双单倍体诱导物的制作方法

1.本公开涉及植物分子生物学和植物育种领域。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2020年10月21日提交的美国临时申请号63/094,830的优先权，将其通过引用以其全文并入本文。
4.以电子方式提交的序列表的引用
5.该序列表的官方副本经由efs-web作为ascii格式的序列表以电子方式提交，文件名为20211010_8536-wo-pct_st25，创建于2021年10月10日，且具有1,131,526字节大小，并与本说明书同时提交。包含在此ascii格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其全文并入本文。


背景技术：

6.植物育种计划通过筛选众多植物以鉴定具有希望特征的个体来鉴定新品种。典型地，理想地跨多年和多种环境培养和评估来自杂交的大量子代，以选择具有最希望的特征的植物。
7.典型的育种方法使两种亲本植物杂交，并且子代1杂交体(f1杂交体)是第一杂交世代。当来自不同杂合组的两种亲本株(典型地近交株)杂交时，观察到商业f1杂交体中的杂交体活力。杂交体活力(由于组合了其亲本的遗传贡献而产生的任何生物品质的改善的或增加的功能)对于商业玉蜀黍种子生产是重要的。商业杂交性能的改善需要持续开发新的近交亲本系。
8.玉蜀黍近交系开发方法可以使用母本(产生雌性特征的)双单倍体生产，其中从第一代杂交产生的植物的雌穗(已经用来自所称的“单倍体诱导物”系的花粉受精)受精后，选择母本单倍体胚。与同时继承母本和父本基因组的拷贝相反，用单倍体诱导物系(花粉供体)的花粉对雌花进行授粉导致仅含有单倍体(1n)母本基因组的胚珠水平升高，因此产生母本单倍体胚。雌花内的胚珠是减数分裂的产物，并且每个母本胚珠都是独特的减数分裂重组单倍体基因组，从而允许使用包括染色体加倍处理在内的体外组织培养方法分离和处理未成熟的母本单倍体胚，以使得快速生成包含成对母本染色体的母本双单倍体(2n)重组群体成为可能。通过用来自玉蜀黍单倍体诱导物系的花粉对目标植物受精产生的许多玉蜀黍母本单倍体胚无法再生为可育的、双单倍体植物，并且如果有的话，也很少有体外组织培养和小植株再生方法会从一个单倍体胚繁殖出多个可育植物。此外，母本单倍体胚产生具有单倍体、二倍体和/或多倍体细胞混合物、产生少量种子的混倍体植物。这种混倍性阻碍了对这些植物的初步表型评估。此外，母本单倍体胚的分离需要大量劳动且耗时。一些化学加倍剂在一定浓度下对哺乳动物细胞有害。因此，需要改善生产来自玉蜀黍中母本配子双单倍体的双单倍体植物的方法。
9.因此，植物育种者还将受益于开发重组近交系群体的方法，这些重组近交系不需要大量授粉控制方法或不需要延长将自体受精系繁殖为等基因态所需的时间。


技术实现要素：

10.本公开提供了生产双单倍体植物的方法，其包括a)提供第一植物，其中该第一植物包含至少一种引入的遗传染色体加倍剂；b)将该第一植物与第二植物杂交，其中在不存在外源性施加的化学或生化染色体加倍剂的情况下，该第一植物的至少一种引入的遗传染色体加倍剂诱导该第二植物的受精卵细胞的染色体加倍；c)获得包含从该第二植物遗传的一对染色体且不包含该引入的遗传染色体加倍剂的二倍体胚；以及d)从该二倍体胚再生二倍体植物。在一方面，第一植物是单倍体诱导物。在一方面，单倍体诱导物包括马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因(patatin-like phospholipase a2αgene)中的功能丧失突变。在一方面，马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变是matrilineal(matl)基因。在一方面，第一植物表达标记基因。在一方面，标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：gus、pmi、pat及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：gfp、rfp、cfp及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：b1、r-nj、r1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，遗传染色体加倍剂是遗传染色体加倍多肽。在一方面，遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的多肽；b)使微管蛋白聚合不稳定的多肽；c)改变细胞周期调控的多肽；以及d)上述的组合。在一方面，允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：24具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；b)与seq id no：25具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；c)与seq id no：26具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或d)与seq id no：2具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，使微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：3具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或b)与seq id no：28具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，改变细胞周期调控的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：23具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；b)与seq id no：86具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；c)与seq id no：87具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；d)与seq id no：88具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；e)与seq id no：89具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；f)与seq id no：90具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；g)与seq id no：91具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；h)与seq id no：92具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；i)与seq id no：93具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；j)与seq id no：94具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；k)与seq id no：95具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；l)与seq id no：96具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；m)与seq id no：97具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；n)与seq id no：98具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；o)与seq id no：99具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％
或98％)同一的氨基酸序列；p)与seq id no：100具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；q)与seq id no：101具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；r)与seq id no：102具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或s)与seq id no：103具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，第一植物是与第二植物不同的植物物种的单倍体诱导物。在一方面，第一植物用于广泛杂交。在一方面，第二植物物种是玉米、大豆、小麦、芸苔、棉花或高粱。在一方面，第二植物物种是非杂交作物物种。
11.本公开提供了生产双单倍体诱导物(dhi)植物的方法，该方法包括a)从非转基因单倍体诱导物植物提供可转化的细胞或组织；b)用包含遗传染色体加倍剂的异源dna构建体转化该细胞或组织；以及c)获得包含引入的遗传染色体加倍剂的双单倍体诱导物(dhi)系。在一方面，非转基因单倍体诱导物包括马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变。在一方面，马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变是matrilineal(matl)基因。在一方面，遗传染色体加倍剂选自由以下组成的组：a)允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的多肽；b)使微管蛋白聚合不稳定的多肽；c)改变细胞周期调控的多肽；以及d)上述的组合。在一方面，允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：24具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；b)与seq id no：25具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；c)与seq id no：26具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或d)与seq id no：2具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，使微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：3具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或b)与seq id no：28具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，改变细胞周期调控的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：23具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；b)与seq id no：86具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；c)与seq id no：87具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；d)与seq id no：88具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；e)与seq id no：89具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；f)与seq id no：90具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；g)与seq id no：91具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；h)与seq id no：92具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；i)与seq id no：93具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；j)与seq id no：94具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；k)与seq id no：95具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；l)与seq id no：96具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；m)与seq id no：97具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；n)与seq id no：98具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；o)与seq id no：99具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；p)与seq id no：100具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；q)与
seq id no：101具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；r)与seq id no：102具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或s)与seq id no：103具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。
12.本公开提供了生产双单倍体诱导物(dhi)系的方法，该方法包括a)提供包含含有遗传染色体加倍剂的异源dna构建体的转化的第一单倍体诱导物系；b)提供含有标记的第二单倍体诱导物系；c)将该第一单倍体诱导物系与该第二单倍体诱导物系杂交以产生母本胚和二倍体胚的组合；d)基于不存在来自该第二单倍体诱导物系的选择性标记来选择母本胚；以及e)获得包含引入的遗传染色体加倍剂的双单倍体诱导物(dhi)系，从而产生该dhi系。在一方面，第一单倍体诱导物包括马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变。在一方面，马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变是matrilineal(matl)基因。在一方面，标记选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：gus、pmi、pat及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：gfp、rfp、cfp及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：b1、r-nj、r1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，遗传染色体加倍剂是遗传染色体加倍多肽。在一方面，遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的多肽；b)使微管蛋白聚合不稳定的多肽；c)改变细胞周期调控的多肽；以及d)上述的组合。在一方面，允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：24具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；b)与seq id no：25具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；c)与seq id no：26具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或d)与seq id no：2具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，使微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：3具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或b)与seq id no：28具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，改变细胞周期调控的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：23具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；b)与seq id no：86具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；c)与seq id no：87具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；d)与seq id no：88具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；e)与seq id no：89具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；f)与seq id no：90具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；g)与seq id no：91具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；h)与seq id no：92具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；i)与seq id no：93具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；j)与seq id no：94具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；k)与seq id no：95具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；l)与seq id no：96具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；m)与seq id no：97具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；n)与seq id no：98具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；o)与
seq id no：99具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；p)与seq id no：100具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；q)与seq id no：101具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；r)与seq id no：102具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或s)与seq id no：103具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。
