1814)与细胞表面受体发现平台结果的所指示人类受体蛋白结合的水平(hcmv三聚体的归一化结合信号，表示为最大信号的百分比)的图。
67.图6b是示出人类tgfβr3的结构域布局的示意图。结构域：孤儿结构域2(od2)、孤儿结构域1(od1)、n末端透明带结构域(zp-n)、c末端透明带结构域(zp-c)、跨膜结构域(tm)和胞内结构域(icd)。
68.图6c是示出洗脱的ghglgo-tgfβr3-13h11-msl-109复合物在280nm处的吸光度的尺寸排阻色谱图(顶部图)和示出所指示的sec级分中ghglgo-tgfβr3-13h11-msl-109复合物的组分的对应sds-page凝胶图像(底部图)。色谱图上以及sds-page凝胶图像旁边的虚线指示等效的sec洗脱级分。
69.图6d是示出与tgfβr3 od2结合的hcmv ghglgo三聚体复合物的前视图的图。深绿色：tgfβr3。红色：go亚单元。粉红色：gl亚单元。蓝色：gh亚单元。
70.图6e是在示出go、gl和gh n末端的近视图中示出hcmv三聚体远侧区域的图，其中突出显示的表面积(深绿色)涉及与tgfβr3(灰色)的相互作用。
71.图6f是示出基于go和gh的93种疱疹病毒5株以及gl的59种疱疹病毒5株的序列对hcmv go-gl+gh n末端进行保守性分析的结果的图。保守性范围：低到高(绿色到紫色)。
72.图6g是在示出tgfβr3 od1-od2、go、gl和gh n末端的近视图中示出hcmv三聚体远侧区域的一组图。tgfβr3 od1以低不透明度示出，以说明受体相对于宿主细胞膜的定向。插图示出了hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3之间的关键相互作用位点(位点1-3)的近视图。红色：go亚单元。粉红色：gl亚单元。蓝色：gh亚单元。绿色：tgfβr3 od2。
73.图6h是示出tgfβr3和内皮糖蛋白(endoglin)(pdb代码：5i04)的od2结构域之间的结构比较的一组图。右图示出了tgfβr3α1和内皮糖蛋白的β6与β7之间的对应环区域的近视图。
74.图7a是在正视图(左)和俯视图(右)中示出pdgfrα(浅绿色)和tgfβr3(深绿色)与hcmv ghglgo(灰色)结合的一对图。
75.图7b是示出洗脱的ghglgo-tgfβr3和ghglgo-pdgfrα-tgfβr3复合物在280nm处的吸光度的尺寸排阻色谱图(顶部图)和示出所指示的sec级分中ghglgo-tgfβr3和ghglgo-pdgfrα-tgfβr3复合物的组分的对应sds-page凝胶图像(底部图)。
76.图7c是示出在结构比较中与hmcv ghglgo(红色)结合的pdgfrα(绿色)和基于pdgfb-pdgfrβ共晶结构pdgf与pdgfrα结合的模型(pdgfb未示出；pdb代码：3mjg)的图。
77.图7d是一组图，其示出了与pdgfrα-fc接触、具有野生型go(三聚体
wt
)和/或突变go(三聚体
突变
；具有m84r、f111r、r117e、f136r、r212e、r230e、r234e、r336e、f342e、a351r和n358r氨基酸取代突变的go)的hcmv ghglgo三聚体的bli结合曲线。
78.图7e是示出mrc-5细胞中所示pdgfrα细胞信号传导组分的含量的蛋白印迹分析。在不存在(-)或存在(+)具有野生型或突变go的hmcv ghglgo三聚体的情况下，在添加生长因子pdgf-aa后评估pdgfrα磷酸化(py762、py849)和下游信号传导活性(如图7d所示)。
79.图7f是示出经hcmv ghglgo三聚体的受体结合和经抗体中和三聚体结合的工作模型的示意图。
80.图8a是示出使用fab 13h11和msl-109的hcmv ghglgo纯化和重构过程的示意图。组氨酸(his)；链霉亲和素(strep)；尺寸排阻色谱法(sec)。
81.图8b是示出洗脱的ghglgo-13h11-msl-109复合物在280nm处的吸光度的尺寸排阻色谱图(顶部图)和示出所指示的sec级分中ghglgo-13h11-msl-109复合物的组分的对应sds-page凝胶图像(底部图)。色谱图上以及sds-page凝胶图像旁边的虚线指示等效的sec洗脱级分。
82.图8c是示出ghglgo-13h11-msl-109复合物的冷冻em显微图片。比例尺：10nm。
83.图8d是示出单体和二聚体ghglgo-13h11-msl-109的代表性2d类平均值的一组冷冻em显微图片。比例尺：10nm。
84.图8e是获得ghglgo-13h11-msl-109的从头开始3d重建的处理工作流程的示意图。
85.图8f是示出获得ghglgo-13h11-msl-109的高分辨率3d重建的数据收集和处理方
案的示意图。
86.图8g是示出在根据通过加窗傅里叶壳层相关(fsc)估计的局部分辨率进行表面着色的聚焦细化之前ghglgo-13h11-msl-109 3d图的等值面渲染的图。分辨率范围：2.7至(蓝色到红色)。
87.图8h是指定颗粒定向分布的热图表示。热图示出在3d空间中以定义的定向布置的颗粒数量。
88.图8i是示出用于整体ghglgo-13h11-msl-109 3d重建与聚焦细化重建(如图8f所示)的半数据集之间的fsc的图。
89.图9a是一组带状图，其示出了hcmv三聚体与五聚体(pdb代码：5vob)gh亚单元以及gl亚单元的结构比较，这些gh亚单元被分为结构域di、dii、dii和div。
90.图9b是一对图，其示出了在gl上映射的go(顶部)与gl上的ul130和ul128(底部，基于pdb代码：5vob)的相互作用界面。
91.图9c是一对图，其示出了hcmv五聚体复合物(pdb代码：5vob)上的糖基化位点分布(彩色分子)，其中突出显示假定的受体结合位点。
92.图10是示出结合至gh的dii-div区域的13h11和msl-109的可变fab区域的近视图的图。突出显示gh上之前通过氢交换质谱法确定的fab接触区域。
93.图11a是示出洗脱的ghglgo-pdgfrα-13h11-msl-109复合物在280nm处的吸光度的尺寸排阻色谱图(顶部图)和所指示的sec级分中ghglgo-pdgfrα-13h11-msl-109复合物的组分的对应sds-page凝胶图像(底部图)。色谱图上以及sds-page凝胶图像旁边的虚线指示等效的sec洗脱级分。
94.图11b是示出ghglgo-pdgfrα-13h11-msl-109复合物的代表性冷冻em显微图片。
95.图11c是示出ghglgo-pdgfrα-13h11-msl-109的代表性2d类平均值的一组冷冻em显微照片。
96.图11d是示出获得ghglgo-pdgfrα-13h11-msl-109的高分辨率3d重建的数据收集和处理方案的示意图。
97.图11e是示出在根据通过加窗fsc估计的局部分辨率进行表面着色的聚焦细化之前ghglgo-pdgfrα-13h11-msl-109 3d图的等值面渲染的图。
98.图11f是示出指定颗粒定向分布的热图表示的图。热图示出在3d空间中以定义的定向布置的颗粒数量。
99.图11g是示出用于ghglgo-pdgfrα-13h11-msl-109 3d重建与聚焦细化重建(如图11d所示)的半数据集之间的fsc的图。
100.图12a是一组图，其示出了pdgfrα(三聚体结合)与pdgfrβ(pdgfβ未示出；pdb代码：3mjg)、kit(scf未示出；pdb代码：2e9w)或fms(m-csf未示出；pdb代码：3ejj)的d1-d3的结构比较。
101.图12b是一组带状图，其示出了pdgfrα(三聚体结合)和pdgfrβ(pdgfb未示出；pdb代码：3mjg)的单独d1、d2和d3结构域的结构比较。
102.图12c是一组图，其示出了pdgfrα(三聚体结合)与pdgfrβ(pdgfb未示出；pdb代码：3mjg)在d2上比对后d1-d3的结构比较。
103.图12d是示出ghglgo-pdgfrα和ghglgo(fab 13h11和msl-109未示出)的结构比较
的棒图。
104.图12e是示出d1-d3区域与pdgfrβ序列的基于pdgfrα结构的序列比对的序列比对图。与hcmv三聚体ghglgo(位点1-4)和pdgfβ的相互作用位点以红色框突出显示。
105.图13a是示出ghglgo-tgfβr3-13h11-msl-109复合物的代表性冷冻em显微图片。比例尺：10nm。
106.图13b是示出ghglgo-tgfβr3-13h11-msl-109的2d类平均值的一组冷冻em显微图片。比例尺：10nm。
107.图13c是示出获得ghglgo-tgfβr3-13h11-msl-109的高分辨率3d重建的数据收集和处理方案的示意图。
108.图13d是示出在根据通过加窗fsc估计的局部分辨率进行表面着色的聚焦细化之前ghglgo-tgfβr3-13h11-msl-109 3d图的等值面渲染的图。分辨率范围：2.5至(蓝色到红色)。
109.图13e是示出指定颗粒定向分布的热图表示。热图示出在3d空间中以定义的定向布置的颗粒数量。
110.图13f是示出用于ghglgo-tgfβr3-13h11-msl-109 3d重建与聚焦细化重建(如图13e所示)的半数据集之间的fsc的图。
111.图13g是示出ghglgo-tgfβr3(绿色)和ghglgo(fab 13h11和msl-109未示出)的结构比较的图。
112.图13h是示出od2区域与内皮糖蛋白(endoglin)od2序列的基于tgfβr3结构的序列比对的序列比对图。与hcmv三聚体ghglgo(位点1-3)的相互作用位点以红色框突出显示。
113.图14a是示出洗脱的pdgfrα和tgfβr3在280nm处的吸光度的一对尺寸排阻色谱图(左图)和示出所指示的sec级分的pdgfrα和tgfβr3的对应sds-page凝胶图像(右图)。
114.图14b是示出洗脱的hcmv ghglgo三聚体和ghglgo-pdgfrα复合物在280nm处的吸光度的一对尺寸排阻色谱图(左图)以及示出所指示的sec级分的ghglgo-pdgfrα复合物的组分的对应sds-page凝胶图像(右图)。
115.图14c是示出洗脱的ghglgo-tgfβr3和ghglgo-pdgfrα-tgfβr3复合物在280nm下的吸光度的一对尺寸排阻色谱图(左图)和示出ghglgo-tgfβr3和ghglgo-pdgfrα-tgfβr3复合物的组分的对应sds-page凝胶图像(右图)。ghglgo-tgfβr3与等摩尔量的pdgfrα预培育。
具体实施方式
116.i.定义
117.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不应解释为表示与本领域通常理解的定义具有实质性区别。
118.如本文所用，术语“约”是指本技术领域技术人员易于知晓的各个值的通常误差范围。在本文中，涉及“约”的值或参数包括(并描述)指向该值或参数本身的方面。
119.如本文所用，单数形式的“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确指出。例如，提及“分离的肽”是指一种或多种分离的肽。
120.在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包含”或“含有”的变形将被理解为表示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
121.本文可互换使用的术语“患者”、“受试者”或“个体”是指人类患者。
122.药物的“静脉内”或“iv”剂量、施用或制剂是经由静脉，例如通过输注施用的药物。
123.药物的“皮下”或“sc”剂量、施用或制剂是在皮肤下例如经由载药注射器、自动注射器或其他装置施用的药物。
124.出于本文的目的，“临床状态”是指患者的健康状况。实例包括患者正在改善或恶化。在一个实施例中，临床状态基于临床状态的顺序量表。在一个实施例中，临床状态不基于患者是否发烧。
[0125]“有效量”是指有效产生治疗/预防益处(例如，如本文所述)的药剂(例如，治疗剂)的量，该益处不会被不想要的/不期望的副作用所抵消。
[0126]
术语“药物制剂”是指一种制剂，其呈允许一种或多种活性成分的生物活性有效的形式，并且其不含对制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。此类制剂为无菌的。在一个实施例中，该制剂用于静脉内(iv)施用。在另一实施例中，该制剂用于皮下(sc)施用。
[0127]
本文中的“天然序列”蛋白是指包含自然界中发现的蛋白的氨基酸序列的蛋白，包括蛋白的天然存在的变异体。本文使用的术语包括从其天然来源分离的或重组产生的蛋白。
[0128]
除非另有说明，否则如本文所使用的术语“蛋白”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然蛋白，该脊椎动物包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人类)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语涵盖在细胞中加工产生的任何形式的“全长”未经加工的蛋白。该术语还涵盖蛋白的天然存在的变异体，例如剪接变异体或等位基因变异体，例如氨基酸取代突变或氨基酸缺失突变。该术语还包括蛋白的分离区域或结构域，例如胞外结构域(ecd)。
[0129]“分离”蛋白或多肽是从其自然环境的组分中分离出来的蛋白或多肽。在一些方面，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，通过(例如)电泳(例如sds-page、等电位聚焦(ief)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相hplc)来测定。
[0130]“分离”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或与自然染色体位置不同的染色体位置。
[0131]
如本文所用，术语“人巨细胞病毒(hcmv)三聚体”、“hcmv ghglgo三聚体”和“hcmv三聚体”是指位于人巨细胞病毒(hcmv)的病毒包膜外表面上的糖蛋白复合物，并且是由gh、gl和go糖蛋白亚单元构成。
[0132]
