用于检测样品中的目标分析物的方法与流程

1.本发明涉及一种用于测定至少一种感兴趣的分析物的方法。本发明进一步涉及试剂盒、复合物、合成复合物的方法及其用于检测样品中的目标分析物的用途。


背景技术：

2.us 9,511,150报道了糖醇和交联试剂、大分子和治疗性生物缀合物。us 2016/0250896报道了膦酸酯和磺酸酯以及亲水接头，以及此类接头用于药物至细胞结合分子的缀合的用途。us 2010/0009902报道了与具有选定分子量的peg(聚乙二醇)的缀合。vlahov i.r.等人j.org.chem.75(2010)3685-3691报道了一种基于碳水化合物的合成方法来控制叶酸-药物缀合物的毒性特征。更详细地，该文件公开了将1-氨基-1-脱氧-d-葡萄糖醇-γ-谷氨酸盐亚基掺入肽骨架中。从δ-葡萄糖酸内酯，分四个步骤实现了fmoc-3，4；5，6-二-o-亚异丙基-1-氨基-1-脱氧-d-葡萄糖醇-γ-谷氨酸盐的合成，适合于fmoc策略固相肽合成(spps)。交替加入谷氨酸和3，4；5，6-二-o-亚异丙基-1-氨基-1-脱氧-d-葡萄糖醇-γ-谷氨酸盐部分至负载半胱氨酸的树脂上，随后加入叶酸，脱保护和裂解，使得裂解出新的叶酸间隔物：pte-γglu-(glu(1-氨基-1-脱氧-d-葡萄糖醇)-glu)
2-glu(1-氨基-1-脱氧-d-葡萄糖醇)-cys-oh。
3.聚合物化学领域已知的特定技术特征为多分散性，它表示并入的单体的量和/或聚合物链长度缺乏均匀性。特定的技术问题为由经常观察到的包含接头的化合物和缀合物的多分散性引起的。
4.具体而言，基于peg的接头可能具有此类缺点。由于通常使用的聚合化学的技术特征，产生的高分子量peg分子表征为显著的多分散性。即，典型的聚合会产生具有不同分子质量的分子的混合物。使用此类混合分子量的peg分子作为接头会导致产生的缀合物之间的多分散性的传播。结果，缀合物的任何分析都是复杂的，因为所需的缀合物将被定义为均匀的分子量。然而，达不到这种均匀的分子量。此外，尽管间隔物中的peg部分具有亲水性，但某些带有peg的缀合物仍然缺乏足够的溶解度。
5.由于糖化学的复杂性和困难性，多糖也往往为多分散的并且结构可变的。更长和更复杂的醇的合成需要精细和低产率的保护基团操作。
6.因此在本领域中迫切需要克服上述提及问题。
7.对于本发明，已经设计出具有多元醇的特定的基本上单分散的接头分子，其可用于有利地交联功能分子。发明人已经发现，具有多元醇的某些接头分子不仅仅提供优于含peg衍生物的亲水性。在示例性设置中，包含此类接头(使分析物特异性结合剂和标记化合物交联)的复合物在分析物检测测定中产生改进的信噪比。此外，接头和/或复合物显示出单分散性，这优选地由肽合成产生并且可以通过hplc色谱图显示。
8.本发明的目的为提供一种用于检测样品中的目标分析物的方法。此外，本发明的目的为提供试剂盒、复合物、合成复合物的方法及其用于检测样品中的目标分析物的用途。
9.该目的或这些目的由独立权利要求的主题来解决。进一步的实施例服从于从属权
利要求。


技术实现要素：

10.在下文中，本发明涉及以下方面：
11.在第一方面，本发明涉及一种用于检测样品中的目标分析物的方法，该方法包括以下步骤：
12.a)提供包含目标分析物的样品，
13.b)提供包含接头的复合物，其中该接头共价结合标记化合物和分析物特异性结合剂，其中该标记化合物能够产生可检测信号，优选地是基于化学发光的信号，
14.c)将步骤a)的样品与步骤b)的复合物偶联，
15.d)通过使用标记化合物的可检测信号来检测目标分析物，
16.其中复合物为式i化合物：
[0017][0018]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0019]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0020]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0021]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0022]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0023]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0024]
z为整数并且≥1。
[0025]
在第二方面，本发明涉及根据本发明的第一方面所述的方法用于检测样品中的目标分析物的用途。
[0026]
在第三方面，本发明涉及一种用于对样品中的目标分析物进行检测的试剂盒该试剂盒在单独的容器中包括
[0027]
a)能够固定分析物的固相；
[0028]
b)式i化合物：
[0029][0030]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0031]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0032]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0033]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0034]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0035]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0036]
z为整数并且≥1。
[0037]
在第四方面，本发明涉及根据本发明的第三方面所述的试剂盒用于检测样品中的目标分析物的用途。
[0038]
在第五方面，本发明涉及式i复合物：
[0039][0040]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0041]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0042]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0043]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0044]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0045]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0046]
z为整数并且≥1，
[0047]
优选地，其中该化合物适合于检测样品中的目标分析物。
[0048]
在第六方面，本发明涉及一种方法，其用于合成根据本发明的第五方面所述的复合物，该方法包括以下步骤
[0049]
a)提供单体或其衍生物，其中该单体为包含氨基基团、羧基基团和至少一个羟基基团的氨基酸，其中该氨基基团或该羧基基团被第一保护基团保护，并且所述至少一个羟基基团或每个羟基基团被第二保护基团保护，
[0050]
b)在固相肽合成的过程中使用该单体，裂解第一保护基团和第二保护基团并且形成式iii复合物，
[0051][0052]
其中a代表该标记化合物，并且r代表第二间隔物，或反之亦然，其中r能够共价键合至分析物特异性结合剂或被共价键合至分析物特异性结合剂，
[0053]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0054]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0055]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0056]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0057]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0058]
z为整数并且≥1。
附图说明
[0059]
图1显示了elecsys ecl技术。
[0060]
图2至图4显示了elecsys e170的结果：根据本发明和根据比较例的肌钙蛋白t hs测定。
具体实施方式
[0061]
在下文详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的特定实施例和实例，因为这些实施例和实例可以变化。还应当理解，如本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外指明，否则本文所用的所有科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
[0062]
本说明书文本全文引用了若干文献。本文所引用的文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明等)中的每一篇，无论上文或下文中引用，均通过引用而以其整体并入本文。在此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导矛盾时，以本说明书文本为准。
[0063]
下面将描述本发明的元件。这些元件与具体实施例一起列出，然而，应理解，它们可以任何方式和任何数目组合以创建另外的实施例。各种描述的实例和优选实施例不应解释为仅将本发明限制为明确描述的实施例。此描述应理解为支持并且涵盖将明确描述的实施例与任何数目的所公开和/或优选元件组合的实施例。此外，除非上下文另有说明，否则本技术中所有所描述要素的任何排列和组合均应视为由本技术的说明书公开。
[0064]
定义
[0065]
词语“包括”以及变体诸如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。
[0066]
如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括多个指代物。
[0067]
百分比、浓度、量和其他数值数据在本文中可以“范围”格式表达或呈现。应当理解，此类范围格式仅出于方便和简洁而使用，因此应灵活地解释为不仅包括明确列举为范围限值的数值，而且包括该范围所涵盖的所有单独的数值或子范围，就如同明确列举出每个数值和子范围一样。作为例示，数值范围“4％至20％”应解释为不仅包括明确列举出的4％至20％的值，而且包括所示范围内的各个值和子范围。因此，此数值范围中包括个体值诸如4、5、6、7、8、9、10、...18、19、20％和子范围诸如4-10％、5-15％、10-20％等。此相同原则适用于引用最小值或最大值的范围。此外，无论所述范围或特征的广度如何，均适用此类解释。
[0068]
当与数值相连使用时，术语“约”意为涵盖处于一定范围内的数值，该范围具有比所指示的数值小5％的下限和比所指示的数值大5％的上限。
[0069]
如本文所用，术语“检测”目标分析物，指目标分析物的定量或定性，例如样品中的
目标分析物存在或量(采用本文别处描述的适当检测方法)。
[0070]