13.本公开提供了在近交群体生产中消除或减少胚形成后外源诱导染色体加倍的步骤的方法，该方法包括将包含引入的遗传染色体加倍剂的双单倍体诱导物(dhi)系与第二系杂交以及获得第二系的双单倍体子代，而无需由于染色体加倍剂的外源处理而染色体加倍的单独步骤，其中该双单倍体子代不包含该引入的遗传染色体加倍剂。在一方面，双单倍体诱导物包括马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变。在一方面，马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变是matrilineal(matl)基因。在一方面，双单倍体诱导物(dhi)系表达标记基因。在一方面，其中标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：gus、pmi、pat及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：gfp、rfp、cfp及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：b1、r-nj、r1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，引入的遗传染色体加倍剂是遗传染色体加倍多肽。在一方面，遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的多肽；b)使微管蛋白聚合不稳定的多肽；c)改变细胞周期调控的多肽；以及d)上述的组合。在一方面，允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：24具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；b)与seq id no：25具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；c)与seq id no：26具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或d)与seq id no：2具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，使微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：3具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或b)与seq id no：28具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。在一方面，改变细胞周期调控的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：23具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；b)与seq id no：86具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；c)与seq id no：87具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；d)与seq id no：88具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；e)与seq id no：89具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；f)与seq id no：90具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；g)与seq id no：91具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；h)与seq id no：92具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；i)与seq id no：93具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；j)与seq id no：94具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；k)与seq id no：95具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；l)与seq id no：96具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；m)与seq id no：97具有至少70％(例如，至少80％、90％、
95％或98％)同一的氨基酸序列；n)与seq id no：98具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；o)与seq id no：99具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；p)与seq id no：100具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；q)与seq id no：101具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；r)与seq id no：102具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列；或s)与seq id no：103具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一的氨基酸序列。
14.本公开提供了维持包含遗传染色体加倍剂的双单倍体诱导物(dhi)系的方法，该方法包括a)提供包含异源维持构建体的维持系，该维持构建体包含(i)用于遗传染色体加倍剂的阻遏物或抑制剂成分，(ii)花粉传播阻止成分，和(iii)用于鉴定含有该维持构建体的种子的选择性标记成分；b)使具有该维持构建体和该遗传染色体加倍剂的维持系自体受精；c)从自体受精中鉴定含有该维持构建体的种子，其中该维持构建体存在于约50％的f1种子中；以及d)使这些含有维持构建体的种子生长，从而使dhi系维持在二倍体状态，以用于进一步的种子增加或单倍体诱导杂交。在一方面，阻遏物或抑制剂是遗传染色体加倍剂的转录阻遏物。在一方面，阻遏物或抑制剂是靶向遗传染色体加倍剂的转录物的人工微小rna。在一方面，选择性标记是适用于种子分选的基于颜色的标记。在一方面，花粉传播阻止成分是降低花粉活力从而阻止维持构建体通过花粉传播的遗传元件。
15.本公开提供了双单倍体诱导物(dhi)维持系，其包含遗传染色体加倍剂和异源维持构建体，该维持构建体包含(i)用于该遗传染色体加倍剂的阻遏物或抑制剂成分，(ii)花粉传播阻止成分，和(iii)用于鉴定含有该维持构建体的种子的选择性标记成分。在一方面，阻遏物或抑制剂是遗传染色体加倍剂的转录阻遏物。在一方面，阻遏物或抑制剂是靶向遗传染色体加倍剂的转录物的人工微小rna。在一方面，选择性标记是适用于种子分选的基于颜色的标记。在一方面，花粉传播阻止成分是降低花粉活力从而阻止维持构建体通过花粉传播的遗传元件。
附图说明
16.图1显示了用于本公开的方法的构建体设计。
17.图2显示了本公开的方法的示意图。
18.图3显示了使用通过本文公开的方法产生的双单倍体诱导物的示意图。
19.图4显示了本公开的方法的示意图。
20.图5显示了维持构建体(a)、遗传染色体加倍剂(b)和种子鉴定(c)的示意图，其用于维持双单倍体诱导物系以用于种子增加和双单倍体诱导目的。
具体实施方式
21.将在下文中参考附图更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的方面。实际上，公开内容能以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的方面；而是提供这些方面，使得本公开能满足适用的法律要求。
22.所公开的方法和组合物所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文公开的许多修改和其他方面具有以下描述和相关附图中呈现的传授的益处。因此，应当理解，这些公开内
容不限于所公开的特定方面，并且修改和其他方面旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了特定术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
23.也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定方面而不旨在进行限制。如在说明书和权利要求中所用的，术语“包含”包括“由......组成”的方面。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求中，将参考本文中所定义的若干术语。
24.如本文所用，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“该/所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“该/所述蛋白质”包括提及一种或多种蛋白及其等同物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
25.本说明书中提到的所有专利、出版物和专利申请指示了本公开所属领域技术人员的水平。将所有专利、出版物和专利申请通过引用以其全文并入本文，其程度就像明确且个别指出通过引用将每一篇个别专利、出版物或专利申请以其全文并入一样。
26.在植物中，生殖系细胞(种系)通过在孢子发生过程中产生孢子母细胞，在每个后代中提供遗传信息的跨代遗传。例如，孢子发生提供了发育雌配子的大孢子母细胞、分别产生胚和胚乳的卵细胞和中央细胞；或发育雄性配子的小孢子母细胞，产生四个单倍体小孢子，其中每个小孢子进一步发育成成熟的花粉粒。种系细胞独特作用的一个关键方面是提供未来的后代接收的遗传信息，其中一半的遗传贡献来自雌配子，并且一半的遗传贡献来自雄性配子。卵细胞与一个精子细胞受精形成二倍体合子，而第二精子细胞与中央细胞的两个极核融合形成三倍体胚乳。胚乳是胚的终末营养组织，但对种系没有贡献。受精后，合子产生胚，这一过程被称为合子胚发生，是有性生殖的特征。新形成的胚经历这样的胚发生发育程序，该胚发生发育程序包含受遗传决定子和表观遗传重编程影响的潜在调节程序，导致从胚发生细胞状态到获得分化的一种或多种细胞命运，最终产生具有其所有分化组织的植物。
27.孤雌生殖是无性生殖的一种自然形式，其中雌配子(胚)的生长和发育无需通过精子受精即可发生。通过孤雌生殖产生的雌配子可以为单倍体或二倍体。
28.本公开的方法改变了上述植物有性和无性生殖的这样的发育程序。这样的方法作为用于农业用途的植物生殖方法是有价值的。本公开提供了使用影响细胞周期的分子机制的方法，这些方法可用于农业用途和作物改良。
29.当诱导物系用于为二倍体植物授粉时，会衍生出单倍体胚。来自花粉的一个精核与胚囊中的极核融合，产生三倍体(3n)胚乳。三倍体胚乳将包含来自雌性的2组染色体和来自雄性的1组染色体，在这种情况下其是诱导物系。单倍体胚含有一组染色体，这些染色体源自雌性植物，并且通过本文所述的方法和组合物加倍。
30.广泛杂交也可用于产生单倍体，其中来自遥远但相关的属/种的花粉用作诱导物杂交。这种单倍体生产方法由于从授粉亲本中消除染色体而发生。本文关于提供遗传染色体加倍剂所述的方法和组合物也可以通过基于广泛杂交的诱导杂交来提供。
31.孤雌生殖诱导是指向细胞提供刺激的方法，其提高了母本单倍体诱导水平。将
apetala2(ap2)变体肽用作孤雌生殖因子，特别地包含编码基因产物的多肽或多核苷酸，这些基因产物用于从雌配子生成双单倍体或单倍体植物。与孤雌生殖因子基因产物接触的玉蜀黍雌配子体导致提高的母本单倍体诱导水平。特别地，当用包括能够改变植物细胞的细胞命运的调节元件和结构基因的遗传构建体转化植物时，玉蜀黍植物的配子发育成单倍体植物。进一步，当用包括能够改变植物细胞的细胞命运和细胞周期调控的调节元件和结构基因的遗传构建体转化植物时，玉蜀黍植物的配子发育成二倍体植物。在本公开的方法中，从遗传构建体表达的细胞周期调控蛋白用于改变体内细胞命运和倍性水平。
32.如本文所用，“孤雌生殖因子”包括但不限于提高母本单倍体诱导和无性生殖水平的基因产物，其中在卵细胞中表达时，雌配子(胚)的生长和发育在不经精子受精的情况下发生。
33.如本文所用，“孤雌生殖处理”是本文公开的在接触的细胞中引发孤雌生殖响应的任何处理。
34.如本文所用，“无性生殖”意指没有配子融合的生殖。
35.如本文所用，“中央细胞”意指产生胚乳的雌配子。
36.如本文所用，“卵细胞”意指产生胚的雌配子。
37.如本文所用，“大孢子母细胞(megaspore mother cell)”意指发育成雌配子体的细胞，也称为大孢子母细胞(megasporocyte)或功能性大孢子(fms)。
38.如本文所用，“小孢子母细胞(microspore mother cell)”意指发育成雄配子体的细胞，也称为小孢子母细胞(microsporocyte)。
39.如本文所用，“配子发生”意指来自孢子的配子体的发育。
40.如本文所用，“孤雌生殖”意指从未受精的卵细胞形成胚。
41.如本文所用，“假受精”意指从中央细胞的受精依赖地形成胚乳。
42.如本文所用，“有性生殖”意指其中雌性(卵)和雄性(精子)配子融合形成合子的生殖方式。
43.如本文所用，“体细胞胚发生”意指在没有配子和种子形成情况下从孢子体细胞形成胚。
44.如本文所用，“孢子发生”意指从孢子母细胞形成孢子。
45.如本文所用，“孢子母细胞”意指生殖谱系的第一个细胞，由植物雌性和雄性生殖组织中的孢子体细胞形成。
46.如本文所用，“营养生殖”意指其中形成新植物而不形成胚的生殖形式。
47.如本文所用，术语“胚”意指胚及其子代、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、合子胚、体细胞胚、胚性愈伤组织以及衍生自成熟穗来源种子的胚。胚是能够萌发形成植物的结构。
48.如本文所用，“单倍体”意指具有单组染色体(基因组)并且减少的染色体数目(n)等于配子中的染色体数目的植物或植物细胞。
49.如本文所用，术语“1n”或“1n细胞”意指含有单组染色体的细胞，典型地是减数分裂的产物。1n细胞的实例包括配子，例如精细胞、卵细胞或通过有丝分裂衍生自配子的组织，如1n胚或1n植物。在植物通常是二倍体而配子是单倍体的玉蜀黍中，这样的配子衍生的胚或植物被称为单倍体胚和单倍体植物。
behavior[植物信号传导与行为]5：691-694)。
[0065]
如本文所用，术语“转录因子”意指通过与启动子的dna序列结合以及上调或下调表达来控制特定基因的转录速率的蛋白质。转录因子(也是形态发生基因)的实例包括ap2/erebp家族的成员(包括babyboom(bbm)和胚珠发育蛋白2(odp2)基因以及变体、plethora和aintegumenta亚家族)，caat-盒结合蛋白(如lec1和hap3)，以及myb、bhlh、nac、mads、bzip和wrky家族成员。在一方面，zm-odp2(编码seq id no：62的seq id no：61)、os-odp2(osant(水稻ant，genbank登录号ap003313)(编码seq id no：64的seq id no：63))和os-odp2(水稻bmn，genbank登录号ay062180)(编码seq id no：66的seq id no：65)在本公开的方法中用作形态发生基因。
[0066]
如本文所用，术语“合成的转录因子”是指包含至少两个结构域(自然界中非天然存在的识别结构域和调节结构域)的分子。
[0067]
如本文所用，术语“表达盒”意指由编码和非编码序列组成的载体dna的独特成分，该编码和非编码序列包括在转化/转染细胞中控制表达的5
′
和3
′
调节序列。
[0068]
如本文所用，术语“编码序列”意指由编码蛋白质的氨基酸的起始密码子和终止密码子界定的dna序列部分。
[0069]
如本文所用，术语“非编码序列”意指进行转录以产生信使rna但不编码蛋白质的氨基酸的dna序列部分，例如5’非翻译区，内含子和3’非翻译区。非编码序列也指rna分子，例如微小rna、干扰rna或rna发夹，当其表达时下调内源基因或其他转基因的表达。
[0070]
如本文所用，术语“调节序列”意指能够增加或减少基因表达的核酸分子区段。调节序列包括启动子、终止子、增强子元件、沉默元件、5’utr和3’utr(非翻译区)。
[0071]
如本文所用，术语“转移盒”意指t-dna，其包含侧翼为右边界和左边界的一个或多个表达盒。
[0072]
如本文所用，术语“t-dna”意指插入宿主植物细胞的基因组中的ti质粒的一部分。
[0073]
如本文所用，术语“胚发生因子”意指当表达时增强体细胞衍生结构的改善的形成的基因。更精确地，胚发生因子的异位表达刺激器官发生结构(例如来自胚发生愈伤组织的结构)的从头形成，这改善胚的形成。这种刺激的从头胚发生形成发生在其中胚发生因子表达的细胞中，或者发生在相邻细胞中。胚发生因子基因是调节其他基因表达的转录因子，或为影响植物细胞中激素水平的基因，其刺激胚发生改变。
[0074]
胚发生因子涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、或其组合。
[0075]
在一方面，本公开提供了用于使用无性生殖生产植物的方法。无配子生殖是开花植物的一种生殖方式，其特征是胚囊中的二倍体细胞在未受精的情况下发育成胚。孤雌生殖是无配子生殖的一种形式，并且在更广泛的意义上包括由单倍体配子体细胞(例如由大孢子发生产生的卵细胞)从头胚发生形成。
[0076]
本公开提供了产生重组近交系的群体的高效且有效的方法，这些方法包括但不限于使得能够产生双单倍体重组群体的方法。
[0077]
可用于与形态发育基因组合的孤雌生殖因子涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的
644)。wus在拟南芥中的组成型表达已显示可导致叶片的不定芽增殖(原位)(laux，t.，talk presented at the xvi international botanical congress meeting[在第十六届国际植物大会上发表的演讲]，1999年8月1-7日，密苏里州圣路易斯)。
[0081]
在一方面，可用于本公开的方法的功能性wus/wox同源盒多肽是wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5、wox5a或wox9多肽(参见，美国专利7,348,468和7,256,322以及美国专利申请公开号2017/0121722和2007/0271628，将其通过引用以其全文并入本文以及van der graaff等人，2009，genome biology[基因组生物学]10：248)。可用于本公开的方法中的功能性wus/wox同源盒多肽获自或衍生自任何植物。可用于本公开的方法中的编码含有同源盒dna结合结构域、wus盒和ear阻遏结构域的蛋白质的功能性wus/wox核苷酸公开于美国专利申请公开号2020/0270622中，将其通过引用以其全文并入本文。
[0082]
可用于本公开的其他形态发生基因包括但不限于lec1(美国专利6,825,397，通过引用以其全文并入本文；lotan等人，1998，cell[细胞]93：1195-1205)、lec2(stone等人，2008，pnas[美国科学院院报]105：3151-3156；belide等人，2013，plant cell tiss.organ cult[植物细胞组织器官培养]113：543-553)、kn1/stm(sinha等人，1993.genes dev[基因发育]7：787-795)、来自农杆菌属(agrobacterium)的ipt基因(ebinuma和komamine，2001，in vitro cell.dev biol-plant[体外细胞发育生物学-植物]37：103-113)、monopteros-delta(ckurshumova等人，2014，new phytol.[新植物学]204：556-566)、农杆菌属av-6b基因(wabiko和minemura 1996，plant physiol.[植物生理学]112：939-951)、农杆菌属iaa-h和iaa-m基因的组合(endo等人，2002，plant cell rep.[植物细胞报告]，20：923-928)、拟南芥serk基因(hecht等人，2001，plant physiol.[植物生理学]127：803-816)、拟南芥agl15基因(harding等人，2003，plant physiol.[植物生理学]133：653-663)、fusca基因(castle和meinke，plant cell[植物细胞]6：25-41)和pickle基因(ogas等人，1999，pnas[美国科学院院报]96：13839-13844)。
[0083]
通常，花粉致死性多核苷酸或非传播花粉多核苷酸表示阻止花粉实现受精的任何多核苷酸。这种非传播性可以在转录水平(例如，转录影响)或蛋白质水平(例如，导致花粉致死性或非传播性的酶促作用)上实现。在某些实施例中，花粉非传播如果发生在减数分裂后或配子体阶段则是最有效的。非传播花粉多核苷酸可以通过各种机制起作用。它可以阻止花粉存活，例如通过表达有毒化合物。
[0084]