如本文所用，术语“人巨细胞病毒(hcmv)的go亚单元”、“go亚单元”和“go”泛指来自任何哺乳动物来源，包括灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然go，除非另有说明。该术语涵盖全长go和go的分离区域或结构域。该术语还涵盖天然go变异体，例如剪接变异体或等位基因变异体。示例性人类go的氨基酸序列如seq id no:1所提供。本发明还考虑了极小序列变异，特别是不影响go功能和/或活性的go的保守氨基酸取代。
[0133]
如本文所用，术语“人巨细胞病毒(hcmv)的gh亚单元”、“gh亚单元”和“gh”泛指来
自任何哺乳动物来源，包括灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然gh，除非另有说明。该术语涵盖全长gh和gh的分离区域或结构域。该术语还涵盖天然gh变异体，例如剪接变异体或等位基因变异体。示例性人类gh的氨基酸序列如seq id no:2所提供。本发明还考虑了极小序列变异，特别是不影响gh功能和/或活性的gh的保守氨基酸取代。
[0134]
如本文所用，术语“人巨细胞病毒(hcmv)的gl亚单元”、“gl亚单元”和“gl”泛指来自任何哺乳动物来源，包括灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然gl，除非另有说明。该术语涵盖全长gl和gl的分离区域或结构域。该术语还涵盖天然gl变异体，例如剪接变异体或等位基因变异体。示例性人类gl的氨基酸序列如seq id no:3所提供。本发明还考虑了极小序列变异，特别是不影响gl功能和/或活性的gl的保守氨基酸取代。
[0135]
如本文所用，“调节剂”是调节(例如，增加、降低、活化或抑制)给定生物活性，例如相互作用或由相互作用产生的下游活性的药剂。调节剂或候选调节剂可以是例如小分子、抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、抗原结合片段(例如双-fab、fv、fab、fab'-sh、f(ab')2、双体抗体(diabody)、线性抗体、scfv、scfab、vh结构域或vhh结构域)、肽、模拟物、反义寡核苷酸或抑制性核酸(例如，反义寡核苷酸(aso)或小干扰rna(sirna))。
[0136]“增加”或“活化”意指引起总体增加的能力，例如为20％或更大、50％或更大或者75％、85％、90％或95％或更大。在某些方面，增加或活化可以指蛋白-蛋白相互作用的下游活性。
[0137]“降低”或“抑制”意指引起总体减少的能力，例如为20％或更大、50％或更大或者75％、85％、90％或95％或更大。在某些方面，降低或抑制可以指蛋白-蛋白相互作用的下游活性。
[0138]“亲和力”指分子(例如受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所使用的“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如受体和配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对于其搭配物y的亲和力通常可通过解离常数(kd)来表示。可以通过本领域已知的常规方法测量亲和力，包括那些本文所述的方法。
[0139]
如本文所使用，“复合物”或“复合的”涉及两个或两个以上分子经由非肽键的键和/或力(例如，范德华力、疏水力、亲水力)相互作用的缔合。在一个方面，复合物是异源多聚体。应理解，如本文所使用，术语“蛋白复合物”或“多肽复合物”包括具有与蛋白复合物中的蛋白结合的非蛋白实体的复合物(例如，包括，但不限于，诸如毒素或检测剂的化学分子)。
[0140]
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已向其中引入外源性核酸的细胞，包括这类细胞的子代细胞。宿主细胞包括“转染细胞”、“转化细胞”和“转化体”，其包括原代转化细胞和由其衍生的子代细胞，而与传代次数无关。子代细胞的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括与自原始转化细胞中所筛选或选择具有相同功能或生物活性的突变子代细胞。在某些方面，宿主细胞用外源核酸稳定转化。在其他方面，宿主细胞用外源核酸瞬时转化。
[0141]
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语
包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入该宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导与其操作性连接的核酸的表达。此类载体在本文称为“表达载体”。
[0142]
本文中的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出期望抗原结合活性即可。
[0143]“抗原结合片段”或“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗原结合片段的实例包括但不限于双-fab、fv、fab、fab、fab'-sh、f(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scfv、scfab)抗原片段形成的多特异性抗体。
[0144]
单结构域抗体为包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或抗体的轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体为人单结构域抗体(参见例如美国专利号6,248,516b1)。单结构域(single-domain)抗体的实例包括但不限于vhh。
[0145]“fab”片段是通过木瓜蛋白酶消化抗体产生的抗原结合片段，并且由完整的l链以及h链的可变区域(vh)和一个重链的第一恒定结构域(ch1)组成。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的fab片段。胃蛋白酶对抗体的处理产生单一大的f(ab')2片段，该片段大致对应于两个具有两价抗原结合活性并且仍能够交联抗原的双硫键连接的fab片段。fab'片段与fab片段的不同之处在于，在ch1结构域的羧基末端具有额外的少数残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab'-sh是指恒定结构域的半胱氨酸残基带有一个游离硫醇基的fab'。f(ab')2抗体片段最初作为成对fab'片段产生，其之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
[0146]
本文中术语“fc区域”用于定义免疫球蛋白重链的c端区域，包括天然序列fc区域和变异fc区域。尽管免疫球蛋白重链的fc区域的边界可能略有变化，但通常将人igg重链的fc区域定义为从cys226或pro230位置的氨基酸残基延伸至其羧基端。例如，在抗体生产或纯化过程中，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸，可去除fc区域的c端赖氨酸(根据eu编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可包含去除所有lys447残基的抗体群体、未去除lys447残基的抗体群体以及具有含和不含lys447残基的抗体混合物的抗体群体。
[0147]“fv”由紧密、非共价缔合的一个重链可变区和一个轻链可变区域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠产生六个高度变异环(h和l链各3个环)，这些环形成用于抗原结合的氨基酸残基，并且为抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个针对抗原的cdr的半个fv)也具有辨识和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
[0148]
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构实质上类似的结构或具有含有如本文中所定义的fc区域的重链的抗体。
[0149]“单链fv”也简称为“sfv”或“scfv”，是包含连接到单一多肽链中的vh和vl抗体结构域的抗体片段。优选地，scfv多肽在vh和vl结构域之间进一步包含多肽连接子，其使scfv能够形成用于抗原结合的期望结构。关于scfv的综述，参见pluckthun,the pharmacology of monoclonal antibodies,vol.113,rosenburg and moore eds.,springer-verlag,new york,pp.269-315(1994)；malmborg等人.,j.immunol.methods 183:7-13,1995。
[0150]
术语“小分子”是指具有约2000道尔顿或更少(例如约1000道尔顿或更少)的分子
量的任何分子。在一些方面，小分子是有机小分子。
[0151]
如本文所用，术语“模拟物”或“分子模拟物”是指与给定多肽或该多肽的一部分在构形和/或结合能力(例如二级结构、三级结构)方面具有足够相似性的多肽以结合至该多肽的结合配偶体。模拟物可以以与其模拟的多肽相同、更低或更高的亲和力与结合配偶体结合。分子模拟物与其模拟的多肽可能具有或不具有明显的氨基酸序列相似性。模拟物可以是天然存在的，或者可以是经过工程化的。在一些方面，模拟物是结合对的成员的模拟物。在另外其他方面，模拟物是结合至结合对的成员的另一种蛋白的模拟物。在一些方面，模拟物可以执行模拟多肽的全部功能。在其他方面，模拟物不执行模拟多肽的全部功能。
[0152]
如本文所用，术语“允许两种或两种以上蛋白彼此结合的条件”是指在不存在调节剂或候选调节剂的情况下两种或两种以上蛋白将相互作用的条件(例如蛋白浓度、温度、ph、盐浓度)。允许结合的条件可能因个体蛋白而异，并且蛋白-蛋白相互作用测定(例如，表面等离子体共振测定、生物膜干涉技术测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、细胞外相互作用测定和细胞表面相互作用测定)之间可能有所差异。
[0153]
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性”，是指候选序列中氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比，在比对序列并且引入差异后(如有必要)，可实现最大的序列一致性百分比，并且不考虑将任何保守性取代作为序列一致性的一部分。为确定氨基酸序列一致性百分比的目的而进行的比对可以本领域中技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可取得的计算机软件诸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域的技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序align-2产生％氨基酸序列一致性值。align-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(genentech，inc.)编写，源代码已与用户文件一起存档于美国版权局，华盛顿特区，20559，并且以美国版权注册号txu510087进行注册。align-2程序可从加利福尼亚南旧金山的基因泰克公司(genentech，inc.)公开取得，还可以从源代码进行编译。align-2程序应编译为在unix操作系统(包括数字unix v4.0d)上使用。所有序列比较参数均由align-2程序设置，并且没有变化。
[0154]
在使用align-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列a对、与、或相对于给定氨基酸序列b的％氨基酸序列一致性(其可选地表述为给定氨基酸序列a，其对、与、或相对于给定氨基酸序列b具有或包含一定％的氨基酸序列一致性)计算如下：
[0155]
100乘以分数x/y
[0156]
其中x是序列比对程序align-2在a与b程序比对中评分为同一匹配的氨基酸残基数，y是b中氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a与b的％氨基酸序列一致性将不等于b与a的％氨基酸序列一致性。除非另有特别说明，否则如前一段所述，使用align-2计算机程序获得本文使用的所有％氨基酸序列一致性值。
[0157]
如本文中所使用的“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)，是指试图改变受治疗个体的疾病自然病程的临床干预，并且可进行预防或在临床病理过程中执行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病的发生或复发(例如防止hcmv感染或其症状)、减少或防止患有感染的患者的继发性感染(例如减少或防止神经组
织、免疫细胞、淋巴组织和/或肺组织的继发性感染)、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。
[0158]
疾病或病状的“病理”包括损害受试者健康的全部现象。
[0159]“改善(amelioration)”、“改善(ameliorating)”、“减轻(alleviation)”、“减轻(alleviating)”或其等同形式是指治疗和预防或预防措施，其中目的是改善、预防、减慢(减轻)、减少或抑制疾病或病状，例如hcmv感染。需要治疗的人包括已患有疾病或病状的人，以及易于患疾病或病状的人或待预防疾病或病状的人。
[0160]
ii.蛋白-蛋白相互作用的调节剂
[0161]
在一些方面，本公开的特征在于一种pdgfrα或tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体之间的相互作用的分离的调节剂，其中相对于在无调节剂的存在下的结合，该调节剂使hcmv ghglgo三聚体与pdgfrα或tgfβr3的结合减少。