在本公开的上下文中，术语“分析物”、“分析物分子”或“目标分析物”可互换使用，其指经由可检测标记分析的化学物质。适合经由可检测标记分析的化学物质，即分析物，可以为活体生物体中存在的任何种类的分子，包括但不限于核酸(例如，dna、mrna、mirna、rrna等)、氨基酸、肽、蛋白质(例如，细胞表面受体、胞质蛋白等)、药物分子、代谢物或激素(例如，睾酮、雌激素、雌二醇等)、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物(例如，维生素d)、以另一分子的某一修饰(例如，蛋白质上的糖部分或磷酰残余物、基因组dna上的甲基-残余物)为特征的分子或已经由生物体内化的物质(例如，治疗性药物、滥用的药物、毒素等)或此类物质的代谢物。此类分析物可用作生物标志物。在本发明的上下文中，术语“生物标志物”指生物学系统内的物质，其用作所述系统的生物学状态的指示物。“分析物”可以是可以被分析物特异性受体结合的任何分子。在一实施例中，分析物是传染原的抗原。传染原的实例是感染人类的病毒、细菌和原生动物病原体。在一实施例中，分析物是病毒抗原，在一实施例中是肝炎病毒抗原或人逆转录病毒抗原。在一实施例中，分析物是丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒或hiv抗原。
[0071]
通常，术语“受体”表示能够识别靶分子(即分析物的表位位点)的特定空间和极性组织的任何化合物或组合物。因此，本文所指的术语“分析物特异性受体”包括能够与分析物结合或复合的分析物特异性反应物。这包括但不限于抗体，具体地单克隆抗体或抗体片段。这种受体可以充当分析物的捕集器，例如以固定分析物。结合抗体识别的表位，然后是对分析物的另一个表位特异的标记抗体。其他受体是本领域技术人员已知的。参考本公开，本领域技术人员将理解各种受体在基于受体的分析物测定中的特定用途。
[0072]
分析物或目标分析物可以存在于样品中，例如生物学或临床样品中。术语“生物或临床样品”在本文中可互换使用，其是指组织、器官或个体的一部分或一片，通常小于这种组织、器官或个体，旨在代表整个组织、器官或个体。在分析时，生物或临床样品提供关于组织状态或者器官或个体的健康或患病状态的信息。生物或临床样品的实例包括但不限于：流体样品，诸如血液、血清、血浆、滑液、脊髓液、尿液、唾液和淋巴液；或固体样品，诸如干血斑和组织提取物。生物或临床样品的其他实例为细胞培养物或组织培养物。
[0073]
在本公开的上下文中，术语“抗体”涉及完整的免疫球蛋白分子，具体为igm、igd、ige、iga或igg，以及此类免疫球蛋白分子的部分，如fab-片段或v
l-、v
h-或cdr-区域。此外，该术语涉及修饰和/或改变的抗体，如嵌合和人源化抗体。该术语还涉及修饰或改变的单克隆或多克隆抗体以及重组或合成产生/合成的抗体。该术语还涉及完整抗体以及抗体片段/其部分，例如分离的轻链和重链、fab、fab/c、fv、fab
′
、f(ab
′
)2。术语“抗体”还包括抗体衍生物、双功能抗体和抗体构建体，如单链fv(scfv)、双特异性scfv或抗体融合蛋白。
[0074]
在化学中，“固相合成”为一种分子共价结合在固体支持物材料上，并利用选择性保护基团化学在单一反应容器中逐步合成的方法。作为一个具体的实施例，固相肽合成为涉及肽的合成的离散步骤的常用技术。此方法允许通过洗涤去除未反应的试剂而不损失产物。通常，肽为从氨基酸链的羰基基团侧(c末端)到氨基基团侧(n末端)合成的。在肽合成中，受保护的氨基的氨基酸结合至固相材料(诸如但不限于聚苯乙烯珠粒)，从而在羰基基团与树脂之间形成共价键，最常见的为酰胺键或酯键。然后氨基基团脱保护并与下一个受保护的氨基的氨基酸的羰基反应。固相现在荷有二肽。重复此循环以形成所需的肽链。所有
反应完成后，合成的肽从固相中裂解出来。
[0075]
更具体地说，每个进入的氨基酸的羧基部分被几种策略中的一种激活，并与前述氨基酸的α-氨基基团偶联。进入残余物的α-氨基基团被暂时封闭，以阻止在此位点形成肽键。残余物在下一个合成周期的开始处被解封。此外，氨基酸上的反应性侧链被用适当的保护基团修饰。肽链通过合成循环的重复而延长。过量试剂用于驱动反应尽可能接近完成。
[0076]
用于封闭α-氨基的“封闭基团”或“保护基团(protecting group)”或“保护基团(protection group)”决定了所采用的合成化学和侧链保护基团的性质。两个最常用的α-氨基保护基团为fmoc(9-芴基-甲氧基-羰基)和tboc(叔丁氧基羰基)。fmoc侧链保护通常由叔丁醇的酯、醚和尿烷衍生物提供，而典型的对应tboc保护基团为苯甲醇的酯、醚和尿烷衍生物。后者通常通过引入吸电子卤素来改性，以提高酸稳定性。也可采用环戊醇或环己醇的醚和酯衍生物。
[0077]
完全组装肽后，如果需要，可去除侧链保护基团，然后使用对不稳定残余物造成最小破坏的条件将肽从固体支持物中裂解出来。
[0078]
其后可以分析产物以验证序列。合成肽通常通过凝胶色谱法或hplc进行纯化。
[0079]
可以通过不同的方法将标记和/或目标分子偶联到肽上。作为一个非限制性实例，可将适用于spps的结构单元并入肽中，其中结构单元包含反应基团，该反应基团任选地被保护并且可用于在spps过程后与选择的其他化合物形成连接。或者，选择的化合物在进入spps过程时可能已经附加到结构单元上。其他替代方案是可能的。
[0080]
fmoc保护基团为碱不稳定的。它通常用稀碱诸如哌啶去除。通过用三氟乙酸(tfa)处理来去除侧链保护基团，三氟乙酸也会裂解将肽固定在支持物上的键。用弱酸(通常为稀tfa)去除tboc保护基团。氢氟酸(hf)既可用于氨基酸侧链的脱保护，也可用于将肽从树脂支持物中裂解出来。fmoc为一种比tboc更温和的方法，因为肽链在每个循环中都不会受到酸的影响，并且已成为商业自动化肽合成中采用的主要方法。
[0081]
肽合成中最多使用的氨基基团的保护基团为9-芴基甲基氧基羰基基团(fmoc)和叔丁氧基羰基(boc)。许多氨基酸在侧链中荷有官能团，必须特别保护这些官能团以免与进入的受保护的n氨基酸发生反应。与boc和fmoc基团相反，它们在肽合成的过程中必须保持稳定，尽管它们在肽的最终脱保护期间也会被去除。
[0082]“标记化合物”包括可检测的或可变得可检测的部分。技术人员知道标记为能够提供与物理活化(或激发)或化学试剂结合的可检测信号，并且能够被修饰从而减小或增加特定信号的化合物或组合物。
[0083]
能够产生可检测信号的标记化合物的具体实施例，包括可由许多利用化学发光，优选地电化学发光(ecl)用于分析测量的市售仪器检测的标记。可以诱导发射ecl的种类(ecl活性种类)已被用作ecl标记。ecl标记的实例包括：i)有机金属化合物，其中金属来自例如第viii族贵金属，包括含ru、含ir和/或含os的有机金属化合物，诸如三联吡啶钌(rubpy)部分和ii)鲁米诺和相关化合物。与ecl标记一起参与ecl过程的种类在本文中称为ecl共反应物。常用的共反应物包括叔胺(参见例如us5,846,485)、草酸盐和用于来自rubpy的ecl的过硫酸盐和用于来自鲁米诺的ecl的过氧化氢(参见例如us5,240,863。ecl标记产生的光可用作诊断程序中的报告信号(bard et al.，us5,238,808)。例如，ecl标记可以与结合剂共价偶联，诸如抗体、核酸探针、受体或配体；结合试剂在结合相互作用中的参与可
以通过测量从ecl标记发出的ecl来监测。或者，来自ecl活性化合物的ecl信号可以指示化学环境(参见例如us5,641,623，其描述了监测ecl共反应物的形成或破坏的ecl测定)。有关ecl、ecl标记、ecl测定和用于进行ecl测定的仪器的更多背景，请参阅us5,093,268；us5,147,806；us5,324,457；us5,591,581；us5,597,910；us5,641,623；us5,643,713；us5,679,519；us5,705,402；us5,846,485；us5,866,434；us5,786,141；us5,731，147；us6,066,448；us6,136,268；us5,776,672；us5,308,754；us5,240,863；us6,207,369和us5,589,136；和wo99/63347、wo00/03233、wo99/58962、wo99/32662、wo99/14599、wo98/12539、wo97/36931和wo98/57154。
[0084]
术语“基于化学发光的信号”指作为化学反应的结果由光的发射(发光)产生的信号。此信号为例如通过许多利用化学发光的市售仪器可检测的。
[0085]
在本公开的上下文中，术语“复合物”指通过接头、标记化合物与分析物特异性结合剂的反应产生的产物。此反应导致一方面在标记化合物与接头之间形成共价键，另一方面在接头与分析物特异性结合剂之间形成共价键。
[0086]
术语“接头”可以指用作标记化合物与分析物特异性结合剂之间的间隔物和/或影响复合物的物理化学性质诸如亲水性和溶解度的化合物。
[0087]
术语“分析物特异性结合剂”指能够特异性结合目标分析物的(大)分子(蛋白质、肽、核酸等)，例如单克隆抗体。
[0088]
术语“a代表标记化合物，并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然”表示：式i的a代表标记化合物，并且式i的b代表分析物特异性结合剂。或者，其表示：式i的b代表标记化合物，并且式i的a代表分析物特异性结合剂。
[0089]
术语“将步骤a)的样品与步骤b)的复合物偶联”指包含或含有目标分析物的样品与步骤b)的复合物的反应。优选地，偶联指样品(优选地目标分析物)与复合物之间的共价结合。
[0090]
术语“肽”指表示使用天然存在的l-氨基酸或其类似物，如d-氨基酸或n-烷基化氨基酸等形成的分子。优选的氨基酸选自由以下项组成的组：ala、arg、asn、asp、cys、glu、gln、gly、his、hyl、hyp、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr和val。其他结构单元也可能具有羧酸和氨基基团。此外，如荧光染料或生物素等修饰也是可能的。
[0091]“固相肽合成(spps)”为一种行之有效的方法。merrifield等人为通过随后使用固相树脂作为异质性反应介质来偶联氨基酸单体而开发出构建肽的便捷策略的第一批人(r.b.merrifield，j.am.chem.soc.85(1963)2149-2154)。
[0092]
与肽的溶液内合成相比的一个主要优点，spps可以轻松实现自动化，并且杂质或副产品、试剂以及未反应的起始材料可以被洗掉，而产品或中间体仍被束缚在固相上。
[0093]
通常，以上所提及的merrifield方法开始于将第一c末端氨基酸附接到交联聚苯乙烯树脂的所谓“接头”。“接头”作为树脂与待合成肽的c末端氨基酸之间的桥接元件，并且接头含有用于合成后肽的脱离的酸敏键。
[0094]
作为一个典型的spps协议的实例，n末端可以用9-芴基甲氧基羰基(fmoc)基团保护，该基团在酸中稳定，但可以被碱去除。任何侧链官能团都用碱基稳定基团保护，以确保在去除fmoc基团后，只有并入肽骨架的n末端氨基基团才能与随后氨基酸的甲酸基团发生反应。如已经提及的，固定第一氨基酸后的第一步骤为：通过使用20％哌啶的n，n-二甲基甲