本公开还包括通过本文公开的任何方法或组合物获得的植物。本公开还包括来自通过本文公开的任何方法或组合物获得的植物的种子。如本文所用，术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。如本文所用，术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。植物细胞为分化的或未分化的(例如，愈伤组织、未分化的愈伤组织、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、未成熟的子叶、胚轴、悬浮培养细胞、原生质体、叶、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。植物细胞包括但不限于来自以下的细胞：种子、悬浮培养物、外植体、未成熟胚、胚、合子胚、体细胞胚、胚发生愈伤组织、分生组织、体细胞分生组织、器官发生性愈伤组织、原生质体、衍生自成熟的穗衍生种子的胚、叶基、来自成熟植物的叶、叶尖、未成熟花序、雄穗、未成熟穗、长须、子叶、未成熟子叶、分生组织区域、愈伤组织、来自叶的细胞、来自茎的细胞、来自根的细胞、来自芽的细胞、配子体、孢
子体、花粉、小孢子、多细胞结构(mcs)和胚样结构(els)。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的培养中的细胞(例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。谷物旨在意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也被包括在本公开的范围内，只要这些后代、变体和突变体是衍生自使用本文公开的方法和组合物制造的再生植物的和/或包含本文公开的引入的多核苷酸。
[0085]
如本文所用，术语“经转化的植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因或转化的植物基因组内，这样使得多核苷酸得以传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组dna构建体的部分整合进基因组中。如本文所用，术语“转基因的”包括其基因型已经通过异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些。转基因植物定义为含有转基因的成熟可育植物。
[0086]
通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的异源dna构建体转化植物细胞，该核酸表达盒包含目的基因；再生由所转移的基因插入该植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的植物。事件在表型上表征为插入的基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”也指转化体和另一个植物之间有性杂交所产生的子代，其中该子代包括异源dna。
[0087]
本公开的组合物和方法可应用于宽范围的植物物种，包括双子叶植物和单子叶植物。根据本文公开的方法处理的植物的代表性实例包括但不限于小麦、棉花、向日葵、红花、烟草、拟南芥属、大麦、燕麦、稻、玉蜀黍、黑小麦、高粱、黑麦、粟、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、土豆、甜菜、葡萄、桉属(eucalyptus)、小麦草(wheat grass)、草皮草、苜蓿、三叶草、大豆、花生、柑橘、番木瓜、狗尾草属物种(setaria sp)、可可、黄瓜、苹果、辣椒属(capsicum)、竹、瓜、观赏植物(包括商业花园和鳞茎花卉物种)、果树、蔬菜物种、芸苔属物种以及种间杂交体。在优选的实施例中，将本公开的组合物和方法应用于玉蜀黍植物。
[0088]
本公开的方法涉及将多肽、多核苷酸(即，dna或rna)或核苷酸构建体(即，dna或rna)引入植物中。如本文所用，“引入”意在指以使得多核苷酸、多肽或核苷酸构建体得以进入植物细胞内部的方式，将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体呈送给植物。本公开的方法不取决于用于将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体引入植物中的特定方法，只要该多核苷酸、多肽或核苷酸构建体得以进入该植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体引入植物的方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
[0089]
如本文所用，“稳定转化”是其中引入到植物中的多核苷酸或核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能由其子代继承的转化。“瞬时转化”意指将多核苷酸或核苷酸构建体引入植物中并且不整合到该植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。此外，在某些实施例中，“瞬时”可以表示在细胞中存在胚发生诱导剂，其中这样的药剂已经被外源性施加或从邻近细胞分泌或从染色体外位置(例如，质粒或另一种独立复制来源)产生，或者不是由相同细胞内的稳定整合的重组dna构建体产生。
[0090]
如本文所用，“接触”、“与......接触”或“与......进行接触”意指“直接接触”或
culture：fundamental methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，编辑gamborg和phillips(springer-verlag[施普林格出版社]，柏林)；mccabe，等人，(1988)biotechnology[分子技术学]6：923-926)和lec1转化(us 6,825,397)。还参见，weissinger，等人，(1988)ann.rev.genet.[遗传学年鉴]22：421-477；sanford，等人，(1987)particulate science and technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；christou，等人，(1988)plant physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；mccabe，等人，(1988)bio/technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；finer和mcmullen，(1991)in vitro cell dev.biol.[体外细胞生物学和发育生物学]27p：175-182(大豆)；singh，等人，(1998)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；datta，等人，(1990)biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；klein，等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]85：4305-4309(玉蜀黍)；klein，等人，(1988)biotechnology[生物技术]6：559-563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；klein，等人，(1988)plant physiol.[植物生理学]91：440-444(玉蜀黍)；fromm，等人，(1990)biotechnology[生物技术]8：833-839(玉蜀黍)；hooykaas-van slogteren，等人，(1984)nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；bytebier，等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]84：5345-5349(百合科(liliaceae))；de wet，等人，(1985)the experimental manipulation of ovule tissues[胚珠组织的实验操作]，编辑chapman，等人(longman[朗文出版社]，纽约)，第197-209页(花粉)；kaeppler，等人，(1990)plant cell reports[植物细胞报告]9：415-418和kaeppler，等人，(1992)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；d
′
halluin，等人，(1992)plant cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；li，等人，(1993)plant cell reports[植物细胞报告]12：250-255以及christou和ford，(1995)annals of botany[植物学年报]75：407-413(稻)；ishida，等人，(1996)nature biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)的玉蜀黍)，所有这些通过引用以其全文并入本文。在u.s.2017/0121722中也发现了用于快速植物转化的方法和组合物，将其通过引用以其全文并入本文。在美国专利申请序列号15/765,521中发现了可用于植物转化的载体，将其通过引用以其全文并入本文。
[0094]
报告基因或选择性标记基因也可以包括在本公开的表达盒中。合适的报告基因的实例可以在以下中找到：例如，jefferson等人(1991)plant molecular biology manual[植物分子生物学年刊]，gelvin等人编辑，(kluwer academic publishers[鲁维尔学术出版社])，第1-33页；dewet，等人，(1987)mol.cell.biol.[分子细胞生物学]7：725-737；goff，等人，(1990)embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]9：2517-2522；kain，等人，(1995)bio techniques[生物技术]19：650-655和chiu，等人，(1996)current biology[当前生物学]6：325-330，通过引用以其全文并入本文。
[0095]
用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的实例包括但不限于编码对如下的耐受性的基因：氯霉素(herrera estrella，等人，(1983)embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；氨甲蝶呤(herrera estrella，等人，(1983)nature[自然]303：209-213；meijer，等人，(1991)
plant mol.biol.[植物分子生物学]16：807-820)；潮霉素(waldron，等人，(1985)plant mol.biol.[植物分子生物学]5：103-108和zhijian，等人，(1995)plant science[植物科学]108：219-227)；链霉素(jones，等人，(1987)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(bretagne-sagnard，等人，(1996)transgenic res.[转基因研究]5：131-137)；博莱霉素(hille，等人，(1990)plant mol.biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺类(guerineau，等人，(1990)plant mol.biol.[植物分子生物学]15：127-36)；溴草腈(stalker，等人，(1988)science[科学]242：419-423)；草甘膦(shaw，等人，(1986)science[科学]233：478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(deblock，等人，(1987)embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)，通过引用以其全文并入本文。
[0096]
其他基因可以使用本公开的表达盒，它们也有助于转基因事件的恢复，并且包括但不限于gus(β-葡糖醛酸糖苷酶；jefferson，(1987)plant mol.biol.rep.[植物分子生物学报告]5：387)、gfp(绿色荧光蛋白；chalfie，等人，(1994)science[科学]263：802)、萤光素酶(riggs，等人，(1987)nucleic acids res.[核酸研究]15(19)：8115和luehrsen，等人，(1992)methods enzymol.[酶学方法]216：397-414)以及编码花青素产生的玉蜀黍基因(ludwig，等人，(1990)science[科学]247：449)，通过引用以其全文并入本文。
[0097]
本公开还提供了在分离和胚发生诱导方法(用于生成父本配子(产雄性特征的)或母本配子(产生雌性特征的)双单倍体群体)的任何部分之前、期间、之后或与之重叠，使单倍体细胞与一定量的染色体加倍剂接触的方法。
[0098]
如本文所用，“重组体”意指细胞或载体，其已经通过引入异源核酸或衍生自已经如此修饰的细胞而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达未在天然(非重组)细胞中以相同形式或位置发现的基因的细胞、或以不同于天然(非重组)细胞的表达模式表达天然基因的细胞，例如，由于故意的人为干预，天然基因异常表达、表达不足、表达降低或根本不表达。如本文所用，术语“重组”不涵盖由于自然发生的事件(例如，自发突变、自然转化/转导/转位)(如在没有故意的人为干预的情况下发生的事件)而引起的细胞或载体的改变。
[0099]
如本文所用，“重组表达盒”是以重组或合成方式产生的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件的核酸构建体。重组表达盒被掺入质粒、染色体、线粒体dna、质粒dna、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括，除了其他序列之外，待转录的核酸和启动子。
[0100]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0101]
术语“调节元件”是指具有基因调节活性的核酸分子，即能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸的转录和/或翻译表达模式的核酸分子。因此，术语“基因调节活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，从而影响这种可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调节活性可为正向和/或负向，并且该影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应，还可通过定量指示或定性指示来表征。
[0102]
在一方面，在植物卵细胞中表达的调节元件可用于调节zm-odp2肽活性以引起母
本单倍体诱导，导致所产生的一定比例的子代为单倍体(与亲本相比具有一半染色体数目)。此外，使用替代调节元件以进一步优化孤雌生殖母本单倍体诱导水平。例如，在本公开的方法中使用以下调节元件，如us 2015/0152430中公开的那些(启动子包括但不限于at-dd5启动子、at-dd31启动子、at-dd65启动子和zm-dd45)和us 2018/0094273中公开的那些(玉蜀黍卵细胞启动子)(将us 2015/0152430和us 2018/0094273通过引用以其全文并入本文)。
[0103]
顺式调节元件是影响基因表达的调节元件。顺式调节元件是调节相邻基因转录的非编码dna区域，通常为它们调节的基因附近的dna序列。顺式调节元件典型地通过编码赋予转录因子结合的dna序列来调节基因转录。
[0104]
如本文所用，“启动子”是示例性调节元件，并且通常是指能够控制编码序列或功能性rna的表达的核苷酸序列。通常，编码序列位于启动子序列的3
′
端。启动子序列包含近端元件和较远端上游元件，后一元件通常称为增强子。因此，“增强子”是刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，用来增强启动子的水平或组织特异性。启动子可以全部衍生自天然基因，或者可以由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的核苷酸区段。不同的调节元件可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境条件的表达。
[0105]
植物启动子是能够在植物细胞中起始转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于，从植物、植物病毒和包含在植物细胞内表达的基因的细菌(如农杆菌属或根瘤菌属(rhizobium))中获得的启动子。实例是优先在某些组织(如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)中启动转录的启动子。这样的启动子称为“组织偏好性”启动子。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调节型”启动子是指在环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光照的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育期间驱动表达的启动子。组织偏好性启动子、细胞类型特异性启动子、发育调节启动子和诱导型启动子是“非组成性”启动子类别的成员。“组成型”启动子是导致核酸片段在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子。
[0106]
可以使用的花粉特异性启动子的实例包括但不限于pg47(rogers等人(1991)，pollen specific cdna clones from zea mays[来自玉蜀黍的花粉特异性cdna克隆]，biochem.biophys.acta[生物化学与生物物理学报]1089，411-413；allen，r.l.，和lonsdale，d.m.(1992)sequence analysis of three members of the maize polygalacturonase gene family expressed during pollen development[花粉发育过程中表达的玉蜀黍聚半乳糖醛酸酶基因家族中三个成员的序列分析]，plant mol.biol.[植物分子生物学]20，343-345，allen，r.l.，和lonsdale，d.m.(1993)，molecular characterization of one of the maize polygalacturonase gene family members which are expressed during late pollen development[花粉发育后期表达的玉蜀黍聚半乳糖醛酸酶基因家族成员中一个的分子表征].the plant journal[植物杂志]3，261-271)；玉蜀黍花粉特异性基因zm13(hamilton等人(1992)plant mol.biol.[植物分子生物学]18：211-218；guerrero等人(1993)mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]224：161-168)；
小孢子特异性启动子，例如apg基因启动子(twell等人，sex.plant reprod.[有性植物繁殖]6：217-224(1993))；进一步包括向日葵花粉表达基因sf3(baltz等人(1992)the plant journal[植物杂志]2：713-721)、甘蓝型油菜(b.napus)花粉特异性基因(arnoldo等人(1992)j.cell.biochem[细胞生物化学]，摘要编号y101204)。这样的启动子是本领域已知的或者可以通过已知的技术发现；参见例如，bhalla和singh(1999)molecular control 0f male fertility in brassica[芸苔属中雄性能育性的分子控制]第10届年度油菜籽大会，澳大利亚堪培拉；van tunen等人(1990)pollen-specific chi promoters from petunia：tandem promoter regulation of the chia gene[来自矮牵牛的花粉特异性chi启动子：chia基因的串联启动子调控]，plant cell[植物细胞]2：393-40；jeon等人(1999)；以及twell等人(1993)activation and developmental regulation of an arabidopsis anther-specific promoter in microspores and pollen of nicotiana tabacum[拟南芥花药特异性启动子在烟草小孢子和花粉中的激活和发育调控]，sex.plant reprod[有性植物繁殖].6：217-224。