[0162]
a.pdgfrα与hcmv ghglgo三聚体之间的相互作用的调节剂
[0163]
i.结合hcmv ghglgo三聚体的调节剂
[0164]
在一些方面，本公开的特征在于人巨细胞病毒(hcmv)ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至go亚单元的无糖基化表面并且使得go亚单元与pdgfrα的结合减少。
[0165]
在一些方面，该调节剂结合至：(a)go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个(例如，r230、r234、v235、k237和y238中的一个、两个、三个、四个或全部五个)；(b)go亚单元的残基n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个或多个(例如，n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部十一个)；以及(c)go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个(例如r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)。
[0166]
在一些方面，本公开的特征在于一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至：(a)go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个(例如，r230、r234、v235、k237和y238中的一个、两个、三个、四个或全部五个)；(b)go亚单元的残基n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个或多个(例如，n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部十一个)；以及(c)go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个(例如r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个、二个、三个、四个、五个、六个或全部七个)；并且使得go亚单元与pdgfrα的结合减少。
[0167]
在一些方面，该调节剂结合至go亚单元的残基r230、r234、v235、k237、y238、n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121、v123、r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的全部23个。
[0168]
在一些方面，该调节剂进一步结合至hcmv的gh亚单元的残基r47、y84和n85中的一个或多个(例如，r47、y84和n85中的一个、两个或全部三个)。在一些方面，该调节剂进一步使得gh亚单元与pdgfrα的结合减少。
[0169]
在一些方面，该调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核
酸(例如aso或sirna)。下面进一步描述调节剂。
[0170]
在一些方面，该抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。在一些方面，该双特异性抗体或多特异性抗体结合至go亚单元的至少三个不同的表位。在一些方面，该至少三个不同的表位包括：(a)第一表位，其包括go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个；(b)第二表位，其包括go亚单元的残基n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个或多个；以及(c)第三表位，其包括go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个。
[0171]
在一些方面，该调节剂为pdgfrα的模拟物。
[0172]
ii.结合pdgfrα的调节剂
[0173]
在一些方面，本公开的特征在于一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至pdgfrα的d1、d2和d3结构域并且使得go亚单元与pdgfrα的结合减少。
[0174]
在一些方面，该调节剂结合至：(a)pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个(例如，n103、q106、t107、e108和e109中的一个、两个、三个、四个或全部五个)；(b)pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个(例如，m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)；以及(c)pdgfrα的n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个(例如n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个)。
[0175]
在一些方面，本公开的特征在于一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至：(a)pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个(例如，n103、q106、t107、e108和e109中的一个、两个、三个、四个或全部五个)；(b)pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个(例如，m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)；以及(c)pdgfrα的残基n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个(例如n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个、二个、三个、四个或全部五个)，并且使得go亚单元与pdgfrα的结合减少。
[0176]
在一些方面，该调节剂结合至pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108、e109、m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206、l208、n240、d244、q246、t259、e263和k265中的全部十九个。
[0177]
在一些方面，该调节剂进一步结合至pdgfrα的残基e52、s78和l80中的一个或多个。在一些方面，该调节剂进一步使得gh亚单元与pdgfrα的结合减少。
[0178]
在一些方面，该调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸(例如aso或sirna)。下面进一步描述调节剂。
[0179]
在一些方面，该抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。在一些方面，该双特异性抗体或多特异性抗体结合至pdgfrα的至少三个不同的表位。在一些方面，该至少三个不同的表位包括：(a)第一表位，其包括pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个；(b)第二表位，其包括pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个；以及(c)第三表位，其包括pdgfrα的残基n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个。
[0180]
在一些方面，该调节剂为hcmv ghglgo三聚体的go亚单元的模拟物。
[0181]
iii.结合和/或感染减少
[0182]
在一些方面，该调节剂使hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα的结合减少至少50％。在一些方面，相对于无调节剂的存在下的结合，结合的减少为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，取消结合)，例如减少为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％。在一些方面，该调节剂使hcmv三聚体的go亚单元与pdgfrα的结合减少至少90％。在一些方面，例如通过表面等离子体共振、生物膜干涉技术或酶联免疫吸附测定(elisa)测量的结合的减少为至少50％。
[0183]
在一些方面，该调节剂使hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与tgfβr3的结合减少至少50％。在一些方面，相对于无调节剂的存在下的结合，结合的减少为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，取消结合)，例如减少为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％。在一些方面，该调节剂使hcmv三聚体的go亚单元与tgfβr3的结合减少至少90％。在一些方面，例如通过表面等离子体共振、生物膜干涉技术或酶联免疫吸附测定(elisa)测量的结合的减少为至少50％。
[0184]
在一些方面，相对于不存在该调节剂的情况下的感染，该调节剂使得hcmv对细胞的感染减少。在一些方面，如在使用假型颗粒的病毒感染测定或病毒进入测定中所测量，感染减少至少40％。在一些方面，减少为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，不发生感染)，例如减少为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％。
[0185]
在一些方面，该调节剂与pdgfrα的触发下游信号传导的区域具有最小的结合，或者不结合至pdgfrα的触发下游信号传导的区域。在一些方面，该pdgfrα的触发下游信号传导的区域为pdgf的结合位点。在一些方面，该调节剂不会在空间上阻碍pdgfrα配体与pdgfrα的触发下游信号传导的区域的结合或使得该结合的空间位阻最小，例如，不会在空间上阻碍pdgf与pdgfrα的结合或使得该结合的空间位阻最小。
[0186]
在一些方面，与不存在该调节剂的情况下的信号传导相比，该调节剂使得通过pdgfrα的信号传导减少小于20％。在一些方面，与不存在该调节剂的情况下的信号传导相比，该调节剂使得通过pdgfrα的信号传导减少小于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(例如，与不存在该调节剂的情况下的信号传导相比，使得通过pdgfrα的信号传导减少0％-5％、5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％或85-95％)。在一些方面，与不存在该调节剂的情况下的信号传导相比，该调节剂不使得通过pdgfrα的信号传导减少。
[0187]
在一些方面，该调节剂包含药用载体。
[0188]
b.tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体之间的相互作用的调节剂
[0189]
i.结合hcmv ghglgo三聚体的调节剂
[0190]
在一些方面，本公开的特征在于一种hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至：(a)hcmv ghglgo三聚体的go亚单元的残基q115、l116、r117和k118中的一个或多个(例如，q115、l116、r117和k118中的一个、两个、三个或全部四个)；(b)hcmv ghglgo三聚体的go亚单元的残基y188和p191以及hcmv三聚体的gl亚单元的残基n97中的一个或两个；以及(c)hcmv ghglgo三聚体的gl亚单元的残基t92和e94中的一个或两个，并且使得hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3的结合减少。
[0191]
在一些方面，该调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸(例如aso或sirna)。在一些方面，该抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。
[0192]
ii.结合tgfβr3的调节剂
[0193]
在一些方面，本公开的特征在于一种hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3之间的相互作用的调节剂，该调节剂结合至：(a)tgfβr3的残基v135、q136、f137和s143中的一个或多个(例如，v135、q136、f137和s143中的一个、两个、三个或全部四个)；(b)tgfβr3的残基r151、n152和e167中的一个或多个；以及(c)tgfβr3的残基w163和k166中的一个或两个，并且使得hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3的结合减少。
[0194]
在一些方面，该调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸(例如aso或sirna)。在一些方面，该抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。
[0195]
iii.结合和/或感染减少
[0196]