酰胺(dmf)溶液去除fmoc基团来使氨基官能脱保护。氨基官能经由下一个氨基酸的o-(苯并三唑-1-基)-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲鎓六氟磷酸盐(hbtu)酯在碱基存在下与活化的羧酸偶联而形成新的酰胺键。重复此过程，直到所需的肽在树脂上组装。作为最后的步骤，使用含有三氟乙酸(tfa)的溶液将完整的肽从树脂中裂解出来。溶液中释放的肽可在进一步纯化前沉淀和洗涤。
[0095]
近年来，这种spps的“经典”方法使用改性树脂、接头、保护基团、偶联化学和裂解程序来优化，但原理保持不变。
[0096]
如本文所用，术语“固相”指本领域技术人员通常使用的来隔离分子的多种材料，包括固体、半固体、凝胶、薄膜、膜、网、毡、复合材料、颗粒、树脂、纸等。固相可以为例如在色谱柱中或作为具体实施例的材料，其用作固相合成的装置的柱中的功能化树脂。固相可以是无孔的或多孔的。固相可以为非磁性的或磁性的(涵盖抗磁性、顺磁性和超顺磁性特征)。
[0097]
如上所述的那些固相的表面可以被修饰以提供连接位点，例如通过溴乙酰化、硅烷化、使用硝酸加成氨基和连接中间蛋白质、树枝状聚合物和/或星形聚合物。该列表并不意味着限制，并且可以使用本领域技术人员已知的任何方法。
[0098]
术语“多元醇单元”指包含1个或多个oh基团的单体(例如氨基酸)。此类单体可以共价连接至彼此以形成均聚物或杂聚物。
[0099]
术语“线性接头”指由多元醇单元形成的接头，其中所有或至少所有oh基团直接结合至接头骨架/主链。
[0100]
术语“支化接头”指由其中一个或多个oh基团结合至侧链的多元醇单元形成的接头。术语“整数”表示整数而不是分数。
[0101]“试剂盒”是包含至少一种本发明试剂的任何制品(例如，包装或容器)，该试剂例如是用于治疗疾病的药品，或用于特异性地检测生物标志物基因或蛋白质的探针。试剂盒优选作为用于执行本发明方法的单元来推销、分发或贩售。通常，试剂盒可进一步包括被分隔开的载体装置以在紧密的限定空间中接纳一个或多个容器装置，诸如小瓶、管等。特别地，每个容器意味着包含将在第一方面的方法中使用的单独元件之一。试剂盒可进一步包含一种或多种其他试剂，包括但不限于反应催化剂。试剂盒可进一步包含一个或多个包含其他材料的其他容器，该其他材料包括但不限于缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。标记物可存在于容器上以指示将组合物用于具体应用，并且也可指示体内或体外使用的指南。计算机程序代码可提供于数据存储介质或装置诸如光学存储介质(例如，光盘)上或直接提供于计算机或数据处理装置上。此外，试剂盒可包含如本文别处所述的用于校准目的生物标志物的标准量。
[0102]
在该详细描述中，对“一个实施例”、“一实施例”或“在实施例中”的提及意味着所提及的特征包括在关于根据本公开的所有方面的技术的至少一个实施例中。此外，对“一个实施例”、“一实施例”或“实施例”的单独提及不一定指代相同的实施例；然而，这些实施例都不是相互排斥的，除非另有说明，并且除非对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，根据本公开的技术在其所有方面可以包括本文描述的实施例的任何种类的组合和/或集成。
[0103]
实施例
[0104]
在第一方面，本发明涉及一种用于检测样品中的目标分析物的方法，该方法包括
以下步骤：
[0105]
a)提供包含目标分析物的样品，
[0106]
b)提供包含接头的复合物，其中该接头共价结合标记化合物和分析物特异性结合剂，其中该标记化合物能够产生可检测信号，优选地是基于化学发光的信号，
[0107]
c)将步骤a)的样品与步骤b)的复合物偶联，
[0108]
d)通过使用标记化合物的可检测信号来检测目标分析物，
[0109]
其中复合物为式i化合物：
[0110][0111]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0112]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0113]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0114]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0115]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0116]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0117]
z为整数并且≥1。
[0118]
发明人惊奇地发现，本发明的主题，特别是根据本发明的第一方面的方法，显示了一种复合物，其特别地包含基于肽的多元醇接头，其对结构和多分散性具有极好的控制。使用单一分子量和纯接头降低产品纯化、表征的复杂性并提高制造的可重复性。特别地，固相肽化学可用于产生本发明的复合物。
[0119]
根据本发明的方法包括基本上由上述步骤组成的方法或包括其他步骤的方法。此外，本发明的方法优选地是离体方法，更优选地是体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可涉及检测其他目标分析物和/或样品预处理、富集步骤或评估通过该方法得到的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。优选地，步骤(a)、(b)、(c)和/或(d)可以全部或部分由自动化辅助，例如由合适的机器人和传感设备辅助。
[0120]
根据步骤b)，提供了复合物。该复合物为式i化合物。该复合物包含接头。该接头共价结合标记化合物和分析物特异性结合剂。标记化合物能够产生可检测信号。优选地，可检测标记为基于化学发光的信号。
[0121]
根据步骤c)，将步骤a)的样品与步骤b)的复合物偶联。
[0122]
根据步骤d)，通过使用标记化合物的可检测信号来检测目标分析物。
[0123]
在本发明的第一方面的实施例中，x为oh。在这种情况下，可以形成包含具有多元醇单元的线性接头的复合物。或者，x为(choh)t-ch2oh，其中t≥1。优选地t＝1、3、5或7，例如3或5。在这种情况下，可以形成包含具有多元醇单元的支化接头的复合物。
[0124]
在本发明的第一方面的实施例中，m为整数。m选自1至8的范围。优选地，m大于或等于2，例如2或3或4或5或6或7或8。
[0125]
在本发明的第一方面的实施例中，n为整数。n选自1至20的范围。优选地，m大于或等于2，例如2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20。
[0126]
在本发明的第一方面的实施例中，r为整数。r大于或等于0。优选地，例如在x＝(choh)
t-ch2oh，其中t≥1的情况下，r为0。在x＝oh的情况下，r大于或等于1。
[0127]
在本发明的第一方面的实施例中，s为整数。s大于或等于0。优选地，s为0。
[0128]
在本发明的第一方面的实施例中，z为整数。z大于或等于1。优选地，z为5至10。
[0129]
在本发明的第一方面的实施例中，该复合物为式ii化合物：
[0130][0131]
其中a、b、m和n中的每一者与上述关于式i所提及者具有相同的含义，
[0132]
其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7。
[0133]
在本发明的第一方面的实施例中，该复合物为式iii化合物：
[0134][0135]
其中a、b、m和n中的每一者与上述关于式i所提及者具有相同的含义，
[0136]
其中x为oh并且r≥1，优选地r＝1。
[0137]
在本发明的第一方面的实施例中，步骤b)包括基于肽的合成，优选地固相肽合成(spps)。
[0138]
在本发明的第一方面的实施例中，x为oh且/或m为2或4或6。
[0139]
在本发明的第一方面的实施例中，x为(choh)
t-ch2oh，其中t＝1、3、5或7。
[0140]
在本发明的第一方面的实施例中，标记化合物选自由以下项组成的组：酶、荧光染料、发光染料、金属螯合物复合物以及含有放射性同位素的部分。
[0141]
在本发明的第一方面的实施例中，标记化合物能够在电化学氧化或还原时被诱导以发光。
[0142]
在本发明的第一方面的实施例中，标记化合物包含金属离子，其为ru
2+
或ir
3+
。
[0143]
优选地，该标记化合物选自以下组：ru或ir。
[0144]
在本发明的第一方面的实施例中，标记化合物经由第一缀合方法被共价键合至接头，其中第一缀合方法选自下组：点击化学、酰胺、酯、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、二氢哒嗪、硫醇-马来酰亚胺、环加成、四嗪连接、光点击、施陶丁格连接、狄尔斯-阿尔德反应、交叉偶联、皮克特-施彭格勒反应、四环庚烷。
[0145]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物特异性结合剂选自由以下项组成的组：
抗体、抗体的分析物特异性片段和/或衍生物、适配体、镜像适配体、设计的锚蛋白重复蛋白、凝集素、含有锚蛋白重复序列的蛋白质，以及含有kunitz型结构域的蛋白质。
[0146]
在本发明的第一方面的实施例中，分析物特异性结合剂经由第二缀合方法共价键合至接头，其中第二缀合方法选自以下组：点击化学、酰胺、酯、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、二氢哒嗪、硫醇-马来酰亚胺、环加成、四嗪连接、光点击、施陶丁格连接、狄尔斯-阿尔德反应、交叉偶联、皮克特-施彭格勒反应、四环庚烷。
[0147]
优选地，分析物特异性结合剂选自下组：抗体、fab。
[0148]
在本发明的第一方面的实施例中，式i、ii或iii的a代表标记化合物并且式i、ii或iii的b代表分析物特异性结合剂。
[0149]
在本发明的第一方面的实施例中，式i、ii或iii的b代表标记化合物并且式i、ii或iii的a代表分析物特异性结合剂。
[0150]
在本发明的第一方面的实施例中，在步骤(c)前、期间或后，将分析物固定在固相上。
[0151]
在本发明的第一方面的实施例中，样品选自由以下项组成的组：痰液、唾液、清液、尿液、全血、溶血全血、血清和血浆。
[0152]
在本发明的第一方面的实施例中，步骤(b)的复合物以溶解形式提供，并且步骤(c)在液体水性缓冲液中进行。
[0153]
在本发明的第一方面的实施例中，液体水性缓冲液选自：磷酸盐、tris缓冲液、柠檬酸盐、二甲胂酸盐、巴比妥、甘氨酸、hepes、mes、pipes、mops、bis-tris甲烷、ada、bis-tris丙烷、aces、mopso、bes、ampb、tes、dipso、mobs、乙酰氨基甘氨酸、tapso、tea、popso、heppso、eps、hepps、tricine、甘氨酰胺、gly-gly、hepbs、bicine、taps及其混合物。
[0154]