[0107]
在一方面，卵细胞启动子和卵细胞特异性启动子可用于本公开的方法中。除本文公开的那些卵细胞启动子和/或卵细胞特异性启动子以及us 2015/0152430和us 2018/0094273中(其各自以其全文并入本文)公开的那些以外，可用于本公开中的卵细胞启动子和/或卵细胞特异性启动子包括但不限于sprunck等人，(2012)science[科学]，338，1093-1097和steffen等人(2007)plant j.[植物杂志]，51：281-92中公开的卵细胞特异性ec1.1和ec1.2启动子。
[0108]“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全处理的mrna上游。翻译前导序列可以影响多种参数，包括初级转录物到mrna的加工、mrna稳定性和/或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(turner和foster，(1995)mol.biotechnol[分子生物技术]3：225-236)。
[0109]
如本文所用，“异源”是指源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行实质性修饰得到的核酸。例如，可操作地连接到异源结构基因的启动子，该异源结构基因来自与衍生结构基因的物种不同的物种，或者，如果来自相同的物种，则其中一者或二者从其原始形式和/或基因组位置进行了实质性的修饰。
[0110]
在用于在目的植物中表达的表达盒中提供可用于本公开的方法中的孤雌生殖因子和形态发育基因。表达盒包括可操作地连接到本文公开的孤雌生殖因子和形态发育基因序列的5
′
和3
′
调节序列。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接(融合蛋白)时，可操作地连接意指这些编码区域处于相同的阅读框中。该盒可以额外地含有至少一个待共转化到生物体中的另外的基因。替代性地，在多个表达盒上提供一种或多种孤雌生殖因子和形态发育基因。这样的表达盒具有用于插入孤雌生殖因子和形态发育基因序列的多个限制性位点，该孤雌生殖因子和形态发育基因序列将位于调节区域(一个或多个启动子)的转录调节之下。表达盒可额外地含有选择性标记基因。
[0111]
可用于本公开的方法中的多核苷酸包括但不限于孤雌生殖因子、形态发育基因和
细胞周期基因(包括周期蛋白a、周期蛋白b、周期蛋白c、周期蛋白d、周期蛋白e、周期蛋白f、周期蛋白g和周期蛋白h)；pin1；e2f；cdc25；repa基因和类似的编码复制相关蛋白的植物病毒多核苷酸。参见美国专利公开号2002/0188965，通过引用以其全文并入本文。
[0112]
如本文所用，“嵌合基因表达盒”是包含可操作地连接到转录起始区的编码序列的表达盒，该转录起始区与该编码序列异源，并且该表达盒在转录的5
′‑3′
方向上包括转录起始区域(即启动子)和翻译起始区、分泌信号肽、胚发生诱导形态发育基因序列、荧光蛋白序列以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。
[0113]
本公开的孤雌生殖诱导方法改善母本单倍体胚再生生产力并且使基因编辑能够提供再生的经基因编辑的玉蜀黍母本单倍体。
[0114]
在一方面，使单倍体细胞与一定量的染色体加倍剂接触，以促进染色体加倍，然后从经处理的单倍体细胞再生纯合二倍体植物。在小孢子胚发生或胚成熟之前、期间或之后，使单倍体小孢子细胞与加倍剂接触。染色体加倍后，双单倍体胚将含有2拷贝的由父本衍生的染色体。用于从单倍体胚获得双单倍体植物的方法的效率可以大于10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％或90％。单倍体细胞与染色体加倍剂之间接触的持续时间可以变化。接触时间可以是从少于24小时(例如4-12小时)至约一周。接触的持续时间通常为从约8小时至2大。
[0115]
染色体加倍方法公开于：antoine-michard，s.等人，plant cell，tissue organ cult.[植物细胞、组织器官培养]，cordrecht，荷兰，kluwer academic publishers[鲁维尔学术出版社]，1997，48(3)：203-207；kato，a.，maize genetics cooperation newsletter[玉蜀黍遗传学合作通讯]1997，36-37；和wan，y.等人，tag[理论与应用遗传学]，1989，77：889-892。wan，y.等人，tag[理论与应用遗传学]，1991，81：205-211。将其公开内容通过引用并入本文。典型的加倍方法涉及使细胞与秋水仙碱、抗微管剂或抗微管除草剂、拿草特、一氧化二氮或任何有丝分裂抑制剂接触，以产生纯合的双单倍体细胞。培养基中使用的秋水仙碱的量通常是0.01％-0.2％，或可以使用大约0.05％的甲基胺草磷(apm)(5-225μm)。秋水仙碱的量在大约400-600mg/l的范围或大约500mg/l。培养基中拿草特的量是大约0.5-20μm。表1中包括有丝分裂抑制剂的实例。其他药剂可以与有丝分裂抑制剂一起使用以改善加倍效率。这样的药剂包括二甲基亚砜(dmso)、辅助剂、表面活性剂等。
[0116]
表1.化学染色体加倍剂
[0117]
[0118]
[0119][0120]
作为使用化学染色体加倍剂的替代方案，通过刺激细胞周期(和细胞分裂)或通过刺激核内复制来调节影响植物细胞周期的基因(遗传染色体加倍蛋白)的表达，用于使胚中的染色体组加倍。通过调节刺激细胞周期细胞中关键控制点的基因表达，可实现植物细胞中倍性水平的提高。已经证明使用卵细胞启动子表达孤雌生殖因子增强了母本单倍体胚的形成，而同时表达孤雌生殖因子和zm-dz470(玉蜀黍周期蛋白-d家族成员)不仅导致母本单倍体胚形成，而且刺激染色体数目加倍。因此，在形成母本单倍体胚中添加过表达的周期蛋白-d似乎提供了适当水平的细胞周期刺激，从而导致1n单倍体染色体数目加倍至2n(二倍体)。预期其他刺激植物细胞周期(或细胞分裂)的植物基因可用于在形成母本单倍体胚中产生类似的染色体数目加倍。预期这些基因将在本公开的方法中用于从双单倍体诱导物的雄性配子向母本单倍体胚提供遗传染色体加倍活性。过表达刺激细胞周期的植物基因的实例包括烟草中的周期蛋白a(yu等人，2003)、烟草中的周期蛋白d(cockcroft等人，2000，nature[自然]405：575-79；schnittger等人，2002，pnas[美国科学院院报]99：6410-6415；dewitte等人，2003，plant cell[植物细胞]15：79-92)、拟南芥中的e2fa(de veylder等人，2002，embo j[欧洲分子生物学学会杂志]21：1360-1368)、拟南芥中的e2fb(magyar等人，
2005，plant cell[植物细胞]17：2527-2541)。类似地，使用调节植物细胞周期机制的病毒基因的过表达，例如当小麦矮化病毒repa基因的过表达时刺激玉蜀黍中的细胞周期进展(g1/s转变)和细胞分裂时(gordon-kamm等人，2002，pnas[美国科学院院报]99：11975-11980)。相反，当拟南芥属中的周期蛋白依赖性激酶抑制剂(ick1/krp)等基因下调时，其编码的产物抑制细胞周期的植物基因已经显示会导致细胞分裂增加(cheng等人2013，plant j[植物杂志]75：642-655)。因此，使用卵细胞特异性启动子驱动表达的krp基因的下调预计与dz470的过表达具有相似的效果，导致染色体加倍。下调基因(如krp)的方法包括表达靶向krp mrna的人工微小rna，或表达通过grna靶向krp启动子序列来靶向krp启动子的dcas9-阻遏融合物。最后，存在特异性影响核内复制过程的植物基因。当在本公开的方法中使用这样的基因(如例如ccs52基因或del1基因)时，预期ccs52的过表达将导致增加的倍性水平，如在紫花苜蓿(medicago sativa)中观察到的(cebolla等人，1999，embo j[欧洲分子生物学学会杂志]18：4476-4484)，并且del1的下调将导致增加的倍性水平，如在拟南芥属中观察到的(vlieghe等人，2005，current biol[当代生物学]15：59-63)。预期刺激细胞周期、g1/s转变或核内复制的其他基因在本文公开的方法中可用于增加倍性水平。
[0121]
阻遏基序，例如参见kagale和rozwadowski(epigenetics[表观遗传学].2011.6：141-]46)可用于本公开的方法。乙烯响应元件结合因子相关的两亲性阻遏(ear)基序介导的转录阻遏，包括由lxlxl和dlnxxp的共有序列模式所定义的ear基序(参见hiratsu等人，2003.plant j.[植物杂志]35：177-192)可用于本公开的方法中。本公开感兴趣的是肽，这些肽包括us 9,499,831(通过引用以其全文并入本文)中披露的两亲性阻遏基序以及dr1/drap1全局阻遏物复合物(参见us 7,288,695 b2，通过引用以其全文并入本文)，该dr1/drap1全局阻遏物复合物包括与拟南芥mybl2中发现的基序相似的dr1基序(参见matsui k，umemura y，ohme-takagi m.2008.plant j.[植物杂志]55：954-967)。
[0122]
用于创建单倍体诱导物系的方法，例如通过异位表达含有转录因子的ap2结构域。例如，优选地，使用gordon-kamm等人的方法(参见美国专利号7,579,529；通过引用以其全文并入本文)可用于本公开的方法。
[0123]
当前方法感兴趣的是如前所述的全长zm-odp2肽的表达(参见美国专利号7,579,529；通过引用以其全文并入本文)，当用于本文公开的方法时，其诱导孤雌生殖和胚形成而不受精。另外，非洲狼尾草(pennisetum squamulatum)ap2转录因子无孢子生殖特异性基因组区域(apospory-specific-genomic-region)babyboomlike(本文称为psasgr-bbml)转基因在不受精的情况下诱导孤雌生殖和胚形成。在玉蜀黍中，用具有r1-navajo花青素颜色标记的花粉受精的具有psasgr-bbml转基因的个体表现出单倍体胚产生(steffen jg等人2007.plant j[植物杂志]51：281-292，us2016/0304901 a1，通过引用以其全文并入本文)。最近，khanday和sundaresan的方法证明了类似的发现，例如在水稻中(参见wo 2018/098420 a1；通过引用以其全文并入本文)。
[0124]
在植物基因组中的特定位置靶向插入多核苷酸的方法在本公开的方法中是有用的。利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在希望的基因组位置处的插入。参见例如，us 6，]87,994、us 6，331,661、us 6,262,341、us 6,300,545和us 6,528，700，所有这些均通过引用以其全文并入本文。简而言之，侧翼为两个不相同重组位点的感兴趣的多核苷酸包含在t-dna转移盒中。将t-dna转移盒引入植物中，该植物已经将靶位点稳定地掺入其基因组
中，该靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，并将转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。
[0125]
所公开的方法用于向外植体中引入多核苷酸，这些多核苷酸用于靶向衍生自该外植体的植物的基因组中特定位点以进行修饰。用所公开的方法引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr-cas等。例如，所公开的方法用于将crispr-cas系统引入植物细胞或植物中，以用于以下目的：对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，选择植物，缺失碱基或序列，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入植物或植物细胞的基因组中。因此，所公开的方法与crispr-cas系统一起使用以提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。cas内切核酸酶基因是植物优化的cas9内切核酸酶，其中植物优化的cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
[0126]
cas内切核酸酶在指导核苷酸的指导下识别并任选地将特定靶位点处的双链断裂引入细胞的基因组中。crispr-cas系统提供了用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。还提供了采用指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统的方法，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和用于编辑细胞基因组内的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定了基因组靶位点，即采用多种方法进一步修饰靶位点，使得它们含有多种目的多核苷酸。所公开的方法用于引入用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的crispr-cas系统。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)位于由cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。
[0127]
crispr基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(又称spidr-间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的dna基因座的家族。crispr基因座由部分回文的短而高度保守的dna重复序列(典型地为24至40bp，重复从1至140次，也称为crispr重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(典型地为20至58，依赖于crispr基因座(wo 2007/025097，2007年3月1日公开))间隔。
[0128]
cas基因包括通常与侧翼crispr基因座偶合、相关或相近或相邻的基因。术语“cas基因”和“crispr相关的(cas)基因”在本文中可互换地使用。
[0129]
在另一方面，cas内切核酸酶基因可操作地连接到cas密码子区域上游的sv40核靶向信号和cas密码子区域下游的二分型vird2核定位信号(tinland等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：7442-6)。
[0130]
关于cas内切核酸酶，术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语是指cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中产生双链断裂的能力被保留。
[0131]
关于cas内切核酸酶，术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语是指cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。这些片段和变体经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得。
[0132]
在一方面，cas内切核酸酶基因是识别原则上靶向的n(12-30)ngg形式的任何基因组序列的植物密码子优化的酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)cas9基因。
[0133]
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割dna而不损害碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括i型、ii型、iii型、和iv型内切核酸酶，这些限制性内切核酸酶进一步包括亚型。在i型和iii型系统中，甲基化酶和限制性酶活性二者均包含在单复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(he酶)，该酶相似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，这些识别位点典型地更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请pct/us 12/30061)。基于保守序列基序，大范围核酸酶已被分为四个家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其dna底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别表征为针对由独立的orf、内含子、和内含肽编码的酶的前缀f-、i-、或pi-。重组方法的一个步骤涉及在识别位点处或在该识别位点附近的多核苷酸切割。将该切割活性用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见sauer(1994)curr op biotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及sadowski(1993)faseb[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(integrase)或解离酶(resolvase)家族。tal效应物核酸酶是一类新的序列特异性核酸酶，其用于在植物或其他生物的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(miller，等人(2011)nature biotechnology[自然生物技术]29：143-148)。锌指核酸酶(zfn)是由锌指dna结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，该锌指结构域典型地包含两个、三个、或四个锌指，例如具有c2h2结构，然而其他锌指结构已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。zfn包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自ms型内切核酸酶，例如fokl的核酸酶结构域)的工程化dna结合锌指结构域。另外的功能性融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录活化物结构域、转录阻遏结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶dna中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于该核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
[0134]
如本文所用，“dead-cas9”(dcas9)用于提供转录阻遏结构域。dcas9已经发生突变，因此它不再切割dna。dcas0在被grna引导至序列时仍然结合，也与阻遏元件融合。如本文所述，融合至阻遏元件的dcas9缩写为dcas9-rep，其中阻遏元件(rep)是已在植物中表征的任何阻遏基序。表达的指导rna(grna)与dcas9-rep蛋白结合，并靶向dcas9-rep融合蛋白与启动子(t-dna内的启动子)内特定的预定核苷酸序列的结合。例如，如果使用zm-ubi pro：：dcas9-rep：：pinii term盒和u6-pol pro：：grna：：u6 term盒将其表达在边界外，且grna被设计成指导dcas9-rep蛋白以结合t-dna内表达盒sb-ubi pro：：mopat：：pinii term中的sb-ubi启动子，任何整合了边界外序列的事件会是双丙氨磷敏感性的。仅整合t-dna的转基因事件将表达mopat，并且对双丙氨磷具有抗性。使用与阻遏物融合的dcas9蛋白(与tetr或esr相反)的优点是能够将这些阻遏靶向t-dna内的任何启动子。tetr和esr仅限于同源操纵子结合序列。替代性地，可使用与阻遏结构域融合的合成的锌指核酸酶代替grna和dcas9-rep(urritia等人，2003，genome biol.[基因组生物学]4：23])，如上所述。
[0135]
来自细菌的ii型crispr/cas系统采用crrna和tracrrna将cas内切核酸酶指导至