在一些方面，该调节剂使hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与tgfβr3的结合减少至少50％。在一些方面，相对于无调节剂的存在下的结合，结合的减少为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，取消结合)，例如减少为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％。在一些方面，该调节剂使hcmv三聚体的go亚单元与tgfβr3的结合减少至少90％。在一些方面，例如通过表面等离子体共振、生物膜干涉技术或酶联免疫吸附测定(elisa)测量的结合的减少为至少50％。
[0197]
在一些方面，该调节剂使hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα的结合减少至少50％。在一些方面，相对于无调节剂的存在下的结合，结合的减少为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，取消结合)，例如减少为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％。在一些方面，该调节剂使hcmv三聚体的go亚单元与pdgfrα的结合减少至少90％。在一些方面，例如通过表面等离子体共振、生物膜干涉技术或酶联免疫吸附测定(elisa)测量的结合的减少为至少50％。
[0198]
在一些方面，相对于不存在该调节剂的情况下的感染，该调节剂使得hcmv对细胞的感染减少。在一些方面，如在使用假型颗粒的病毒感染测定或病毒进入测定中所测量，感染减少至少40％。在一些方面，减少为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，不发生感染)，例如减少为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、
55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。
[0199]
在一些方面，该调节剂包含药用载体。
[0200]
c.小分子
[0201]
在一些方面，调节剂或候选调节剂是小分子。小分子是除本文定义的结合多肽或抗体之外的分子，其可以优选特异性地结合至pdgfrα(例如，其d1、d2和/或d3结构域)、tgfβr3或hcmv ghglgo三聚体(例如，go和/或gh)。结合小分子可以使用已知方法鉴定以及化学合成(参见例如pct出版物第wo00/00823和wo00/39585号)。结合小分子的大小通常小于约2000道尔顿(例如，大小小于约2000、1500、750、500、250或200道尔顿)，其中能够结合、优选特异性地结合至如本文所述多肽的此类有机小分子可以使用众所周知的技术在没有过度实验的情况下鉴定。就这一点而言，注意到筛选小分子文库中能够结合至多肽靶标的分子的技术是此项技术中众所周知的(参见，例如，pct出版物第wo00/00823和wo00/39585号)。结合小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、半卡腙、卡肼、伯胺、仲胺、叔胺、n-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫缩酮、缩醛、硫缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸酯、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、恶唑烷、恶唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮杂环丙烷、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰氯等。
[0202]
在一些方面，在小分子的存在下，pdgfrα和/或tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体的结合减少(例如减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如减少5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。在一些方面，在小分子的存在下，pdgfrα和/或tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体的结合增加(例如增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％，例如增加5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％、95％-100％或超过100％)。在一些方面，在小分子的存在下，pdgfrα、tgfβr3和/或hcmv ghglgo三聚体的下游活性(例如，细胞被hcmv感染)降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如降低5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。
[0203]
d.抗体和抗原结合片段
[0204]
在一些方面，调节剂或候选调节剂是结合pdgfrα、tgfβr3和/或hcmv ghglgo三聚体的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗原结合片段为双-fab、fv、fab、fab'-sh、f(ab')2、双体抗体(diabody)、线性抗体、scfv、scfab、vh结构域或vhh结构域。
[0205]
在一些方面，调节剂为多特异性抗体，例如双特异性抗体。在一些方面，调节剂为结合hcmv ghglgo三聚体的多个表位、pdgfrα的多个表位或tgfβr3的多个表位的双特异性或多特异性抗体。在一些方面，调节剂是结合hcmv ghglgo三聚体、pdgfrα和tgfβr3中的两个或全部三个的双特异性或多特异性抗体。
[0206]
在一些方面，在抗体或抗原结合片段的存在下，pdgfrα和/或tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体的结合减少(例如减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如减少5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。在一些方面，在抗体或抗原结合片
95％、95％-100％或超过100％)。在一些方面，在模拟物的存在下，pdgfrα和/或tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体的结合减少(例如减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如减少5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。
[0213]
g.用于调节蛋白-蛋白相互作用的测定
[0214]
在一些方面，在候选调节剂存在或不存在的情况下，pdgfrα或tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体的结合在用于蛋白-蛋白相互作用的测定中进行评估。在蛋白-蛋白相互作用中，相互作用的调节可被鉴定为与不存在调节剂的情况下的蛋白-蛋白相互作用相比，在存在调节剂的情况下的蛋白-蛋白相互作用增加，例如增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、100％或超过100％(例如5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％、95％-100％或超过100％)。替代性地，在蛋白-蛋白相互作用中，调节可被鉴定为与不存在调节剂的情况下的蛋白-蛋白相互作用相比，在存在调节剂的情况下的蛋白-蛋白相互作用减少，例如减少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或100％(例如5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。用于蛋白-蛋白相互作用的测定可以是例如spr测定、生物膜干涉技术(bli)测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、细胞外相互作用测定或细胞表面相互作用测定。
[0215]
pct/us2020/025471中描述了用于鉴定蛋白-蛋白相互作用的调节剂的示例性方法，以及可以调节此种相互作用的药剂，该专利通过引用整体并入。
[0216]
iv.治疗或防止hcmv感染的方法
[0217]
a.治疗患有hcmv感染的个体的方法
[0218]
在一些方面，本公开的特征在于一种用于治疗个体的hcmv感染的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的调节剂(例如，hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂和/或hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3之间的相互作用的调节剂)，从而治疗个体。在一些方面，该个体是免疫功能不全的、是怀孕的或者为婴儿。
[0219]
在一些方面，相对于未施用该调节剂的个体，hcmv感染的持续时间或严重程度减少至少40％。在一些方面，hcmv感染的持续时间或严重程度减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。
[0220]
b.防止hcmv感染或继发性感染的方法
[0221]
在一些方面，本公开的特征在于一种防止个体的hcmv感染的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的调节剂(例如，hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂和/或hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3之间的相互作用的调节剂)，从而防止个体的hcmv感染。
[0222]
在一些方面，相对于无调节剂的存在下的感染，调节剂降低个体的hcmv感染的可能性。在某些方面，根据上述方法治疗的患者中hcmv感染的可能性、程度或严重度相对于未治疗的患者或相对于使用对照方法(例如，soc)治疗的患者而言降低，例如降低至少5％、至
少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％(例如，降低5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。
[0223]
在一些方面，本公开的特征在于一种针对预防个体(例如，具有hcmv感染的个体)的继发性hcmv感染的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的调节剂(例如，hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂和/或hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3之间的相互作用的调节剂)，从而防止个体的继发性hcmv感染。在一些方面，该继发性感染为未经感染组织的hcmv感染。
[0224]
在一些方面，相对于无调节剂的存在下的继发性感染，调节剂降低个体的继发性hcmv感染的可能性。在某些方面，根据上述方法治疗的患者中继发性hcmv感染的可能性、程度或严重度相对于未治疗的患者或相对于使用对照方法(例如，soc)治疗的患者而言降低，例如降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％(例如，降低5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。
[0225]
c.组合疗法
[0226]
在上述治疗和预防方法的一些方面，该方法包括向个体施用至少一种额外疗法(例如，一种、两种、三种、四种或超过四种额外疗法)。pdgfrα或tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体之间的相互作用的调节剂可以在至少一种额外疗法之前、同时或之后向个体施用。
[0227]
d.递送方法
[0228]
本文所述方法中使用的组合物(例如，pdgfrα或tgfβr3与hcmv ghglgo三聚体之间的相互作用的调节剂，例如小分子、抗体、抗原结合片段、肽、模拟物、反义寡核苷酸或sirna)可以通过任何适合的方法施用，这些方法包括例如静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、结膜下、囊内、黏膜内、心包内、脐内、眼内、眶内、口服、透皮、玻璃体内(例如，通过玻璃体内注射)、通过滴眼剂、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注沐浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳膏形式或以脂质组合物形式。本文所述的方法中使用的组合物还可以全身或局部施用。施用方法可以根据多种因素而变化(例如，施用的化合物或组合物以及待治疗的病状、疾病或疾患的严重程度)。在一些方面，蛋白-蛋白相互作用的调节剂经静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。给药可通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于短暂施用还是长期施用。本文中考虑各种给药方案，其包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速注射施用和脉冲输注。
[0229]
本文描述的蛋白-蛋白相互作用的调节剂(和任何额外治疗剂)可以以符合良好医学实践的方式调配、给药和施用。在这种情况下，考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个别患者的临床病症、病症的原因、递送药物的部位、施用方法、施用日程和医疗从业者已知的其他因素。调节剂并非必须、但可以任选地与一种或多种目前用于防止或治疗所述疾病的药剂一起调配和/或与其同时施用。此类其他治疗剂的有效量取决