在本发明的第一方面的实施例中，液体水性缓冲液选自：磷酸盐、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris，优选地其中ph为6.0-7.4)及其混合物。
[0155]
在本发明的第一方面的实施例中，该复合物为式iv-1或式iv-2化合物：
[0156][0157]
其中n大于1，优选地1≤n≤15，例如n＝10。优选地，该复合物为具有下式的化合物：
[0158][0159]
此化合物在此处缩写为bpru-(mf77)
10
k(mh)酰胺。
[0160]
在本发明的第一方面的实施例中，该复合物包括式v或式vi化合物：
[0161][0162]
其中式v或式vi的n彼此独立地大于1，优选地1≤n≤15，例如n＝10。
[0163]
优选地，该复合物为具有下式的化合物：
[0164][0165]
此化合物在此处缩写为bpru-(mf74)5k(mh)酰胺。
[0166]
优选地，该复合物为具有下式的化合物：
[0167][0168]
优选地，该复合物为具有下式的化合物：
[0169][0170]
在实施例中，标记化合物不包括或不含叶酸或其衍生物。
[0171]
在实施例中，标记化合物不包括或不含叶酸受体结合配体。
[0172]
在实施例中，分析物特异性结合剂不包括或不含半胱氨酸。
[0173]
在实施例中，该方法不含药物递送。
[0174]
在实施例中，该方法为诊断方法，优选地为体外诊断方法。
[0175]
在实施例中，n＞2。
[0176]
在实施例中，n＞4。
[0177]
在实施例中，标记化合物不含药物化合物，例如去乙酰基长春花碱酰肼或其衍生物。
[0178]
在实施例中，x＝(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7。
[0179]
在第二方面，本发明涉及根据本发明的第一方面的方法用于检测样品中的目标分析物的用途。
[0180]
对于本发明的第一方面提及的所有实施例都适用于本发明的第二方面，且反之亦然。
[0181]
在第三方面，本发明涉及一种用于对样品中的目标分析物进行检测的试剂盒该试剂盒在单独的容器中包括
[0182]
a)能够固定分析物的固相；
[0183]
b)式i化合物：
[0184][0185]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0186]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0187]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0188]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0189]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0190]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0191]
z为整数并且≥1。
[0192]
对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面提及的所有实施例都适用于本发明的第三方面，且反之亦然。
[0193]
在本发明的第三方面的实施例中，该复合物为式ii化合物：
[0194][0195]
其中a、b、x、m和n中的每一者与方面21中所提及者具有相同的含义，
[0196]
其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7。
[0197]
在本发明的第三方面的实施例中，该复合物为式iii化合物：
[0198][0199]
其中a、b、m和n中的每一者与方面21中所提及者具有相同的含义，
[0200]
其中x为oh并且r≥1，优选地r＝1。
[0201]
在本发明的第三方面的实施例中，x为oh并且m为2或4或6。
[0202]
在本发明的第三方面的实施例中，x为(choh)
t-ch2oh，其中t＝1、3、5或7。
[0203]
在本发明的第三方面的实施例中，该复合物以溶解的形式体现。
[0204]
在本发明的第三方面的实施例中，至少一个容器或多个容器由玻璃或塑料制成。
[0205]
在第四方面，本发明涉及根据本发明的第三方面的试剂盒用于检测样品中的目标分析物的用途。
[0206]
对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面提及的所有实施例都适用于本发明的第四方面，且反之亦然。
[0207]
在第五方面，本发明涉及式i的a复合物：
[0208][0209]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0210]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0211]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0212]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0213]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0214]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0215]
z为整数并且≥1，
[0216]
优选地，其中该化合物适合于检测样品中的目标分析物。
[0217]
对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面和/或本发明的第四方面提及的所有实施例都适用于本发明的第五方面，且反之亦然。
[0218]
在本发明的第五方面的实施例中，该复合物为式ii化合物：
[0219][0220]
其中a、b、x、m和n中的每一者与方面28中所提及者具有相同的含义，
[0221]
其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7。
[0222]
在本发明的第五方面的实施例中，该复合物为式iii化合物：
[0223][0224]
其中a、b、m和n中的每一者与方面28中所提及者具有相同的含义，
[0225]
其中x为oh并且r≥1，优选地r＝1。
[0226]
在本发明的第五方面的实施例中，x为oh并且m为2或4或6。
[0227]
在本发明的第五方面的实施例中，x为(choh)
t-ch2oh，其中t＝1、3、5或7。
[0228]
在本发明的第五方面的实施例中，a或b选自由以下项组成的组：肽、多肽和蛋白质。
[0229]
在本发明的第五方面的实施例中，a包含分析物特异性结合剂并且b包含标记化合物，或者b包含分析物特异性结合剂并且a包含标记化合物。
[0230]
在本发明的第五方面的实施例中，分析物特异性结合剂选自由以下项组成的组：抗体、抗体的分析物特异性片段和/或衍生物、适配体、镜像适配体、设计的锚蛋白重复蛋白、凝集素、含有锚蛋白重复序列的蛋白质，以及含有kunitz型结构域的蛋白质，并且标记化合物选自由以下项组成的组：酶、荧光染料、发光染料、金属螯合物复合物以及含有放射性同位素的部分。
[0231]
在第六方面，本发明涉及一种方法，其用于合成根据本发明的第五方面所述的复合物，该方法包括以下步骤
[0232]
a)提供单体或其衍生物，其中该单体为包含氨基基团、羧基基团和至少一个羟基基团的氨基酸，其中该氨基基团或该羧基基团被第一保护基团保护，并且所述至少一个羟基基团或每个羟基基团被第二保护基团保护，
[0233]
b)在固相肽合成的过程中使用该单体，裂解第一保护基团和第二保护基团并且形成式iii复合物，
[0234][0235]
其中a代表该标记化合物，并且r代表第二间隔物，或反之亦然，其中r能够共价键合至分析物特异性结合剂或被共价键合至分析物特异性结合剂，
[0236]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0237]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0238]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0239]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0240]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0241]
z为整数并且≥1。
[0242]
针对本发明第一方面和/或本发明第二方面和/或本发明第三方面和/或本发明第四方面和/或本发明第五方面所提及的所有实施例均适用于本发明的第六方面，且反之亦然。
[0243]
在本发明的第六方面的实施例中，第一保护基团和/或第二保护基团第一保护基团和/或第二保护基团选自下组：酯、醚、甲硅烷基醚、缩醛、9-芴基甲基氧基羰基(fmoc)、苄氧基羰基(boc)、苄氧基羰基(cbz)、烯丙基氧基羰基(a1loc)、酰胺和叔丁酯。
[0244]
在本发明的第六方面的实施例中，单体或其衍生物选自下式m-1至式m-4：
[0245][0246]
其中fmochn表示用9-芴基甲氧基羰基保护基团保护的胺。缩写m-1在此处和本公开的内容中也可以命名为mf77。缩写m-2在此处和本公开的内容中也可以命名为(化合物)18(参见例如方案4)或fa36。缩写m-3在此处和本公开的内容中也可以命名为s779。缩写m-4在此处和本公开的内容中也可以命名为mf74。
[0247]
在本发明的第六方面的实施例中，如上所示的式iii复合物可以通过采用固相合成领域已知的标准知识和过程、方法和技术在自动化固相肽合成(spps)装置中合成和提供。
[0248]
在进一步的实施例中，本发明涉及以下方面：
[0249]
1.一种用于检测样品中的目标分析物的方法，该方法包括以下步骤：
[0250]
a)提供包含目标分析物的样品，
[0251]
b)提供包含接头的复合物，其中该接头共价结合标记化合物和分析物特异性结合剂，其中该标记化合物能够产生可检测信号，优选地是基于化学发光的信号，
[0252]
c)将步骤a)的样品与步骤b)的复合物偶联，
[0253]
d)通过使用标记化合物的可检测信号来检测目标分析物，
[0254]
其中复合物为式i化合物：
[0255][0256]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0257]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0258]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0259]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0260]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0261]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0262]