其dna靶。该crrna(crispr rna)含有与双链dna靶的一条链互补，并且与tracrrna(反式激活crispr rna)碱基配对形成rna双链体的区域，该rna双链体引导cas内切核酸酶切割dna靶。如本文所用，术语“指导核苷酸”涉及两个rna分子-包含可变靶向结构域的crrna(crispr rna)和tracrrna的合成性融合。在一方面，该指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和与cas内切核酸酶相互作用的rna片段。
[0136]
如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及与cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得cas内切核酸酶能够识别并任选地切割dna靶位点。指导多核苷酸为单分子或双分子。指导多核苷酸序列为rna序列、dna序列或其组合(rna-dna组合序列)。任选地，指导多核苷酸包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，如但不限于锁核酸(lna)、5-甲基dc、2，6-二氨基嘌呤、2
′‑
氟a、2
’‑
氟u、2
′‑
o-甲基rna、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5
′
至3
′
共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导核苷酸”。
[0137]
指导多核苷酸、vt结构域和/或cer结构域的核苷酸序列修饰选自但不限于由以下组成的组：5
′
帽、3
′
聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsrna双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(lna)、5-甲基dc核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2
′‑
氟代a核苷酸、2
′‑
氟代u核苷酸；2
′‑
o-甲基rna核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18分子的连接、5
′
至3
′
共价连接、或其任何组合。这些修饰产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自以下的组：修饰的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修饰的结合亲和力、修饰的细胞降解抗性、和增加的细胞渗透率。
[0138]
在一方面，指导核苷酸和cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使得cas内切核酸酶能够在dna靶位点引入双链断裂。
[0139]
在本公开的一方面，可变靶结构域是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。
[0140]
在本公开的一方面，指导核苷酸包含ii型crispr/cas系统中的与ii型cas内切核酸酶形成复合物的crna(或crna片段)和tracrrna(或tracrrna片段)，其中该指导核苷酸/cas内切核酸酶复合物将cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。使用任何方法(包括但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植物细胞。
[0141]
在一方面，通过引入包含相应指导dna序列的重组dna分子间接引入指导核苷酸，该指导dna序列可操作地连接到能够在植物细胞中转录指导核苷酸的植物特异性启动子。术语“相应的指导dna”包括与rna分子相同但用“t”代替rna分子的每个“u”的dna分子。
[0142]
在一方面，经由粒子轰击或使用所公开的用于重组dna构建体的农杆菌转化的方法来引入指导核苷酸，该重组dna构建体包含可操作地连接到植物u6聚合酶iii启动子的相应指导dna。
[0143]
在一方面，指导rna/cas9内切核酸酶复合物的rna是包含双链体crrna-tracrrna的双链体化的rna。使用指导核苷酸对比双链体crrna-tracrrna的一个优点是，为了表达融合的指导核苷酸，仅需要制造一个表达盒。
[0144]
术语“靶位点”、“靶序列”、“靶dna”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且是指植物细胞的基因组(包括叶绿体dna和线粒体dna)中的多核苷酸序列，在该多核苷酸序列处通过cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点为植物基因组中的内源性位点，或者替代性地，靶位点与植物异源，从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比，靶位点发现于异源基因组位置中。
[0145]
如本文所用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而是指对于植物的基因组是内源的或天然的靶序列，并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。
[0146]“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指已经引入植物基因组中的靶序列。这样的人工靶序列在序列上与植物的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。
[0147]“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列：该靶序列当与未改变的靶序列相比时包含至少一种改变。这样的“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
[0148]
在一方面，将公开的方法用于向植物中引入用于植物中靶基因的基因抑制的多核苷酸。对于植物基因工程的几个方面来说，降低特定基因的活性(也称为基因沉默或基因抑制)是希望的。用于基因沉默的技术包括但不限于反义技术。
[0149]
在一方面，将公开的方法用于可用于多核苷酸引入植物中，这些多核苷酸可用于将核苷酸序列靶向整合到植物中。例如，将公开的方法用于引入t-dna表达盒以转化包含靶位点的植物，该表达盒包含不相同重组位点侧翼的目的核苷酸序列。在一方面，靶位点含有至少一组与t-dna表达盒上的那些相对应的不相同的重组位点。重组位点侧翼的核苷酸序列的交换通过重组酶进行。因此，将公开的方法用于引入t-dna表达盒以靶向整合核苷酸序列，其中该t-dna表达盒的侧翼为由重组酶识别的不相同重组位点，该重组酶识别并实现不相同重组位点处的重组。因此，将公开的方法和组合物用于改善含有不相同重组位点的植物的发育效率和发育速度。
[0150]
因此，公开的方法进一步包括用于将外源核苷酸定向、靶向整合到转化植物中的方法。在一方面，公开的方法在基因靶向系统中使用重组位点，该基因靶向系统有利于将希望的基因和核苷酸序列定向靶向到先前引入到靶植物基因组中的相应重组位点。
[0151]
在一方面，将侧翼有两个不相同重组位点的核苷酸序列引入到衍生自靶生物体基因组的外植体的一个或多个细胞中，从而建立用于插入目的核苷酸序列的靶位点。一旦建立了稳定的植物或培养组织，将侧翼有与侧翼靶位点的那些重组位点相对应的重组位点的第二构建体或目的核苷酸序列，在重组酶蛋白存在下引入稳定转化的植物或组织中。此过程导致靶位点和t-dna表达盒的不相同重组位点之间的核苷酸序列的交换。
[0152]
应认识到，以这种方式制备的转化植物可以包含多个靶位点；即多组不相同的重组位点。以这种方式，转化植物中的靶位点的多个操作是可获得的。转化植物中的靶位点是指已经插入到转化植物基因组中的并包含不相同重组位点的dna序列。
[0153]
在大多数天然存在的酿酒酵母菌株中发现的两微米质粒编码位点特异性重组酶，
sequence encoding flp recombinase[编码flp重组酶的新颖核酸序列]”的美国申请系列号08/972,258，通过引用并入本文。
[0162]
该噬菌体重组酶cre催化在两个lox位点之间的位点特异性重组。参见例如guo等人(1997)nature[自然]389：40-46；abremski等人，(1984)j.biol.chem.[生物化学杂志]259：1509-1514；chen等人(1996)somat.cell mol.genet.[体细胞与分子遗传学]22：477-488；以及shaikh等人(1977)j.biol.chem.[生物化学杂志]272：5695-5702。所有这些通过引用并入本文。这样的cre序列也可以使用植物优选密码子来合成。
[0163]
在适当的情况下，可以对待插入植物基因组的核苷酸序列进行优化以增加转化植物中的表达。在本公开中使用哺乳动物、酵母或细菌基因的情况下，使用植物优选密码子来合成它们以改善表达。应认识到，为了在单子叶植物中表达，也使用单子叶植物优选密码子合成双子叶植物基因。关于合成植物优选基因的方法，参见例如，美国专利号5,380,831和5,436,391，以及murray等人(1989)nucleic acids res.[核酸研究]17：477-498，通过引用并入文中。可以从目的植物中表达的蛋白质中更频繁使用的密码子确定植物优选密码子。应认识到，可以构建单子叶植物或双子叶植物优选序列以及特定植物物种的植物优选序列。参见例如，ep 0359472；ep 0385962；wo 91/16432；perlak等人，(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]88：3324-3328；以及murray等人(1989)nucleic acids res.[核酸研究]17：477-498。美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；等，通过引用并入本文。进一步认识到，该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用完全优化的或部分优化的序列。
[0164]
增强细胞宿主中的基因表达的另外的序列修饰用于本公开中。这些包括：消除编码假的聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可以将序列的g-c含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。如果可能，修饰序列以避免出现预测的发夹二级rna结构。
[0165]
本公开还涵盖flp重组靶位点(frt)。frt已被鉴定为包含由八(8)个碱基间隔子隔开的两个13个碱基对重复序列的最小序列。只要这两个13碱基的重复序列被八个核苷酸分开，间隔区中的核苷酸即可被核苷酸组合代替。似乎间隔子的实际核苷酸序列不是关键的；然而，对于本公开的实践，间隔区域中核苷酸的某些取代可能比其他取代更好地起作用。在链交换期间，八个碱基对间隔子参与dna-dna配对。该区域的不对称性决定了重组事件中位点比对的方向，这将随后导致倒位或切除。如上所示，大部分间隔子被突变而不丧失功能。参见例如，schlake和bode(1994)biochemistry[生物化学]33：12746-12751，通过引用并入本文。
[0166]
frt突变位点可用于所公开方法的实践中(参见us 7,820,880的seq id no：2、3、4和5，通过引用以其全文并入本文)。其他突变位点可以通过基于pcr的诱变来构建，以用于本公开的方法。本公开不限于使用特定的frt或重组位点，而是使用不相同的重组位点或frt位点以将核苷酸序列在植物基因组中靶向插入和表达。因此，基于本公开构建和使用其他突变frt位点。
[0167]
如上所讨论的，在重组酶存在下，含有具有不相同重组位点的靶位点的基因组dna与含有具有相应不相同重组位点的t-dna表达盒的载体一起导致重组。将位于侧翼重组位
点之间的t-dna表达盒的核苷酸序列与位于侧翼重组位点之间的靶位点的核苷酸序列进行交换。以此方式，目的核苷酸序列可以精确地并入宿主的基因组中。构建具有多个不相同重组位点的靶位点。因此，多个基因或核苷酸序列在植物基因组中的精确位置处堆叠或排序。同样地，一旦已经在基因组内建立了靶位点，可以通过将这样的位点并入t-dna表达盒的核苷酸序列内并将位点转移至靶序列来引入另外的重组位点。因此，一旦已经建立了靶位点，就可能随后通过重组来添加位点或改变位点。
[0168]
另一种变化包括提供与生物体中的靶位点可操作地连接的启动子或转录起始区。优选地，该启动子将位于第一重组位点的5
′
。通过用包含编码区的t-dna表达盒转化生物体，在t-dna表达盒整合到靶位点时将发生编码区的表达。这方面提供了通过提供选择性标记序列作为编码序列来选择转化细胞(特别是植物细胞)的方法。
[0169]
本系统的其他优点包括通过利用如上所讨论的t-dna表达盒并且用简单的整合模式选择生物体来降低转基因或转移的dna在生物体中整合的复杂性的能力。以相同的方式，通过比较几个转化事件来鉴定基因组内的优选位点。基因组内的优选位点包括不破坏必需序列的表达并提供转基因序列的充分表达的位点。
[0170]
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
[0171]
实例
[0172]
本公开的多个方面在以下实例中被进一步定义，其中除非另有说明，否则份数和百分数以重量计，并且度数以摄氏度计。尽管这些实例说明了本公开的多个方面，但仅是通过说明的方式给出的。从以上的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的多个方面的本质特性，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行它们的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，从上述说明书来看，除了本文所示出和描述的那些之外，各种修改对于本领域技术人员来说将是清楚的。这样的修改也当视为落入所附权利要求的范围内。
[0173]
实例1：质粒
[0174]
可用于本公开中的质粒的描述参见表2。
[0175]
表2.
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
[0181]
[0182]
[0183][0184]
实例2：培养基
[0185]
可用于本公开的方法中的用于转化、选择和再生的培养基形成的描述参见表3和表4。
[0186]
表3.
[0187]
[0188][0189]
表4.
[0190]
[0191]
[0192][0193]
实例3：农杆菌属介导的玉米转化
[0194]
a.农杆菌属母板的制备
[0195]
将带有二元供体载体的根癌农杆菌从-80℃冷冻等分试样划线到固体12r培养基上，并在黑暗中在28℃培养2-3天，以制备母板。
[0196]
b.使农杆菌属在固体培养基上生长
[0197]
从母板上挑出单菌落或多菌落的农杆菌属，并将其划线到含有810k培养基的第二平板上，并在黑暗中于28℃孵育过夜。将农杆菌感染培养基(700a；5ml)和100mm 3
′‑5′‑
二甲氧基-4
′‑
羟基苯乙酮(乙酰丁香酮；5μl)添加到通风橱中的14ml锥形管中。将来自第二平板的约3个满环的农杆菌属悬浮于管中，然后将管涡旋以形成均匀的悬浮液。将悬浮液(1ml)转移到分光光度计管中，并将悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35-1.0的读数。农杆菌属浓度为大约0.5至2.0
×
109cfu/ml。将最终的农杆菌属悬浮液等分到2ml微量离心管中，每个管含有约1ml悬浮液。然后尽快使用悬浮液。
[0198]
c.使农杆菌属在液体培养基中生长
[0199]
替代性地，通过在液体培养基中生长来制备农杆菌属用于转化。感染前一天，用以下来准备125ml烧瓶：30ml 557a培养基(10.5g/l磷酸氢二钾、4.5g/l无水磷酸二氢钾、1g/l硫酸铵、0.5g/l脱水柠檬酸钠、10g/l蔗糖、1mm硫酸镁)和30μl壮观霉素(50mg/ml)和30μl乙酰丁香酮(20mg/ml)。将来自第二平板的半环农杆菌属悬浮于烧瓶中，并置于设定为200rpm的轨道振荡器上，并在28℃下孵育过夜。将农杆菌属培养物以5000rpm离心10分钟。去除上清液并添加含乙酰丁香酮溶液的农杆菌属感染培养基(700a)。将细菌通过涡旋重悬，并将农杆菌属悬液的光密度(550nm)调节至约0.35至2.0的读数。
[0200]
d.玉蜀黍转化
[0201]
将玉蜀黍(maize，zea mays l.)栽培品种的穗在20％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)加1滴吐温20中进行表面灭菌15-20分钟，然后在无菌水中洗涤3次。从穗分离未成熟胚(ie)，并将其置于具有乙酰丁香酮溶液的2ml农杆菌感染培养基(700a)中。胚的最佳大小因近交系而异，但是对于用wus2和zm-odp2转化，使用大范围的未成熟胚大小。取出农杆菌属感染培养基(810k)，将1ml农杆菌属悬液加入胚中，并将试管涡旋5-10秒。使微量离心管在通风橱中孵育5分钟。将农杆菌属悬液和胚倾倒在710i(或562v)共培养基(分别参见表3和表4)上。使用无菌刮刀将留在管中的任何胚转移到平板上。然后抽取农杆菌属悬液，并且将胚置于培养基的轴侧。将平板在黑暗中于21℃孵育1-3天进行共培养，然后将胚转移到静息培养基(605b培养基)中而不进行选择。
[0202]
实例4：产生具有引入的遗传染色体加倍因子的双单倍体诱导物(dhi)
[0203]
本公开提供了玉蜀黍母本单倍体诱导系统，其包含含有matrilineal(matl)基因
的功能丧失突变的玉蜀黍系，其具有诱导单细胞单倍体合子染色体加倍的非化学遗传机制。破坏g1-s-g2-m(间隙期1-合成期-间隙期2-有丝分裂)细胞周期以获得双单倍体利用玉蜀黍母本单倍体诱导中单亲(雄性)染色体消除之前的瞬时合子状态。本公开提供了使用单倍体诱导物的方法，该单倍体诱导物包含整合到单倍体诱导物基因组中、可用于破坏g1-s-g2-m细胞周期的构建体。这些转化的单倍体诱导系用作两种植物之间杂交的亲本。在授粉期间，来自父本等位基因的遗传染色体加倍因子的表达发生在受精之前、期间或之后(或上述的组合)，为胚囊细胞(例如卵细胞)提供染色体加倍能力。这样的在胚囊细胞，特别是卵细胞内或附近(或邻近)的染色体加倍活性刺激含有成对母本染色体的细胞的胚发生。任何能够掺入引入的遗传加倍因子的单倍体诱导物系都适用于本文所述的方法。提供功能丧失mtl1等位基因作为诱导物系的说明性实施例。就玉蜀黍而言，这些诱导系包括选自和/或衍生自stock 6、rwk、rws、uh400、ax5707rs和np2222-matl的那些。
[0204]
将本文所述的含有编码遗传染色体加倍因子的表达盒的构建体可操作地连接到驱动雄性基因组的表达的启动子，例如在受精后的最早阶段。用于此目的的示例性启动子是水稻baby boom 1基因座(bbm1；seq id no：1)的近端启动子，其中bbm1的合子表达最初对雄性等位基因具有特异性。预期其他bbm同源物的启动子序列可用于本文公开的方法。例如，玉蜀黍bbm-2基因座的启动子(seq id no：9)和5’utr(seq id no：10)在本公开的方法中可能是有用的。
[0205]
替代性地，遗传染色体加倍活性可以在核配之前由雄性配子提供给母本单倍体胚。在这方面，遗传染色体加倍活性是在受精之前、期间或之后以及核配之前由雄性配子表达的蛋白质赋予的。在雄性配子中有活性的包含启动子和5’utr的调节元件用于本公开的方法中，包括但不限于来自profilin同源物2基因座(prf2 pro seq id no：11和5’utr seq id no：12)、花粉特异性蛋白sf3样蛋白(sf3 pro seq id no：13和5’utr seq id no：14)、或果胶酸裂合酶/amb过敏原基因座(plaa pro seq id no：15和5’utr seq id no：16)的玉蜀黍调节元件。
[0206]
示例性遗传染色体加倍方法包括但不限于允许母本单倍体基因组核内复制的蛋白质、抑制母本单倍体基因组的微管蛋白聚合的蛋白质以及如本文所述的改变母本单倍体基因组的细胞周期调控的蛋白质。
[0207]
a.使用核内复制的遗传染色体加倍
[0208]
本公开的方法允许通过遗传破坏g1-s-g2-m细胞周期来获得双母本单倍体。
[0209]
在一方面，遗传染色体加倍是通过允许基因组复制而不进行细胞分裂来实现的。在没有完成m期(其特征在于完成胞质分裂并产生两个子细胞)的情况下用于刺激基因组复制的示例性蛋白质是有丝分裂抑制剂细胞周期开关52蛋白(ccs52)。ccs52通过降解有丝分裂周期蛋白来阻碍有丝分裂，导致包含g1-s-g2期的核内周期。预期ccs52蛋白的表达可用作控制核内复制的遗传染色体加倍剂。
[0210]
这样的ccs52蛋白是参与有丝分裂周期蛋白降解的后期促进复合物激活剂(“apc”；也称为“细胞周期体”)的植物同源物，其中apc成分包含通过26s蛋白酶体降解靶向的周期蛋白的e3泛素连接酶。含有wd重复序列的酵母蛋白如ccs52的过表达以与本公开的方法一致的方式触发有丝分裂周期蛋白降解、细胞分裂停滞、核内复制和细胞增大。表5中显示了用于本公开的方法的作为玉蜀黍同源物的遗传染色体加倍因子。
[0211]
表5.