于制剂中存在的调节剂量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文中所述相同的剂量和施用途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以经验上/临床上确定为适当的任何剂量和通过任何途径使用。
[0230]
本说明书中引用的所有专利、专利出版物和参考文献都通过引用整体并入本文。
[0231]
v.实例
[0232]
实例1.hcmv三聚体ghglgo的结构
[0233]
过去已证明hcmv ghglgo三聚体结构表征具有挑战性，因为它具有灵活性、细长性质及其众多糖基化位点，可能会阻碍衍射至高分辨率的晶体的形成(ciferri等人,proc natl acad sci u s a,112:1767-1772,2015)。为了确定hcmv三聚体(也称为ghglgo复合物)的高分辨率结构，在expi293细胞中重组表达了ghglgo复合物的可溶性区域，并且将该复合物纯化至高纯度(图8a)。与之前的报导一致，hcmv gh、gl和go通过二硫键共价连接，并通过sds-page作为单一条带运行(图8b)(ciferri等人,proc natl acad sci u s a,112:1767-1772,2015)。为了克服由于ghglgo复合物的大小、形状和灵活性造成的限制，我们在用gh特异性中和单克隆抗体(mab)13h11和msl-109的片段抗原结合(fab)区域重建ghglgo后，转向了冷冻em和单颗粒分析(图8a-8i)(macagno等人,jvirol,84:1005-1013,2010；fouts等人,proc natl acad sci u s a,111:8209-8214,2014)。两种fab的结合增加了ghglgo复合物的大小、稳定性和尺寸，并且促进了高分辨率的冷冻em研究(图8c和图8d)。2d类平均值显示出高度的细节，包括二级结构特征和不同定向的颗粒比对(图8d)。此外，还注意到2d类别和3d从头开始体积中的二聚体ghglgo颗粒亚群(图8d和图8e)。二聚体ghglgo颗粒在相反的方向上头对尾定向，界面处仅有少数几个小的接触区域。头对尾定向表明病毒膜位于复合物的相对末端，因此这似乎不太可能具有生理相关性。通过在单体ghglgo复合物周围使用遮罩，确定了ghglgo-13h11-msl-109复合物的高分辨率结构，其扩展至的分辨率(图1a和图8f-8i以及表1)。该复合物被分为三个子区域，以在聚焦局部细化中使用特定遮罩进一步提高整个ghglgo-13h11-msl-109分子的图品质(图8f)。聚焦3d重建的组合允许构建结构并且将序列分配给gh、gl和先前未知的go亚单元的主要部分以及两个fab的可变结构域(fv)(图1a和图1b)。
[0234]
表1.冷冻em数据收集、细化和验证统计
[0235]
[0236][0237]
hcmv三聚体ghglgo的整体结构采用类似靴子的结构，其相对尺寸为长度和宽度(图1b)。该三个亚单元以线性顺序相互作用，其中gh的c末端最靠近hcmv病毒膜，并且go指向受体结合分子的远侧末端(图1a和图1b)。gl亚单元桥接复合物中心的gh和go亚单元(图1a和图1b)。表面静电荷不对称地分布在ghglgo复合物上，在复合物的近侧gh区域有负电荷簇，在复合物的远侧go区域有正电荷簇(图1c)。同样，观察到的22个n连接的
糖基化位点沿ghglgo复合物不对称分布，gh上有5个，gl上有1个，并且go上有16个。值得注意的是，在远侧go区域，特别是沿着整个复合物的背面，糖基化残基富集(图1d)。相比之下，三聚体复合物的正面似乎在所有三个亚单元中都缺乏糖基化残基(图1d)。表面电荷和糖基化的这种不对称分布对受体相互作用以及与gb融合前构形的潜在相互作用具有重要意义，并且因此可用于为抗病毒策略的设计提供信息。
[0238]
蛋白表达和纯化
[0239]
人类疱疹病毒5、gh(1-716)、gl和go(用于gh和gl的hcmv merlin菌株以及用于go的vr1814菌株)的优化编码dna各自被克隆至cmv启动子后面的prk载体中。将c末端myc-avi-his标签添加至gh，并且将c末端双链球菌标签添加至go。
[0240]
将悬浮的expi293细胞在smm 293t-i培养基中在5％ co2下于37℃培养，并且当细胞密度达到每毫升4
×
106个细胞时，使用聚乙烯亚胺(pei)与dna以1:1:1的比率进行转染以用于ghglgo表达。在收获表达上清液之前，将转染的细胞培养7天。
[0241]
如下纯化hcmv三聚体ghglgo。经由切向流过滤(tff)将对应于35l表达体积的表达上清液浓缩至1-2l的体积，加载于20ml ni sepharose excel(cytiva)树脂上，用13个柱体积(cv)洗涤缓冲液(30mm tris(ph8.0)、250mm nacl、5％甘油、20mm咪唑)洗涤并且在5cv洗脱缓冲液(30mm tris(ph 8.0)、250mm nacl、5％甘油、400mm咪唑)中洗脱。将洗脱液施加至3ml strep-tactin xt高亲和力树脂(iba)并且结合2小时。将树脂用10cv strep洗涤缓冲液(25mm hepes(ph 7.5)、300mm nacl、5％甘油)洗涤，并且在补充有50mm生物素的strep洗涤缓冲液中从珠粒上洗脱。将洗脱液用超离心过滤装置(30kda截留分子量(mwco))浓缩，并且加载于在三聚体-sec缓冲液(25mm hepes(ph 7.5)、300mm nacl、5％甘油)中平衡的superdex 200 10/300或10/60柱上。
[0242]
将fab msl-109的重链和轻链在phoa启动子下在大肠杆菌34b8细胞中在磷酸盐限制培养基(c.r.a.p)中在30℃共表达20小时。将1l表达体积的沉淀物重新悬浮在补充有罗氏蛋白酶抑制剂片剂的70ml裂解缓冲液(1x pbs，25mm edta)中，并且通过超声处理裂解。通过以25,000x g离心1小时清除裂解物，然后通过0.45μm过滤器。将澄清的裂解物加载于在裂解缓冲液中平衡的5ml hitrap蛋白g hp(cytiva)柱上。将柱用10-20cv裂解缓冲液洗涤并且用0.58％(v/v)乙酸洗脱。通过添加sp-a缓冲液(20mm mes,ph 5.5)立即调节洗脱液的ph，并且将其加载于5ml hitrap sp hp阳离子交换色谱柱(cytiva)上。将fab以线性20cv梯度洗脱至sp-b缓冲液(20mm mes(ph 5.5)，500mm nacl)。将洗脱液使用超离心过滤装置(10kda mwco)浓缩，并且在于fab-s200缓冲液(25mm tris(ph 7.5)，300mm nacl)中平衡的superdex 200 10/300柱上进一步纯化。将纯化的fab在超离心过滤装置(10kda mwco)中浓缩，在液氮中冷冻并且储存在-80℃。将13h11抗体如前所述纯化(ciferri等人,plos pathog,11:e1005230,2015)。
[0243]
用人受体蛋白和中和fab重构hcmv ghglgo三聚体
[0244]
通过将18.3μm ghglgo(300μg)与过量的30μm(150μg)fab 13h11和30μm(150μg)msl-109在冰上培育30分钟来组装ghglgo-13h11-msl-109复合物。通过在于sec-reconst-1缓冲液(25mm hepes(ph 7.5)，200mm nacl)中平衡的superose 6 3.2/300柱上纯化，去除过量的fab。将ghglgo-13h11-msl-109的主峰级分用sec-reconst-1缓冲液稀释至0.4mg/ml的浓度，用于冷冻em样品制备。
[0245]
冷冻em样品制备和数据采集
[0246]
将ghglgo-13h11-msl-109复合物如所述按以下方式制备。将多孔碳网格(c-flat 45nm r 1.2/1.3 300目，涂有au/pd 80/20；protochips)使用solarus
tm
等离子清洗仪(gatan)辉光放电10秒。将该复合物在室温下与0.025％ em级戊二醛温和交联10分钟，并且用9mm tris(ph 7.5)淬灭。将3μl样品(现在为约0.4mg/ml)施加至网格。以vitrobot mark iv(thermo fisher)使用2.5秒的印迹时间在100％的湿度下印迹网格，并且在液氮冷却的液态乙烷中进行快速冷冻。
[0247]
使用serialem(mastronarde等人,j struct biol.oct；152(1):36-51,2005)在以300kev运行的titan krios上收集影片堆栈，其带有配备k2summit直接电子检测器相机(gatan)的生物量子能量过滤器。使用20ev能量缝以对应于每像素的165,000
×
放大率记录图像。每个图像堆栈包含每0.2秒记录的50帧，累积剂量为约并且总曝光时间为10秒。以0.5μm至1.5μm的设定离焦范围记录图像。
[0248]
冷冻em数据处理
[0249]
使用relion(scheres,j struct biol.,180(3):519-30,2012)和cistem(grant等人,elife,7(7):e35383,2018)软件包的组合来处理冷冻em数据。
[0250]
对于ghglgo-13h11-msl-109复合物，使用relion中的motioncor2(zheng等人，nat methods,14(4):331-332,2017)实现方式校正了总计14,717部影片的帧运动，并且使用ctffind-4(rohou和grigorieff,jstruct biol.,192(2):216-2,2015)光谱的波段拟合对比转移函数参数。为了生成第一从头开始3d重建，根据检测到的拟合分辨率好于对图像进行滤波。使用cistem内的圆形斑点拾取工具共拾取了974,766个颗粒。在2轮cistem 2d分类中对颗粒进行分类，以选择最佳排列颗粒，产生313,196个颗粒。这些颗粒在具有三个靶标体积的cistem内从头开始生成。对应于单个hcmv三聚体的体积用作参考，用于在单个(单体)ghglgo-13h11-msl-109复合物周围使用遮罩，并且通过在该遮罩外应用低通滤波器(lpf)进行cistem自动细化和手动细化。该图用作高分辨率3d细化的3d参考。
[0251]
为了生成ghglgo-13h11-msl-109复合物的高分辨率3d重建，根据检测到的拟合分辨率好于对ctf拟合图像进行滤波。使用低通滤波的ghglgo-13h11-msl-109复合物参考结构，通过与gautomatch(mrc laboratory of molecular biology)模板匹配挑选出总计1,478,640个颗粒。在relion 2d分类期间对颗粒进行分类，并且将所选择的1,350,211个颗粒导入cistem进行3d细化。ghglgo-13h11-msl-109 3d重建是在单个(单体)ghglgo-13h11-msl-109复合物周围使用遮罩，并且通过在遮罩外应用低通滤波器(lpf)(滤波器分辨率)和0.25的得分阈值进行自动细化和手动细化后获得的。因此，在迭代轮次的手动细化中，外部重量从0.5逐渐减少到0.15。3d重建收敛至的图分辨率(傅里叶壳层相关(fsc)＝0.143，在cistem中确定)。为了提高图的质量，在使用遮罩将图划分为三个不同的区域和在遮罩外使用低通滤波器(lpf)手动细化后，获得了集中细化，如上所述。聚焦图在cistem中使用以下参数进行锐化：从分辨率变平，从倒易空间的原点应用的预截止b因子并且应用质量因子滤波器(rosenthal和henderson，j mol biol.,333(4):721-45,2003)。对于模型构建和图形准备，使用phenix combine_focused_maps从
三个个体聚焦3d图生成合成图。
[0252]
模型构建和结构分析
[0253]
hcmv五聚体结构的gh和gl亚单元(chandramouli等人，sci immunol，2：eaan1457，2017)作为刚体纳入冷冻em图中。go亚单元是从头开始构建至高分辨率冷冻em图上的。所得模型作为刚体纳入冷冻em图。在大量重建和手动调整后，使用phenix.real_space_refinement(afonine等人,acta crystallogr d struct biol,74(pt 9):814-840,2018)工具进行多轮真实空间细化是用于校正初始模型与图之间的全局结构差异。在coot(emsley等人,acta crystallogr d biol crystallogr.,66(pt 4):486-501,2010)中通过phenix中的迭代轮次的模型构建和真实空间细化进一步手动调整该模型。该模型使用phenix.validation_cryoem(afonine等人，acta crystallogr d struct biol.,74(pt 9):814-840,2018)与内置molprobity评分(williams等人，protein sci.,27(1):293-315,2018)进行验证。使用pymol(the pymol molecular graphics system,v.2.07llc)、ucsf chimerax(goddard等人,protein sci.,27(1):14-25,2018)制图。使用dali服务器(holm,methods mol biol.,2112:29-42,2020)进行3d同源结构分析。使用jalview(waterhouse等人,bioinformatics,25(9):1189-91,2009)的clustal omega(sievers等人,mol syst biol.,7:539,2011)比对序列，并且使用espript 3.0(robert和gouet,nucleic acids res.,42(web server issue):w320-4,2014)说明，然后根据pdgfrα-ghglgo-13h11-msl-109或tgfβr3-ghglgo-13h11-msl-109结构模型的考虑进行手动调整。
[0254]
实例2.hcmv三聚体和五聚体特异性亚单元组装的结构基础