z为整数并且≥1。
[0263]
2.根据方面1所述的方法，其中复合物为式ii化合物：
[0264][0265]
其中a、b、m和n中的每一者与方面1中所提及者具有相同的含义，
[0266]
其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7。
[0267]
3.根据方面1所述的方法，其中复合物为式iii化合物：
[0268][0269]
其中a、b、m和n中的每一者与方面1中所提及者具有相同的含义，
[0270]
其中x为oh并且r≥1，优选地r＝1。
[0271]
4.根据前述方面中任一项所述的方法，其中x为oh且/或m为2或4或6。
[0272]
5.根据前述方面中任一项所述的方法，其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t＝1、3、5或7。
[0273]
6.根据前述方面中任一项所述的方法，其中标记化合物选自由以下项组成的组：酶、荧光染料、发光染料、金属螯合物复合物以及含有放射性同位素的部分。
[0274]
7.根据前述方面中任一项所述的方法，其中标记化合物能够在电化学氧化或还原时被诱导以发光。
[0275]
8.根据前述方面中任一项所述的方法，其中标记化合物包含金属离子，其为ru
2+
或ir
3+
。
[0276]
9.根据前述方面中任一项所述的方法，其中所述标记化合物经由第一缀合方法被共价键合至所述接头，其中所述第一缀合方法选自下组：点击化学、酰胺、酯、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、二氢哒嗪、硫醇-马来酰亚胺、环加成、光点击、施陶丁格连接、狄尔斯-阿尔德反应、四嗪连接、交叉偶联、皮克特-施彭格勒反应、四环庚烷。
[0277]
10.根据前述方面中任一项所述的方法，其中分析物特异性结合剂选自由以下项组成的组：抗体、抗体的分析物特异性片段和/或衍生物、适配体、镜像适配体、设计的锚蛋白重复蛋白、凝集素、含有锚蛋白重复序列的蛋白质，以及含有kunitz型结构域的蛋白质。
[0278]
11.根据前述方面中任一项所述的方法，其中分析物特异性结合剂经由第二缀合方法共价键合至接头，其中第二缀合方法选自下组：点击化学、酰胺、酯、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、二氢哒嗪、硫醇-马来酰亚胺、环加成、四嗪连接、光点击、施陶丁格连接、狄尔斯-阿尔德反应、交叉偶联、皮克特-施彭格勒反应、四环庚烷。
[0279]
12.根据前述方面中任一项所述的方法，其中式i、ii或iii的a代表标记化合物并且式i、ii或iii的b代表分析物特异性结合剂。
[0280]
13.根据前述方面中任一项所述的方法，其中式i、ii或iii的b代表标记化合物并且式i、ii或iii的a代表分析物特异性结合剂。
[0281]
14.根据前述方面中任一项所述的方法，其中在步骤(c)前、期间或后，将分析物固定在固相上。
[0282]
15.根据前述方面中任一项所述的方法，其中样品选自由以下项组成的组：痰液、唾液、清液、尿液、全血、溶血全血、血清和血浆。
[0283]
16.根据前述方面中任一项所述的方法，其中步骤(b)的复合物以溶解形式提供，并且步骤(c)在液体水性缓冲液中进行。
[0284]
17.根据前述方面中任一项所述的方法，其中液体水性缓冲液选自：磷酸盐、tris缓冲液、柠檬酸盐、二甲胂酸盐、巴比妥、甘氨酸、hepes、mes、pipes、mops、bis-tris甲烷、ada、bis-tris丙烷、aces、mopso、bes、ampb、tes、dipso、mobs、乙酰氨基甘氨酸、tapso、tea、popso、heppso、eps、hepps、tricine、甘氨酰胺、gly-gly、hepbs、bicine、taps及其混合物。
[0285]
18.根据前述方面中任一项所述的方法，其中复合物为式iv-1化合物：
[0286][0287][0288]
其中n大于1，优选地1≤n≤15，例如n＝10。
[0289]
19.根据前述方面中任一项所述的方法，其中复合物为式v或式vi化合物：
[0290][0291]
其中式v或式vi的n彼此独立地大于1，优选地1≤n≤15，例如n＝10。
[0292]
20.根据前述方面中任一项所述的方法，其中步骤b)包括基于肽的合成，优选地固相肽合成(spps)。
[0293]
21.根据前述方面1至20中任一项所述的方法用于检测所述样品中的所述目标分析物的用途。
[0294]
22.一种用于对样品中的目标分析物进行检测的试剂盒，该试剂盒在单独的容器中包括
[0295]
a)能够固定分析物的固相；
[0296]
b)式i化合物：
[0297][0298]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0299]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0300]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0301]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0302]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0303]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0304]
z为整数并且≥1。
[0305]
23.根据方面22所述的试剂盒，其中复合物为式ii化合物：
[0306][0307]
其中a、b、x、m和n中的每一者与方面22中所提及者具有相同的含义，
[0308]
其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7。
[0309]
24.根据方面22所述的试剂盒，其中复合物为式iii化合物：
[0310][0311]
其中a、b、m和n中的每一者与方面22中所提及者具有相同的含义，
[0312]
其中x为oh并且r≥1，优选地r＝1。
[0313]
25.根据方面22至24中任一项所述的试剂盒，其中x为oh且m为2或4或6。
[0314]
26.根据方面22至25中任一项所述的试剂盒，其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t＝1、3、5或7。
[0315]
27.根据方面22至26中任一项所述的试剂盒，其中复合物以溶解的形式体现。
[0316]
28.根据前述权利要求22至27中任一项所述的试剂盒用于检测样品中的目标分析物的用途。
[0317]
29.一种式i复合物，
[0318][0319]
其中a代表标记化合物并且b代表分析物特异性结合剂，或反之亦然，
[0320]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0321]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0322]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0323]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0324]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0325]
z为整数并且≥1，优选地，其中该化合物适合于检测样品中的目标分析物。
[0326]
30.根据方面29所述的复合物，其中复合物为式ii化合物：
[0327][0328]
其中a、b、x、m和n中的每一者与方面29中所提及者具有相同的
[0329]
含义，
[0330]
其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7。
[0331]
31.根据方面29所述的复合物，其中复合物为式iii化合物：
[0332][0333]
其中a、b、m和n中的每一者与方面29中所提及者具有相同的含义，
[0334]
其中x为oh并且r≥1，优选地r＝1。
[0335]
32.根据方面29至31中任一项所述的复合物，其中x为oh且m为2或4或6。
[0336]
33.根据方面29至32中任一项所述的复合物，其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t＝1、3、5或7。
[0337]
34.根据方面29至33中任一项所述的复合物，其中a或b选自由以下项组成的组：肽、多肽和蛋白质。
[0338]
35.根据方面29至34中任一项所述的复合物，其中a包含分析物特异性结合剂并且b包含标记化合物，或者b包含分析物特异性结合剂并且a包含标记化合物。
[0339]
36.根据方面29至35中任一项所述的复合物，其中分析物特异性结合剂选自由以下项组成的组：抗体、抗体的分析物特异性片段和/或衍生物、适配体、镜像适配体、设计的锚蛋白重复蛋白、凝集素、含有锚蛋白重复序列的蛋白质，以及含有kunitz型结构域的蛋白质，并且标记化合物选自由以下项组成的组：酶、荧光染料、发光染料、金属螯合物复合物以及含有放射性同位素的部分。
[0340]
37.一种合成根据方面29至36中任一项所述的复合物的方法，该方法包括以下步骤：
[0341]
a)提供单体或其衍生物，其中该单体为包含氨基基团、羧基基团和至少一个羟基
基团的氨基酸，其中该氨基基团或该羧基基团被第一保护基团保护，并且所述至少一个羟基基团或每个羟基基团被第二保护基团保护，
[0342]
b)在固相肽合成的过程中使用该单体，裂解第一保护基团和第二保护基团并且形成式iii复合物，
[0343][0344]
其中a代表该标记化合物，并且r代表第二间隔物，或反之亦然，其中r能够共价键合至分析物特异性结合剂或被共价键合至分析物特异性结合剂，
[0345]
x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，
[0346]
m为1至8，优选地≥2，特别是2至8的整数，
[0347]
n为2至20，优选地5至20的整数，
[0348]
r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，
[0349]
s为整数并且≥0，优选地是0，并且
[0350]
z为整数并且≥1。
[0351]
38.根据方面37所述的方法，其中第一保护基团和/或第二保护基团选自下组：fmoc、tbu(叔丁基)和醚、酯和/或缩醛。
[0352]
39.根据方面37至38中任一项所述的方法，其中单体或其衍生物选自下式m-1至式m-4：
[0353][0354]
其中fmochn表示用9-芴基甲氧基羰基保护基团保护的胺。
[0355]
实例
[0356]
提供以下实例来例示而非限制本文要求保护的发明。
[0357]
实例1
[0358][0359]
方案1.线性结构单元的合成。
[0360]