[0212][0213]
在本公开的方法中，预期从双单倍体诱导物的雄性配子向母本单倍体胚提供遗传染色体加倍活性。
[0214]
b.使用微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍
[0215]
在另一方面，提供了遗传破坏g1-s-g2-m细胞周期的方法，其中微管蛋白聚合通过抑制蛋白的表达受到抑制，从而模拟用作染色体加倍剂的化学物质的抗有丝分裂作用。
[0216]
真核细胞表达几种微管蛋白，其中α-微管蛋白和β-微管蛋白是微管的主要成分。有丝分裂纺锤体的微管为在有丝分裂期间分离子染色单体提供了框架。微管由13根细丝组成，并且每根细丝都是横向缔合成管状结构的α-β-微管蛋白的端对端异二聚体。微管蛋白是gtp酶，其活性位点在亚基之间的界面处形成，使用来自两个亚基的必需氨基酸残基。此外，gtp酶活性只当两个或更多个亚基相缔合时发生，其中一个亚基的n末端结构域提供核苷酸结合位点，并且c末端结构域提供负责核苷酸水解的“t7环”。
[0217]
鉴于α-β-微管蛋白异二聚体端对端连接，极性不同(例如β-微管蛋白始终存在于(+)端，α-微管蛋白存在于(-)端)，并且两个亚基之间存在gtp结合袋，本公开的方法破坏了微管聚合。例如，通过表达突变的β-微管蛋白亚基(特别是在提供核苷酸结合位点的亚基的n末端结构域中)，然后核苷酸水解被阻止。因此，突变的β-微管蛋白亚基充当“有毒”亚基或显性负突变，阻碍聚合物(+)端的聚合，从而抑制细丝聚合。在酵母中，突变体α-微管蛋白tub1-828：d252a/e255a(seq id no：3，由seq id no：5编码)的表达也抑制纺锤体组装，即使仅作为总α-微管蛋白池的次要成分存在。因此，表达突变的微管蛋白亚基会导致细丝的动态不稳定性，从而导致可用作遗传染色体加倍剂的抗有丝分裂作用模式。
[0218]
在一方面，预期保守位点(如微管蛋白保守位点[sag]-g-g-t-g-[sa]-g(prosite登录号ps00227))内的错义突变(其中多核苷酸用于编码错义突变，例如h-a-a-h-r-q-a残基取代到ps00227位点，本文称为“β-微管蛋白-ps00227缺失”(多核苷酸seq id no：22；编码seq id no：28))由双单倍体诱导物的雄性配子向母本单倍体胚提供遗传染色体加倍活性。
[0219]
c.使用改变的细胞周期调控的遗传染色体加倍
[0220]
在另一方面，遗传染色体加倍剂是能够在受精之前、期间或之后改变细胞周期调控的周期蛋白基因。通过向卵细胞提供编码周期蛋白δ-2样蛋白(seq id no：23)的周期蛋白基因dpzm07g031470.1.1(本文称为zm-cycd2(seq id no：17))的活性，已经显示了孤雌生殖单倍体胚的遗传染色体加倍。此周期蛋白基因在雌性配子发生期间的活性提供了体内单倍体胚的染色体加倍活性，从而产生了仅具有母本染色体的二倍体(2n)胚。
[0221]
预期这些基因将在本公开的方法中用于从双单倍体诱导物的雄性配子向母本单倍体胚提供遗传染色体加倍活性。
[0222]
d.获得双单倍体诱导物的方法
[0223]
本文公开的方法使用具有表达盒的质粒，该表达盒具有包含如上所述的遗传染色体加倍因子的多核苷酸。表2和6中描述了可用于当前方法的质粒。
[0224]
表6.
[0225][0226][0227]
对于这些实验，转化选自和/或衍生自stock 6、rwk、rws、uh400、ax5707rs和np2222-matl的玉蜀黍植物或几种其他单倍体诱导物系中的任一种。还预期在本公开的方法中使用含有matrilineal(matl)基因突变的玉蜀黍植物。优选地，所选择的玉蜀黍植物具有如us 8,859,846 b2(通过引用以其全文并入本文)中所述的父本形态标记基因。这里，使用单倍体检测方法，包括检测父本形态标记。父本形态标记可以包含荧光报告表达构建体
(如绿色、黄色或红色荧光报告基因，该荧光报告表达构建体允许在早期发育阶段的胚中进行荧光检测)，和/或花青素基因的等位基因(如r1-scm等位基因)，该花青素基因的等位基因在早期发育阶段的胚中表达。这样的标记基因允许分别基于父本标记基因产物的存在或不存在来鉴别二倍体和单倍体胚。
[0228]
使用实施例3中所述的方法，使用表2和6中所述的质粒rv044054(seq id no：29)、rv042024(seq id no：35)、rv042025(seq id no：41)、rv042026(seq id no：47)和rv044484(seq id no：67)产生转化的双单倍体诱导物植物。通过qpcr分析再生的t0植物，以鉴定含有每种质粒的单拷贝半合子植物。繁殖这样的植物导致获得并使用单拷贝纯合植物，以用于单倍体诱导杂交。此外，预期表6中列出的剩余质粒将可用于产生如实例3中所述的转化的双单倍体诱导物植物，以用于本文公开的方法。
[0229]
使任何这样的加倍诱导物植物或其子代生长并用作花粉供体，以使包括单倍体诱导杂交的雌性植物的供体穗受精。在抽丝前将母本植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。用从双单倍体诱导物的花药中收集的有活力的花粉粒对母本植物的穗丝进行授粉。
[0230]
在一方面，在授粉后大约9
‑‑
21天，理想地在18天，收获未成熟的穗。将穗在30％高乐氏漂白剂加上0.5％洗涤剂中表面消毒20分钟，并用无菌水冲洗两次。基于诱导系中可见标记基因的鉴定来分离单倍体胚。例如，使用含有与启动子可操作地连接的荧光报告基因或花青素生物合成基因的诱导物，该启动子允许基因在早期发育阶段在胚中表达。
[0231]
替代性地，收获成熟的穗，收集种子，并分别基于父本形态标记基因的不存在和存在来鉴定含有单倍体或二倍体胚的种子。
[0232]
预期使用双单倍体诱导物的本公开的方法将消除进行染色体加倍处理的需要。还预期每个dh(双单倍体)育种群体的植物数量和质量两者都将得到改善。还预期，与使用某些化学染色体加倍处理的当前方法相比，本文所述的双单倍体诱导物方法将改善人类安全和环境健康问题。
[0233]
实例5：双单倍体诱导物(dhi)系统的开发、维护和效用
[0234]
当前实例的方法描述了双单倍体诱导物的维护和用途。遗传染色体加倍方法描述于实例4中，并且相关概念在此进一步描述为包含双单倍体诱导物系统的方法。
[0235]
在一个方面，当前方法描述了在植物转化、再生和孢子体生长期间具有无活性遗传染色体加倍性状的转化质粒，其在雄性配子中变得有活性。以这种方式，预期双单倍体诱导物在雄性配子细胞除外的大多数细胞中作为二倍体植物繁殖和维持。以这种方式，雄性配子赋予母本卵细胞随后的染色体加倍活性。因此，在第二方面，实例描述了用于获得体内二倍体化的母本单倍体植物(也称为“母本二单倍体”植物)的方法，这里在不使用化学染色体加倍剂的情况下获得。
[0236]
这里描述了获得稳定转化植物的方法(参见图2)。简而言之，使用农杆菌属菌株lba4404 thy-转化缺乏荧光蛋白标记的单倍体诱导物的未成熟二倍体胚(参见美国专利8，334，429，通过引用以其全文并入本文)。使用农杆菌属混合物进行转化，如美国专利申请公开号2021/0062203中所述，将其通过引用以其全文并入本文。具有质粒rv020636(seq id no：56)的农杆菌属菌株用于获得具有来自“双单倍体诱导物”(dhi)质粒的整合t-dna的单拷贝的转基因植物。
[0237]
本文所述的示例性dhi质粒(seq id no：55；参见图1)含有具有第一表达盒的多核苷酸，该第一表达盒包含具有染色体加倍活性的，与玉蜀黍bbm2启动子和5’utr(分别为seq id no：9-10)可操作地连接的zm-cycd2(seq id no：17)。第一表达盒含有侧接loxp位点的第二插入表达盒。此第二插入表达盒编码cre重组酶蛋白，其与玉蜀黍matrilineal(matl)基因的启动子和终止子(分别为seq id no：53和seq id no：54)可操作地连接。预期cre的表达将在小配子发生过程中发生，并将切除第二插入表达盒，从而允许在将父本染色质递送到卵细胞时表达遗传染色体加倍因子。使用实例4中描述的任何遗传染色体加倍因子(取代zm-cycd2或以任何其他组合)的双单倍体诱导质粒都可用于本文公开的方法。dhi质粒还含有编码报告标记基因(如红色荧光蛋白)和选择性标记基因的表达盒。在此实验中，将包含90％具有dhi质粒的农杆菌属菌株和10％质粒rv020636(v/v)(seq id no：56)的混合物用于转化。
[0238]
在二倍体胚的共感染之后，响应于rv020636(seq id no：56)活性激活体细胞胚发生，并如实例3中所述培养体细胞胚。大约6-10天后，任何增殖组织和体细胞胚被解剖和传代培养，其中解剖组织的每一部分被转移到成熟培养基(289q)中，在26℃-28℃在黑暗条件下进行体外培养。大约6-10天后，将传代培养的组织转移到26℃的光培养室中，直到长出具有良好根的健康小植株。大约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地中并在生长室中生长1周，随后在温室中再生长1-2周，然后移植到盆中的土壤中并在温室条件下生长。
[0239]
为鉴别具有由dhi质粒提供的稳定整合的t-dna并且缺乏质粒rv020636(seq id no：56)的t-dna的t0植物，对每株植物的叶组织取样并且使用pcr诊断方法进行评估。选择缺乏rv020636质粒序列(seq id no：56)(其是dhi质粒的二倍体和单拷贝)的植物，其中每株植物包含独特的事件。选定的t0植物生长至成熟。
[0240]
在抽丝前将选定的t0植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。用从双单倍体诱导物收集的有活力的花粉粒对母本植物的穗丝进行授粉。优选地，单倍体诱导物具有独特的形态性状，例如编码与dhi质粒提供的报告基因不同的荧光蛋白报告基因的转基因，例如编码zsyellow荧光蛋白报告基因的转基因。
[0241]
在授粉后大约9-14天，收获未成熟的穗。将穗在30％漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中表面消毒20分钟，并且用无菌水冲洗两次。如实例3中所述解剖和培养t1胚，并且此处包括染色体加倍步骤，如使植物细胞与浓度为0.1至1.0g/ml的秋水仙碱接触24小时，然后转移至缺乏染色体加倍处理的静息培养基(605j)中。替代性地，染色体加倍步骤在稍后进行，例如使用浸根法。
[0242]
24小时后，对t1胚进行父本形态性状的不存在/存在评分，例如zsyellow荧光蛋白的表达，其中单倍体和二倍体胚分别基于所述性状的不存在或存在进行检测。在本文公开的方法中，预期单倍体诱导杂交将产生一定比例的母本单倍体胚，其中一半预期为非转基因，一半预期已遗传dhi构建体。转基因单倍体胚的鉴定将以不存在父本形态性状和存在dsred性状为特征(参见图1和2)。非转基因单倍体胚将缺乏父本形态性状并存在dsred性状，并被丢弃。
[0243]
将具有dhi质粒提供的稳定整合的t-dna且缺乏质粒rv020636(seq id no：56)的t-dna的二倍体化的t1植物盆栽到土壤中并生长至成熟。预期这样的植物对于dhi性状是纯合的，并且预期100％的花粉粒具有在小配子发生期间变得有活性的dhi构建体(参见图1)。
简言之，可操作地连接到matl启动子的cre重组酶表达盒将在花粉粒中表达，从而允许可操作地连接到zm-bbm2启动子的加倍因子的表达。编码其他遗传染色体加倍因子的其他表达盒在本文公开的方法中是有用的，例如实例4中所述，以及与其他有用的启动子可操作地连接的所述表达盒，例如实例4中所述。
[0244]