[0255]
在hcmv中介导三聚体和五聚体特异性组装的结构决定因素仍然未知。三聚体和五聚体共享它们的gh和gl亚单元，但分别在介导受体识别的远侧亚单元go和ul128-131的组成方面不同(ciferri等人,proc natl acad sci u s a,112:1767-1772,2015)。在三聚体中，四个gh结构域(di-iv)远离膜近轴面线性延伸，其中gh(di)的n末端区域与分子膜远侧区域附近的gl共折叠(图1b和图9)。三聚体与五聚体晶体结构之间ghgl亚单元的结构比较，结合ul130特异性中和fab 8i21(chandramouli等人sci immunol,2:eaan1457,2017)，几乎揭示了两种复合物中gh和gl的结构相同(rmsd/582ca)(图2a)。因此，除了残基n641之外，gh和gl上的大多数糖基化残基指向三聚体和五聚体的相同方向，残基n641存在于三聚体结构的不良解析的无序环区域中(图2b)。
[0256]
以前，go和ul128/ul130/ul131a被建立为通过与gl-cys144形成二硫键结合至ghgl上的相同位点(ciferri等人,proc natl acad sci u s a,112:1767-1772,2015)，但三聚体和五聚体特异性蛋白可如何与相同的gl界面形成非常稳定的相互作用的细节仍然无法解释。三聚体与五聚体之间的个体gh结构域和gl亚单元的深入结构比较证实了期望的高度结构相似性。尽管存在此种整体相似性，我们仍在gl亚单元的最远程观察到关键差异，其与三聚体中的go或五聚体中的ul128和ul130亚单元相互作用(图2c和图2d)。go加帽冠结合在gl周围，覆盖其表面的约(图9b)。在hcmv五聚体中，gl与go之间的相互作用表面比gl与ul128或ul130之间的对应界面跨越更大的面积(图9b)。三聚体与五聚体之间的比较表明，尽管gl的整体折叠是保守的，但以关键cys144残基
为中心的残基组织存在差异。值得注意的是，在三聚体中，此段残基呈现出环状结构(图2c)，而在五聚体中，该区域折叠成规则的α螺旋以协调ul128结合(图2d)。因此，gl成为关键的转接蛋白，该转接蛋白已经进化为能够通过以gl c
144
为中心的结构开关识别go或ul128/ul130蛋白，从而将三聚体或五聚体复合物加载至hcmv病毒表面，这取决于细胞向性和确定细胞向性。
[0257]
实例3.hcmv三聚体和五聚体中和抗体的结合位点
[0258]
hcmv研究的重要目标是理解广泛中和单克隆抗体(mab)的结构基础和机制。值得注意的是，先前已经报导了从健康的hcmv血清阳性供体中分离出的靶向hcmv五聚体和三聚体构形依赖性表位的mab(macagno等人,j virol,84:1005-1013,2010；falk等人.,j infect dis,218:876-885,2018；nokta等人,antiviral res,24:17-26,1994)。其中，msl-109和13h11靶向hcmv三聚体和五聚体复合物中的gh，并且能够广泛中和hcmv(nokta等人,antiviral res,24:17-26,1994)。此处，hcmv三聚体ghglgo-13h11-msl-109复合物的新结构将两个fab的fv区域和它们在gh上的对应表位解析为高分辨率(图1a、图3a和图8g)。
[0259]
13h11和msl-109结合在gh的扭结c末端区域的相对面上。使用重链和轻链，13h11识别出大面积的gh dii-diii结构域(图3b和图3c)。具体而言，13h11重链通过极性相互作用与gh dii结构域上的残基r223、d241、d243结合(图3b，图1)。13h11的轻链与gh-dii结构域上的r329、l218和t387残基以及gh-diii结构域上的残基s553、s556、h530和e576建立极性接触(图3b，图2和图3)。与13h11相比，msl-109利用其重链识别gh的跟部区域，以识别相对较小面积的diii-div结构域。msl-109相互作用涉及其cdr与gh-diii和div结构域的残基w167、m168、p170和d445之间的极性接触。值得注意的是，msl-109接触的残基与逃逸突变位置(w167c/r、p170s/h和d445n)相同，这些位置是通过在次优msl-109抗体浓度下在上皮细胞或成纤维细胞中使hcmv vr1814病毒生长而分离的(fouts等人,proc natl acad sci u s a,111:8209-8214,2014)。新建立的结构，包括gh上的fab接触区域，显著扩展了之前通过质谱方法表征的13h11和msl-109表位的知识(ciferri等人,plos pathog,11:e1005230,2015)(图10)。
[0260]
实例4.go的结构揭示了新折叠
[0261]
go的结构代表最神秘的hcmv糖蛋白之一，因为它的氨基酸序列与任何先前公布的结构都不能很好地比对。在实例1中描述的冷冻em结构中，go采用爪状形状，其包含一个n末端结构域和一个c末端结构域(图4a)。n末端球状结构域由五个β链组成，而c末端结构域主要是α-螺旋。值得注意的是，c末端结构域的中央四个α螺旋与经典的细胞因子折叠具有高度的结构相似性，最接近的成员是flt3(图4a-4c)。
[0262]
go的两个结构域通过由cys
167-cys
218
和cys
149-cys
141
介导的两个双硫键保持在一起(图4d)，并且在穿过包括cys
343
(go)-cys
167
(gl)之间的二硫化物的go亚单元的一个对角平面上对齐。go中的全部半胱氨酸在全部hcmv菌株中都是保守的，从而表明该组织可能对hcmv三聚体的功能很重要，并且可能用于受体识别。hcmv亚单元一级序列的综合生物信息学序列分析表明，go是保守程度最低的包膜糖蛋白之一，其保守程度等于81％(foglierini等人,front microbiol,10:1005,2019)。值得注意的是，将go保守性映射至新建立的结构上表明，尽管go的整体保守性低于其他hcmv蛋白，但实际上在go的高度保守的两个结构域上都存在大的表面补片(图4e)。go的静电表面分析鉴定了包含n末端结构域和c末端结构域
的大的区域，其富含正电荷(图4f)。该区域与保守的go表面重叠(图4e-4f)。值得注意的是，go亚单元上的糖基化位点分布不均，并且仅聚集在三聚体的一个表面上，而go的一个面则完全未修饰(图4g)。go的此保守的、带电的和无糖基化表面被预测为参与受体结合的主要区域。
[0263]
实例5.三聚体与pdgfrα建立多重接触
[0264]
pdgfrα最近被鉴定为病毒进入成纤维细胞所需的hcmv三聚体的受体(martinez-martin等人,cell,174:1158-1171e19,2018；kabanova等人,nat microbiol,1:16082,2016；wu等人,plos pathog,13:e1006281,2017；wu等人,proc natl acad sci u s a,115:e9889-e9898,2018)，但pdgfrα识别的结构基础仍然未知。值得注意的是，hcmv三聚体以高亲和力和高选择性结合至pdgfrα，因为它不结合至密切相关的pdgfrβ或iii类受体酪氨酸激酶(rtk)或相关的vegf受体(flt1、kdr、flt4)的其他成员(图5a)。这些与所选择的人类受体蛋白的相互作用数据来自之前公布的细胞表面受体发现平台结果(图5a)(martinez-martin等人,cell,174:1158-1171e19,2018)。iii类rtk的成员包括pdgfrα、pdgfrβ、kit、fms和flt3，其中这些受体的架构由五个细胞外ig结构域区段(d1-d5结构域)、一个短跨膜结构域和一个细胞内激酶结构域组成(图5b)。将hcmv三聚体与fab 13h11/msl-109和pdgfrαd1-d5胞外区域重建在复合物中，并且使用冷冻em确定其结构(图11a)，总体分辨率为(图5c和图11a-11g)。冷冻em图的高分辨率允许构建大部分hcmv三聚体-13h11-msl109复合物和pdgfrαd1-d3结构域的氨基酸序列(图11e-11f和图5c-5d)。pdgfrαd4和d5结构域的密度非常弱，可能是由于没有与hcmv三聚体直接接触。或许，pdgfrα受体相互作用可能会在三聚体上传播构形变化，以启用或禁用其他hcmv糖蛋白(例如融合前gb)的结合。然而，当比较pdgfrα结合之前或之后的结构时，观察到几乎相同的三聚体构形(图12d)，表明不同的机制可能是hcmv融合机制活化的原因。
[0265]
当结合至三聚体时，pdgfrαd1-d3采用类似于先前确定的pdgfrβ结构和iii类rtk的其他d1-d3结构域的扭结构形(图12a)。pdgfrα与pdgfrβ(在与pdgf复合物中确定)之间的个体d1-d3结构域的结构比较证实了两种受体之间的高度相似性(rmsd介于之间，图12b)。然而，沿d2结构域排列的pdgfrα和pdgfrβd1-d3结构域的比较显示出，两种结构之间的d3结构域的相对旋转为≈105
°
，而d1的位置基本没有变化(图12c)。
[0266]
pdgfrαd1-d3结构域在跨越go和gh的n末端的四个主要保守表面处建立了广泛的相互作用(位点1-4；图5d-5f和表3)。具体而言，第一个主要相互作用表面(位点1)涉及gh的n末端和链d1-b与d1-c之间以及链d1-d与d1-e之间的pdgfrαd1的环区域(图5d和图12e)。在位点1，pdgfrαe52分别与gh r47以及pdgfrαs78和l80接触残基gh n85和y84形成盐桥(图5d和图12e)。位点2具有静电性质，在pdgfrαd1-f与d1-g(e108和e109)之间的延伸环中具有两条酸性侧链，这些侧链结合至go的n末端结构域和c末端结构域之间的碱性凹槽(图5d和图12e)。在位点3，pdgfrαd2结构域(m133、l137、i139、l208、y206)的疏水残基朝向go的n末端区域的疏水凹槽(图5d)。位点4涉及pdgfrαd3结构域的链d上的e263和k265，以与go上的r336、y337和n358建立带电和极性相互作用(图5d，位点4)。值得注意的是，该四个主要相互作用位点中每一者的细微但独特的侧链差异可能共同使三聚体与pdgfrα结合但不与pdgfrβ结合的高度特异性合理化(图12e)。pdgfrα以低毫微摩尔亲和力结合至三聚体(表2和图5g-5h)，与该结构中观察到的四个大接触位点一致。有趣的是，旨在向gh或go中的每个个体
位点添加庞大的n连接聚糖的突变的引入并未显著减少pdgfrα与三聚体的结合(表2和图5g-5h)。然而，n-聚糖引入突变的组合或在所有四个位点引入电荷突变几乎完全消除了pdgfrα与三聚体之间的相互作用(图5g)。因此，三聚体与pdgfrα之间广泛的相互作用界面由许多高度保守的残基组成，这些残基通过pdgfrα的结合促进了三聚体与成纤维细胞表面的高亲和力和高选择性结合。表3示出了参与hcmv ghglgo三聚体与pdgfrα结合的残基。
[0267]
表2.hcmv ghglgo三聚体与pdgfrα-fc野生型或单位点突变的结合亲和力。
[0268]
pdgfrαkd(m)wt2.25
×
10-9
±
1.1位点11.65
×
10-8
±
0.1位点22.70
×
10-9
±
2.1位点32.15
×
10-8
±
0.1位点44.65
×
10-9
±
3.1
[0269]
单位点点突变(位点1：e52n、e54s；位点2：e108n、n110s；位点3：e208n、s210s；位点4：e263n、k265s)。kd，解离常数；wt，野生型。
[0270]
表3.参与hcmv ghglgo三聚体与pdgfrα结合的残基
[0271]
[0272][0273]
蛋白表达和纯化
[0274]
将人类pdgfrα(1-528)的优化编码dna克隆至cmv启动子后面的prk载体中。将c末端人类igg1(fc)标签添加至pdgfrα构建体。将悬浮的expi293细胞在smm 293t-i培养基中在5％ co2下于37℃培养，并且当细胞密度达到每毫升4
×
106个细胞时，使用聚乙烯亚胺(pei)与dna以1:1:1的比率进行转染以用于ghglgo表达。在收获表达上清液之前，将转染的细胞培养7天。
[0275]
在c末端具有五个氨基酸的pdgfrα(1-524)(ddddk)(sino biological)用于冷冻em样品制备和体外竞争实验。将冻干粉重新悬浮在ddh2o中，在超离心过滤装置(30kda mwco)中浓缩，并且在用hcmv三聚体ghglgo和中和fab重构之前在pdgfrα-sec缓冲液(25mm hepes(ph 7.5)，250mm nacl)中平衡的superose 6 3.2/300柱上纯化。
[0276]
用pdgfrα和中和fab重构hcmv ghglgo三聚体
[0277]
通过将5μm(83.3μg)ghglgo与过量的6μm(33.3μg)pdgfrα以及各自为18μm(50μg)的fab 13h11和msl-109在冰上培育至少30分钟来组装pdgfrα-ghglgo-13h11-msl-109复合物。通过在于sec-reconst-2缓冲液(25mm hepes(ph 7.5)，300mm nacl)中平衡的superose 6 3.2/300柱上纯化，去除过量的fab。合并ghglgo-13h11-msl-109的主峰级分并且浓缩至0.5mg/ml，用于冷冻em样品制备。
[0278]
生物膜干涉技术
[0279]
通过生物膜干涉技术使用octet red系统来分析pdgfrα蛋白与cmv三聚体之间的相互作用。将重组pdgfrα蛋白捕获至抗人fc包被的传感器(forte pall)上，并且测试与作
为可溶性分析物的cmv三聚体的结合，在pbs中进行测定。使用forte pall软件版本9.0获取数据。为了比较wt三聚体与pdgfrαwt和突变蛋白之间的相对结合，在50nm或100nm浓度下测定三聚体，并且绘制缔合结束时的结合单元。在传感器上捕获低含量的pdgfrα蛋白，用于估计结合动力学。使用octet red仪器获取数据，随后使用biaevaluation软件版本4.1(ge healthcare)计算动力学参数。
[0280]
冷冻em样品制备和数据采集
[0281]