氨基酸(mf76)是通过kamiya等人的方法(kamiya，t.；saito，y.；hashimoto，m.；seki，h.tetrahedron 1972，28，899)由市售(-)-2，3-o-亚异丙基-d-赤酮酸内酯(mf79)得到的。用使用标准mecn-na2co3水溶液条件下提供的结构单元mf77的fmoc-osu进行随后的fmoc保护，产率为81％。mf：c22h23no6.mw：397.15.物理状态：白色固体。1h nmr(cdcl3，400mhz)：δ＝7.77(d，j＝7.5hz，2h)，7.60(d，j＝7.5hz，2h)，7.37-7.44(m，2h)，7.30-7.36(m，2h)，5.22-5.37(m，1h)，4.65(d，j＝7.3hz，1h)，4.36-4.58(m，3h)，4.17-4.31(m，1h)，3.45-3.53(m，2h)，1.61(s，3h)，1.42(s，3h)ppm。hplc-ms(teaac(ph 7.0)-mecn，梯度在7min内从5％到100％mecn)m/z396.2([m-h]-)；保留时间4.8min。
[0361]
实例2
[0362][0363]
方案2.支化结构单元的合成。
[0364]
fmoc-d-氨基葡萄糖酸(mf73)。在0℃，将fmoc-osu(3.28g，9.74mmol)在mecn(50ml)中的溶液加入到搅拌的d-氨基葡萄糖酸(2.0g，10.25mmol)和碳酸钾(2.17g，20.50mmol)在水(50ml)中的溶液中。在形成白色混浊之前，混合物短暂变清。将反应在0℃搅拌0.5h，然后在室温搅拌1h。通过加入hcl(1.0m)将混合物调节至ph 8，并且然后真空浓缩。将残余物溶于水(-200ml)中并且用etoac(3x100ml)萃取。通过加入hcl(1.0m)将水层调节至ph 2.0并且用etoac(5x150ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(na2so4)，过滤，并且浓缩以获得4.0g所需产物(产率94％)。mf：c21h23no8.mw：417.14.物理状态：白色固体。hplc-ms(teaac(ph 7.0)-mecn，梯度在7min内从5％到100％mecn)m/z 416.2([m-h]-)；保留时间4.1min。
[0365]
fmoc-异亚丙基-d-氨基葡萄糖酸(mf74)。向fmoc-d-氨基葡萄糖酸mf73(1.22g，2.92mmol)在etoac(20ml)中的搅拌悬浮液中加入2，2-二甲氧基丙烷(20ml)和对甲苯磺酸(0.1g，0.53mmol)。1h后将溶液用etoac(200ml)稀释，并且用盐水(3x25ml)洗涤。有机层经分离、干燥(na2so4)并且浓缩。将残余物转化为钠盐，将该钠盐通过快速色谱法(c-18，h2o-mecn)纯化，以得到840mg所需产物(产率58％)。mf：c27h31no8.mw：497.20.物理状态：白色
固体。1h nmr(cdcl3，400mhz)：δ＝7.77(d，j＝7.4hz，2h)，7.62(dd，j＝8.2，8.0hz，2h)，7.41(dd，j＝7.5，7.4hz，2h)，7.32(dd，j＝7.4，7.3hz，2h)，5.59(d，j＝10.0hz，1h)，4.79(d，j＝9.9hz，1h)，4.46-4.55(m，2h)，4.41(dd，j＝10.5，7.5hz，1h)，4.26(dd，j＝7.0，6.9hz，1h)，4.09-4.23(m，2h)，4.01(dd，j＝8.0，3.5hz，1h)，3.72(t，j＝7.9hz，1h)，1.44(s，3h)，1.43(s，3h)，1.40(s，3h)，1.36(s，3h)ppm。hplc-ms(teaac(ph 7.0)-mecn，梯度在7min内从5％到100％mecn)m/z 496.3([m-h]-)；保留时间5.3min。
[0366]
实例3
[0367]
实例3显示了扩展线性结构单元的合成(方案3)。
[0368][0369]
方案3.扩展线性结构单元的合成。
[0370]
化合物s763的合成
[0371]
将d-半乳糖酸内酯-1，4-内酯(2.94g，16.5mmol)悬浮于2，2-二甲氧基丙烷(60ml)和丙酮(4.5ml)中，并且之后加入对甲苯磺酸一水合物(1.59g，8.35mmol)，并且将反应混合物在40℃搅拌7h。然后通过加入na2co3来淬灭反应，将悬浮液经硅藻土垫过滤并减压去除溶剂。然后将残余物溶解在二氯甲烷中并将有机层用水洗涤两次，经无水na2so4干燥，并减压浓缩。最后，通过快速柱色谱法(sio2，正己烷/etoac 1∶1)纯化残余物，得到2.59g所需产物(54％)1h nmr(400mhz，chloroform-d)δppm 1.36-1.43(m，9h)1.46(s，3h)3.67-3.75(m，1h)3.76-3.80(m，3h)3.80-3.87(m，1h)3.90-3.96(m，1h)4.05-4.12(m，1h)4.33-4.39(m，1h)4.53-4.57(m，1h)7.21-7.37(m，2h)
[0372]
化合物s769的合成
[0373]
将化合物s763(2.59g，8.92mmol)溶解在35ml干燥吡啶中，并且在用冰浴将溶液冷却至0℃后，加入dmap(115mg，0.94mmol)。最后，加入甲磺酰氯(828μl，10.71mmol)，并且将混合物在0℃搅拌1h，然后在室温再搅拌1h。减压蒸发溶剂并将残余物溶解在二氯甲烷中。然后用水、nacl饱和溶液洗涤有机相，并且然后经无水na2so4干燥。减压蒸发溶剂并通过快速柱色谱法(sio2，正己烷∶etoac 7∶3)纯化残余物，得到2.93g所需产物(89％)。1h nmr(400mhz，chloroform-d)δppm 1.41-1.48(m，12h)3.09(s，3h)3.81(s，3h)3.94(t，j＝7.53hz，1h)4.24-4.30(m，2h)4.30-4.42(m，2h)4.50(dd，j＝11.10，2.70hz，1h)4.56(d，j＝5.40hz，1h)
[0374]
化合物s771的合成
[0375]
将化合物s769(2.93g，7.961mmol)溶解在干燥dmf(27ml)中，并且然后加入na n3(569mg，8.757mmol)，并将混合物在85℃搅拌5h。减压蒸发溶剂并将残余物分配在h2o和
etoac的混合物中。分离两相后，水层用etoac萃取两次，并且合并的有机层用nacl饱和溶液洗涤，经无水na2so4干燥，并且浓缩至干。最后通过快速柱色谱法(sio2，正己烷∶etoac 9∶1)纯化残余物，得到1.74产物(69％)。1h nmr(400mhz，chloroform-d)δppm 1.35-1.53(m，12h)3.32(dd，j＝13.18，5.02hz，1h)3.64(dd，j＝13.18，3.26hz，1h)3.79-3.80(m，3h)3.94(t，j＝7.50hz，1h)4.12-4.20(m，1h)4.34(dd，j＝7.53，5.27hz，1h)4.55(d，j＝5.27hz，1h)
[0376]
化合物s775的合成
[0377]
将化合物s771(1.74g，5.518mmol)溶解在1：2thf/h2o(160ml)混合物中，并且之后加入ba(oh)28h2o(2.84g，16.5mmol)并且将混合物在室温搅拌1h。加入dowex 50wx2，并且之后过滤混合物。最后将滤液真空干燥，并且直接用于下一步骤。
[0378]
化合物s777的合成
[0379]
将化合物s775(1.37g，4.54mmol)溶解在meoh/h2o 4∶1昆合物(25ml)中。并且然后加入活性炭上的pd。然后将烧瓶抽空并置于h2气氛下并将混合物在室温剧烈搅拌3h，不断供应h2。混合物经硅藻土垫过滤，并且滤液减压浓缩，并且真空干燥，得到1.25mg产物，该产物直接用于下一步骤(100％)。1h nmr(400mhz，methanol-d4)δppm 1.40-1.46(m，12h)3.06(dd，j＝13.20，8.80hz，1h)3.24(dd，j＝13.10，2.90hz，1h)4.01(dd，j＝7.90，4.40hz，1h)4.25(d，j＝6.60hz，1h)4.29-4.38(m，2h)
[0380]
化合物s779的合成
[0381]
将化合物s777(1.15g，4.17mmol)溶解在h2o/丙酮1∶1昆合物(100ml)中，并且之后加入fmocosu(2.28g，6.75mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜。加入nahco3(350mg，4.18mmol)，并且在室温搅拌1h后，使用0.1m hcl将ph调节至≈5单位，并且将混合物用etoac萃取3次。合并的有机层用无水na2so4干燥，减压浓缩，并且残余物通过快速柱色谱法纯化(sio2，从正己烷∶etoac 2∶3到etoac+1％乙酸的梯度洗脱)，得到1.5g所需产物(73％)。1h nmr(400mhz，chloroform-d)δppm 1.34-1.50(m，12h)3.42-3.56(m，2h)3.75-3.84(m，1h)4.08-4.16(m，1h)4.17-4.24(m，1h)4.27-4.35(m，1h)4.38-4.48(m，2h)4.59(d，j＝6.00hz，1h)5.15-5.25(m，1h)7.30(t，j＝7.50hz，2h)7.39(t，j＝7.40hz，2h)7.58(d，j＝7.40hz，2h)7.75(d，j＝7.60hz，2h)
[0382]
实例3b
[0383]
支化二醇衍生物的合成
[0384][0385]
方案4.衍生物18的合成：i)fmocosu，na2co3，h2o/acn 1∶1，3h；ii)ad-mixβ，k2co3，h2o/叔-buoh 1∶1，70h；iii)2，2-二甲氧基丙烷，p-tsoh，干燥etoac，4天。
[0386]
化合物16的合成
[0387]
将(s)-2-氨基丁-3-烯酸盐酸盐(15，750mg，5.45mmol)溶解在h2o/acn 1∶1混合物(50ml)中，并且然后加入fmocosu(1.84g，5.45mmol)和na2co3(1.73g，16.3mmol)。将反应混合物在室温搅拌3h。并且减压蒸发有机溶剂后，使用2n hcl将水溶液酸化至ph≈1-2。然后将得到的混合物用etoac萃取5次并将有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。通过快速柱色
谱法(rp-c18aq，从2∶3到3∶2的h2o/acn梯度洗脱)纯化粗产物。合并含有产物的级分并减压蒸发有机溶剂。过滤出形成的白色沉淀并真空干燥，得到1.50g受保护的fmoc衍生物16(85％)1h nmr(400mhz，chloroform-d)δppm 4.18-4.56(m，3h)4.60-5.55(m，4h)5.76-6.06(m，1h)7.28-7.36(m，2h)7.37-7.45(m，2h)7.51-7.65(m，2h)7.72-7.84(m，2h)
[0388]
化合物17的合成
[0389]