预期维持选定的t1植物是通过自体受精进行的，并产生以下结果：单倍体胚(父本基因组消除而不使母本染色体加倍)、二倍体胚(父本基因组消除和母本染色体加倍；获得dhi植物的希望结果)或三倍体胚(遗传的父本基因组(1n)和双母本基因组(2n))(参见图2)。预期具有dhi构建体的2个拷贝的二倍体t1植物使用拷贝数分析方法进行确认，该方法鉴定并选择这样的植物或其子代作为双单倍体诱导物，如图3所示。
[0245]
在当前方法中，dhi系的效用如图3中所示，其中收集来自dhi植物的花粉并用于使供体穗受精，例如使用上述方法获得和处理的双亲本杂交产生的f1杂交体的穗。预期dhi构建体将如上所述变得有活性(参见图1)，从而产生具有或不具有父本基因组的胚。具有父本基因组的胚预期将使用父本形态标记基因(例如dsred活性)进行检测，并且这样的二倍体胚被丢弃。基于父本形态标记基因的不存在来检测缺乏父本基因组的胚，例如不表达dsred蛋白的胚。选择这样的缺乏父本标记的母本胚并将其转移到生长培养基中以获得小植株。
[0246]
预期使用本文公开的方法，在受精期间或之后，响应于父本基因组提供的遗传染色体加倍活性而获得二倍体化的母本胚。预期提供给单倍体母本卵细胞的这样的活性在体内产生双单倍体胚。预期这样的胚不需要使用化学加倍剂的组织培养方法(参见图3)。
[0247]
实例6：鉴定体内二倍体化母本胚的自动化方法
[0248]
如实例5中所述，虽然本文公开的方法的预期目标和目的是获得体内双单倍体胚，但实例5的结果可以产生作为体内双单倍体胚和母本单倍体的组合的母本胚群体。因此，辨别单倍体和二倍体的方法在本公开的方法中是有用的。此实例描述了用于此目的的方法。
[0249]
例如，使用用于制备植物组织、保持组织、转移植物组织、培养植物组织和/或使组织承受力以将组织分成单独的部分的设备来分析母本胚群体。预期这样的步骤使用一个以上的设备。
[0250]
预期以上自动化步骤还包含集成分析能力，包括但不限于使用不同的传感器和图像捕获系统。例如，设备用于获取图像，如视觉、高光谱、热或荧光成像设备。在另一方面，设备用于测量、捕获和分析定性和定量性状，如生物量、形状、厚度、体积、生长速率和/或形态特征。在一方面，设备还用于测量和分析其他参数，如光强度、光照持续时间、水和营养物吸收、蒸发和蒸腾、和/或在不同的外部刺激下对整套离子或离子产生变化的定量测量。
[0251]
在另一方面，包括分析使用至少一个设备收集的取样组织的方法与用于执行倍性分析的方法(例如使用流式细胞术的方法)相结合。这样的方法包括但不限于收集组织，分离完整细胞核，向分离的细胞核中添加各种缓冲液、试剂和染料，以及将样品自动转移和加载到流式细胞仪中。
[0252]
采集的图像和数据用于数据分析和解释；此处不努力描述与当前实例相关的所有采集方法。这样的方法包括出于分类目的执行特征提取，其中这样的分类用于预测模型生成。这样的预测建模是一种计算机实现的模型，包含来自数据挖掘、自动特征提取和机器学习的各种统计技术。
[0253]
还预期，这样的数据分析包括将基因型数据与捕获的表型数据联系起来，包括在
执行这种自动化方法之前、期间或之后从组织中测量生物分子的方法。
[0254]
预期本文所述的自动化方法的结果与基因型数据相关联，例如能够使用基于使用本文公开的方法生成和/或处理的表征植物、组织或植物细胞的基因组数据的生物学模型来预测表型性能。
[0255]
预期本文公开的方法改善了从单倍体母本胚中鉴定和选择二倍体母本胚的能力，包括但不限于用于改善再生频率、改善移植成功率以及最终改善使用这样的自动化处理、处理和表型分析方法生产的二倍体化植物的繁殖成功率的方面。预期当群体因产生可育植物的二倍体化母本胚而富集时，生产力将提高。
[0256]
在另一方面，预期将基因型数据与获得的表型数据联系起来的结果将能够使用基于所处理的表征植物、组织或植物细胞的基因组数据的生物学模型来改善预测的表型性能。
[0257]
此外，预期本文公开的方法改善植物育种结果，例如，当使用将上述数据分析和解释与基于基因组估计的育种值选择这样的双单倍体植物的方法相结合的这种自动化处理、处理和表型分析方法时。
[0258]
预期这些方法改善非随机、结构化育种群体的生产力，从而经济高效地提供具有所需数量的具有一些特定数量和/或目的质量的个体的群体。因此，与在理想化群体(例如在提供随机群体时所需的有效群体规模大小)中具有相同的概率相比，本文公开的方法提高了遗传增益的相对速率，同时使用相对较少的资源。
[0259]
实例7：双单倍体诱导物(dhi)的替代维持方法
[0260]
如实例4中所述的双单倍体诱导物(dhi)需要一种防止在dhi的种子增加(自授粉)期间发生加倍过程的方法。此外，大多数转化过程涉及胚发生步骤，当由baby boom 1启动子驱动时，该步骤可以激活实例4中所述的构建体。这样的维持构建体通常具有3种成分：(i)防止通过花粉传播，(ii)种子颜色标记基因，用于鉴定含有维持构建体的种子，以及(iii)抵消性状作用或表型的抵消因子，存在于另一构建体或天然植物基因组中。
[0261]
图5中显示了用于维持dhi系的示例性通用维持构建体。维持构建体被设计为允许双单倍体诱导物(dhi)系的种子生产，而不增加由含有植物转录单元(ptu)的遗传染色体加倍因子引起的倍性。在此实例中，维持构建体包括三种成分：种子颜色ptu，用于鉴定自授粉产生的含有维持构建体的种子；花粉非功能ptu，用于防止维持构建体通过花粉传播(图5a)；以及遗传染色体加倍因子ptu的抑制剂，以使dhi保持二倍体状态。所有功能性花粉将仅含有遗传染色体加倍因子ptu(图5b)，并将在诱导杂交中诱导双单倍体(dh)。维持构建体将通过雌配子传播，并将以杂合状态存在于约50％的dhi自授粉种子中(图5c)。这样的种子用于进一步的种子增加和/或dh诱导。
[0262]
第一成分的实例是玉蜀黍α-淀粉酶基因，其中天然信号肽被来自玉蜀黍脆性-1基因的淀粉体靶向信号肽取代，该淀粉体靶向信号肽由来自玉蜀黍聚半乳糖醛酸酶基因的晚期花粉特异性启动子pg47(seq id no：6；参见wu等人2016.plant biotechnology journal[植物生物技术杂志]14：1046-1054)驱动。第二成分的实例是编码dsred2蛋白编码序列的多核苷酸(seq id no：8)，其由来自大麦脂质转移蛋白(ltp2)基因的启动子驱动，优先在胚乳中表达(seq id no：7；参见wu等人2016.plant biotechnology journal[植物生物技术杂志]14：1046-1054)。第三成分被设计为抑制诱导实例4中所述的染色体加倍的遗传机制
的转录、翻译和/或活性。
[0263]
人工微小rna(amirna)介导的基因沉默就是这样一种技术。amirna技术利用微小rna(mirna)生物发生途径，使用mirna基因骨架产生人工设计的小rna。它产生单一类型的小rna群体，其中所有小rna都具有相同的选择性核酸序列，通常长度为21个核苷酸(nt)，为沉默单个基因或同时沉默密切相关的基因亚型提供了可行的方法。密码子使用差异用于特异性靶向构建体中存在的遗传机制，而不影响所述遗传机制的内源形式的表达。
[0264]
转录阻遏物是与dna上的特定位点结合并阻止附近基因转录的蛋白质，并且代表了另一种抑制诱导染色体加倍的遗传机制的转录、翻译或活性的技术。驱动染色体加倍遗传机制的启动子被修饰以含有阻遏结合位点。阻遏蛋白不会存在于含有维持构建体的植物的活性花粉中，从而允许染色体加倍的遗传机制在受精后在合子中激活。
[0265]
用于抑制染色体加倍活性的示例性方法是使用阻遏蛋白。在没有同源配体的情况下，转录阻遏蛋白通过与操纵子区域或“操纵子”中的特定dna序列结合而起作用。例如，属于细菌调节蛋白的四环素阻遏物(tetr)家族的转录阻遏物是当前方法感兴趣的这样一类转录阻遏物。在大肠杆菌中，在不存在四环素的情况下，tetr与四环素操纵子(teto)序列结合，并且这样的与tetr/操纵子序列的结合亲和力阻遏操纵子基因表达。在四环素存在下，tetr-四环素复合物的构象改变，tetr/操纵子结合亲和力降低，tetr复合物与四环素操纵子解离，并且操纵子的基因表达被激活。
[0266]
这里，描述了使用tetr/操纵子系统来抑制诱导染色体加倍的遗传机制的转录、翻译或活性的条件转录阻遏方法。
[0267]
在一个实施例中，公开了此实例7的方法，其中植物具有稳定掺入的染色体加倍表达盒，该染色体加倍表达盒含有编码遗传染色体加倍因子的多核苷酸，该基因染色体加倍因子可操作地连接到胚发生启动子，如水稻baby boom 1启动子(seq id no：1)(具有至少一个四环素操纵子序列)，这里称为“tet op1(phi)”(seq id no：57)。遗传加倍因子包括但不限于表5中描述的fizzy相关序列；突变的微管蛋白编码序列，如突变的α-微管蛋白tub1-828：d252a/e255a(seq id no：3，由seq id no：5编码)或微管蛋白-ps00227缺失(seq id no：22)；和周期蛋白基因，如zm-cycd2(seq id no：17)。
[0268]
为了阻遏以上染色体加倍表达盒，当前实例的示例性方法还包括具有条件性tetr表达盒的稳定转化植物，该表达盒含有编码可操作地连接到花椰菜花叶病毒35s启动子的四环素阻遏物的多核苷酸(seq id no：58)。例如，这里使用的四环素阻遏物是玉蜀黍密码子优化的合成四环素阻遏蛋白(多核苷酸seq id no：59，编码seq id no：60)。在此实例中，阻遏蛋白不会存在于含有维持构建体的植物的活性花粉中，但会在其他细胞类型中表达。因此，花椰菜花叶病毒35s启动子是一种有用的调节元件，因为它在孢子体细胞中具有活性，而在玉蜀黍花粉中缺乏活性(参见koziel，等人1993.nat biotechnol[自然生物技术]11：194-200；https://doi.org/10.1038/nbt0293-194的表3)。因此，预期tetr蛋白在孢子体生长期间，在大配子发生期间将具有活性，但在小配子发生期间不具有活性。
[0269]
预期这两个表达盒(染色体加倍表达盒和条件tetr表达盒)的组合包含提供抵消因子的方法，该抵消因子抵消染色体加倍性状的作用或表型，从而允许染色体加倍的遗传机制在受精后在合子中激活。
[0270]
以这种方式，预期包含(i)防止通过花粉传播，(ii)种子颜色标记基因，用于鉴定
含有维持构建体的种子，以及(iii)抵消性状的作用或表型的抵消因子的维持构建体是维持双单倍体诱导物的方法的整合成分。
[0271]
实例8：使用替代周期蛋白基因的遗传染色体加倍
[0272]
使用转化的单倍体诱导物系用于体内遗传染色体加倍的方法在本公开的方法中是有用的。实例4的方法描述了体内遗传染色体加倍方法，例如改变雌配子(如卵细胞)的细胞周期调控。特别感兴趣的是实例4c中描述的方法，其中周期蛋白基因在体内赋予单倍体胚遗传染色体加倍活性。额外的细胞周期调控基因对于用于本公开的方法中是有意义的。
[0273]
此实例8描述了使用用于遗传染色体加倍性状的替代周期蛋白基因与由单倍体诱导物系(如stock 6或其任何衍生物)的父本基因组提供的单倍体诱导的组合的方法。
[0274]
本公开的方法简化了双单倍体生产物流，降低了材料成本，减少了劳动需求，通过减少化学加倍剂的实验室使用改善了安全性，并减轻了尽管从衍生自单倍体诱导杂交的供体穗获得胚样品但仍发生的损耗的负面影响。
[0275]
使用周期蛋白家族成员作为dz470蛋白的替代品进行遗传染色体加倍。优选地，周期蛋白家族成员是能够连接生长和细胞周期控制的周期蛋白，如d型周期蛋白。例如，与周期蛋白δ-2蛋白dz470具有同源性的d型周期蛋白。
[0276]
使用实例4中所述的方法，预期使用编码表7所示周期蛋白家族成员的dna多核苷酸创建质粒并将其用于转化到植物中，如实例3所述。
[0277]
表7.