将pdgfrα-ghglgo-13h11-msl-109复合物如所述按以下方式制备。将多孔碳网格(c-flat 45nm r 1.2/1.3 300目，涂有au/pd 80/20；protochips)使用solarus等离子清洗仪(gatan)辉光放电10秒。将该复合物在室温下与0.025％ em级戊二醛温和交联10分钟并且用9mm tris(ph7.5)淬灭。将3μl样品(现在为约0.4mg/ml)施加至网格。以vitrobot mark iv(thermofisher)使用2.5秒的印迹时间在100％的湿度下印迹网格，并且在液氮冷却的液态乙烷中进行快速冷冻。
[0282]
冷冻em数据处理
[0283]
将pdgfrα-ghglgo-13h11-msl-109复合物以与实例1中针对ghglgo-13h11-msl-109复合物的描述类似的方式进行处理。从两个网格中收集了总计34,829部影片，使用relion的motioncor2(zheng等人nat methods,14(4):331-332,2017)实现方式校正帧运动，并且使用ctffind-4(rohou和grigorieff,j struct biol.,192(2):216-2,2015)光谱的波段拟合对比转移函数参数。根据检测到的拟合分辨率好于对ctf拟合图像进行滤波。使用低通滤波的ghglgo-13h11-msl-109复合物参考结构，通过与gautomatch(mrc laboratory of molecular biology)模板匹配挑选出总计4,151,085个颗粒。在relion 2d分类期间对颗粒进行分类，并且将所选择的3,560,620个颗粒导入cistem进行3d细化。pdgfrα-ghglgo-13h11-msl-109 3d重建是在使用遮罩、通过在遮罩外应用低通滤波器(lpf)(滤波器分辨率)和0.25的得分阈值进行自动细化和手动细化后获得的。因此，在迭代轮次的手动细化中，外部重量从0.5逐渐减少到0.15。3d重建收敛至的图分辨率(傅里叶壳层相关(fsc)＝0.143，在cistem中确定)。为了提高图的质量，在使用遮罩将图划分为三个不同的区域和在遮罩外使用低通滤波器(lpf)手动细化后，获得了集中细化，如上所述。聚焦图在cistem中锐化，并且使用phenix组合，如上文实例1所述。
[0284]
模型构建和结构分析
[0285]
pdgfrβ的结构(pdb：3mjg)用作pdgfrαd1-d3建模的模板。模型构建和结构分析如实例1中所述进行。
[0286]
实例6.tgfβr3在gh、gl和go之间的界面处结合
[0287]
hcmv向性进入所有细胞类型，包括内皮细胞和上皮细胞，需要三聚体(zhou等人,j virol,89:8999-9009,2015；wille等人,mbio,4:e00332-13,2013；ryckman等人,j virol,82:60-70,2008)。此要求表明三聚体可能通过与多种受体直接相互作用而直接促成hcmv宿主细胞向性。因此，tgfβr3最近被鉴定为三聚体的高亲和力结合剂和假定的hcmv受体(martinez-martin等人,cell,174:1158-1171e19,2018)。tgfβr3糖蛋白是tgf-β信号传导通路受体超家族的成员，在介导大多数人体组织中的细胞增殖、凋亡、分化和细胞迁移中起
重要作用(zhang等人,cold spring harb perspect biol,9:a022145,2017)。tgfβr3的胞外结构域由两个n末端膜远侧孤儿结构域(od2和od1)和膜近侧透明带(zp)结构域构成(kim等人,structure,27:1427-1442e4,2019)。每个od包含两个β夹心结构域，而zp结构域采用经典的免疫球蛋白样折叠(图6b)(lin等人,proc natl acad sci u s a,108:5232-5236,2011)。尽管tgfβr3与tgfβr1、tgfβr2或内皮糖蛋白之间存在同源性，但未观察到这些额外蛋白与hcmv三聚体之间的结合(图6a)(martinez-martin等人,cell,174:1158-1171e19,2018)，其之前发表在cell-surface receptor discovery platform结果中。
[0288]
表4.参与hcmv ghglgo三聚体与tgfβr3结合的残基
[0289][0290]
为了通过三聚体获得对tgfβr3识别的直接结构见解，重构了tgfβr3的化学计量复合物，其含有od和zp结构域以及hcmv三聚体和fab 13h11和msl-109，并且使用冷冻em来确定结构，总体分辨率为总体分辨率为(图6c-6g和图13a-13f)。由于三聚体与pdgfrα的ig样d1-d3结构域缔合，因此预计tgfβr3的结合将通过其ig样结构域发生。出乎意料的是，新揭示的结构表明，tgfβr3专门利用od2结构域在三个主要位点处与go和gl上的保守残基结合(图6d-6g和表4)，而tgfβr3 od1结构域的密度似乎很弱，显然是由于没有与三聚体直接接触。tgfβr3od1未与hcmv三聚体进行特异性接触，在冷冻em图中不良解析，并且未在结构中建模。值得注意的是，tgfβr3的结合不会在三聚体上诱导任何主要的结构重排(图13g)，类似于对pdgfrα观察到的。
[0291]
人类tgfβr3 od2结构域包含10个β链和两个α螺旋，一个在β6与β7之间(α1)，并且另一个在β7与β8之间(α2)(图13h)，并且两个螺旋周围的区域与hcmv三聚体进行了关键接触。具体而言，tgfβr3利用围绕α1区域的环状结构在go的n末端结构域处分别与s
143
羰基和q
136
侧链形成氢键连接至go侧链k
118
和r
117
(位点1，图6g和图13h)。tgfβr3 f
137
与go l
116
之间的疏水接触进一步支持了位点1处的相互作用(图6g，位点1)。在位点2，链β7b处的tgfβr3 r
151
与go y
188
形成pi堆栈相互作用，并且氢键合至gl n
97
(图6g，位点2)。在位点3，α2处的tgfβr3 w
163
和k
166
的羰基分别与gl侧链e
94
和t
92
形成氢键(图6g，位点3)。
[0292]
tgfβr3和内皮糖蛋白(endoglin)的od2结构域在结构上高度相似(图6h)。详细的视图，尤其是在位点1和2的关键相互作用区域处，揭示了内皮糖蛋白(endoglin)od2结构域在α1处缺乏环状结构，并且在β7b处没有采用β链二级结构(图13h和图6h)。总体而言，具有
对比性质的大量相互作用残基合理化了tgfβr3与hcmv三聚体之间的强相互作用，并且在位点1和位点2处与内皮糖蛋白(endoglin)的关键差异提供了对tgfβr3-三聚体相互作用的高特异性和选择性的解释。
[0293]
蛋白表达和纯化
[0294]
将人类tgfβr3(1-787)的优化编码dna克隆至cmv启动子后面的prk载体中。将c末端flag标签添加至tgfβr3构建体中。将悬浮的expi293细胞在smm 293t-i培养基中在5％ co2下于37℃培养，并且当细胞密度达到每毫升4
×
106个细胞时，使用聚乙烯亚胺(pei)与dna以1:1:1的比率进行转染以用于ghglgo表达。在收获表达上清液之前，将转染的细胞培养7天。
[0295]
从10l表达上清液中纯化人类tgfβr3-flag。将上清液与10ml m2琼脂糖flag树脂(sigma)一起培育，并且在4℃培育20小时。将树脂用10cv flag洗涤缓冲液(30mm hepes(ph 7.5)、300mm nacl、5％甘油)洗涤，并且用补充有0.2mg/ml flag肽的flag洗涤缓冲液洗脱。将洗脱液用超离心过滤装置(30kda mwco)浓缩，并且加载于在tgfβr-sec-1缓冲液(30mm hepes(ph 7.5)、300mm nacl、5％甘油)中平衡的superdex 200 10/60柱上。
[0296]
带有c末端his标签(sino biological)的tgfβr3(1-781)用于冷冻em样品制备。将冻干粉重新悬浮在ddh2o中，在超离心过滤装置(30kda mwco)中浓缩，并且在用hcmv三聚体ghglgo和中和fab组装之前在tgfβr-sec-2缓冲液(25mm hepes(ph 7.5)、200mm nacl)中平衡的superdex 200 3.2/300柱上纯化。
[0297]
用人类tgfβr3和中和fab重构hcmv ghglgo三聚体
[0298]
通过将7.6μm(85.5μg)ghglgo与过量的9.2μm(54μg)tgfβr3以及22.6μm(78μg)的fab 13h11和61μm(210μg)的msl-109在冰上培育至少30分钟来组装tgfβr3-ghglgo-13h11-msl-109复合物。通过在于sec-reconst-2缓冲液(25mm hepes(ph 7.5)，300mm nacl)中平衡的superose 6 3.2/300柱上纯化，去除过量的fab。合并ghglgo-13h11-msl-109的主峰级分并且浓缩至0.5mg/ml，用于冷冻em样品制备。
[0299]
冷冻em样品制备和数据采集
[0300]
将tgfβr3-ghglgo-13h11-msl-109复合物按以下方式制备。使用solarus等离子清洗仪(gatan)将多孔碳网格(ultrafoil 25nm au r 1.2/1.3300mesh；quantifoil)辉光放电10秒。将3μl样品施加至网格上，并且使用leica em gp(leica)使用3.5秒的印迹时间在100％湿度下进行单面印迹，并且在由液氮冷却的液态乙烷中快速冷冻。
[0301]
将tgfβr3-ghglgo-13h11-msl-109复合物以与上文实例1中对ghglgo-13h11-msl-109复合物的描述类似的方式进行处理。使用relion的motioncor2(zheng等人nat methods,14(4):331-332,2017)实现方式校正总计19,993部影片的帧运动，并且使用ctffind-4的光谱的波段拟合对比转移函数参数(rohou和grigorieff,j struct biol,.192(2):216-2,2015)。使用低通滤波的ghglgo-13h11-msl-109复合物参考结构，通过与gautomatch模板匹配挑选出总计2,780,519个颗粒。在relion 2d分类期间对颗粒进行分类，并且将所选择的2,780,519个颗粒导入cistem进行3d细化。tgfβr3-ghglgo-13h11-msl-109 3d重建是在使用遮罩、并且通过在遮罩外应用低通滤波器(lpf)(滤波器分辨率)和0.25的得分阈值进行自动细化和手动细化后获得的。因此，在迭代轮次的手
动细化中，外部重量从0.5逐渐减少到0.15。3d重建收敛至的图分辨率(傅里叶壳层相关(fsc)＝0.143，在cistem中确定)。为了提高图的质量，在使用遮罩将图划分为两个不同的区域和在遮罩外使用低通滤波器(lpf)手动细化后，获得了集中细化，如上所述。聚焦图在cistem中锐化，并使用如上所述的phenix组合。使用内部重新实现的blocres算法(cardone等人2013)在cistem中确定局部分辨率。
[0302]
模型构建和结构分析
[0303]
斑马鱼tgfβr3的结构(pdb:6mzn)用作人类tgfβr3 od2建模的模板。模型构建和结构分析如实例1中所述进行。
[0304]
实例7.pdgfrα和tgfβr3竞争hcmv三聚体结合
[0305]
hcmv三聚体能够以高亲和力结合至存在于不同受体上的两种完全不同的结构域架构：pdgfrα的ig样d1-d3结构域和tgfβr3的od2结构域(图5和图6)。尽管两种受体都在三聚体的膜远侧区域处相互作用，但pdgfrα和tgfβr3跨越不同的相互作用表面结合至三聚体(图5e和图6e)。尽管如此，三聚体-pdgfrα和三聚体-tgfβr3复合物结构的叠加表明这些受体在gh、gl和go之间的界面处共享一个部分重叠的结合位点，并且因此不能同时结合三聚体(图7a)。此外，发现pdgfrαn
179
上的n连接的聚糖链指向tgfβr3结合位点的方向，这可能进一步限制同时受体结合(图7a)。
[0306]
为了测试pdgfrα和tgfβr3与三聚体结合是相互排斥的假设，通过将与tgfβr3结合的hcmv三聚体与等摩尔量的pdgfrα一起培育来进行竞争实验(图7b和图14)。结果表明pdgfrα可以完全替代结合的tgfβr3(图7b)，与报导的hcmv三聚体与pdgfrα之间的亲和力高于tgfβr3一致(martinez-martin等人,cell,174:1158-1171e19,2018)。综上所述，这些结构和生物物理数据表明pdgfrα和tgfβr3不作为共同受体发挥作用，而是更有可能作为独立受体介导hcmv向性。
[0307]
pdgfrα和tgfβr3与hcmv三聚体ghglgo的结合竞争实验
[0308]
hcmv三聚体ghglgo、pdgfrα和tgfβr3单独或ghglgo+pdgfrα、ghglgo+tgfβr3或ghglgo+pdgfrα+tgfβr3的组合以3μm的浓度在sec竞争缓冲液(25mm hepes(ph 7.5)，300mm nacl)中在冰上共培育至少60分钟，并且加载至在sec竞争缓冲液中平衡的superose 6 3.2/300柱上。
[0309]
实例8.hcmv三聚体与生长因子pdgf竞争结合至pdgfrα
[0310]
在实例4-6中，三聚体、三聚体-pdgfrα和三聚体-tgfβr3的冷冻em结构揭示了参与受体结合的三聚体上功能重要并且高度保守的表面，以及有效中和抗体的可能靶标(图4、图5和图6)。因此，研究了三聚体与pdgfrα的相互作用是否可能干扰关键的细胞信号传导通路。对于pdgfrα，pdgf生长因子的结合使受体二聚化并且活化细胞内激酶结构域以诱导信号传导级联反应(shim等人,proc natl acad sci u s a,107:11307-11312,2010)。三聚体-pdgfrα复合物与二聚体(信号传导活性)pdgfrα-pdgf复合物的同源模型的结构叠加显示出在pdgfrαd2和d3相互作用界面处的go和pdgf的多重空间冲突(图7c和图12e)。鉴于三聚体与pdgfrα在低毫微摩尔亲和力下的强相互作用(kabanova等人,nat microbiol,1:16082,2016)(表2)以及通过三位数的毫微摩尔亲和力表征的pdgf-aa对pdgfrα的中等结合亲和力(mamer等人,sci rep,7:16439,2017)，测试了三聚体可以与pdgf竞争结合至pdgfrα并且由此防止信号传导级联的诱导的假设。为了测试该假设，首先纯化了hcmv三聚体，并且