将fmoc-乙烯基甘氨酸16(1.48g，4.59mmol)溶解在叔-buoh/h2o 1∶1混合物(30ml)中，并且之后加入ad-mixβ(6.88g)和k2co3(634mg，4.59mmol)并将混合物在室温搅拌24h。加入na2s2o3(3g)，并且在室温搅拌15min后，使用6n hcl将混合物酸化至ph 1-2，并且然后用etoac萃取5次。减压去除溶剂，并且将残余物通过快速柱色谱法(rp-c18ao，从1：2至1∶1的h2o/acn梯度洗脱)纯化，得到1.03g二醇衍生物17(63％)；1h nmr(400mhz，丙酮)δppm 3.52-3.64(m，2h)3.67-3.82(m，1h)4.20-4.51(m，5h)4.52-4.63(m，1h)6.23-6.42(m，1h)7.29-7.36(m，2h)7.37-7.45(m，2h)7.69-7.79(m，2h)7.82-7.89(m，2h)。
[0390]
化合物18的合成
[0391]
将化合物14(1.02g，2.85mmol)溶解在干燥etoac(20ml)和2，2-二甲氧基丙烷(34ml，276.5mmol)中。加入对甲苯磺酸(54.2mg，0.285mmol)并将混合物在室温搅拌4天。通过加入20ml 5％nahco3溶液终止反应，并且然后减压蒸发有机溶剂。将水相直接进样用于色谱分离(rp-c18aq，从9∶1至7∶3的h2o/acn梯度洗脱)。合并含有产物的级分并减压去除有机溶剂。在冰浴中冷却剩余的水相后，使用2n hcl将ph调节至≈1-2，沉淀出对应的羧酸。所得悬浮液用etoac萃取2次，并且合并的有机层用nacl饱和溶液洗涤，经无水na2so4干燥，并浓缩至干，得到900mg产物(80％)。1h nmr(400mhz，chloroform-d)δppm 1.24-1.54(m，6h)3.69-3.92(m，1h)4.04-4.31(m，2h)4.32-4.54(m，3h)4.54-4.71(m，1h)5.37-5.53(m，1h)7.26-7.34(m，2h)7.34-7.45(m，2h)7.48-7.64(m，2h)7.75(d，j＝7.5hz，2h)。
[0392]
实例4
[0393]
肽合成
[0394]
特别地，通过在例如来自multisyntech的多肽合成器上的芴基甲基氧基羰基(fmoc)固相肽合成来合成肽。对此，使用4.0当量的每种氨基酸衍生物。氨基酸衍生物溶解在含有1当量的1-羟基-7-氮杂苯并三唑的n-甲基吡咯烷酮中。肽是在tentagel r树脂上合成的。偶联反应在相对于树脂负载而言具有4当量hatu和8当量n，n-二异丙基乙胺(dipea)的二甲基甲酰胺(作为反应介质)中进行5分钟。在每个合成步骤后8分钟内使用在二甲基甲酰胺中的25％哌啶来裂解fmoc基团。将树脂用2％肼在dmf中的溶液处理2x30min以释放受保护的ivdde赖氨酸。之后将6-马来酰亚胺己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(10eq.)和dipea(10eq.)加入到树脂中并孵育1h，随后用dmf进行3次洗涤步骤。在室温，使用含有三氟乙酸、三异丙基硅烷和水(38∶1∶1)的混合物，在3小时内实现了肽从合成树脂中的释放和酸不稳定保护基团的裂解。随后将反应溶液与冷却的二异丙醚混合以沉淀肽。将沉淀物过滤，再次用冷的二异丙醚洗涤，溶于少量乙酸水溶液中并冻干。使用含有0.1％三氟乙酸的乙腈/水的梯度通过制备型rp-hplc纯化所得粗材料。
[0395][0396]
纯化的材料的身份通过离子喷雾质谱来检查。
[0397]
bpru-(mf74)5-k(mh)酰胺
[0398]
序列：bpru-mf74-mf74-mf74-mf74-mf74-lys(mh)-nh2
[0399]
特殊氨基酸衍生物：
[0400]
bpru：钌(联吡啶)3羧酸
[0401]
fmoc-lys(ivdde)
[0402]
esi-ms
calc
：m
+
＝1876da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝937da
[0403]
bpru-(mf77)5-k(mh)酰胺
[0404]
序列：bpru-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-lys(mh)-nh2
[0405]
特殊氨基酸衍生物：
[0406]
bpru：钌(联吡啶)3羧酸
[0407]
fmoc-lys(ivdde)
[0408]
esi-ms
calc
：m+＝1576da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝789da
[0409]
bpru-(mf77)10-k(mh)酰胺
[0410]
序列：：bpru-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-lys(mh)-nh2
[0411]
特殊氨基酸衍生物：
[0412]
bpru：钌(联吡啶)3羧酸
[0413]
fmoc-lys(ivdde)
[0414]
esi-ms
calc
：m+＝2161da；esi-ms
exp
：[m+3h]
3+
＝721da
[0415]
bpru-(s779)5-k(mh)酰胺
[0416]
序列：：bpru-s779-s779-s779-s779-s779-lys(mh)-nh2
[0417]
特殊氨基酸衍生物：
[0418]
bpru：钌(联吡啶)3羧酸
[0419]
fmoc-lys(ivdde)
[0420]
esi-ms
calc
：m+＝1876da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝939da
[0421]
bpru-(fa36)5-k(mh)酰胺
[0422]
序列：：bpru-fa36-fa36-fa36-fa36-fa36-lys(mh)-nh2
[0423]
特殊氨基酸衍生物：
[0424]
bpru：钌(联吡啶)3羧酸
[0425]
fmoc-lys(ivdde)
[0426]
esi-ms
calc
：m+＝1576da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝788da
[0427]
bpru-(fa36)5-k(mh)酰胺
[0428]
序列：：bpru-fa36-fa36-fa36-fa36-fa36-fa36-fa36-fa36-fa36-fa36-lys(mh)-nh2
[0429]
特殊氨基酸衍生物：
[0430]
bpru：钌(联吡啶)3羧酸
[0431]
fmoc-lys(ivdde)
[0432]
esi-ms
calc
：m+＝1935da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝968da
[0433]
缩写：
[0434]
dmf：二甲基甲酰胺
[0435]
mh：马来酰亚胺己酰基
[0436]
bpru-(mf74)5-k(mh)酰胺和bpru-(mf74)5-k(mh)-nh2可以在此处和本公开的内容中互换使用。bpru-(mf77)5-k(mh)酰胺和bpru-(mf77)5-k(mh)-nh2可以在此处和本公开的内容中互换使用。bpru-(mf77)10-k(mh)酰胺和bpru-(mf77)10-k(mh)-nh2可以在此处和本公开的内容中互换使用。
[0437]
用于ir接头-mf77缀合的一般方案：
[0438]
步骤1，ir偶联：
[0439][0440]
在10ml闪蒸中，将多元醇接头n
°
(n＝10，6.6mg，4.34μmol)溶解在1ml干燥dmf中；加入dipea(2.8mg，21.7μmol)和ir3+-nhs酯(cs+盐，10.5mg，5.20μmol，溶于1ml dmf)。将反应在室温反应。4h.之后，蒸发溶剂并将红色固体溶解在2ml h2o中并通过hplc-prep c18纯化产物，10ml/min，1次注射：
[0441]
方法：
[0442]
0min：98％h2o，2％ch3cn；
[0443]
0-10min：98％h2o，2％ch3cn；
[0444]
10-60min：70％h2o；30％ch3cn；
[0445]
60-90min：20％h2o；80％ch3cn；
[0446]
步骤2，脱保护：
[0447]
将合并的级分8.8mg溶解在4ml 5％肼的dmf溶液中，并且将反应在室温反应2h。之后，蒸发溶剂并将红色固体溶于2ml h2o中，并且加入10eq.cs2co3。将产物通过hplc-prep c18纯化，以得到7.4mg产物。
[0448]
步骤3，马来酰亚胺偶联：
[0449]
在10ml闪蒸中，将步骤2的产物(7.4mg，2.81μmol)溶解在2ml干燥dmf中，加入dipea(1.8mg，14.04μmol)和马来酰亚胺-nhs酯(7.5mg，28.07μmol)。将反应在室温反应4h。之后，将红色溶液干燥并将红色固体溶解在0.2ml chcl3中，转移到eppendorf中并且用0.8et2o沉淀，通过离心分离固体。将固体通过用相同方法洗涤4次提纯；溶于0.2ml chcl3并且用0.8et2o沉淀。之后，将固体真空干燥以得到4.9mg红色固体产物n
°
。
[0450][0451]
ir3+-(mf77)10-k(马来酰亚胺)酰胺
[0452]
序列：ir3+-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-lys(马来酰亚胺)-nh2
[0453]
esi-ms
calc
：m+＝2844da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝1423da
[0454]
多元醇前体：(mf77)10-k(ivdde)酰胺
[0455]
序列：mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-k(ivdde)-nh2
[0456]
esi-ms
calc
：m+＝1522da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝762da
[0457]
ir3+-(mf77)5-k(马来酰亚胺)酰胺
[0458]
序列：ir3+-mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-lys(马来酰亚胺)-nh2
[0459]
esi-ms
calc
：m+＝2259da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝1130da
[0460]
多元醇前体：(mf77)5-k(ivdde)酰胺
[0461]
序列：mf77-mf77-mf77-mf77-mf77-k(ivdde)-nh2
[0462]
esi-ms
calc
：m+＝937da；esi-ms
exp
：[m+2h]
2+
＝469da
[0463]
实例6
[0464]
位点特异性抗体缀合物
[0465]