[0278][0279]
预期提供单倍体诱导物系的单倍体诱导特征的同时活性与由替代周期蛋白基因家族成员提供的遗传染色体加倍活性组合用于获得体内二倍体化母本胚。
[0280]
提供单倍体诱导物系的单倍体诱导特征的同时活性与遗传染色体加倍活性组合的益处有很多。这些益处包括但不限于：消除1)进行需要种植供体植物和单倍体诱导物植物的单倍体诱导杂交，2)在进行单倍体诱导杂交后监测胚发育，3)基于胚发育及时收获所述单倍体诱导杂交的供体穗，4)从所述供体穗中分离胚(通常是耗时费力且繁琐的过程)，5)使分离的胚与化学染色体加倍剂接触(该过程造成暴露于哺乳动物细胞的安全性和健康问题)，6)避免处理后的胚与所述化学染色体加倍剂接触，7)从二倍体胚中鉴别和分选单倍体，8)转移选定的单倍体胚以在体外继续组织培养繁殖，9)从所述组织培养步骤再生小植株，10)硬化小植株，11)移植所述硬化小植株，以及12)在每个步骤中可能发生的导致发育受损的负面影响，以及更重要的是所述双单倍体植物的能育性的受损。本文公开的方法对
物流具有积极影响，从而节省成本，并且通过减少整个过程中单倍体胚的损耗，为使用双单倍体技术的育种计划提供生产力提升。
[0281]
实例9：使用广泛杂交的遗传染色体加倍
[0282]
广泛杂交包括由于来自遥远基因库的物种之间的杂交而导致的基因交换或修饰。不同物种或属的个体之间的杂交，在此分别称为种间杂交和属间杂交，提供了一种将分化的基因组组合到一个细胞核中的方法。用于本文公开的方法的广泛杂交包括但不限于获得种间或属间杂交体的方法。
[0283]
广泛杂交的子代(其中广泛杂交的一个亲本用含有编码遗传染色体加倍因子的异源构建体的构建体转化)在本文公开的方法中是有用的。具有遗传染色体加倍性状的亲本用作花粉供体，花粉用于使第二亲本的母本配子体受精。预期第一亲本的遗传染色体加倍活性被提供给第二亲本的母本配子体。预期第二亲本的母本配子体将是单倍体(1n)细胞，其变成包含两组母本染色体的体内二倍体化(2n)细胞。这样的体内二倍体化(2n)细胞用于获得胚，该胚用于获得双单倍体植物。通过这样的双单倍体植物的自体受精获得的子代用于植物育种。
[0284]
预期具有遗传染色体加倍性状的第一亲本的基因组将从母本细胞中消除，例如，在受精之前、期间或之后通过基因组消除。使用栽培玉蜀黍(maize，zea mays)作为第二亲本的广泛杂交将提供用从第一亲本获得的花粉受精的母本配子体。花粉获得自通常不与玉蜀黍性相容的任何植物，包括但不限于获得自以下的花粉，禾本科(poaceae)家族，优选来自包括黍亚科(panicoideae)、芦竹亚科(arundinoideae)、虎尾草亚科(chloridoideae)、micrairoideae、三芒草亚科(aristidoideae)和扁芒草亚科(danthonioideae)的进化枝，并且更优先地来自须芒草族(andropogoneae)亚科，也称为“总族”，包含paspaleae、高粱族(andropogoneae)和野古草族(arundinelleae)。特别感兴趣的是高粱族的tripsacinae亚族，其中香鳞茅属(elionurus)、偏基草属(oxyrhachis)、皱颖草属(rhytachne)、摩擦草属(tripsacum)、尾鳞草属(urelytrum)、河马草属(vossia)或玉蜀黍属(zea)的任何物种都可以用作花粉供体以进行广泛杂交。
[0285]
预期获得用含有赋予遗传染色体加倍活性的多核苷酸的异源构建体稳定转化的花粉供体。例如，编码表达盒的多核苷酸如实例4所述。
[0286]
预期用作花粉供体的第一亲本为第二亲本的母本配子体提供遗传染色体加倍活性。因此，预期与遗传染色体加倍活性接触的单倍体(1n)母本配子体提供包含两组母本染色体的体内二倍体化(2n)胚。这样的体内二倍体化(2n)胚用于获得双单倍体植物，在这里不用化学染色体加倍剂处理母本细胞即可实现。预期二倍体化(2n)胚以对植物育种有用的方式产生双单倍体植物及其子代。

技术特征：
1.一种生产双单倍体植物的方法，所述方法包括：a)提供第一植物，其中所述第一植物包含至少一种引入的遗传染色体加倍剂；b)将所述第一植物与第二植物杂交，其中在不存在外源性施加的化学或生化染色体加倍剂的情况下，所述第一植物的至少一种引入的遗传染色体加倍剂诱导所述第二植物的受精卵细胞的染色体加倍；c)获得包含从所述第二植物遗传的一对染色体且不包含所述引入的遗传染色体加倍剂的二倍体胚；以及d)从所述二倍体胚再生二倍体植物。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一植物是单倍体诱导物。3.如权利要求2所述的方法，其中所述单倍体诱导物包含马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变。4.如权利要求3所述的方法，其中所述马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变是matrilineal(matl)基因。5.如权利要求2所述的方法，其中所述第一植物表达标记基因。6.如权利要求5所述的方法，其中所述标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。7.如权利要求6所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：gus、pmi、pat及其组合。8.如权利要求6所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：gfp、rfp、cfp及其组合。9.如权利要求6所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：b1、r-nj、r1-scm、花青素色素及其组合。10.如权利要求1所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂是遗传染色体加倍多肽。11.如权利要求10所述的方法，其中所述遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的多肽；b)使微管蛋白聚合不稳定的多肽；c)改变细胞周期调控的多肽；以及d)前述的组合。12.如权利要求11所述的方法，其中所述允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：24具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；b)与seq id no：25具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；c)与seq id no：26具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或d)与seq id no：2具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。13.如权利要求11所述的方法，其中所述使微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍多
肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：3具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或b)与seq id no：28具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。14.如权利要求11所述的方法，其中所述改变细胞周期调控的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：23具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；b)与seq id no：86具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；c)与seq id no：87具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；d)与seq id no：88具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；e)与seq id no：89具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；f)与seq id no：90具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；g)与seq id no：91具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；h)与seq id no：92具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；i)与seq id no：93具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；j)与seq id no：94具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；k)与seq id no：95具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；l)与seq id no：96具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；m)与seq id no：97具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；n)与seq id no：98具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；o)与seq id no：99具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；p)与seq id no：100具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；
q)与seq id no：101具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；r)与seq id no：102具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或s)与seq id no：103具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。15.一种生产双单倍体诱导物(dhi)植物的方法，所述方法包括：a)从非转基因单倍体诱导物植物提供可转化的细胞或组织；b)用包含遗传染色体加倍剂的异源dna构建体转化所述细胞或组织：以及c)获得包含引入的遗传染色体加倍剂的双单倍体诱导物(dhi)系。16.如权利要求15所述的方法，其中所述非转基因单倍体诱导物包含马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变。17.如权利要求16所述的方法，其中所述马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变是matrilineal(matl)基因。18.如权利要求15所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂选自由以下组成的组：a)允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的多肽；b)使微管蛋白聚合不稳定的多肽；c)改变细胞周期调控的多肽；以及d)前述的组合。19.如权利要求18所述的方法，其中所述允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：24具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；b)与seq id no：25具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；c)与seq id no：26具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或d)与seq id no：2具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。20.如权利要求18所述的方法，其中所述使微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：3具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或b)与seq id no：28具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。21.如权利要求18所述的方法，其中所述改变细胞周期调控的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：23具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；
b)与seq id no：86具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；c)与seq id no：87具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；d)与seq id no：88具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；e)与seq id no：89具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；f)与seq id no：90具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；g)与seq id no：91具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；h)与seq id no：92具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；i)与seq id no：93具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；j)与seq id no：94具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；k)与seq id no：95具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；l)与seq id no：96具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；m)与seq id no：97具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；n)与seq id no：98具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；o)与seq id no：99具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；p)与seq id no：100具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；q)与seq id no：101具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；r)与seq id no：102具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或s)与seq id no：103具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。22.一种生产双单倍体诱导物(dhi)系的方法，所述方法包括：a)提供包含含有遗传染色体加倍剂的异源dna构建体的转化的第一单倍体诱导物系；b)提供含有标记的第二单倍体诱导物系；
c)将所述第一单倍体诱导物系与所述第二单倍体诱导物系杂交以产生母本胚和二倍体胚的组合；d)基于不存在来自所述第二单倍体诱导物系的选择性标记来选择母本胚；以及e)获得包含引入的遗传染色体加倍剂的双单倍体诱导物(dhi)系，从而产生所述dhi系。23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一单倍体诱导物包括马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变。24.如权利要求23所述的方法，其中所述马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变是matrilineal(matl)基因。25.如权利要求22所述的方法，其中所述标记选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。26.如权利要求22所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：gus、pmi、pat及其组合。27.如权利要求22所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：gfp、rfp、cfp及其组合。28.如权利要求22所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：b1、r-nj、r1-scm、花青素色素及其组合。29.如权利要求22所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂是遗传染色体加倍多肽。30.如权利要求29所述的方法，其中所述遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的多肽；b)使微管蛋白聚合不稳定的多肽；c)改变细胞周期调控的多肽；以及d)前述的组合。31.如权利要求30所述的方法，其中所述允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：24具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；b)与seq id no：25具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；c)与seq id no：26具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或d)与seq id no：2具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。32.如权利要求30所述的方法，其中所述使微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：3具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或b)与seq id no：28具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述改变细胞周期调控的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：23具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；b)与seq id no：86具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；c)与seq id no：87具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；d)与seq id no：88具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；e)与seq id no：89具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；f)与seq id no：90具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；g)与seq id no：91具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；h)与seq id no：92具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；i)与seq id no：93具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；j)与seq id no：94具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；k)与seq id no：95具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；l)与seq id no：96具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；m)与seq id no：97具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；n)与seq id no：98具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；o)与seq id no：99具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；p)与seq id no：100具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；q)与seq id no：101具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；r)与seq id no：102具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或s)与seq id no：103具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基
酸序列。34.一种在近交群体生产中消除或减少胚形成后外源诱导染色体加倍的步骤的方法，所述方法包括将包含引入的遗传染色体加倍剂的双单倍体诱导物(dhi)系与第二系杂交以及获得第二系的双单倍体子代，而无需由于染色体加倍剂的外源处理而染色体加倍的单独步骤，其中所述双单倍体子代不包含所述引入的遗传染色体加倍剂。35.如权利要求34所述的方法，其中所述双单倍体诱导物包含马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变。36.如权利要求35所述的方法，其中所述马铃薯糖蛋白样磷脂酶a2α基因中的功能丧失突变是matrilineal(matl)基因。37.如权利要求34所述的方法，其中所述双单倍体诱导物(dhi)系表达标记基因。38.如权利要求37所述的方法，其中所述标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。39.如权利要求38所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：gus、pmi、pat及其组合。40.如权利要求38所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：gfp、rfp、cfp及其组合。41.如权利要求38所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：b1、r-nj、r1-scm、花青素色素及其组合。42.如权利要求34所述的方法，其中所述引入的遗传染色体加倍剂是遗传染色体加倍多肽。43.如权利要求42所述的方法，其中所述遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的多肽；b)使微管蛋白聚合不稳定的多肽；c)改变细胞周期调控的多肽；以及d)前述的组合。44.如权利要求43所述的方法，其中所述允许在没有细胞分裂的情况下复制基因组的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：24具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；b)与seq id no：25具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；c)与seq id no：26具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或d)与seq id no：2具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。45.如权利要求43所述的方法，其中所述使微管蛋白聚合不稳定的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：3具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；或
b)与seq id no：28具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。46.如权利要求43所述的方法，其中所述改变细胞周期调控的遗传染色体加倍多肽选自由以下组成的组：a)与seq id no：23具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；b)与seq id no：86具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；c)与seq id no：87具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；d)与seq id no：88具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；e)与seq id no：89具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；f)与seq id no：90具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；g)与seq id no：91具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；h)与seq id no：92具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；i)与seq id no：93具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；j)与seq id no：94具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；k)与seq id no：95具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；l)与seq id no：96具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；m)与seq id no：97具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；n)与seq id no：98具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；o)与seq id no：99具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；p)与seq id no：100具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；q)与seq id no：101具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列；r)与seq id no：102具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基
酸序列；或s)与seq id no：103具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。47.一种维持包含遗传染色体加倍剂的双单倍体诱导物(dhi)系的方法，所述方法包括：a)提供包含异源维持构建体的维持系，所述维持构建体包含(i)用于所述遗传染色体加倍剂的阻遏物或抑制剂成分，(ii)花粉传播阻止成分，和(iii)用于鉴定含有所述维持构建体的种子的选择性标记成分；b)使具有所述维持构建体和所述遗传染色体加倍剂的维持系自体受精；c)从自体受精中鉴定含有所述维持构建体的种子，其中所述维持构建体存在于约50％的f1种子中；以及d)使所述含有维持构建体的种子生长，从而使所述dhi系维持在二倍体状态，以用于进一步的种子增加或单倍体诱导杂交。48.如权利要求47所述的方法，其中所述阻遏物或抑制剂是所述遗传染色体加倍剂的转录阻遏物。49.如权利要求47所述的方法，其中所述阻遏物或抑制剂是靶向所述遗传染色体加倍剂的转录物的人工微小rna。50.如权利要求47所述的方法，其中所述选择性标记是适用于种子分选的基于颜色的标记。51.如权利要求47所述的方法，其中所述花粉传播阻止成分是降低花粉活力从而阻止所述维持构建体通过花粉传播的遗传元件。52.一种双单倍体诱导物(dhi)维持系，其包含遗传染色体加倍剂和异源维持构建体，所述维持构建体包含(i)用于遗传染色体加倍剂的阻遏物或抑制剂成分，(ii)花粉传播阻止成分，和(iii)用于鉴定含有所述维持构建体的种子的选择性标记成分。53.如权利要求52所述的维持系，其中所述阻遏物或抑制剂是所述遗传染色体加倍剂的转录阻遏物。54.如权利要求52所述的维持系，其中所述阻遏物或抑制剂是靶向所述遗传染色体加倍剂的转录物的人工微小rna。55.如权利要求52所述的维持系，其中所述选择性标记是适用于种子分选的基于颜色的标记。56.如权利要求52所述的维持系，其中所述花粉传播阻止成分是降低花粉活力从而阻止所述维持构建体通过花粉传播的遗传元件。57.如权利要求1所述的方法，其中所述第一植物是与所述第二植物不同的植物物种的单倍体诱导物。58.如权利要求1所述的方法，其中所述第一植物用于广泛杂交。59.如权利要求1所述的方法，其中所述第二植物物种是玉米、大豆、小麦、芸苔、棉花或高粱。60.如权利要求1所述的方法，其中所述第二植物物种是非杂交作物物种。

技术总结
提供了产生双单倍体诱导物的方法。这些双单倍体诱导物用于生产母本双单倍体。单倍体诱导物用于生产母本双单倍体。单倍体诱导物用于生产母本双单倍体。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：先锋国际良种公司
技术研发日：2021.10.20
技术公布日：2023/8/24