在go处发生电荷突变(三聚体
突变
；位点2-4：m84r、f111r、r117e、f136r、r212e、r230e、r234e、r336e、f342e、a351r、n358r)，并且观察到与pdgfrα的体外结合减少约10,000倍(kd
三聚体-wt
：2.25x10-9
+/-1.1m相对于kd
三聚体-突变
：4.25x10-5
+/-0.5m)(图7d)。接下来，通过检测自磷酸化pdgfrα残基y
762
和y
849
以及磷酸化akt作为下游底物，在添加pdgf-aa和三聚体
wt
或三聚体
突变
后评估mrc-5成纤维细胞中的pdgfrα活化和信号传导。尽管pdgf-aa单独在pdgfrα和akt处诱导强活化信号，但三聚体
wt
的滴定强烈降低了pdgf-aa诱导的pdgfrα活性(图7e)。相反，在pdgf-aa存在的情况下，添加pdgfrα结合缺陷型三聚体
突变
不会降低pdgfrα的活性(图7e)。因此，hcmv三聚体直接与pdgf-aa竞争结合至pdgfrα并且干扰pdgfrα信号传导，这是设计有效并且安全的基于三聚体的抗病毒策略的重要考虑因素。
[0311]
pdgfrα活化和信号传导
[0312]
成纤维细胞是mrc-5用于研究受体磷酸化和下游信号传导。将mrc-5在补充有10％ fbs、谷氨酰胺和抗生素的rpmi培养基中生长。将细胞在37℃和5％ co2下培养。将细胞接种在m6孔板中，生长至约75％汇合度并且在刺激前饥饿过夜。在测定当天，用pdgf-aa(3.7nm浓度)、cmv三聚体或pdgf-aa:cmv三聚体以增加的摩尔比刺激细胞。将刺激在37℃在无血清培养基中进行10分钟。处理后，将细胞用冷pbs洗涤并且裂解(裂解缓冲液：50mm tris hcl(ph 7.4)、150mm nacl、2mm edta、1％(v/v)np40，补充有蛋白酶(roche)和磷酸酶抑制剂(sigma))。使用变性条件在上样缓冲液(thermo fisher scientific)中稀释样品，并且使用仪器通过蛋白印迹进行分析。
[0313]
抗体和重组蛋白
[0314]
这些实例中使用的所有一抗都购自cell signaling用于检测的二抗购自biosciences。全部抗体都按制造商推荐的稀释度使用，并且培育过夜(一抗)或在室温下进行1小时(li-抗体)。
[0315]
用于细胞刺激的人类pdgf-aa购自stemcell
tm
technologies。全部其他重组蛋白都是在内部生产。
[0316]
结论
[0317]
这些实例展示了hcmv三聚体的结构，这些结构揭示了对三聚体复合物的架构、广泛中和抗体的结合、三聚体介导的hcmv受体相互作用的机制以及对细胞信号传导通路的影响的前所未有的见解。这些结果对基于三聚体的疫苗和抗病毒疗法的设计具有重要意义。
[0318]
重要的是，这些实例直接表明go的无聚糖表面可能成为开发新广泛中和抗体的靶标。此外，阻断三聚体与pdgfrα和tgfβr3的相互作用还将为针对hcmv进入提供新的策略。值得注意的是，三聚体在多个相互作用位点与pdgfrα和tgfβr3进行广泛接触，并且试图破坏单个位点处的结合完全未能消除pdgfrα结合(图5)。相反，证明了go中的多个相互作用位点，并且需要同时靶向以阻断hcmv三聚体与pdgfrα的相互作用(图5g)。因此，在go上具有足够大相互作用面积的广泛中和抗体，包括例如多特异性(例如，双特异性)抗体，可用于取代pdgfrα和tgfβr3受体蛋白两者的相互作用。替代性地，为了开发抗病毒疗法，可以利用pdgfrα的d1-d3结构域来阻断三聚体与内源性宿主受体的结合。

技术特征：
1.一种人巨细胞病毒(hcmv)ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，所述调节剂结合至所述go亚单元的无糖基化表面并使得所述go亚单元与pdgfrα的结合减少。2.根据权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂结合至：(a)所述go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个；(b)所述go亚单元的残基n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个或多个；以及(c)所述go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个。3.一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，所述调节剂结合至：(a)所述go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个；(b)所述go亚单元的n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123；以及(c)所述go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个；并且使得所述go亚单元与pdgfrα的结合减少。4.根据权利要求2或3所述的调节剂，其中所述调节剂结合至所述go亚单元的残基r230、r234、v235、k237、y238、n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121、v123、r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的全部23个。5.根据权利要求1至4中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂进一步结合至hcmv的gh亚单元的残基r47、y84和n85中的一个或多个。6.根据权利要求1至5中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸。7.根据权利要求6所述的调节剂，其中所述抑制性核酸为aso或sirna。8.根据权利要求6所述的调节剂，其中所述抗原结合片段为双-fab、fv、fab、fab'-sh、f(ab')2、双体抗体、线性抗体、scfv、scfab、vh结构域或vhh结构域。9.根据权利要求6所述的调节剂，其中所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。10.根据权利要求9所述的调节剂，其中所述双特异性抗体或多特异性抗体结合至所述go亚单元的至少三个不同的表位。11.根据权利要求10所述的调节剂，其中所述至少三个不同的表位包括：(a)第一表位，其包含所述go亚单元的残基r230、r234、v235、k237和y238中的一个或多个；(b)第二表位，其包含所述go亚单元的残基n81、l82、m84、m86、f109、f111、t114、q115、r117、k121和v123中的一个或多个；以及(c)第三表位，其包含所述go亚单元的残基r336、y337、k344、d346、n348、e354和n358中的一个或多个。12.根据权利要求6所述的调节剂，其中所述调节剂为pdgfrα的模拟物。13.一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，所述调节剂结合至pdgfrα的d1(seq id no:11)、d2(seq id no:12)和d3(seq id no:13)结构域并且使得所述go亚单元与pdgfrα的结合减少。14.根据权利要求13所述的调节剂，其中所述调节剂结合至：
(a)pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个；(b)pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个；以及(c)pdgfrα的残基n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个。15.一种hcmv ghglgo三聚体的go亚单元与pdgfrα之间的相互作用的调节剂，所述调节剂结合至：(a)pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个；(b)pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个；以及(c)pdgfrα的残基n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个；并且使得所述go亚单元与pdgfrα的结合减少。16.根据权利要求14或15所述的调节剂，其中所述调节剂结合至pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108、e109、m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206、l208、n240、d244、q246、t259、e263和k265中的全部19个。17.根据权利要求13至16中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂进一步结合至pdgfrα的残基e52、s78和l80中的一个或多个。18.根据权利要求13至17中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸。19.根据权利要求18所述的调节剂，其中所述抑制性核酸为aso或sirna。20.根据权利要求18所述的调节剂，其中所述抗原结合片段为双-fab、fv、fab、fab'-sh、f(ab')2、双体抗体、线性抗体、scfv、scfab、vh结构域或vhh结构域。21.根据权利要求18所述的调节剂，其中所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。22.根据权利要求21所述的调节剂，其中所述双特异性抗体或多特异性抗体结合至pdgfrα的至少三个不同的表位。23.根据权利要求22所述的调节剂，其中所述至少三个不同的表位包括：(a)第一表位，其包含pdgfrα的残基n103、q106、t107、e108和e109中的一个或多个；(b)第二表位，其包含pdgfrα的残基m133、l137、i139、e141、i147、s145、y206和l208中的一个或多个；以及(c)第三表位，其包含pdgfrα的残基n240、d244、q246、t259、e263和k265中的一个或多个。24.根据权利要求18所述的调节剂，其中所述调节剂为所述hcmvghglgo三聚体的所述go亚单元的模拟物。25.根据权利要求1至24中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂使所述hcmv ghglgo三聚体的所述go亚单元与pdgfrα的结合减少至少50％。26.根据权利要求25所述的调节剂，其中所述调节剂使hcmv三聚体的所述go亚单元与pdgfrα的结合减少至少90％。27.根据权利要求1至26中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂使所述hcmv ghglgo三聚体的所述go亚单元与tgfβr3的结合减少至少50％。28.根据权利要求25至27中任一项所述的调节剂，其中通过表面等离子体共振、生物膜
干涉技术或酶联免疫吸附测定(elisa)来测量结合的减少。29.根据权利要求1至28中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂与pdgfrα的触发下游信号传导的区域具有最小的结合。30.根据权利要求1至28中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂不结合至pdgfrα的触发下游信号传导的区域。31.根据权利要求29或30所述的调节剂，其中pdgfrα的触发下游信号传导的所述区域为pdgf的结合位点。32.根据权利要求1至31中任一项所述的调节剂，其中与不存在所述调节剂的情况下的信号传导相比，所述调节剂使得通过pdgfrα的信号传导减少小于20％。33.根据权利要求32所述的调节剂，其中与不存在所述调节剂的情况下的信号传导相比，所述调节剂不使得通过pdgfrα的信号传导减少。34.根据权利要求1至33中任一项所述的调节剂，其中相对于不存在所述调节剂的情况下的感染，所述调节剂使得hcmv对细胞的感染减少。35.根据权利要求34所述的调节剂，其中如在使用假型颗粒的病毒感染测定或病毒进入测定中所测量，感染减少至少40％。36.根据权利要求1至35中任一项所述的调节剂，其进一步包含药用载体。37.一种用于治疗个体中的hcmv感染的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至36中任一项所述的调节剂，从而治疗所述个体。38.根据权利要求37所述的方法，其中相对于未施用所述调节剂的个体，hcmv感染的持续时间或严重程度减少至少40％。39.一种用于防止个体中的hcmv感染的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的根据权利要求1至36中任一项所述的调节剂，从而防止所述个体中的hcmv感染。40.一种针对个体中的继发性hcmv感染的预防的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至36中任一项所述的调节剂，从而防止所述个体中的继发性hcmv感染。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述继发性感染为未经感染组织的hcmv感染。42.根据权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述个体为免疫功能不全的、为怀孕的或者为婴儿。

技术总结
本文提供了治疗或防止人巨细胞病毒(HCMV)感染的方法，所述方法包括调节HCMV gHgLgO三聚体与质膜表达的宿主细胞蛋白之间的相互作用；以及鉴定此类相互作用的调节剂的方法。方法。方法。


技术研发人员：C
受保护的技术使用者：基因泰克公司
技术研发日：2021.11.26
技术公布日：2023/8/24