来自elecsys抗肌钙蛋白t克隆5d8的thiomab变体在a114c和s374c位置与不同的钌标记(具有不同的接头)缀合；分别根据bhakta s.et al.，2013(engineering thiomabsfor site-specific conjugation of thiol-reactive linkers，methods mol biol)中描述的方案。然后将这些缀合物用于运行罗氏肌钙蛋白t hs elecsys测定(id.05092744190，roche diagnostics gmbh，mannheim，germany)，以不同浓度替代原来的r2试剂(检测试剂)。
[0466]
标记的非位点特异性缀合(satp-马来酰亚胺)
[0467]
elecsys高灵敏度肌钙蛋白-t(hs tn-t)克隆5d8用于新合成的马来酰亚胺-ru(钌)复合物(包含多种多元醇接头)的缀合和elc(电化学发光)性能评估。为了生成功能化抗体，通过以1：5(igg：satp)的化学计量比与n-琥珀酰亚氨基-s-乙酰硫代丙酸酯(satp)缀合，将硫醇功能性引入igg以生成mab《tn-t》chim-5d8-igg-satp(1：5)。通过羟胺处理来从硫去除乙酰基保护以获得最终的含巯基抗体。然后在50mm kpp、150mm kcl、ph 7.4和5％dmso中，将此sh抗体与马来酰亚胺-多元醇-钌标记缀合。
[0468]
实例7
[0469]
elecsys性能
[0470]
所有测定变体均在cobas e170模块上运行，使用肌钙蛋白t hs测定方案和空白对照(稀释剂多测定，id.11732277122，roche diagnostics gmbh，mannheim，germany，cal1和cal2来自肌钙蛋白t hs calset(id.05092752190，roche diagnostics gmbh，mannheim，germany)使用肌钙蛋白t测定规范。基于peg和多元醇的接头的掺入率相似(参见掺入率)。新的多元醇接头fa41在tnt分析物的低(cal1/ma)和高范围(cal2/ma)中显示出相当的信噪比，与上一代多元醇(mf74)相比，接头稳定性显著提高。ma：血清空白；cal1：18ng/l；cal2：4200ng/l。
[0471]
然后将这些缀合物用于肌钙蛋白t hs elecsys测定变体(id.05092744190，roche diagnostics gmbh，mannheim，germany)，以2.5μg/ml浓度替代原来的r2试剂。在4℃在tnt r2缓冲液中缀合孵育一周后进行第一次ecl测量。
[0472]
表1：非位点特异性缀合的elecsys性能
[0473][0474]
与peg23和无接头(bpru-mea)相比，支链多元醇接头(基于mf74)得到更好的信噪比(call/ma和cal2/ma)。
[0475]
图1显示了elecsys ecl技术的原理和可能的elecsys抗体测试的功能。ecl(电化学发光，1-具有结合抗原抗体复合物的可磁化微粒，2-未结合的缀合物，3-流道，4-磁铁，5-例如生物素化抗体，6-例如链霉亲和素包被的磁珠粒)为罗氏用于免疫测定检测的技术。基于这项技术并结合精心设计、特异性和灵敏的免疫测定，elecsys提供了可靠的结果。ecl免疫测定法的开发可以基于钌复合物和三丙胺(tpa)的使用。用于检测反应复合物的化学发光反应是通过向样品溶液施加电压来引发的，产生精确控制的反应。ecl技术可以适应许多免疫测定原理，同时提供卓越的性能。
[0476]
表2显示bpru-(mf77)5k(mh)酰胺、bpru-(s779)
5-mh和bpru-(mf74)5k(mh)酰胺在rp hplc(水/乙腈+0.1％tfa)中具有相似的保留时间，分别为6.85、6.75和6.72min。对应的peg连接化合物具有9.73min的保留时间。
[0477]
表2：bpru-(mf77)5k(mh)酰胺、bpru-(s779)5-mh、bpru-(mf74)5k(mh)酰胺和bpru-peg24-mh的保留时间
[0478]
标记名称保留时间bpru-peg24-mh9.73minbpru-(mf74)5-mh6.72minbpru-(mf77)5-mh6.85min
bpru-(s779)5-mh6.75min
[0479]
图2显示了elecsys e170的结果：分别通过使用本发明的方法和通过使用具有peg接头和无接头的比较方法的肌钙蛋白t hs测定(空白值)。它显示了多测定(ma)稀释剂计数作为掺入率的函数。掺入率在此处表示每个抗体的ecl标记的平均数量。多测定稀释剂包含空白和2.5μg/ml缀合物。术语缀合物和复合物在整个公开中可以互换使用。缀合程序描述于例如实例6中。
[0480]
图3和图4显示了elecsys e170的结果：分别通过使用本发明的方法和通过使用具有peg接头和无接头的比较方法的肌钙蛋白t hs测定。它显示了call计数/多测定(ma)稀释剂计数和cal2计数/多测定(ma)稀释剂计数作为标记掺入率的函数。标记掺入率在此处表示每个抗体的ecl标记的平均数量。cal1/多测定稀释剂和cal2/多测定稀释剂不包括预洗步骤和2.5μg/ml缀合物。
[0481]
该专利申请请求欧洲专利申请20216267.3的优先权，其中该欧洲专利申请的内容通过引用并入本文。

技术特征：
1.一种用于检测样品中的目标分析物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含所述目标分析物的所述样品，b)提供包含接头的复合物，其中所述接头共价结合标记化合物和分析物特异性结合剂，其中所述标记化合物能够产生可检测信号，优选地是基于化学发光的信号，c)将步骤a)的所述样品与步骤b)的所述复合物偶联，d)通过使用所述标记化合物的所述可检测信号来检测所述目标分析物，其中所述复合物为式i化合物：其中a代表所述标记化合物并且b代表所述分析物特异性结合剂，或反之亦然，x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，m为1至8，优选地≥2的整数，n为2至20，优选地5至20的整数，r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，s为整数并且≥0，优选地是0，并且z为整数并且≥1。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物为式ii化合物：其中a、b、m和n中的每一者与权利要求1中所提及者具有相同的含义，其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物为式iii化合物：其中a、b、m和n中的每一者与权利要求1中所提及者具有相同的含义，其中x为oh并且r≥1，优选地r＝1。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中x为oh并且/或者m为2或4或6。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中x为(choh)
t-ch2oh，其中t＝1、3、5或7。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记化合物经由第一缀合方法被共价键合至所述接头，其中所述第一缀合方法选自下组：点击化学、酰胺、酯、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、二氢哒嗪、硫醇-马来酰亚胺、环加成、光点击、施陶丁格连接、狄尔斯-阿尔德反应、四嗪连接、交叉偶联、皮克特-施彭格勒反应、四环庚烷，并且/或者其中所述分析物特异性结合剂选自由以下项组成的组：抗体、抗体的分析物特异性片段和/或衍生物、适配体、镜像适配体、设计的锚蛋白重复蛋白、凝集素、含有锚蛋白重复序列的蛋白质，以及含有kunitz型结构域的蛋白质。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物为式iv-1化合物：其中n大于1，优选地1≤n≤15，例如n＝10。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物为式v或式vi化合物：
其中式v或式vi的n彼此独立地大于1，优选地1≤n≤15，例如n＝10。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)包括基于肽的合成，优选地固相肽合成(spps)。10.根据前述权利要求1至9中任一项所述的方法用于检测所述样品中的所述目标分析物的用途。11.一种用于对样品中的目标分析物进行检测的试剂盒，所述试剂盒在单独的容器中包括a)能够固定所述分析物的固相；b)式i化合物：其中a代表所述标记化合物并且b代表所述分析物特异性结合剂，或反之亦然，x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，m为1至8，优选地≥2的整数，n为2至20，优选地5至20的整数，r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，s为整数并且≥0，优选地是0，并且z为整数并且≥1。12.根据权利要求11所述的试剂盒用于检测所述样品中的所述目标分析物的用途。13.一种式i复合物，
其中a代表所述标记化合物并且b代表所述分析物特异性结合剂，或反之亦然，x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，m为1至8，优选地≥2的整数，n为2至20，优选地5至20的整数，r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，s为整数并且≥0，优选地是0，并且z为整数并且≥1，优选地，其中所述化合物适合于检测样品中的目标分析物。14.一种合成根据权利要求13所述的复合物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供单体或其衍生物，其中所述单体为包含氨基基团、羧基基团和至少一个羟基基团的氨基酸，其中所述氨基基团或所述羧基基团被第一保护基团保护，并且所述至少一个羟基基团或每个羟基基团被第二保护基团保护，b)在固相肽合成的过程中使用所述单体，裂解所述第一保护基团和所述第二保护基团并且形成式iii复合物，其中a代表所述标记化合物并且r代表第二间隔物，或反之亦然，其中r能够共价键合至分析物特异性结合剂或被共价键合至分析物特异性结合剂，x为oh或(choh)
t-ch2oh，其中t≥1，优选地t＝1、3、5或7，m为1至8，优选地≥2的整数，n为2至20，优选地5至20的整数，r为整数并且≥0，优选地是0，其中在x＝oh的情况下r≥1，s为整数并且≥0，优选地是0，并且z为整数并且≥1。15.根据权利要求14所述的方法，其中单体或其衍生物选自以下式m-1至式m-4：
其中fmochn表示用9-芴基甲氧基羰基保护基团保护的胺。

技术总结
本发明涉及一种用于确定至少一种目标分析物的方法。本发明进一步涉及试剂盒、复合物、合成复合物的方法及其用于检测样品中的所述目标分析物的用途。目标分析物的用途。目标分析物的用途。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：豪夫迈
技术研发日：2021.12.20
技术公布日：2023/8/24